Precipitación, separación y punto isoeléctrico de proteínas

Objetivos: Tabla 2. Precipitación por efecto de pH y

solventes
-Comprender el por qué una disolución proteica
precipita al modificar determinados factores. Tubo y 1) Clara de 2) C-h + 3) C-h +
-Determinar el punto isoeléctrico de la insulina y reactiv huevo (C- NaOH Regulado
el pH cuando este punto es alcanzado. os h) + HCl r

Introducción: Obser Partículas Partícul Partículas

vacion de la clara as de la clara
La solubilidad de las proteínas se debe a los es suspendida suspend suspendid
radicales (-R) libres de los aminoácidos que, al s idas de as
ionizarse, establecen enlaces por puente de la clara
hidrógeno con las moléculas de agua. Las precipita
proteínas en disolución muestran grandes ron
cambios en su solubilidad, en función de Etanol 3.0 3.0 3.0
concentraciones salinas, disolventes orgánicos, (mL)
pH y temperatura. Estas variables pueden Obser Apariencia La Formación
utilizarse para separar mezclas de proteínas. vacion viscosa en solubilid de
es el tubo, ad precipitad
La precipitación con solventes orgánicos como partículas aument o
el etanol o acetona disminuyen la interacción de blancas ó blanqueci
la proteína con el agua; se produce así la no.
precipitación cerca del punto isoeléctrico (pH
cuando la carga neta de la molécula proteica es
cero, debido a un aumento en uniones Tabla 3. Precipitación por metales pesados
electrostáticas y fuerzas de Van der Waals
intermoleculares Tubo y reactivos Observaciones

Resultados: 1) C-h y HgCl2 Coloración

blanquecina
Tabla 1. Resultados del SALTING-OUT
2) C-h y AgNO3 Coloración
Biuret Interpretación blanquecina
Filtrado 1 Positivo Quedaron residuos 3) C-h y Coloración
de proteínas en el
filtrado.
Pb[CH3COO]2 blanquecina
4) C-h y BaCl2 No hubo reacción

Precipitado Positivo Precipitaron las 5) C-h y NaCl No hubo reacción

1 proteínas menos
solubles en agua.
6) C-h y H2O No ocurrieron
cambios
Filtrado 2 Negativo Filtrado libre de
proteínas.

Precipitado Positivo Las sales más

2 solubles en agua al
aumentar la
concentración se
precipitaron.
Tabla 4 Determinación del punto isoeléctrico cantidades, después con la ecuación de
de la insulina Henderson-Hasselbach se procedió a calcular
el pH de las soluciones resultantes y analizar los
T Ácido Acetat Insuli pH Observaci
u acéti o de na ones tubos de ensaye, todos eran cristalinos excepto
b co sodio 40 (Solución) el tubo No. 4, este presentó un precipitado
o (mL) 0.2 M U/mL blanco, lo que comprobó que el pI de la insulina
(mL) se puede encontrar a un pH similar a 6.12
1 0.23 0.02 6U 3.67 Cristalina
2 0.15 0.10 6U 4.56 Cristalina El Ph del acetato Tubo No.5 se calculó de la siguiente
manera:
3 0.05 0.20 6U 5.34 Cristalina
4 0.01 0.24 6U 6.12 Blanca →
𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝑁𝑎 + 𝐻2 𝑂 𝐶𝐻 𝐶𝑂𝑂 − + 𝑁𝑎+
← 3
5 0.00 0.25 6U 9.07 Cristalina
→
Ejemplo del cálculo de valor de pH: 𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂− + 𝐻2 𝑂 ←𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝐻 + 𝑂𝐻

Calcular el pH de una disolución 0,5 N de [𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝐻][𝑂𝐻]

1) 𝐾ℎ = 4) 𝐾𝑤 = [𝑂𝐻][𝐻3 𝑂 + ] = 10−14
hidróxido de sodio NaOH [𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂− ]
𝐾𝑤
[𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝐻][𝐻3 𝑂+ ] 5) 𝐾ℎ = = 5.52𝑥10−14
Como es una base fuerte, se disocia 2) 𝐾𝑎 = 𝐾𝑎
[𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂− ]
completamente y podemos aplicar la fórmula:
[𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂𝐻][𝑂𝐻][𝐻3 𝑂+] 𝐾ℎ
pOH = -log [OH-] = -log [0,5] = 0,3 3) 𝐾ℎ = 6) 𝛼 = √ = 4.70𝑥10−5
[𝐶𝐻3 𝐶𝑂𝑂− ][𝐻3 𝑂+] 𝐶
pH= 14 -pOH= 14 - 0,3= 13,4 7) [𝑂𝐻] = 𝛼𝑐 = (0.25)(4.70𝑥10−5 ) = 1.17𝑥10−5

Discusión de resultados: 8) 𝑝𝑂𝐻 = −𝑙𝑜𝑔[𝑂𝐻] = 4.92 𝑝𝐻 = 14 − 4.92 = 9.07

En la tabla 2 se pudo observar que hubo
un pequeño precipitado en las soluciones con
pH ácido; posteriormente al añadir etanol, las
proteínas del tubo con pH cercano a 4.7
precipitaron formando un compuesto
blanquecino. Las proteínas del tubo con pH
próximo a 1 precipitaron en mayor medida
adquiriendo una consistencia viscosa. Esto nos
puede dar una idea de que el punto isoeléctrico
(pI) de la solución ronda en pH ácidos.
Por otra parte la solución con pH igual a 13 no
experimentó formación de precipitado, contrario
a esto, al agregar etanol la mezcla aumentó su
solubilidad.
En todas las reacciones efectuadas con
metales pesados (Hg, Ag y Pb) se formó un
precipitado de aspecto lechoso debido a que las
proteínas de la clara de huevo se unieron con
los metales pesados formando sales. En las
reacciones efectuadas con agua, BaCl2 y NaCl
no hubo formación de enlaces entre la proteína
y los metales, por ende, no hubo precipitación.
Tabla 3.
Para calcular el pI de la insulina se utilizó
CH3COOH y [CH3COO]Na en distintas
El valor de 9.07 era esperado ya que en la
solución solo se encontraba concentración de
acetato, de igual forma se tuvo que calcular de
diferente manera a la de los incisos anteriores,
esto debido a que no hay concentración de
ácido y por lo tanto la Henderson-Hasselbach
no es aplicable, sino se debe partir de la
disociación del acetato de sodio mediante agua
Conclusiones:
Se concluye que la fuerza iónica, el pH, la
temperatura y la constante dieléctrica del
disolvente afectan directamente en la
solubilidad de las proteínas.
Se concluye que entre menos solubles sean las
proteínas precipitan con mayor facilidad.
Se concluye que el punto isoeléctrico de la
Insulina se encuentra a un pH de 6.12
Referencias:
Gómez Fiorentino Susana, 1994. La
inmunología en el diagnóstico clínico., Ed. Ceja,
Santafé de Bogotá, p. 52-56
Peña Díaz Antonio, 2004. Bioquímica. Ed.
Limusa, México D.F., p.96
.