Enzimas

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE
FACULTAD DE QUIMICA Y BIOLOGIA
ESTUDIO DE LA INTERACCION ENTRE

DETERGENTES
Y MACROMOLECULAS AISLADAS Y ORGANIZADAS
Marcia Gloria Henríquez Bustamante
SANTIAGO - CHILE
1997
ESTUDIO DE LA INTERACCION ENTRE DETERGENTES
Trabajo de graduación presentado a la Facultad de Química

y Biología en cumplimiento parcial de los requisitos exigidos para
optar al grado de Doctor en Ciencias, mención Química.
1997
ESTUDIO DE LA INTERACCION ENTRE DETERGENTES
Este trabajo de graduación fue preparado bajo la dirección de la profesora

tutora Doctora Elsa Abum de la Facultad de Química y Biología y ha sido
aprobado por los miembros de la comisión examinadora Doctora Betty
Matsuhiro, Dra Ligia Gargallo y Doctor Franco Rabagliati.
JtJ^^
Dra. Elsa Ábu
>Iu&
Dra. (tBe
Matsuhiro Y.

arg ilcG. ZFoRabagliati C.
Decano
1997
A Fernando y a Laura.
AGRADECIMIENTOS
A la vida, por haberme presentado caminos alternativos y la posibilidad de elegir;

a mis padres, de quienes he recibido todo excepto la presión de lo que se espera sean mis
logros; a Fernando, quien ha tenido siempre la palabra y el gesto preciso para
enseñarme a creer en mi misma y para impulsarme a alcanzar mis metas, a todos ellos,
gracias.
A los profesores Elsa Abuin y Eduardo Lissi de quienes he aprendido que en

Ciencia, todas las preguntas son válidas y que las respuestas deben compartirse; al
profesor Alberto Ciferri, gestor de una parte importante de esta tesis e interlocutor
comprometido en la discusión de resultados; a los integrantes del laboratorio de Físico-
Química, en especial a María Victoria, Juan, Arturo, María Angélica, Ana María, Jorge y
Alexis por su permanente apoyo y colaboración tanto en el desarrollo de este trabajo
como en la convivencia diaria, a todos ellos, gracias.
A Juan Guerrero y a Ana María Campos, por lo saludable que me ha resultado su

amistad, gracias.
Quiero expresar además mis agradecimientos a Conycit por haberme otorgado

una beca de Doctorado, a Fondecyt por el financiamiento del Proyecto de doctorado
041/92 y a la Universidad de Santiago que me hizo beneficiaria de una beca Hugo Levy.
A quienes que de una manera u otra han contribuido a llevar a buen término el
desarrollo de esta tesis, sinceramente, gracias.
Marcia
RESUMEN
Los resultados presentados en esta tesis están relacionados con el estudio de la

interacción entre colágeno yio gelatina y detergentes iónicos.
Las etapas contempladas en el desarrollo del trabajo son:

a) Interacción de dos detergentes iónicos del mismo largo de cadena y de diferente carga
con gelatina en estado gelificado.
b) Estudio de la interacción sinergística yio antagónica de dos agentes
desnaturalizantes, uno de ellos urea y el otro un detergente aniónico presentes en
forma simultánea en soluciones de gelatina.
c) Estudio de la interacción entre un detergente aniónico y colágeno.
d) Efecto de la adición de alcoholes sobre geles de gelatina formados en
microemulsiones.
Los métodos experimentales utilizados han sido: técnicas fotofisicas,

electrodos selectivos de iones, viscosimetría, polarimetría, espectroscopía UV-visible y
cromatografla líquido-gas, entre otros.
Los resultados permiten establecer que la interacción con gelatina es más fuerte
para el detergente amónico que para su homólogo catiónico. Este último podría formar
agregados tipo micela libre al interior del gel con una mínima interacción con las
macromoléculas. La interacción producida con el detergente aniónico ocurriría
preponderantemente con regiones más desordenadas de la gelatina, lo que se manifiesta
en una estabilización de la fase amorfa en el estudio de interacción con el colágeno.
Los diferentes mecanismos de acción desnaturalizante de urea y del detergente

aniónico se expresan de manera antagónica de modo que el detergente actuaría como
un agente protector de microdominios hidrofóbicos presentes en la gelatina.
En los geles de gelatina formados en microemulsiones, la presencia de alcoholes

de cadena larga permitiría aumentar el campo de estabilidad de los geles.
SUMMARY
The results presented in this thesis are related with the study of the interaction
betwen collagen andlor gelatin and ionic detergents.
The foliowing steps were considered:
a) Interaction of two ionic detergents having the same chain length but different charge
with gelatin in the gel state.
b) Study on synergism and / or antagonism of two denaturants, urea and an anionic

detergent, simultaneously present in solutions of gelatin.
c) Study of the interaction betwen an anionic detergent and collagen.
d) Effect of addition of alkanols on gelatin geis formed in microemulsions.
Experimental methods employed were: photophysical techniques, selective

electrode measurements, viscosimetry, polarimetry, UV-visible absorption spectroscopy
and gas-liquid chromatography, among others.
The results obtained allow to conclude that, the interaction of gelatin with the
anionic detergent is stronger than that corresponding to the cationic homolog. The
cationic detergent could be under the form of aggregates similar to free micelles
inmersed in the gel, but the interaction with the macromolecule is minimal. The
interaction with the anionic detergent takes place on disordered regions of the gelatin
chains, as is manifested by the stabilization of the amorphous form in collagen.
The different mechanisms involved in the denaturant action of urea and the
anionic detergent leads to antagonism. The addition of the detergent would protect the
protein against denaturation by urea mantaining the hydrophobic microdomains present
in gelatin.
The addition of alkanols with long aikyl chains would increase the field of
stability of gelatin gels produced in microemulsions.
i
INDICE
Contenido PAGINA
Capítulo 1
-Introducción .......................... . ..................... .... ................................................................ ..1
1.1 -Moléculas tensoactivas................................................................................................. 4
1.2.-Macromolécula en estudio ...................................... . ................................ . .................... 5
1.3.-Modelo para el fenómeno de gelificación ...................................................................... 10
1.4.-Antecedentes previos del comportamiento de la gelatina ............ ... ................ ............... 12
1.5.-Interacción polímero-detergentes .................................... . ................. .... ..............

.......... 16
1.6.-Colágeno en presencia de aditivos, antecedentes .........

........................................ ......... 22
1.7.-Rol desnaturalizante de la urea..................................................................................... 25
1.8.-Geles de gelatina en solvente orgánico......................................................................... 27
1.9.-Uso de técnicas fotofisicas en el estudio de interacciones............................................. 34
Objetivos.......................................................................................................................... 38
Capítulo 11
-Parte Experimental. ........................................................................................................... 39
11. 1 .-Reactivos y solventes ................ ... . ............................................................................... 39
11 .2.-Métodos ............................................. . ... . ....... . ............................ ... .............................. 40

ji
Contenido PAGINA
Parte A
11.2.1 -Preparación de geles de gelatina en solvente acuoso.....................................................40
............ .. ............. 41
11.2.2.-Mediciones de fluorescencia ...............................................................
¡1.2.3.-Actividad de los iones de detergente al interior del gel ................................................42
11.2.4.-Mediciones de Fuerza de gel ... ... ........ . .............................. . ................................. .. ........ 45
11.2.5.-Viscosidades relativas.................................................................................................... 45
Parte
11.2.6.-Desactivación de la fluorescencia del pireno en soluciones de gelatina ................... ... .... 47
11.2.7.-Rotación Optica .............................................................................. . ...... . ....................... 47
11.2.8.-Viscosidades relativas .............. ... . .......... . ....................................................................... 48
Parte C
11 .2.9.-Obtención de tendones ................................................................

................................... 49
11.2.10.-Temperaturas de transición cristalino amorfo...............................................................49
11.2.11 -Grado de hinchamiento ................................................................................................ . 50
11.2.1 2.-Deterninación de la asociación del dodecil sulfato de sodio .................. . ............. .. ......... 52
Parte D
11.2.13.-Preparación de geles en solvente orgánico ....................................... .. ........................... 53
11.2.14. -Construcción de diagramas de fases ........................ . ........ ........... . ............................... 53

Contenido PAGINA
11.2.15.-Determinación de la incorporación de alcoholes a los organogeles............................ 54
11.2.16.-Determinación del contenido de bis(etil-hexil) sulfosuccinato de sodio....................... 55
11.2.17.-Determinación del contenido acuoso en los geles en solvente orgánico ..................... 56
Capítulo Hl
Resultados............... . .................................................... . ......................................................... 57
ifi. 1.-a) Fotofisica del pireno en geles de gelatina. ..................................................................... 57
b) Efecto de los detergentes ........................................................................................... 62
111.2.-Actividad de los detergentes al interior del gel................................................................. 66
111.3.-Efecto de los detergentes sobre la fuerza de gel............................................................. 66
111.4.-Efecto de la adición de urea a soluciones de gelatina .................................................. . ...... 74
¡11.5 -Efecto de la adición de dodecil sulfato de sodio a soluciones de gelatina........................... 81
111.6.-Efecto de la adición simultánea de urea y dodecil sulfato de sodio ..................................... . 81
111.7.-Colágeno: curvas de hinchamiento y de transición de fase ................. .... ............................ 83
111.8.-Cuantificación de la asociación del dodecil sulfato de sodio al colágeno .................... .. ....... 92
111.9.-Diagrama de fases de geles en solvente orgánico... ....... .... ........ . ................ . ....... . ........ . ....... 98
Capítulo IV
- Discusión ............................................................................................................................. 103
IV. 1.-Formación de microdominios en soluciones y geles de gelatina.. ................................. . .... 103
IV.2.-Efecto de la adición de detergentes sobre los microdominios ................................. .... ...... 104
IV.3 . -Asociación de detergentes con gelatina............................................................................ 106
IVA. -Modificación estructural del gel por efecto de detergentes ............. . ................................. 107
iv
Contenido PAGINA
1V.5.-Formación de microdominios en soluciones de gelatina....................................................108
IV.6.-Efecto de la adición de urea sobre microdominios en solución..........................................109
IV.7.-Efecto de la adición de dodecil sulfato de sodio sobre microdominios en solución ...........110
IV.8.-Efecto de la adición simultánea de urea y dodecil sulfato de sodio.....................................111
IV.9. -Interacción entre dodecil sulfato de sodio y colágeno........................................................113
IV. 10.-Análisis del diagrama de fases de organogeles ........... . .................................................... 120
Conclusiones.................... . ........................................................................................................ 126
- Referencias Bibliográficas ........................................................................ . ........... . .................... 128

Indice de Figuras:
Figura
Capítulo 1
1.1 -Esquema de la estructura del colágeno.......................................
1.2. -Patrón de empaquetamiento del colágeno ...................... .. ........ ...
1.3. -Esquema de un gel de gelatina....................................................
1.4.-Modelo para el fenómeno de percolación...................................
1.5.-Simulación de percolación en una red cuadrada......................... II
1.6.-Modelos de modos posibles de asociación detergente- proteína. 20
1.7.-Modelo de gel en solvente orgam........................................... 29
1.8. -Diagrama de fases concentración-temperatura en organogeles... 31
1.9.-Diagrama de fases isotérmico dependiente de la razón
agua/bis(etil-hexil) sulfosuccinato de sodio ................................ 33
Capítulo II
2.1.-Esquema de electrodo selectivo de iones.................................... 43
2.2.-Esquema del gelómetro ............................................................. 46
2.3 -Montaje para la determinación de las temperatura de transición. 51

vi
Figura PAGINA
Capítulo III
3 1 -Dependencia de la razón entre las bandas electrónico - vibracionales 1 y 3 de]
pireno con la concentración de gelatina ..................................................................... 58
3.2.-Dependencia de la razón excímera monomérica con la concentración de gelatina 60
3.3.-Dependencia de la razón entre las bandas 1 y 3 del pireno con la concentración
de dodecil sulfato de sodio en los geles ....................................................................... 63
3.4.-a)Tiempos de vida bajo nitrógeno versus concentración de dodecil sulfato de sodio
enlos geles ................................................................................................................... 64
b)Constantes de desactivación por oxígeno versos concentración de dodedil sulfato de
sodioen los geles .......................................................................................................... 65
3.5 .-a)Dependencia de la fuerza electromotriz con el log de la concentración de dodecil
sulfatode sodio ............................................................................................................. 67
b)Dependencia de la fuerza electromotriz con el log de la concentración de bromuro
de dodeciltrimetil amonio .............................................................................................. 68
3.6.-Isoterma de adsorción de SDS en gel de gelatina al 2%................................................ 69
3.7.-Dependencia de las fuerzas de gel con la concentración de DTAB................................. 70
38-a)Dependencia de la fuerza de gel con la razón [SDS]/gelatma ....................................... 72
b)Dependencia de la viscosidad con la razón [SDS]/gelatina .... . .................. .. .................... 73
3.9. -Desactivación por Acrilamida de la fluorescencia del pireno en agua en solución de
dodecil sulfato de sodio y en soluciones de gelatina .......... . ................. . .............. . ...... . ...... . 75
3.10. -Desactivación por AA en soluciones de gelatina, representado

vi¡

Figura PAGINA
de acuerdo a la ecuación de Lehrer ............................................................................77
3.11.-Dependencia entre la fracción de hélice y la fracción de fluorescencia del
pireno protegida por la desactivación por AA en soluciones de gelatina
bajo adición de urea y/o SDS ............................................................................. . ...... 79
3.12 -Dependencia de la viscosidad de soluciones de gelatina con la adición separada
y simultánea de urea y dodecil sulfato de sodio ..................................................... 80
3.13 -Dependencia de la fracción de hélice de soluciones de gelatina con la
adición separada y simultánea de urea y dodecil sulfato de sodio ...........................82
3.14.-Determinación de las temperaturas de transición cristalino-amorfo para el
colágeno en presencia de distintas concentraciones de SDS ................

...................... 84
3.15.-Curvas de hinchamiento para el colágeno:
a)pH6,0 T=44°C .................................................................................... ... ........ . ....... 85
b)pH 6.0 T = 25 oc ........................................................................................................86
c)pH2.5 T=25 °C ............................................... . ................... .. ................................... 87
3.16.-Diagrama de fase para la transición cristalino-amorfo del colágeno a pH 6,0
bajo adición de dodecil sulfato de sodio ..........................................................................89
3.17.-Diagrama de fase para la transición cristalino-amorfo del colágeno a pH 2,5.............. 91
3.1 8.-a)Isorma de adsorción de dodecil sulfato de sodio al colágeno a pH 6,0 en estado
cristalinoy amorfo ...................... . .... . ............................................................................. 93
b)Isoteiina de adsorción de dodecil sulfato de sodio al colágeno a pH 2,5 en estado
.cristalino y amorfo ........................................................................................................94

vi¡¡

Figura PAGINA
3.19.-Gráficos de Langmuir para los datos de adsorción sobre colágeno............................... 95
3.20-Depndcialfrósobdatucinloeraód
dodecil sulfato de sodio libre ......................................................................................... 97
3.21-Diagrmdeftsélapudoerni:(g,bstl-hx)ufocina
de sodio), isooctano, gelatina ...........................................................................................99
4.1.-Esquema modelo de los distintos tipos de organización posibles en soluciones de
gelatina en ausencia y presencia de urea y SDS ................................................................114

1
Capítulo ¡
INTRODUCCION
La presencia simultánea en solución acuosa de moléculas tensoactivas y
macromoléculas hace que éstas vean afectadas mutuamente sus propiedades individuales como
consecuencia de la operación de interacciones que a la vez conducen a la formación de organizaciones
moleculares de características diversas. El tipo de interacción predominante y la organización
molecular resultante dependen de la naturaleza química de las partes interactuantes, en particular en lo
que respecta a carga e hidrofobicidad.
En la última década se han realizado numerosas investigaciones en relación con
diversos tipos de sistemas organizados, entre los que se encuentran precisamente aquellos
representados por soluciones que contienen simultáneamente detergentes y macromoléculas. Estos
sistemas son de reconocida importancia en campos tan diversos como aislación de proteínas de
membrana (Kwee el al. 1986), recuperación de petróleo (Taber, 1980), farmacología (Thies, 1989),
flotación de minerales (Kale etal., 1982), etc.
Una revisión de la literatura desde el punto de vista del conocimiento básico, en
relación con procesos de interacción que ocurren entre macromoléculas aisladas y detergentes, permite
encontrar estudios que dan cuenta de los distintos tipos de interacción que se pueden presentar y de las
organizaciones moleculares resultantes (Schick, 1987; Saito, 1985; Shirahama el al., 1989 Chandar el
al., 1988), formación de complejos entre detergentes y polielectrolitos (Dubin el al. 1995; Shimizu
1995); procesos de asociación cooperativa (Satake el al. 1984), asociación de detergentes sobre
polímeros hidrofóbicos, con formación de pequeñas micelas reversas en mezclas de solventes (Kientz
MI
el al. 1994; Turro et al., 1984; Zhong Hu el al., 1990), asociación sobre polímeros en bloque
(Almgren el al., 1991), etc.
Se denominan macromoléculas organizadas a aquellos sistemas en los cuales las
cadenas del polímero se pueden organizar en estructuras tipo gel y/o polímeros rígidos con
organización cristalina.
De acuerdo a la literatura los objetivos planteados en los trabajos en que las
macromoléculas no se encuentran organizadas están dirigidos a determinar el grado de asociación del
detergente sobre distintos tipos de polímeros (Anaud el al., 1992; Goddard el al., 1992; Maltesh el
al., 1992), y a la determinación del grado de cooperatividad de la asociación polímero-detergente
(Satake el al. 1984), vale decir, la posible formación de agregados micelares sobre las cadenas de la
macromolécula.
Si bien el proceso de interacción entre macromoléculas aisladas y moléculas
tensoactivas ha sido objeto de numerosos estudios, el nivel de conocimiento existente en cuanto a
interacciones entre estos detergentes y macromoléculas organizadas es escaso (Ryabina el al., 1990;
Ngotthai el al., 1995). Sería interesante por ejemplo, encontrar una posible explicación a algunas
cuestiones básicas tales como:
i) la (las) manera (s) en que la interacción detergente-gel modifica las propiedades de este último.
ü) la capacidad del gel de soportar la formación de agregados micelares sobre la estructura polimérica,
iii) la posibilidad de formar micelas encapsuladas al interior de un gel, etc.
Se ha descrito recientemente la formación de un nuevo tipo de geles (Haering el al.,
1986; Quellet el al.,1986), que corresponde a sistemas que tradicionalmente se estudiaban como
microemulsiones de agua en solvente orgánico, sostenidas por detergentes tal como el bis [etil-hexil]
3
sulfosuccinato de sodio, (AOT). El solvente utilizado habitualmente es n-heptano o isooctano. La
adición, bajo determinadas condiciones de concentración y temperatura, de un polímero natural, en
particular gelatina, ha conducido a la formación de lo que se ha dado en llamar geles basados en
microemulsiones u organogeles.
Se plantean algunos usos interesantes de los geles en solvente orgánico tales como
inmovilización de enzimas (Rees el al. 1993); liberación controlada de drogas (Capitani el al. 1988;
Atkinson et al. 1989); transporte de iones metálicos a través de la fase dispersa (Zeynep el al. 1995)
etc.
La gran mayoría de los trabajos publicados en la literatura en relación con los procesos
de interacción polímero detergentes corresponden al estudio del estado fluido, mientras que el
conocimiento de las propiedades y características de las interacciones en el estado gelificado es escaso.
Es así como resulta de interés estudiar el tipo de interacciones que pueden presentarse entre moléculas
tensoactivas y moléculas poliméricas capaces de estructurarse formando geles; en particular, el
estudio comparativo del comportamiento de los sistemas con las correspondientes macromoléculas
aisladas.
Los sistemas considerados involucran por una parte moléculas tensoactivas iónicas y
por otra una macromolécula anfotérica que dependiendo de las condiciones experimentales, vale decir
temperatura y concentración, se puede encontrar como macromolécula aislada, como agregados bajo
forma de gel, o actuando como polímero rígido.

ti
1.1.- Moléc tilas tensoactivas
Los detergentes son moléculas anflpáticas y por lo tanto capaces de presentar
propiedades hidrofóbicas e hidrofihicas. Sus características hidrofóbicas le son conferidas por una larga
cadena hidrocarbonada, en tanto que sus propiedades hidrofihicas vienen determinadas por una cabeza
polar o jónica que forma parte de la molécula.
Los detergentes así constituidos se clasifican en función de la naturaleza de su extremo
hidrofilico en neutros, aniónicos y catiónicos.
En solución acuosa este tipo de moléculas presenta propiedades muy particulares. A
baja concentración las moléculas se presentan como monómeros; no obstante, sobre cierto intervalo
de concentración conocida como concentración micelar crítica, CMC, se producen agrupaciones de
monómeros. En ese caso, las cadenas hidrocarbonadas escapan del agua interactuando entre sí y
dejando la parte hidrofilica en contacto con el agua. A este tipo de agregados de detergente se les
conoce como micelas.
La magnitud de la CMC depende, entre otros factores, de la longitud de la cadena
hidrocarbonada, de la naturaleza del grupo polar, del contraión y es afectada por la presencia de
aditivos.
En solventes orgánicos, frecuentemente isooctano o heptano, algunos detergentes
pueden formar micelas inversas; es decir, organizaciones micelares en las cuales las cadenas
hidrocarbonadas quedan expuestas al solvente en tanto que se forma una laguna acuosa rodeada y
sostenida por las cabezas polares o iónicas del detergente. La formación y tamaño de las micelas
inversas es dependiente de la razón molar entre agua y detergente.

5
L2.- Macromolécula en estudio
La macromolécula considerada en este estudio es el colágeno (de] cual procede la
gelatina). Esta proteína en estado nativo presenta una estructura cristalina, cuyo orden permite a la
macromolécula comportarse en forma rígida, y en estado desnaturalizado puede mantenerse
aisladamente en solución o formar geles si las condiciones de concentración y temperatura lo permiten.
El colágeno es una proteína estructural (Clark y Ross-Murphy, 1987) que proporciona
fuerza mecánica a huesos, tendones, cartílago y piel. El término colágeno contempla al menos diez
tipos de proteína llamadas colágeno tipo 1, II, III, etc. En este trabajo se restringirá la descripción a
colágeno tipo 1.
El colágeno de los tendones (tipo 1), tiene una resistencia a la tracción de 20 a 30
Kg/mm2 . El colágeno está constituido por una triple hebra helicoidal. Las hebras helicoidales
corresponden a monómeros de hélices alfa de mano izquierda, llamados a 1 y a2 presentándose en la
triple hebra en la razón 2a 1/a2. Pero el haz formado por las tres cadenas polipeptídicas está reforzado
por una torsión hacia la derecha que da una vuelta por cada diez vueltas de la cadena simple.
Cada una de las cadenas está constituida por unos 1000 residuos aminoacídicos. El
peso molecular de una cadena individual es alrededor de 100.000. Aproximadamente un tercio de los
residuos es glicina y un cuarto corresponde a prolina o hidroxiprolina.
Una secuencia típica es Gly-X-Y-GIy-Pro-Y-Gly-X-Hyp-Gly. También es común la
secuencia Gly-Pro-Hyp-Gly. La molécula helicoidal triple tiene alrededor de 300 nm de largo y 1,5 nm
de diámetro.
Los aminoácidos prolina y glicina tienen importancia en la formación de la estructura
de triple hélice. La prolina, debido a su estructura en anillo estabiliza, en cada cadena a una
6
conformación de hélice de mano izquierda con tres residuos aminoacídicos por vuelta. La glicina es el
aminoácido más pequeño y se encuentra regularmente espaciado cada tercer residuo a través de la
región central de la cadena a. Esto permite que las tres cadenas a helicoidales puedan empaquetarse
juntas para formar la super hélice del colágeno. Los aminoácidos terminales de las cadenas
corresponden a dominios estructurales extra-helicoidales, llamados telopéptidos.
En la figura 1.1 (página 9) se muestra una representación esquemática de la estructura
del colágeno, incluyendo una región de estructura primaria, la estructuración helicoidal de una cadena
individual y la formación de la hélice triple.
Las moléculas individuales de colágeno, también llamadas tropocolágeno, se agregan
ordenadamente formando fibrillas las cuales son estructuras tipo cable que alcanzan un diámetro de
hasta 300 nm y muchos micrómetros de largo. Las fibrillas de colágeno a menudo se agregan en
grandes "fardos' llamados fibras, que tienen varios micrómetros de diámetro y son visibles al
microscopio óptico.
Los residuos de hidroxiprolina e hidroxilisina juegan roles importantes en la estructura
del colágeno. La hidroxilación de la prolina está relacionada con una estabilización de la triple hélice,
formando puentes de hidrógeno entre las cadenas. La hidroxilación de la usina está relacionada con la
formación de enlaces covalentes a glicósidos (lo que da al colágeno su carácter de glicoproteína) y con
el grado de entrecruzamiento de las moléculas de colágeno entre sí durante el proceso de agregación
en el espacio extracelular, cuando la fibrilla de colágeno se está formando.
El patrón de empaquetamiento de la molécula de colágeno en la fibrilla, ver figura 1.2,
(página 9) es escalonado. Las moléculas adyacentes están desplazadas longitudinalmente por casi un
cuarto de su largo (una distancia de 67 nm), permitiendo una separación entre una molécula y la
7
siguiente de 35 nm. El tamaño de la separación permite que el patrón se repita después que 5
moléculas se han alineado en forma escalonada. Presumiblemente este arreglo maximiza la resistencia a
la tracción del agregado y da lugar a las estrías visibles en las fibras teñidas negativamente en el
microscopio electrónico.
Los tejidos colagenosos vienen acompañados por proteoglicanos. Estudios realizados
mediante microscopía electrónica (Scott, 1980) han mostrado que los proteoglicanos están distribuidos
en la parte externa de las fibras de colágeno. La malla de filamentos de proteoglicanos consiste de
componentes horizontales y verticales. Los componentes horizontales están regularmente espaciados y
separados entre sí por una distancia repetitiva de 65 nm. La proporción de proteoglicanos es
dependiente del tipo de colágeno, siendo menos de un 1 % en peso en colágenos tipo 1 (Geofliey,
1976).
La gelatina es obtenida por descomposición alcalina, acídica o enzimática del colágeno.
De acuerdo con el método de obtención, es clasificada como tipo A, para aquella obtenida a través de
un proceso acídico, resultando un producto cuyo punto isoeléctrico fluctúa entre pH 7 y 9; la gelatina
obtenida mediante un proceso alcalino, es denominada tipo B y presenta un punto isoeléctrico
alrededor de pH 5.
Cuando el colágeno es calentado en solución acuosa, los cilindros de tropocolágeno
colapsan en cadenas individuales y su conformación llega a ser la misma que la que presenta la
gelatina en solución a temperaturas mayores que 40 °C (Harrington el al., 1970 a). La transición
hélice-cadena al azar puede ser entonces inducida calentando la solución de colágeno y detectada a
partir de los cambios en la rotación óptica a longitudes de onda en torno a los 250 nm (Djabourov y
A
Papon., 1983). Sin embargo, con el calentamiento permanecen las uniones covalentes entre cadenas
existentes antes de la desnaturalización.
La disminución de la temperatura favorece la renaturalización parcial de las triple
hélices, las que pueden ser nucleadas en puntos de unión de tres cadenas que estén formando parte de
diferentes regiones helicoidales. La gelificación se obtiene a partir de la interconexión de las cadenas,
generando una estructura tridimensional, tal como aparece visualizado de manera esquemática en la
figura 1.3. El incremento del contenido de hélice asociado al proceso de gelificación ha sido
demostrado a través de mediciones de rotación óptica y dicroísmo circular (Wustneck el al., 1988;
Djvaurov yPapon, 1983).
La gelatina forma geles termoreversibles típicos. Cuando una solución de gelatina de
concentración al 1% o mayor se lleva a temperaturas inferiores a 40°C, ocurre una transición sol-gel,
que comienza con un incremento progresivo de la viscosidad y la aparición de elasticidad. Si la
temperatura se eleva, el gel llega a ser líquido de nuevo. Este tipo de gel es frecuentemente llamado
gel fisico en contraste con los geles químicos, sistemas en los cuales se producen uniones de tipo
covalente entre distintas cadenas y que por lo tanto son completamente irreversibles (Djabourov el al.
1983).
El proceso de gelificación descrito recién presenta una cinética lenta, requiriéndose al
menos 24 horas para alcanzar una condición en que las propiedades se mantengan constantes en el
tiempo
En estudios realizados de manera cíclica se produce histéresis y sólo si la temperatura
de trabajo es superior a 40°C se borra completamente la historia previa de la muestra.

Configuración de hélice hacia la Izquierda 9
30A
Gty
^Hyp

—1
9A Figura 1.1
Tres hélices hacia la izquierda enrrolladas entre si con una torsión

hacia la derecha
100 A
molécula de colágeno
Figura 1.2
espaciado entre moléculas
Individuales
Patrón de empaquetamIento en la fibrilla de coigeno
Figura 1.3
Representación esquemática de la unión entre cadenas presentes

en un gel de gelatina
lo
1.3.- Modelo para el fenómeno de gelificación
Se ha propuesto un modelo para el proceso de gelificación (Djvaurov, 1991) que se
encuentra basado en el fenómeno de percolación.
Esta teoría analiza los efectos producidos al variar el número de interconexiones en un
sistema al azar. Una manera de visualizar el concepto involucrado es imaginar una red bidimensional
hecha de un enrejado de resistencias formando una red regular. El enrejado está conectado
externamente a una fuente de poder y a un amperímetro, que permite medir la intensidad de la corriente
eléctrica como se representa en la figura 1.4. Si se comienza a cortar aleatoriamente las uniones del
enrejado la corriente caerá progresivamente. Si se continúa cortando uniones, para una cierta
cantidad de uniones no cortadas, Pc, la corriente dejará de fluir. Para cualquier valor de P, menor que
Pc, la comente será cero.
El ejemplo de las resistencias permite hacer la analogía con un fluido pasando a través
de un enrejado de canales, algunos de los cuales han sido bloqueados (la palabra percolación ha sido
acuñada para este proceso). Además de las propiedades de transporte, que pueden ser ilustradas con
este modelo, se encuentra involucrado un aspecto mecánico: cortar las uniones también debilita la
fuerza mecánica de la red. Bajo Pc, la red se desintegra en pedazos desconectados.
En la figura 1.5 a y b, se muestra una simulación de percolación en una red cuadrada,
que puede considerarse como una analogía de la transición sol-gel. Todos los sitios ubicados en las
líneas de intersección están ocupados por moléculas capaces de reaccionar con su vecino más cercano
para formar enlaces químicos o fisicos. Las moléculas que han establecido uniones forman agregados.
Sea P la fracción de enlaces reaccionados. Cuando P es pequeño se forman agregados de tamaños
diferentes, pero finitos. Incrementando el número de enlaces reaccionados, los agregados crecen en
11
Figura 1.4
Modelo en el cual una red de reslstores cortados

aleatoriamente representa una transición de per-
colación.
Figura 1.5
Simulación del proceso de percolación mediante enlaces:

a.- bajo el umbral de percolación sólo se presentan agre-
gados de tamaño finito.
Simulación del proceso de percolación mediante enlaces:

b.-sobre el umbral de percolaclón se presenta un agregado
de tamaño Infinito que conecta los cuatro lados de la red.
12
tamaño y sobre un cierto umbral Pc, se forma un gran agregado (infinito), el cual se extiende a
través de toda la red.
Teniendo en cuenta lo anterior, la analogía entre una transición de percolación simulada
y un proceso de gelificación puede visualizarse de la siguiente manera: las partículas coloidales o
macromoléculas dispersadas en solución establecen un número creciente de uniones en el curso de una
reacción química o interacción fisica. Las partículas o macromoléculas se unen formando agregados.
En cierta etapa del proceso ocurriría un cambio dramático en la conectividad del sistema, el cual es
llamado el umbral de percolación o punto de gel.
1.4.-Antecedentes previos del comportamiento de la gelatina.
Entre las principales herramientas utilizadas para estudiar el fenómeno de gelificación
se encuentran las mediciones de rotación óptica. Los resultados a menudo han sido analizados
acoplando estos datos con otros provenientes de mediciones reológicas y de espectroscopia de RMN
de protones (Eagland el al, 1974).
En 1960, Flory y Weaber, examinaron los cambios de rotación óptica que ocurren en
soluciones de gelatina, enfriadas rápidamente en un intervalo de temperaturas entre 5 y 23 oc. Para ello
utilizaron soluciones de gelatina de concentraciones menores de 0,4 % en peso.
Los resultados obtenidos fueron comparados con la variación concomitante de las
viscosidades de las muestras. Se observó que los cambios en la viscosidad se produjeron mucho
después que los cambios en la rotación óptica y que la cantidad de reversión a colágeno nativo era
dependiente de la temperatura. Estos autores encontraron que se producía una mayor recuperación de
13
la estructura nativa cuando el proceso de gelificación se realizaba a temperaturas más bajas y que
los principales cambios en la rotación óptica ocurren durante las primeras 12 horas.
Segun los autores del trabajo, el tiempo de vida medio para que se produjese un
cambio conformacional en la gelatina era independiente de la concentración. Este hecho les llevó a
concluir que se trataba de un proceso de primer orden, lo que resulta sorprendente considerando que
se forman estructuras triple helicoidales.
Sumado a lo anterior, quedó en evidencia la dependencia altamente negativa de la
constante de velocidad de reversión con la temperatura; es decir, el hecho que los cambios en la
rotación óptica eran más lentos a medida que la temperatura de gelificación se acercaba a la
temperatura de transición cristalino-amorfo del colágeno.
Flory y Weaber propusieron un modelo para explicar la formación de la hélice, según el
cual la etapa determinante de la velocidad es la formación de segmentos helicoidales en aquellas partes
de la cadena de gelatina ricas en prolina. Supusieron que estos segmentos tenían una existencia
transiente y que eran capaces de transformarse rápidamente en hélices triples a través de reacciones
intermoleculares.
En un examen similar de los cambios conformacionales de la gelatina, Harrington y von
Hippel (1961) confirmaron que para bajas concentraciones de gelatina, se manifestaba una
independencia en los datos de rotación específica con la concentración.
En adición al rápido cambio en rotación óptica observaron sin embargo, un proceso de
lenta mutarotación que tarda días. De acuerdo con ello establecieron que aunque la velocidad de
reacción era de primer orden con respecto a la concentración de gelatina, era un proceso de segundo
orden en relación a los residuos de las cadenas que aún no habían sufrido el cambio conformacional.
14
En un intento de racionalizar estos resultados, Harrington y von l-Iippel (1961)
propusieron un mecanismo según el cual se produciría un cambio conformacional rápido inicial en
aquellos segmentos ricos en prolina, que sería seguido por un cambio más lento y más completo de las
cadenas individuales y finalmente la lenta asociación de las cadenas ordenadas para producir hélices
triple. De acuerdo a este modelo, la cinética de primer orden se explica suponiendo que los cambios
conformacionales son esencialmente unimoleculares y la formación de la hélice triple tomaría lugar por
una asociación lateral de hélices preformadas.
Los dos modelos antes expuestos permanecieron en debate durante años. Actualmente
se cree que es improbable que una única hélice tenga existencia separada. Cuando crece la
concentración, la asociación de hélices intermoleculares se hace más probable y el orden de reacción
con respecto a la concentración de gelatina es mayor.
El comportamiento cinético de segundo orden del fenómeno, visualizado en términos
de segmentos de cadena aún no transformados, puede más bien ser explicado en términos de procesos
de nucleación, crecimiento y reordenamiento. Estas tres etapas se encuentran subordinadas. Una
discusión detallada de estos mecanismos ha sido ofrecida por Harrington el al. (1970 a b). La
nucleación y el crecimiento corresponden al proceso de agregación y estructuración en hélice triple,
respectivamente. El proceso de reordenamiento es posterior y está relacionado con el reordenamiento
intermolecular entre cadenas que se encontraban muy distantes en el momento de la nucleación (Clark
etal., 1987).
El proceso de reordenamiento ocurriría bastante más tarde que la nucleación y el
crecimiento. Las tres etapas ocurren con constantes de velocidad que difieren marcadamente con la
temperatura. A bajas temperaturas de enfriamiento la nucleación es rápida, el crecimiento es lento y el

15
proceso de recocido ocurre muy lentamente. A temperaturas cercanas a la temperatura que
correspondería a la temperatura de geliflcación, el crecimiento es el proceso dominante y se obtienen
estructuras helicoidales más largas y más perfectas, pero no unidas entre sí.
Los autores plantean que las etapas tempranas de agregación de la gelatina
involucrarían cambios substanciales en la rotación óptica, pero poco cambio en la viscosidad; su vez
los últimos procesos tendrían poco efecto sobre la rotación óptica, pero producirían cambios
reológicos importantes.
li)jabourov y colaboradores (1983) han discutido los cambios en rotación óptica de
soluciones enfriadas de gelatina y han explicado los resultados usando una combinación del modelo
cinético de cristalización de Avrami (1940). Este tipo de interpretación es un intento de explicar los
cambios estructurales que tienen lugar durante la gelificación a partir de un ajuste empírico de la
fracción cristalizada en el tiempo. El modelo supone la existencia de sitios de cristalización en la fase
gel
El proceso ha sido identificado como aquel que corresponde a la cristalización del
polímero , que a tiempos prolongados estaría acoplado con procesos de cristalización más complejos.
Durand y colaboradores (1985) han examinado los tiempos de gelificación a la luz del
hecho que este parámetro es sensible a los cambios en concentración y temperatura identificando dos
tipos de comportamiento:
i.- a temperaturas de enfriamiento bajas, el tiempo de gelificación es corto y la sensibilidad a los
cambios de temperatura es baja.
Ú.-a temperatura mayores que 25 oc, los tiempos de gelificación son más prolongados y la sensibilidad
a los cambios de temperatura es mayor.

16
En relación con los cambios viscosimétricos, Yuan y Veis (1973) han señalado que
el proceso de renaturalización de gelatina que da lugar fundamentalmente a cambios en rotación óptica
es la nucleación. El proceso que da lugar tanto a cambios de rotación óptica como reológicos es el
crecimiento de hélices. El proceso que da lugar fundamentalmente a cambios viscosimétricos es el
reordenamiento. En este esquema la formación de triple hélices es vista como la fuente principal de
entrecruzamiento en la gelatina.
1.5.- Interacción polímero-detergentes.
La formación de complejos entre gelatina y detergentes aniónicos en solución acuosa
es un fenómeno conocido desde hace bastante tiempo.
En 1944 , Pankhurst y Smith observaron que en soluciones de gelatina, bajo el punto
isoeléctnco, la interacción detergente-macromolécula conduce a la formación de precipitados, mientras
que sobre el punto isoeléctrico, la viscosidad de dichas soluciones se ve incrementada al aumentar la
concentración de detergente.
Posteriormente, estos sistemas han sido estudiados por precipitación (Knox el al. 1965,
Tavernier, 1983), tensión superficial (Wustneck el al., 1983; Knox el al., 1970), mediciones de
viscosidad (Greener el al 1987), estudios que emplean electrodos selectivos de iones (Frhuner el al.,
1992), dispersión de neutrones a ángulo pequeño (SANS) (Cosgrove etal., 1995), dispersión de rayos
X (Pezron el al., 1991) y estudios relacionados con el espesor de películas de gelatina (Seeboth el
al., 1990).
Alrededor de pH neutro la gelatina es anfotérica y ciertos grupos tales como usina y
arginina que corresponden aproximadamente a un 7,5% del los residuos están positivamente cargados,
17
dando la posibilidad de asociación electrostática con los grupos sulfato de un detergente tal como
dodecilsulfato de sodio (SDS). Otros residuos tales como el ácido aspártico y glutámico, que
corresponden a un 11,8% de los aminoácidos tendrán carga negativa.
Algunos residuos son fuertemente hidrofóbicos. Entre ellos se encuentran leucina,
isoleucina, metionina y valina que corresponden aproximadamente a un 6,2 % del total. Resultados
provenientes de espectroscopía de RMN (Miller el al., 1994) sugieren fuertemente que estos grupos
podrían sostener una asociación hidrofóbica con la cadena hidrocarbonada del detergente.
En particular se destaca entre los estudios desarrollados el uso de electrodos selectivos
de iones. Los electrodos selectivos permiten una rápida determinación de la asociación detergente-
polímero. La respuesta del electrodo no se vería alterada por la presencia de la gelatina (Fruhner el al.,
1989). Ha sido posible determinar de una manera directa el grado de asociación de alquilsulfatos a
gelatina en solución. De acuerdo con los autores el grado de asociación de los alquilsulfatos aumenta
fuertemente con el incremento del largo de cadena del detergente.
En la literatura es común encontrar que se establecen relaciones cualitativas entre la
respuesta viscosimétrica y el grado de asociación entre detergentes y macromoléculas. En un estudio
realizado en seroalbúniina de bovino se pudo determinar que la adición de detergente puede inducir
cambios en la conducta viscosimétrica del sistema. La respuesta viscosimétrica no sólo depende de la
proporción en peso de ambos componentes, sino también se ve afectada por la presencia de sales
(Shinagawa etal., 1993). Sin embargo, según lo planteado por Fruhner se debe tener cuidado al hacer
comparaciones directas entre los resultados relativos a la asociación y los resultados viscosimétricos ya
que la relación podría ser circunstancial. En particular, estos autores trabajaron con dos gelatinas de
18
distinto punto isoeléctrico que presentan isotermas de asociación casi idénticas y encontraron
curvas de viscosidad diferentes.
Del conjunto de trabajos referidos anteriormente, emerge un consenso respecto al
fenómeno de interacción. Sobre una concentración crítica (Frhuner el al. 1992) que es
substancialmente más diluida que la CMC normal del detergente, ocurre un proceso de asociación
altamente cooperativo con la formación de complejos micelares entre el detergente y el polímero. Bajo
esta concentración, la asociación sería casi nula.
Para explicar el incremento substancial en la viscosidad a altas concentraciones de
detergente, se ha propuesto que existe entrecruzamiento fisico de la gelatina por las micelas. (ireener et
al. , (1987) han obtenido resultados para este tipo de sistemas a partir de mediciones realizadas a
41°C, es decir, en condiciones en que las macromoléculas se encontrarían aisladas. Los resultados
obtenidos sefialan que la viscosidad de la solución varía pasando a través de un máximo. Los autores
proponen un mecanismo de asociación micelar que involucra varias etapas. Una concentración umbral
de detergente marcaría el comienzo del cambio viscosimétrico, produciéndose un proceso que
denominan nucleación. A concentraciones intermedias, menores que la concentración correspondiente
al máximo en la viscosidad se estaría produciendo el crecimiento y a concentraciones superiores se
produce una etapa de colapso, seguido de un segundo régimen de crecimiento. La aparición de una
concentración umbral de detergente para promover los cambios viscosimétricos es visualizado como
un proceso cooperativo de formación micelar sobre el polímero, una vez que las micelas se forman. La
etapa de crecimiento estaría asociada al gran aumento de viscosidad y esto debería involucrar algún
tipo de asociación cooperativa de vanas moléculas de gelatina.

i
En la figura 1.6 se presentan esquemáticamente varios tipos de asociación posibles
detergente-proteína. De acuerdo con la figura, de haber formación micelar, las micelas pueden
asociarse con una molécula de gelatina o pueden asociarse a dos o más macromoléculas para formar
un gran complejo. Los autores señalan que el gran aumento en las propiedades reológicas del sistema,
no puede ser explicado en términos de cambios conformacionales en cadenas de gelatina aisladas. Más
bien debería involucrar algún tipo de asociación cooperativa entre varias cadenas conduciendo incluso
a un aumento aparente del peso molecular. Con ese argumento los autores postulan que se ve
favorecida una asociación con entrecruzamientos, representada por la figura 1.6 (d).
La estructura del complejo formado por la proteína y el tensoactivo parece ser muy
similar a aquella postulada para la formación de complejos entre polímeros neutros y detergentes
aniónicos tales como poli (óxido de etileno) (Cabane 1977, Cabane etal., 1982) o polivinilpirrolidona
(Zana, 1982; Abuin y Lissi, 1985).
Es notable el hecho que la gelatina no enlaza SDS en el mismo grado y extensión que
pueden hacerlo muchas otras proteínas. Al comparar la movilidad electroforética de la gelatina con
otras proteínas (Furthmayr el al., 1971), en electroforesis en geles de SDS-poliacrilamida, la gelatina
presenta una movilidad anormalmente baja para un peso molecular dado.
Entre otros métodos aplicados al estudio de la interacción gelatina-detergentes se
cuentan dicroísmo circular (Wustneck el al., 1988, 1989), espectroscopía de RMN (Miller el al.,
1994) y técnicas fotofisicas (Whitesides el al., 1994).
Un conjunto de estudios, siempre realizado en soluciones fluidas, pero que puede ser
asociado al proceso de gelificación es el realizado por Wustneck y colaboradores (1988, 1989). Estos
autores han empleado dicroísmo circular para mostrar que cuando se encuentra formando soluciones
20
Figura 1.6
Modos posibles de asociación detergente-proteína:

a. - asociación del detergente como monómero
b.- micela completamente rodeada por el polímero
c.- micela con cobertura parcial por el polímero
d.- asociación cooperativa del polímero sobre la micela
e. - asociación intramolecular del polímero sobre la micela
21
diluidas, la estructura secundaria y terciaria de la gelatina se ve modificada por la adición de
detergentes iónicos y no iónicos. Sus trabajos indican que la interacción entre detergentes catiónicos y
gelatina es débil, en comparación con sus homólogos aniónicos.
Whitesides y Miller (1994) estudiaron el fenómeno de interacción proteína SDS
utilizando técnicas fotofisicas y han establecido que la interacción involucra la formación de micelas
soportadas sobre el polímero. Estos autores han hecho estimaciones de los números de agregación de
las mácelas formadas sobre la proteína. Los números de agregación estimados son similares a aquellos
que se obtienen en ausencia de gelatina en las mismas condiciones. Las repulsiones electrostáticas entre
las micelas en1aza4a determinarían el curso de la micelización.
Sin embargo, la mayoría de los estudios mencionados han sido llevados a cabo bajo la
concentráçin crítica de gelificación o bien en condiciones de temperatura que garantizan que el gel no
se fçnrá; siendo así, proporcionan poca información en relación con el efecto del detergente sobre la
capacidad gelificante de la proteína.
Los estudios realizados en estado gelificado son muy escasos. Gautam y Schott (1994,
a) hiin determinado la rigidez y el punto de fusión de geles de gelatina conteniendo colorantes
sulfatados o carboxilados. Estqs aditivos disminuyen la rigidez y la temperatura de transición gel -
líquido de los geles y su efectividad en induçjr estos cambios está relacionada con el tamaño de su
porción hidrofóbica. La ascpación de los cpJfrantes es discutida en términos de la formación de pares
iónicos.
De acirdo con el trabajo desarrollado, la adición de detergentes aniónicos, conduciría
á 4 decrecimiento bn la estructura de hélice triple.

22
Por otra parte, se ha observado mediante el uso de rayos conoscópicos (Seeboth
1990), que en películas de gelatina se produce una disminución del orden en la estructura, promovida
por la presencia del detergente. Estos resultados sugieren que la capacidad de la gelatina de alcanzar el
estado gel se ve disminuida por la adición del detergente, interfiriendo en el proceso por asociación
detergente-gelatina, de modo que los detergentes aniónicos son a la vez más efectivos en disminuir el
contenido de hélice (Wustneck el al., 1980; 1988; Tavernier, 1983; Seeboth, 1990) y en asociarse más
fuertemente a la proteína que sus homólogos catiónicos (Fruhner el al., 1989).
1.6.- Colágeno en presencia de aditivos, antecedentes previos.
Blake-Haskins y colaboradores (1986) analizaron el proceso de hinchamiento de
películas de colágeno en presencia de detergentes aniónicos de distinto largo de cadena. Sus resultados
ilustran la utilidad del estudio del fenómeno de hinchamiento para obtener información sobre procesos
de asociación e interacciones específicas entre el detergente y la macromolécula. En particular
encontraron que el hinchamiento máximo se producía para un alquilsulfato de 12 átomos de carbono.
La formación de fibrillas es un proceso endotérmico que involucra interacciones
hidrofóbicas y electrostáticas entre moléculas adyacentes con liberación de agua estructurada (Cassel el
al., 1962).
El proceso de formación de fibrillas es promovido por agentes que incrementan el
desorden del agua "bulk", tales como el aumento en la temperatura de la solución o la adición de iones
desestructurantes del agua (Cooper, 1970). Por el contrario, la formación de fibrillas es retardada por
agentes que incrementan la estructuración del agua "bulk". Se sabe que la formación de fibrillas es
inhibida por moléculas con largas cadenas hidrocarbonadas.

23
Delorenzy y Gatti (1986, 1988, 1990) han publicado una serie de trabajos en los
que estudian la cinética de la fibrillogénesis del colágeno in vitro en presencia de SDS. Esos autores
trabajaron con colágeno obtenido a partir de tendones de cola de rata y encontraron que el SDS a
bajas concentraciones produce un decrecimiento en la velocidad de agregación lineal de la
fibrillogénesis
Los resultados obtenidos se atribuyeron a una posible interacción electrostática de la
parte polar del detergente con los residuos cargados de la molécula de colágeno, aunque no observaron
modificaciones en la etapa de agregación lateral. El efecto sobre el proceso de agregación fue
posteriormente estudiado para detergentes sulfónicos de distinto largo de cadena. En estos casos
encontraron que a baja temperatura se produce un decrecimiento en las velocidades iniciales de
generación de fibrilla, especialmente manifestado para los detergentes de cadena más larga. Los
resultados se explican suponiendo que la interacción hidrofóbica del colágeno con el detergente
modifica la carga neta sobre el polímero. A temperaturas más altas y siempre dependiendo del largo de
la cadena aiifatica encontraron que el proceso de formación de fibrillas se veía favorecido y discutieron
sus resultados en términos de una asociación del detergente que promovería las interacciones
responsables del crecimiento de la fibrilla.
En un trabajo posterior (1993), utilizando colágeno en estado nativo y colágeno
modificado (tratados con pepsina para hidrolizar el grupo de aminoácidos terminales no helicoidales)
discutieron el rol de los telopéptidos y de las interacciones hidrofóbicas en el proceso de fibrillogénesis.
Cifern y colaboradores (1965, 1967 a, b, 1970) realizaron una serie de interesantes
trabajos en relación con el efecto de aditivos sobre las propiedades estructurales de colágeno obtenido
a partir de tendones de cola de rata.

24
Los efectos analizados corresponden a interacciones de naturaleza hidrofóbica y
electrostática. Para ello estudiaron en primer término el rol de un grupo de alcoholes alifaticos sobre la
estabilidad de colágeno y tropocolágeno. En segundo término estudiaron las interacciones de carácter
electrostático que se producen cuando la proteína se encuentran en presencia de sales.
A través de un estudio del efecto de algunos aditivos sobre las temperaturas de
transición del colágeno desde la fase cristalina a la fase amorü, los autores encuentran que los agentes
"salting-in" aumentan el campo de estabilidad del colágeno en estado amorfo, en tanto que los "salting-
out" fundamentalmente hacen más estable al colágeno en estado cristalino. Los alcoholes alifTaticos en
tanto, a bajas concentraciones hacen más estable el colágeno amorfo y a concentraciones altas
estabilizan el colágeno cristalino. Determinaron además que ambos efectos son más relevantes a mayor
longitud de la cadena alif.tica.
Los alcoholes alifticos disminuyen la temperatura de contracción lineal, Te, con una
efectividad creciente en relación al largo de la cadena alifxica en la serie:
metanol< etanol <propanol.
Los resultados han sido interpretados en términos de dos efectos:
i) una fuerte asociación de las sales o de los alcoholes a sitios específicos a lo largo de la cadena
polimérica.
u) un efecto de dilución por parte del solvente, pudiendo haber pérdida de interacciones específicas
entre el polímero y el diluyente (efectos de agua estructurada).

25
Se debe tener en cuenta que el colágeno nativo también dispone de sitios donde
puede asociarse el detergente. Existe evidencia experimental de desorden conformacional a nivel de
telopéptidos, debido a la asociación de alquilsulfonatos, a concentraciones de detergente que no
producen ninguna modificación en la estructura de triple hélice (Delorenzy el al., 1993; Dombi y
1-laIsail, 1985) Un modelo para la autoagregación de colágeno in vitro (George el al. 1991) sugiere
que una ngidización conformacional inducida térmicamente, en secuencias particulares, es necesaria
antes de que comience la nucleación.
1.7.- Rol desnaturalizante de la urea
La urea es un aditivo frecuentemente empleado en estudios de desnaturalización de
proteínas. Este aditivo utilizado a altas concentraciones (2 - 8 M) induce la desnaturalización. Este
fenómeno se explica en términos de dos posibles procesos:
i) la urea actúa a través de un mecanismo indirecto, siendo un agente capaz de romper la
estructura del agua. Esta desestructuración del agua facilita la solvatación de las cadenas
hidrocarbonadas e impide la formación de enlaces de hidrógeno peptídicos que estabilizan la estructura
de la proteína, conduciendo de este modo a que la proteína se desnaturalice (Wetlaufer el al., 1964).
u) la urea reemplaza algunas moléculas de agua que solvatan regiones hidrofóbicas y porciones
no polares de las cadenas polipeptídicas (Enea el al., 1982), conduciendo a la pérdida de estabilidad
de la estructura proteica ya su desnaturalización (Nilsson eral., 1990).
Aún cuando en los años recientes se ha intentado mostrar pruebas en contra del
mecanismo indirecto (Das el al., 1993, Shosheva el al., 1993), este sigue siendo ampliamente aceptado.
Como se ha establecido previamente el mecanismo detallado a través del cual la

26
interacción SDS-proteína conduce a la desorganización de estructuras helicoidales es complejo y es
dependiente de las condiciones experimentales (Markus y Karush, 1957). Es interesante notar que
cuando se trata de proteínas no helicoidales o de proteínas con bajo contenido de estructuras
helicoidales, la acción desnaturalizante del SDS toma lugar precisamente induciendo la formación de
estructuras helicoidales (Jirgensons, 1967; Hunt y Jirgensons., 1973).
En algunos sistemas la adición de pequeñas cantidades de SDS ejerce una acción
protectora contra la desnaturalización inducida por urea (Moriyama etal., 1993).
Takeda y colaboradores (1987, 1988) han mostrado que en presencia de urea la
proteína seroalbúmina de bovino (BSA) pierde su estructura helicoidal, conservando sólo un 10% del
contenido helicoidal original. Cuando se encuentra en presencia de SDS el contenido de estructura
helicoidal de la proteína BSA disminuye un 50 %. Es decir, en ausencia del detergente la urea conduce
al sistema a una pérdida casi total de la estructura helicoidal en tanto que en presencia de SDS, pierde
la mitad de su estructuración. La adición de SDS sobre la solución ya desnaturalizada con urea
recupera el grado de hélice de la BSA permitiendo que ésta decrezca en el grado que correspondería a
al grado de hélice del sistema en presencia sólo del detergente.
En la acción desnaturalizante de la urea y el SDS los mecanismos involucrados son
diferentes, lo que implicaría que sus efectos combinados pueden ser sinérgicos o antagónicos y que su
acción conjunta puede quedar determinada por las características de la proteína. Dado que bajo adición
de SDS, aproximadamente la mitad de los residuos presentarían una tendencia a adoptar la estructura
helicoidal, los autores postulan que el fenómeno producido refleja una competencia entre la
desnaturalización inducida por urea y aquella producida por SDS.

27
L8.- Geles de gelatina en solvente orgánico
Los estudios relacionados con la formación de geles en microemulsiones de agua en
solvente orgánico han estado dirigidos precisamente a un tipo de sistemas que también involucra a la
gelatina.
Los sistemas considerados están constituidos por una microemulsión de agua y bis
[etil-hexil] sulfosuccinato de sodio (AOT) en n-heptano o isooctano como solvente. Cuando a esta
microemulsión se incorpora gelatina, se produce a bajas concentraciones del agente gelificante, una
solución fluida y sobre cierta concentración de gelatina, con un adecuado tratamiento previo, se
forman geles transparentes.
Haering y Luisi (1986, 1990) han desarrollado una serie de trabajos destinados a
caracterizar lo que ellos han denominado "geles basados en microernulsiones" u "organogeles".
Las técnicas de estudio utilizadas involucran: dicroísmo circular; espectroscopia de
RMN de protones; pseudo diagramas de fase expresados en términos de la concentración de gelatina
en función de la razón agua/AOT, difusión de luz, microscopia electrónica y calorimetría de barrido
diferencial (Quellet y Eicke., 1986; Rees el al., 1993 Haering y Luisi, 1986, Capitani etal., 1988).
De importancia relevante en la formulación de un modelo relativo a la formación del
gel han sido el uso de rotación óptica, los estudios conductimétricos y la utilización de dispersión de
neutrones de angulo pequeño.
De acuerdo con Quellet y Eicke (1986) a bajas concentraciones de gelatina, menores
que 2,5 % en peso, se estarían formando pequeñísimas gotas de gel o nanogeles, dispersas en el
solvente orgánico. En este intervalo de concentración de gelatina, no se produce ningún cambio

28
significativo en la conductividad medida. Este hecho estaría de acuerdo con una visión en que las
nanogotas son transportadores móviles de carga moviéndose en una dispersión fluida.
El umbral de percolación en el proceso de formación del gel es detectado
fundamentalmente por un gran salto en la conductividad del sistema, con una variación de cuatro
órdenes de magnitud en este parámetro en la región de la transición sol-gel. El cambio en la
conductividad que evidencia la percolación es acompañado por un brusco aumento en el contenido de
hélice de la red, producido en el proceso de renaturalización parcial a la que tiende la gelatina.
Un trabajo realizado por Atkinson y colaboradores (1989), en el que se utilizó
dispersión de neutrones de ángulo pequeño como herramienta de estudio, apoyada por mediciones de
conductividad eléctrica, proporcionó, la evidencia de que el contenido acuoso del gel consistiría de un
enrejado rígido de cilindros de gelatina, coexistiendo con gotas de microemulsión. En la figura 1.7 se
muestra una representación esquemática de dicho modelo.
De acuerdo al trabajo realizado por Quellet y Eicke (1986) el modelo propuesto sólo
sería válido en el intervalo de concentraciones donde el sistema se encuentra en el estado sol. Estos
autores han realizado mediciones de difusión de luz estática y han determinado a concentraciones de
gelatina menores que 1,5 % una distribución de tamaño de partículas con dos radios de giro diferentes,
las primeras de 20±2 nm que contendrían gelatina y las segundas de 12 ±lnm, que corresponderían a
nanogotas libres de gelatina. A medida que la concentración de gelatina aumenta el radio de giro de las
especies de mayor tamaño aumenta hasta 29 ±2nm, desapareciendo a esta concentración las nanogotas
más pequeñas libres de gelatina. En la literatura se encuentran descritos algunos pseudo diagramas de
fases para los organogeles de gelatina; el diagrama de fases más sencillo construido ha sido presentado
precisamente por Quellet y Eicke. En este diagrama, cuyo esquema corresponde a la figura 1.8 se
29
Figura 1.7
Nanogotas de agua
en solvente orgánico
dros interconectados
por triple hélices
Modelo Propuesto para los geles de gelatina en solvente organico

30
presentan las distintas formas de organización posibles que se producen al variar la temperatura y la
concentración de gelatina, para una razón agua IAOT (R) constante de 60.
En el sistema descrito se observan cuatro regiones principales. Las regiones 1 y II
corresponden claramente a un sol y a un gel en forma respectiva, separados por una región de
transición donde coexisten con el solvente agregados macroscópicos de gelatina. El área de este
dominio decrece con el incremento de la temperatura, en tanto que la concentración de gelatina a la
que se produce la transición es independiente de la temperatura. La región Hl es heterogénea, es decir
se presenta una separación de fase liquido-liquido, donde el polímero se encontraría preferencialmente
en la fase rica en agua. La región IV corresponde a un sol turbio, el cual es controlado por la
composición del sistema y por la temperatura.
La gelificación de las microemulsiones no toma lugar a cualquier concentración de
gelatina o agua (Haering y Luisi, 1986, 1990). A valores de R pequeños, es decir, de bajo contenido
acuoso, no es posible la formación de geles, probablemente debido a que las nanogotas formadas no
alcanzan a disolver suficiente gelatina para llegar a producir una estructura interconectada.
La concentración de AOT necesaria para que se produzca gelificación también debe
estar sobre cieno valor crítico; los autores no obtuvieron geles a concentraciones menores que 50 mM.
Una mayor concentración de detergente, para el mismo valor de R, aumenta el campo de estabilidad
del gel, llevando a menores concentraciones de gelatina la transición sol-gel y a mayores la transición
gel-dos fases.
Como puede observarse en la figura 1.9, la formación del gel como fase única es
también dependiente de R. En la medida que R disminuye la transición sol-gel y gel-dos fases, se ve
desplazada a concentraciones mayores de gelatina. Experimentalmente, se ha determinado que no es

31
Figura 1.8
)Vj
30
/l
ri
sol
Tr
29:3 1
l/jit$IILiik -I
1 2 3 4
%de Gelatina
Diagrama de fases del sistema gelatinalagualAOT/isooctano
R=(agu 3JAOT)=60
Las rejiones representan:
(1) sol transparente. (II) gel. (III) separacion de fase (fase gel
coexistiendo con fase fluida). (IV) sol turbio.
32
posible obtener un gel para valores de R menores que 20, independiente de la concentración de
detergente.
Si se calcula la solubilidad máxima de la gelatina en las micelas reversas de AOT
considerando que ésta se encontraría concentrada en el interior de la laguna acuosa, su valor
corresponde a un 62%.
Los geles obtenidos utilizando isooctano como solvente son insolubles en isooctano o
solventes hidrocarbonados similares.
De acuerdo con Luis¡ el al., (1990), el rol del solvente en el proceso de gelificación
estaría relacionado con el largo de la cadena hidrocarbonada. Un incremento en el largo de la cadena
hidrocarbonada del solvente, de hasta 8 átomos de carbono, induce un decrecimiento en la
concentración de gelatina necesaria para la formación del gel. Solventes cuyo largo de cadena
hidrocarbonada es superior a 8 átomos de carbono no muestran un efecto más pronunciado. Junto con
esto, mientras mayor es la fuerza de gel de la gelatina, es decir la ftterza que es necesario aplicar sobre
un gel para que éste se rompa, se requiere una menor cantidad de gelatina para llegar al estado
gelificado.
A través de espectroscopia de RMN de protones, Haering y Luis¡ (1986) han
determinado que el agua al interior de los organogeles presenta una movilidad restringida y más aun
esta movilidad decrece si se aumenta el contenido de gelatina.
Es necesario someter el sistema a fuerte agitación para que el gel se forme. Esto
último complica la descripción termodinámica del sistema (Haering y Luis¡, 1986).
El uso de otros detergentes en la preparación de las microemulsiones ha estado
limitado a detergentes del tipo alquil-sulfonato (Aikinson el al., 1995). Los resultados obtenidos
Figura 1.9 33
lv lv
66
1 \i
%G 50
40
20 40 20 40 R
A B
Regiones de estabilidad de los geles AOT/isooctano con:

A-lOOmM y B.-140 mM de AOT. Las cuatro regiones repre-
sentan diferentes estados: (l)solución micelar de gelatina.
(H)fase gel. (1l)separación de fases (fase gel fase fluida)
(FV)separacón de fase de gelatina sólida.
El porcentaje de gelatina está referido al agua.

R corresponde a la razón (agua/AOT).
34
sugieren que un parámetro importante para la formación del gel es que la temperatura superior de
la separación de fases de la microemulsión madre, debe ser cercana a la temperatura de la transición
cadena al azar- hélice de la gelatina ( es decir en torno a la temperatura de gelificación). La gelatina no
es soluble en otras microemulsiones detergente/solvente orgánico, aún a altos contenidos de agua. En
contraste, la gelatina es soluble en AOT y otros solventes tales como palmitato de isopropilo o
hexadecano, pero el valor máximo de R que se alcanza en la microemulsión es sólo 16 y no se llega a
formar un gel. En general, los alcanos con volúmenes moleculares mucho más grandes o más pequeños
que heptano no forman geles estables y dan lugar a la separación de fases. En este caso los autores
(Atkinson el al., 1995) aluden al mismo criterio utilizado para los detergentes que permitirían la
formación del gel.
L9.- Uso de técnicas fotofisicas en los estudios de interacción
El uso de técnicas basadas en el análisis del comportamiento fotofisico de sondas
extrínsecas es reciente y ha sido aplicado con éxito en una gran diversidad de sistemas entre los cuales
se incluyen las soluciones de detergentes y macromoléculas.
La fotofisica del pireno ha sido extensamente empleada para caracterizar
microdominios presentes en soluciones de polímeros (Zana y Binana-Limbele, 1990), micelas
(Kalyanasundaram y Thomas, 1977; Abuin el al., 1985; Lissi e! al., 1992) agregados formados por
35
condensación de detergentes sobre macromoléculas (Abuin el al., 1990; Zana et al., 1985), etc. En
el terreno de las transiciones sol-gel, Matsui y colaboradores (1991) han hecho uso del pireno como
sonda fluorescente para estudiar dichos procesos de transición en ortosilicatos.
El pireno es una sonda altamente hidrofóbica con baja solubilidad en agua ( 3x10 7 N)
espectro de fluorescencia del pireno a baja concentración en solución homogénea posee una definida
estructura fina. Las intensidades relativas de los picos correpondientes a las bandas vibracionales 1 y 3,
sufren perturbaciones significativas dependiendo de la polaridad del medio en que éste se encuentre.
(Dong y Winnik, 1982; Kalyanasundaram y Thomas, 1977), de modo que el pireno es un buen sensor
de polaridad ambiental. La razón de la intensidad de fluorescencia entre la primera y la tercera banda
vibracional, (11/13), en solventes hidrocarbonados es 0,6, en etanol su valor es de 1,1 y en agua vale
1,6. En presencia de micelas de SDS, el pireno es solubilizado en la región cercana a la interffise de las
micelas, obteniéndose un valor de ¡1/13 de 1,1. Teniendo en cuenta que la razón 11/13 de la
fluorescencia del pireno es dependiente de la polaridad del medio en que se encuentra, este parámetro
puede emplearse para investigar las interacciones polímero-detergente cuando se está frente a sistemas
acuosos microheterogéneos. A concentraciones de pireno más altas y dependiendo de las
características de hidrofobicidad del entorno, un microambiente determinado puede solubilizar más de
una molécula de pireno, conduciendo a la formación de un excímero con la aparición concomitante de
una banda ancha a 480 nm, que conlleva la disminución de la emisión del monómero.
El tiempo de vida de emisión fluorescente, determinado bajo nitrógeno también es
frecuentemente utilizado como una medida de la micropolaridad sentida por la sonda. Por ejemplo, el
tiempo de vida en solución acuosa es 130 ns, en tanto que en un solvente apolar, como por ejemplo
hexano, su valor es aproximadamente 1 5 ns (en presencia de aire).

36
Otro parámetro de la fotofisica del pireno que aporta información es la constante de
desactivación por oxígeno. Esta constante da cuenta de la accesibilidad que tiene la especie
desactivante a la sonda fluorescente, para llegar a desactivarla. El proceso de desactivación es
diÑsional de modo que la accesibilidad de la especie desactivante depende de la viscosidad del medio y
por lo tanto las constantes obtenidas podrían ofrecer una medida de la rigidez del microentorno.
Por último, también es interesante la información que proporciona el proceso de
desactivación de la sonda por acrilamida, ya que, siendo esta molécula soluble en el agua, es capaz de
desactivar únicamente la fluorescencia del pireno presente en el agua o expuesto a ella.
Thomas y Chu, (1986) han hecho uso del comportamiento fotofisico del pireno y
derivados en un estudio del efecto de detergentes catiónicos sobre la transición conformacional del
ácido poli(metacrilico). Zana y Binana-Limbele, (1990) han utilizado la fotofisica del pireno para
hacer un estudio conformacional de polielectrolitos y su co-micelización con detergentes. Turro el al.,
(1984) publicaron un trabajo clásico en relación con el uso de sondas fotoluminiscentes para la
investigación de interacciones entre SDS y polímeros solubles en agua. Encontraron resultados
análogos a aquellos obtenidos por métodos convencionales que condujeron a la conclusión que SDS
forma micelas asociadas a los polímeros.
El uso de técnicas fluorescentes ha sido también aplicado a una serie de derivados
hidrofóbicos del colágeno (Fonseca el a/., 1993) en un trabajo dirigido a estudiar sistemas que puedan
ser vehículos en procesos de liberación controlada de drogas. A través del desplazamiento del máximo
de emisión de ANS y de su polarización de fluorescencia, se ha estudiado la incorporación de lauril y
hexil derivados de colágeno en monocapas y bicapas lipídicas. El uso de las técnicas fluorescentes ha
permitido verificar la formación de algún tipo de agregados o micelas al interior de las bicapas.
37
En definitiva, los métodos basados en el uso de sondas fluorescentes se presentan
como una herramienta útil que permite deducir el sitio de solubilización de la sonda y puede ser
utilizado para adquirir información sobre su microentorno.
Se concluye, teniendo en cuenta los antecedentes expuestos en esta introducción en
relación con la proteína en estado cristalino y la proteína amorfa, que el conocimiento que se tiene de
estos sistemas en estado gelificado y su posible interacción con detergentes es escaso.
El objetivo del presente trabajo es contribuir al conocimiento básico del citado
fenómeno de interacción, tanto en condiciones fluidas como en estado gelilicado, con el propósito de
mejorar la comprensión de las relaciones existentes entre las propiedades macroscópicas y
microscópicas de los geles, a través de los aspectos que se enuncian a continuación.

38
OBJETIVOS
Los objetivos principales de este trabajo de tesis son los siguientes:
1. - Realizar un estudio comparativo de las interacciones que se producen entre detergentes jónicos de
distinta carga y una macromolécula que puede formar soluciones o alcanzar el estado geliñcado. Dicho
estudio será analizado desde el punto de vista de los efectos de las interacciones detergente-
macromolécula, sobre las propiedades microscópicas de sus soluciones o geles y su relación con
propiedades macroscópicas.
2.-Estudiar los efectos de un aditivo desnaturalizante sobre la formación de microdorninios en
soluciones del polímero que geliñca y el detergente.
3.- Desarrollar un estudio de la interacción entre un detergente y una macromolécula que presenta una
estructura cristalina, para contribuir a elucidar el rol que juegan las cargas fijas sobre el polímero y la
rigidez de la cadena polimérica sobre posibles procesos de asociación entre el detergente y el polímero
4.- Profundizar en el conocimiento de algunas propiedades fisico-químicas de sistemas que forman
geles en solvente orgánico, como es el caso correspondiente a ciertas mezclas
bis(etihexil)suWosuccinato de sodio, agua, gelatina e isooctano.
Para cumplir los objetivos propuestos se han considerado los siguientes sistemas:
i. - Detergentes iónicos del mismo largo de cadena, pero de diferente carga interactuando con geles de
gelatina en solvente acuoso o con colágeno en estado nativo.
¡¡.-Uso de la urea como aditivo en soluciones de gelatina en ausencia y presencia de un detergente
aniónico.
iii. - Geles de gelatina en solvente orgánico, en cuyo caso se empleará un detergente aniónico, bis
[etilhexil] sulfosuccinato de sodio, AOT.

39
Capitulo II.
PARTE EXPERIMENTAL
11.1.- Reactivos y Solventes.
Polímeros:
Gelatina 225 Bloom, Sigma, tipo B. Gelatina 300 bloom, Sigma tipo A, utilizados Sm posterior
purificación. Colágeno (tendones de cola de rata). (Cifeni et al. 1965). Cloruro de po1iniIo (PVC)
Sigma.
Detergentes:
Dodecilsulfato de sodio, (SDS), Fluka, Puriss. Bromuro de dodeciltrimetilamonio, (DTB), Sigma.
Bis (2-etilhexil) sulfosuccinato de sodio (AOT), Aldrich.
Solventes:
Tetrahidrofiirano (THF), Aldrich. Isooctano, Cloroformo, Metano¡, Tolueno, Merck pa.
Agua tritiada.
Sondas fluorescentes:
Pireno, Molecular Probes.
Sales:
Metilsulfato de sodio, sulfato de sodio, cloruro de sodio, Merck p.a.

40
[SIrI
Acrilamida (Sigma. Urea, (Merck p.a.) Ftalato de dibutilo, (Hopkins y Williams).
Azul de metileno, (Sigma). Centelleador, Omnifluor.
1L2.- Métodos
Los métodos experimentales, que se han utilizado serán descritos en los siguientes cuatro
apartados:
Parte A.- Métodos que dicen relación con el estudio de geles de gelatina y soluciones fluidas en
solvente acuoso, y su interacción con detergentes aniónicos y catiónicos.
Parte B.- Métodos utilizados en el estudio de la interacción gelatina-SDS en presencia de urea, en
solución fluida.
Parte C.- Métodos relativos a la asociación de SDS con colágeno
Parte D. - Métodos utilizados en la caracterización de geles de gelatina en solvente orgánico.

41
11.2.- Parte A
Métodos que dicen relación con el estudio de geles de gelatina y soluciones fluidas en solvente acuoso
y su interacción con detergentes aniónicos y catiónicos.
111.2.1.- Preparación de geles de gelatina en solvente acuoso
En la primera parte del tabajo se utilizó gelatina tipo B de 225 Bloom. Su punto
isoeléctrico es pH 5.
Las soluciones y geles de gelatina en solvente acuoso se prepararon disolviendo
cantidades exactas de gelatina y llevando a una temperatura de 50 °C por 10 minutos.
Las muestras permanecieron posteriormente en un baño termorregulado a 21 °C,
temperatura a la que fueron mantenidas durante 24 horas previo a su observación, sea que éstas hayan
formado geles o soluciones fluidas.
Dependiendo del estudio a realizar, las muestras se prepararon en presencia de aditivos,
tales como los detergentes SDS o DTB.
11.2.2.- Mediciones de Fluorescencia.
Los parámetros estudiados en esta sección del trabajo son los siguientes: tiempos de
vida de emisión, intensidad relativa de la fluorescencia a partir de la razón entre la primera y la tercera
banda vibrónica (1 1/13), intensidad de la emisión excimera y la desactivación por oxigeno de la
fluorescencia del pireno.
Se tomaron muestras (3 mL) de soluciones de gelatina preparadas de acuerdo a la
descripción dada en la sección 2.2.1 y se llevaron a una celda de fluorescencia. Se les añadió una
42
alicuota de 1 uL de solución de pireno (preparado en metanol), de modo que su concentración final
!i.iese de 7*1 O M. Las celdas fueron mantenidas a 21 oc por un período de un día. Luego se procedió
a determinar el espectro de fluorescencia del pireno en los geles y a registrar las intensidades de las
bandas 11, a (378 nm), 13, (389 nm), monoménca y excímera a 39748
y nm, respectivamente.
Con el objeto de evaluar las propiedades de los microdominios donde se encontraría
ubicado el pireno, se realizaron mediciones de los tiempos de vida de la fluorescencia del pireno en
estos geles, previamente saturados con oxígeno o con nitrógeno. Para realizar las mediciones en
condiciones de saturación de oxígeno o nitrógeno las soluciones a gelificar fueron llevadas a celdas de
fluorescencia de cuello largo, con tapas de goma., a través de la cual se insertó una jeringa conectada a
un balón con el gas correspondiente. Luego se procedió a purgar con el gas durante 10 minutos.
A la misma muestra que ha sido purgada con nitrógeno, gelificada y medido el tiempo
de vida de fluorescencia del pireno, se le repite el procedimiento purgando con oxígeno. Las
mediciones de fluorescencia se realizaron en un espectrofluorímetro Perkin Elmer LS5. Se midieron
tiempos de vida empleando un laser de nitrógeno LN 100 como fuente de luz y un fotomultiplicador
acoplado a un osciloscopio Tektronix 7633.
11.2.3.- Actividad de los iones de detergente al interior del gel.
Las actividades de los iones del detergente libre, es decir no asociado a la proteína,
(SDS y DTAB, respectivamente) se determinaron en esta etapa haciendo uso de electrodos selectivos
de iones.
Las actividades de los iones se midieron utilizando el montaje que se ilustra en la
figura 2.1.
Figura 2.1 43
La figura presenta el montaje utilizado para realizar las mediciones

de FEM al interior de los geles. Se ha marcado con un recuadro el
electrodo selectivo formado por: A)membrana selectiva.. B)solución
de referencia. C)puente salino, D) electrodo de referencia
E)corresponde a la muestra en análisis.
F)solución de KCI saturada.
44
En el esquema de la figura 2. 1, A corresponde a la membrana selectiva de iones.
Las membranas utilizadas en la construcción de los electrodos selectivos se prepararon
de acuerdo al siguiente procedimiento:
Membrana selectiva para SD:
Se preparó un complejo transportador a partir de la precipitación en solución acuosa de
cantidades equimolares de cloruro de dioctadecildimetilamonio (DODAC) y SDS. El complejo fue
recristalizado repetidas veces de acetona (Hayakawa y Kwak, 1982).
Se añadieron 0,6 g de PVC y 0,6 mg del complejo en 15 mL de TI-IF. Sobre la mezcla
anterior se añadieron 2,3 g de flalato de dibutilo que actúa como plastificante. Se calentó la mezcla
hasta los 64 °C, obteniéndose una solución clara y viscosa. Se evaporó el solvente hasta un volumen
de 6 mL aproximadamente y se dejó escurrir la solución sobre una cápsula de Petri de 10 cm de
diámetro. El THF es gradualmente evaporado al aire, obteniéndose una membrana flexible y
transparente.
Membrana selectiva para DTA:
La membrana selectiva para DTA, se preparó en forma análoga a la anterior. Sin
embargo, el complejo transportador se obtiene por precipitación en solución acuosa de cantidades
equimolares de DTAB y SDS. El complejo se lavó repetidas veces con agua y se recnstalizó de
acetona. Una mezcla de 0,35 g de PVC, 1,15 g de ifalato de dibutilo y 10 mg de complejo
transportador se disolvió en THF, de allí en adelante se siguió un procedimiento análogo al descrito en
la preparación de la membrana para SDS (Shirahama etal., 1981).

45
Se cortó un pedazo de la membrana respectiva para cada electrodo y se adhirió a un
tubo de vidrio mediante un trozo de "paraflm", como se observa en la figura 2.1; el tubo se llenó
entonces con una solución de referencia interna, cuya concentración era lxi O M en los iones que se
requería medir.
Para ambos electrodos las mediciones de fuerza electromotriz se realizaron mediante
un potenciómetro WTW pHlion meter PMX2000, utilizando como referencia electrodos de plata-
cloruro de plata saturado. Se utilizó un puente salino de nitrato de amonio.
11.2.4.- Fuerzas de gel.
Las fuerzas de gel se midieron utilizando un gelómetro modelo GT2 de Marine
Colloids, siguiendo un procedimiento similar al descrito en literatura (Rochas y Landry, 1988). Las
muestras de gelatina se prepararon en solución acuosa a una concentración de 2% p/v, en frascos de
boca ancha. Se determinó en cada caso la fuerza en gramos, aplicada sobre el gel para que éste se
rompiese. como se muestra en la figura 2.2.
11.2.5.- Viscosidades Relativas
Las viscosidades relativas se determinaron haciendo una razón entre el tiempo
requerido para que las soluciones escurriesen por un capilar bajo la fuerza gravitacional, en relación
con el tiempo de escurrimiento del solvente.

46
Figura 2.2
Ira Gelificada
Representación esquemática de un Gelómetro

47
11.2 Parte B.
Métodos utilizados en el estudio de la interacción gelatina-SDS en presencia de urea, en solución
fluida.
Las muestras se prepararon de acuerdo con el párrafo 11.2.1. En esta etapa del trabajo
se utilizó gelatina de 300 "Bloom", cuyo pH isoeléctrico es 9. Las mediciones fueron llevadas a cabo
en soluciones fluidas de gelatina conteniendo urea yio SDS a 20 T. El pH de las soluciones se
mantuvo entre 9,0 y 9,5.
11.2.6.- Desactivación de la fluorescencia del pireno en soluciones de gelatina.
En medio fluido se determinó la desactivación de la fluorescencia del pireno por
acnlamida, (AA).
En una celda de fluorescencia conteniendo 3 mL de solución fluida de gelatina con o
sin aditivos, se añadió 1 uL de una solución 2,1 mM de pireno en metano!. Luego de unos pocos
minutos de agitación suave se obtuvieron medidas estables de la fluorescencia del pireno. Los
experimentos de desactivación se realizaron añadiendo pequeñas alicuotas de una solución concentrada
de AA y midiendo la intensidad de fluorescencia correspondiente.
11.2.7.- Determinaciones de rotación óptica.
A partir de mediciones polarimétncas se evaluó la fracción de hélice de soluciones de
gelatina en presencia de SDS, urea y de ambos aditivos en forma simultánea, respectivamente.
Se realizaron mediciones de rotación óptica utilizando un espectro polarímetro Perkin-
Elmer modelo 241, empleando una celda de 10 cm de paso óptico.

48
La rotación específica de la muestra se determinó a través de la siguiente expresión:
faJ= (amas)*lOOec2j
* (C 1dm)
donde a, corresponde a la rotación óptica observada en la muestra, a es la rotación que presenta el
solvente y C es la concentración de la muestra en % p/v.
La fracción de hélice de la gelatina fue evaluada a partir de la rotación óptica de la
muestra medida a 546 nm. Como solvente de referencia se utilizó una solución acuosa al pH
correspondiente. En aquellos sistemas en que se trabajo con urea, el solvente de referencia fue una
solución acuosa de urea de la misma concentración de la muestra
Todas las mediciones se efectuaron 24 horas después de preparadas las muestras. La
temperatura se mantuvo constante 19±1 oc durante la medición.
11.2.8.- Viscosidades Relativas.
Las viscosidades de las soluciones se determinaron a una temperatura constante de 20
°C, midiendo el tiempo de escurrimiento en un viscosímetro tipo Ostwald. Para evaluar las
viscosidades relativas, se utilizó como sistema de referencia soluciones que sólo difieren por la
presencia de la proteína.
11.2.- Parte
Métodos relativos a la asociación de SDS con colágeno
11.2.9.- Obtención de tendones.
Los tendones de cola de rata fueron obtenidos a partir de animales de 4 meses,
proporcionados por el INTA, Universidad de Chile.
Los tendones se seleccionaron de acuerdo con un diámetro uniforme (aprox. 0,2 mm).
Se lavaron cuidadosamente con agua destilada y mantenidos a 4 °C por períodos no superiores a 10
días previo a su uso. Una porción del colágeno así obtenido se sometió a un posterior
entrecruzamiento. Esto fue llevado a cabo equilibrando los tendones en una solución de p-
benzoquinona 0,1%, por una hora a una temperatura de 20°C (Ciferri etal., 1965).
11.2.10.- Temperaturas de Transición Cristalino-Amorfo.
El colágeno así obtenido se sometió a tres tipos de estudio. El primer estudio, que se
describe a continuación, permitió evaluar las temperaturas de transición desde la fase cristalina a la fase
amorfa, en ausencia y presencia de aditivos. Esto, en términos prácticos, corresponde a determinar la
temperatura de contracción del polímero cristalino.
La variación del largo de cada tendón con la temperatura se siguió por inspección
visual en una escala graduada.
Los tendones hinchados en un exceso de solución, al interior de un tubo de ensayo, en
condiciones de pH regulado y a determinada concentración de aditivos, se mantuvieron en un baño a
temperatura controlada (± 0,1°C). En cada tubo se midieron los cambios de un sólo tendón. En el
50
extremo de cada tendón se amarró un pequeño peso, lo que permitió medir el largo del tendón
extendido. (Ver figura 2.3). En la regíon cercana a la temperatura de contracción, ésta fine
incrementada a una velocidad de 1 grado cada 20 minutos. El largo inicial de los tendones (Lo), se
determinó a 20°C, realizando las mediciones en las soluciones correspondientes.
Con el objeto de evaluar la temperatura de contracción (Te), se midió el largo (L) de
cada tendón a cada temperatura. La temperatura de contracción es aquella que corresponde al punto
medio de las pendientes límites de las porciones lineales a baja y alta temperatura, en una curva en la
que se representa L/Lo, versus temperatura.
Los aditivos utilizados corresponden a SDS, sulfato de sodio y metilsulfato de sodio.
Los pH de trabajo frieron 2,5 y 6,0. El pH 2,5 se eligió con el propósito de trabajar
bajo el pH isoeléctrico, de manera que el polímero se presente como un polielectrolito de carga neta
positiva; el pH 6.0, en cambio permitiría condiciones de trabajo isoeléctricas.
11.2.11.- Grado de Hinchamiento.
El segundo tipo de estudio al que fue sometido el colágeno cristalino corresponde a la
determinación del grado de hinchamiento que presenta a los dos distintos pH y en presencia de los
mismos aditivos.
Los tendones se equilibraron en un tubo de ensayo con un gran exceso de solución
acuosa conteniendo SDS o sal, ajustando al pH deseado (6,0 ó 2,5) con HCI o NaOH.
Una vez alcanzado el equilibrio con la solución se determinó el diámetro de los
tendones con la ayuda de un microscopio, con una precisión de ±20 um.

Figura 2.3 51
Montaje utilizado para la determinación de la temperatura

de encogimiento
52
El grado de hinchamiento (VIVd) se define como la razón del volumen del tendón
hinchado en solución salina o de SDS, al volumen del tendón cristalino seco. V/Vd fue calculado
haciendo el producto entre el área de la sección transversal (suponiéndolo circular) y el largo
correspondiente de cada tendón.
11.2.12.- Determinación de la asociación de SDS al colágeno
El tercer estudio que se realizó con el colágeno en estado cristalino y amorfo
corresponde a la determinación de la magnitud de la asociación de SDS al polímero.
La condición amorfa se obtuvo por un calentamiento previo de los tendones a 70 T.
Dado que la desnaturalización es un proceso irreversible, esto permitió que las mediciones pudieran ser
Nevadas a cabo a temperatura ambiente, lo que se realizó en cada caso (cristalino o amorfo) a pH 2,5 y
a pH 6,0.
Una masa medida de tendones secos se equilibró durante 20 minutos con una solución
de SDS de una concentración determinada. La concentración de detergente libre se evaluó tomando
alicuotas de la solución sobrenadante y formando un complejo en solución acuosa, entre SDS y azul
de metileno (Shirahama, 1974). Este complejo, de color azul, puede ser extraído cuantitativamente del
agua utilizando cloroformo. La absorbancia del complejo fue medida a 570 nm en un
espectrofotómetro Shimadzu UY- 160.

53
11.2.- Parte D.
Métodos utilizados en la caracterización de geles de gelatina en solvente orgánico.
11.2.13.- Preparación de organogeles.
Los geles de gelatina en solvente orgánico se prepararon añadiendo agua (del orden de
1 mL) a una cantidad determinada de gelatina, tal que la concentración final de la proteína en la
microemulsión fuese desde un 1% hasta un 5,5 % en peso. La mezcla así formada se mantuvo a 60 oc
hasta que se obtuvo una solución clara y viscosa, entonces se añadió isooctano conteniendo AOT. Las
muestras fueron llevadas nuevamente a 60 oc por 10 minutos y agitadas vigorosamente. Luego fueron
mantenidas a 20 oc, durante 24 horas como mínimo, previo a su observación. La razón molar final
agua/AOT varía entre 54 y 56.
11.2.14.- Construcción de Diagramas de fases.
El diagrama de fases para el sistema pseudo ternario (agua-AOT), isooctano y gelatina
fue construido por inspección visual. Para ello se utilizó el siguiente procedimiento: Sobre cantidades
previamente pesadas de gelatina, se añadió agua y se calentó a 60 °c hasta que se observó la formación
de una solución altamente viscosa. Luego se añadió una solución de AOT en isooctano, manteniendo
la temperatura a 60 °c y agitando fuertemente durante 10 minutos. Luego de agitadas las muestras se
llevaron rápidamente a 20 oc, en un baño termorregulado.

54
Las muestras se prepararon de tal manera que la razón [agua]/[AOT] se mantuviese
constante en un valor de 55,5 y estableciendo previamente las cantidades de agua y de solución de
AOT añadida de modo que la suma de los componentes agua + AOT, correspondiese al 10, 15, 20%,
etc., en peso.
Luego de transcurridas dos horas desde la preparación de cada muestra es posible
determinar si se ha producido la formación de una solución fluida o de un gel. Si la muestra se
presenta en estado sol se añaden cantidades crecientes de gelatina, hasta que se observa la formación
M gel. Se hace notar sin embargo que, tras cada adición del polímero es necesario repetir varias etapas
del procedimiento. Vale decir, calentar la muestra nuevamente, agitar en forma vigorosa y volver a
enfriar rápidamente a 20 T.
Una vez que se ha conseguido observar la formación del gel se sigue añadiendo
gelatina, hasta observar la separación de fases, lo que permite realizar estudios en la fase fluida
separada. Las observaciones experimentales fueron realizadas después de 24 horas de la preparación.
11.2.15.- Determinación de incorporación de alcoholes a organogeles mediante análisis
cromatográfico de la fase fluida.
Se preparó una serie de muestras con una concentración de gelatina superior a la
concentración crítica de separación de fases. Sobre estas muestras de iguales características iniciales se
añadieron respectivamente, alicuotas de 3 a 5 uL de alcoholes de distinto largo de cadena desde 1-
hexanol hasta 1-nonanol. Se sometió a cada sistema al procedimiento previo a la formación del gel (60
°C, agitación y enfriamiento rápido a 20 °C) y después de 48 horas se midió a través de cromatografia
gas-líquido el contenido de alcohol en la fase fluida.

55
El contenido de alcohol se determinó utilizando un cromatógrafo Perkin Elmer Sigma
313 con una columna S.E.54, semipolar a 100°C. Las señales se registraron mediante un integrador
Hewlett Packard HP 3395. Las calibraciones se realizaron inyectando soluciones de alcohol en
isooctano.
112.16.- Determinación del contenido de AØT en los organogeles, mediante
análisis espectrofotométnco UV-visible.
Las concentraciones de AOT presentes en la fase líquida separada (muestras
preparadas de acuerdo al párrafo anterior), se determinaron a partir de mediciones
espectrofotométricas UY-visible. Esto se llevó a cabo de acuerdo a un método similar al descrito en el
párrafo 2.2.9. para la determinación de SDS.
Se añadieron alícuotas de 50 uL de muestra sobre 1 ml- de solución acuosa
conteniendo azul de metileno. El complejo formado entre AOT-azul de metileno, fue extraído con
cloroformo y su concentración fue cuantificada a través de mediciones espectrofotométricas a una
longitud de onda de 650 nm (Shirahama, 1974).

11.2.17.- Determinación del contenido acuoso en los geles.
En aquellos organogeles preparados en condiciones tales que se produce una
separación de fases, se determinó el contenido de agua de la fase líquida separada. Las muestras se
prepararon con agua tntiada, de acuerdo con el procedimiento descrito en el párrafo 2.2.13.
Después de 48 horas de preparadas las muestras, se tomó una alicuota de 50 uL de
cada una de ellas y se añadió cada alícuota en viales que contenían 5 mL de tolueno además del
centelleador. Las muestra fueron llevadas a un detector de centelleo, modelo Packard 1600 TR para
determinación indirecta de la emisión B del tritio, utilizando "omnifluor" como centelleador.
Para probar la validez del método se determinó el contenido acuoso en una solución en
etanol de concentración conocida y la solubilidad del agua en octano¡. Este último estuvo de acuerdo a
datos obtenidos en la literatura.

57
CAPITULO III
RESULTADOS
Los resultados que se presentan a continuación corresponden a sistemas que
comprenden a soluciones y geles de gelatina tanto en ausencia como en presencia de detergentes, SDS
o DTAB. Los resultados dicen relación con la respuesta fotofisica del pireno en soluciones y geles de
gelatina, la respuesta viscosímetrica o de fuerzas de gel para las soluciones o geles, respectivamente y
el grado de asociación de los detergentes en el estado gelificado.
111.1.- Fotofísica del pireno en geles de gelatina
En la figura 3.1 se muestra el efecto de la adición de gelatina sobre la estructura
electrónica-vibracional del espectro de fluorescencia del pireno, en términos de la razón 1 1/13. Los
resultados fueron obtenidos tanto a contenidos de proteína inferiores como superiores a la
concentración crítica de gelificación que resultó ser de 0,8 % a 2 1°C.
En la figura 3.1 se incluyen datos obtenidos en solución a 50°C, lo que permitiría
establecer comparaciones sobre los cambios que se operarían en los microdominios, cuando la proteína
presenta algún grado de organización en relación con la conformación al azar que se presentaría a la
temperatura de 50 T.
Los datos obtenidos a 21°C muestran un progresivo decrecimiento en la razón 143
cuando incrementa la concentración de gelatina lo cual indicaría un desplazamiento del pireno a un
ambiente menos polar. El decrecimiento más notable se registra a concentraciones de gelatina menores
que un 0,5% en peso permaneciendo constante a concentraciones superiores. A 50 °C,

58
gue
1,5
1O
0.0 O 5 1 O 1.5 2.0 2.5 3.0
% de gelatina
Figura 3.1
Dependencia de la razón 11113 del espectro de fluorescencia

del pireno con la concentración de gelatina. Datos obtenidos
a: 21 0C • , 50°C 40
59
condición bajo la cual no ocurre la renaturalización parcial de la gelatina, se observa un decrecimiento
muy pequeño.
En la figura 3.2 se observa el efecto de la adición de gelatina sobre la razón de
intensidades de fluorescencia entre la banda excímera, medida a 480 nm y la monomérica, medida a
397 nm, en un intervalo de concentraciones de gelatina entre O y 3%. Se observa que la emisión
excímera aumenta con la concentración de gelatina, pero cuando la concentración de la proteína es
superior a un 2% la razón excímera/monomérica disminuye. La observación de los espectros
corespondientes indica que dicha disminución corresponde a un aumento de la emisión monomérica a
expensas de la disminución de la excimera.
Otro aspecto de la fotofisica del pireno que ha sido evaluado con el propósito de
caracterizar su microentorno, corresponde a las constantes de desactivación por oxígeno. Estas
constantes fueron evaluadas a través de la siguiente expresión:
1 1
- Kq><[02] ec.3.1
10
haciendo uso de los tiempos de vida de la fluorescencia del pireno bajo 02 y bajo N2, determinados
previamente.
Las constantes de desactivación así obtenidas se presentan en la Tabla 1, junto con
las concentraciones de gelatina correspondientes. Estos datos indican que a altas concentraciones
60
0 13 S
0,30
0,25
7C
Ui
0,15
1•
os
0,3 10 1,5 210 2,5 3,
Figura 3.2 % de Gelatina
Efecto de la adición de gelatina sobre la razón de intensidades

Excí meraJMonomérjca del espectro de fluorescencia del pireno.
61
Tabla 1
Tiempos de vida bajo nitrógeno y constantes de velocidad pseudounimolecular para la

desactivación por oxigeno de pireno excitado en soluciones de gelatina.
% de Gelatina Tiempos de Vida Kq * 10-6 (s 1 ) Kq * 10 (s1)

(ns)a21°C a21°C a50°C
0.0 200 2.50 3.0
0.3 183 3.10 3.7
0.8a 171 2.40 2.6
2.0a 162 1.05 3.9
( a ) en estado gelificado
rION
de gelatina, donde ocurre renaturalización parcial de la proteína, la velocidad de desactivación se ve
notablemente reducida.
III.lb.- Fotof'ísica del pireno en geles de gelatina:
Efecto de los detergentes.
La adición de DTAB, aún a concentraciones tan altas como 50 mM tiene un moderado
efecto sobre la razón 11/13. Esta razón cambia desde 1,24 en ausencia del detergente a 1,21 en presencia
de éste. Del mismo modo, el DTAB tiene un pequeño efecto sobre el tiempo de vida de la
fluorescencia del pireno bajo nitrógeno, con una variación desde 150 a 180 ns.
Por el contrario, la presencia de SDS produce cambios notables en estas propiedades,
aún a concentraciones de detergente libre muy por debajo de la CMC. En la figura 3.3 se muestra la
gran disminución alcanzada en la 1 1/1 3, desde concentraciones de SDS inferiores a 3 mM, es decir 2,5
veces menor que la CMC en agua. En la figura 3.4 (a) puede observarse el gran incremento alcanzado
en los tiempos de vida de la fluorescencia bajo N 2, promovido por la presencia del detergente.
La adición de detergentes también produce un cambio en la velocidad de acceso de las
moléculas de oxígeno a las moléculas de pireno excitado, como se observa en la figura 3.4 (b).
En el caso de DTAB, las constantes de velocidad de desactivación pseudo-
unimolecular por oxígeno del pireno excitado, a concentraciones sobre la CMC del detergente, que
corresponde a 14 mM, son muy cercanas a aquellas obtenidas en las micelas libres del detergente
(Abuin el al., 1985.). Se debe tener en cuenta sin embargo, que la adición de este detergente produce
un incremento significativo en la velocidad de desactivación aún por debajo de la CMC.

63
1,25
1,20
1115
1a1
laOS
SDS (mM)
Figura 3.3
Dependencia de la razón 11/13 deI espectro de fluorescencia

del pireno con la concentración de SDS en un gel al 2% de
gelatina.
64
350
e-
300
250
1)
200
15c
4 6 8 10
SDS (mM)
Figura 3.4a
Dependencia del tiempo de vida de la fluorescencia del pireno

(bajo N 2 ) con la concentración de SDS en geles al 2% de gela-
tina.
65
11
lo
O 13 20 30 40 50
Concentración de Detergente (mM)
Figura 3.4b
Efecto de la adición de detergente sobre la velocidad de

desactivación de la fluorescencia del pireno por 02 en
geles al 2% de gelatina.
66
La adición de SDS también produce un incremento progresivo en la velocidad de
desactivación por oxígeno. Sin embargo los valores obtenidos a altas concentraciones del tensioactivo,
cuya CMC en agua es 8 mM, nunca llegan a ser tan altos como aquellos valores informados para
micelas libres (Abuin el al., 1985).
111.2.- Actividad de los detergentes al interior del gel
En las figuras 3.5 a y b, se representan las actividades iónicas de los detergentes,
obtenidas empleando electrodos selectivos de iones.
En presencia de SDS en un gel al 2%, los valores de FEM medidos se encuentran
considerablemente desplazados de la curva de calibración. No obstante cuando el detergente en estudio
es DTAB, la curva de calibración es prácticamente coincidente con los resultados obtenidos en el gel.
Es decir, la actividad del detergente no revela una particular interacción con el gel.
En la figura 3.6 se presenta la isoterma de adsorción de SDS asociado versus SDS libre
en los geles de gelatina al 2%.
111.3.- Efecto de los detergentes sobre las fuerzas de gel
La fuerza de gel de gelatina al 2% de concentración se ve modificada por la presencia
de detergentes. El efecto producido por los detergentes, SDS o DTAB, es dependiente de su carga.
La adición de DTAB a concentraciones superiores a 25 mM produce un decrecimiento
monotónico moderado sobre la fuerza de gel de geles al 2%. Este último parámetro se encuentra
representado en la figura 3.7. Los geles formados, a pesar de presentar una fuerza muy reducida,
pueden formarse a concentraciones tan altas como 50 mM de DTAB.

67
46C
44C
42C
4CC
LL
38C
36C
34
320
- 0• -35 -313 -25 -20 -1 5 -3
Log [SDS]
Figura 3.5a
Dependencia de la FEM con el Log[SDS] en

( • ) solución acuosa
( • ) geles de gelatina al 2%.
68
S2
w
LL
52C
4C
-35 -30 -25 -20 -5 -10

Log[DTA B]
Figura 3.5b
Dependencia de la FEM con el Log[DTAB] en:

( • ) solución acuosa
( • ) geles de gelatina al 2%.
69
'4
1,0
o
(f)
im
0 1 4 0,G 0,8 1,0 112
[SOS] mM
Figura 3.6
Isoterma de adsorción de SDS sobre geles de gelatina al 2%.

70
32
30
28
26
o
24
U..
18
16
0 5 10 15 20 25 30
Concentración de DTAB
Figura 3.7
Dependencia de la fuerza de gel (en dinas/m 2 ) con la

concentración de DTAB para un gel al 2% de gelatina.
71
La adición de SDS a una razón (detergente /gelatina) pequeña, produce como se
observa en la figura 3.8 a, un incremento en la ftierza del gel. Este fenómeno se ve seguido, por un
fuerte decrecimiento cuando la razón SDS/gelatina es superior a 0,55 mM/g.
En esta etapa del trabajo se realizaron también algunos estudios viscosimétricos en
soluciones de gelatina al 0,7%. Es decir, cuyas concentraciones son muy cercanas al valor crítico de
gelificación (0,8%). Los resultados obtenidos indican que la adición de detergentes produce sobre las
viscosidades, efectos análogos a los observados sobre la fuerza de gel. La presencia de
concentraciones crecientes de DTAB indujo un decrecimiento en la viscosidad relativa. El efecto
producido por el SDS puede observarse en la figura 3.8 b, que representa la dependencia de la
viscosidad relativa de las soluciones con la razón SDS/gelatina.
Se corroboró experimentalmente que los efectos sobre la viscosidad y sobre las fuerzas
de gel son consecuencia de los detergentes y no corresponden a un simple efecto salino, ya que la
adición de concentraciones similares de bromuro de tetrametilamonio, sal del detergente catiónico, o de
sulfato de sodio, utilizada en lugar del detergente aniónico, produce sólo ligeras modificaciones en la
viscosidad de la solución.
72
60
40
a)
2)
'ro
20
lo
0,0 0.,1 02 03 0,4 0,5 0,6 0,7
SDS/Gelatina (mM/g)
Figura 3.8a
Dependencia de la fuerza de gel (en dinas/cm2)

con la razón de concentraciones SDSlgelatina.
73
4C0
300
200
100
O
0,0 0.,1 02 0,3 04 015 0,6 0,7
(SDS/ Gelatina) mM! g
Figura 3.8b
Dependencia de las viscosidades relativas de
soluciones de gelatina al 0,7 % con la razón
Detergente/gelatina.
74
111.4.- Efectos de la adición de urea a soluciones de gelatina:
En esta etapa del trabajo se presentan resultados relacionados con el estudio de
soluciones de gelatina, en ausencia y en presencia de urea como agente desnaturalizarite. Estos sistemas
permanecen en estado fluido, ya que han sido preparados a concentraciones que no conducen a
gelificación.
En la figura 3.9 se muestran resultados típicos obtenidos a partir de experimentos de
desactivación de la fluorescencia del pireno por acrilamida tanto en agua pura como en soluciones
fluidas de gelatina. Los resultados están representados de acuerdo a la ecuación de Stern-Volmer:
= ¡ + Ksv x [Ql ec.3.2
I e 1 son las intensidades de fluorescencia en ausencia y presencia de agente desactivante
respectivamente, K. es la constante de Stern-Volmer para el proceso y Q es la concentración de la
especie desactivante, que en este caso es acrilamida.
Como se observa, a diferencia de lo que ocurre en agua pura, los resultados de
desactivación obtenidos en la solución de gelatina en ausencia y presencia de urea, son curvados hacia
abajo.
Los datos han sido ajustados a una recta de acuerdo a la ecuación de Lehrer (1971),
que en términos del fenómeno fisico corresponde a utilizar un modelo de dos sitios para la posible
ubicación de la molécula de pireno. Esto equivale a decir que el pireno se encontraría repartido en, a lo
75
iw
0 5 10 15 20 25
[1A] m
Figura 3.9
Resultados obtenidos para la desactivación de la fluorescencia

del pireno por acrilamida, representado de acuerdo a la ecuación 3.2.
( • ) Desactivación en agua (o SDS 1 mM).

( ¿ ) Solución de gelatina al 0,5%
( 0) Solución de gelatina al 0,5%, urea 2M.
76
menos, un tipo de sitio altamente expuesto al agua y otro muy protegido de ella. La fracción de la
fluorescencia que toma lugar desde los sitios protegidos puede ser evaluada según la ecuación:
1
+ ec.3.3
(i-I) Fa (Fa * Kçi * [Q])
donde Fa es la fracción de la fluorescencia que se observa a partir de moléculas de pireno residentes en
el agua o en sitios altamente expuestos al agua.
Un ajuste de los resultados ofrece una respuesta satisfactoria para soluciones de
gelatina de concentraciones superiores al 0,5%. En la figura 3.10 se muestra un gráfico típico de los
resultados obtenidos, representados de acuerdo a la ecuación 3.3, para una solución de gelatina al
0,5%.
La adición de urea a la solución de gelatina al 0,5% conduce a un fuerte aumento en la
fracción de fluorescencia del pireno expuesto a la desactivación por AA, lo que puede observarse en la
misma figura.
El efecto que tiene la urea sobre la formación de los microdominios helicoidales en la
proteína puede ser confirmado a través de mediciones de rotación óptica llevadas a cabo a diferentes
concentraciones de urea.
La fracción de hélice en una muestra determinada, puede ser evaluada a través de la
siguiente expresión (Quellet y Eicke, 1986):

77
CD
.- 3
C)
o
O 100 200 300 400
1 /[AA]
Figura 3.10
Resultados obtenidos para la desactivación del pireno

por acrilamida, representados de acuerdo a la ecuación
3.3
• ) gelatina alo,5%
( O ) gelatina al 0,5%, urea 2M
( y ) gelatina al 0,5%, urea 2M, SDS lmM.
78
- (a Observado - a Desnaturalizado)
J h - ec.3.4
(a l ()0,/0 - a Desnaturalizado )
Donde [a ]corresponde a la rotación óptica específica de la muestra que fue medida a 546 nm, y los
subíndices se relacionan con el valor de [a] observado experimentalmente, aquel esperado para el
polímero completamente desnaturalizado cuyo valor de rotación específica es 120' (a 18 oc y 546
nm) y el valor de [a] 1 o,0 correspondiente al 100% de conformación helicoidal, esto es -465
El valor de a para la conformación 100 1/10 helicoidal fue tomado de la literatura para
colágeno nativo (Quellet, 1986). El valor para el polímero al azar fue determinado experimentalmente
desnaturalizando la proteína mediante una solución altamente concentrada de KSCN y el valor
obtenido está de acuerdo con datos de literatura (Djabourov, 1983).
En la figura 3.11 se presentan las fracciones de hélice obtenidos por este
procedimiento, graficadas en función de Fp, la fracción de fluorescencia del pireno protegida de la
desactivación por acrilamida, donde Fp = (1- Fa), mostrando una relación lineal.
Además de los efectos señalados en el párrafo anterior, en la figura 3.13 se muestran
resultados viseosimétricos que indican que la adición de urea produce una marcada disminución en la
viscosidad relativa de las soluciones de gelatina.

79
0,4
0,3
0,2
0,1
me
0,0 0,1 012 0,3 074
Figura 3.11
Fracción de hélice (fh) de soluciones de gelatina al 0,5%, versus

la fracción de fluorescencia del pireno protegida de la desactivación
por acnlamida (fr).
La fracción de hélice fue modificada por adición de distintas

concentraciones de urea.
(0) en ausencia de urea;
concentraciones de urea para los puntos del 1 al 6:
0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1 y 2 M, respectivamente.
80
1,
ir
- cI
I.
0,4
0,2
op 1,0 ,5 2,0
Concentración de aditivo
(urea M SDS mM)
Figura 3.12
Dependencia del logaritmo de la viscosidad relativa de

soluciones de gelatina al 0,7%, con la concentración de
aditivo en presencia de
) urea
• )SDS
( Á ) adición de SDS en presencia de urea IM.
81
111.5.- Efectos de la adición de SDS a soluciones de gelatina
Como se observa en la figura 3.9, la presencia de SDS 1 mM en solución acuosa no
modifica la desactivación de la fluorescencia del pireno por acrilamida. En cambio, cuando a una
solución de gelatina al 0,5% se le añade 1 mM de SDS la eficiencia de desactivación por acrilamida
decrece dramáticamente
Al comparar la rotación óptica de la proteína en presencia y en ausencia del detergente
a concentraciones menores que 2 mM, se encuentra que ésta prácticamente no se ve modificada. Esto
indica que el grado de triple hélice no es significativamente alterado por el SDS. Recién cuando la
concentración de SDS es superior a 2 mM los resultados indican un decrecimiento en el contenido de
hélice de la proteína, lo que se encuentra en buen acuerdo con datos previos (Wunstneck el al., 1988).
Por otra parte, el SDS tiene el efecto de incrementar notablemente la viscosidad de las
soluciones de gelatina en este intervalo de concentraciones, resultado que se encuentra representado en
la figura 3.12.
111.6.- Efectos de la adición simultánea de SDS y urea
a soluciones de gelatina
Los resultados de la figura 3.10 muestran que la presencia de urea 2 M, no es capaz de
alterar la incorporación casi total del pireno a microdominios altamente protegidos formados en la
presencia de 1 mM de SDS.
En la figura 3.12 se presentan los efectos separados y simultáneos de la adición de SDS
y urea sobre la fracción de hélice de soluciones de gelatina. Separadamente ambos aditivos contribuyen
82
0 40 -i
0,25
0,20
0,0 0,5 1)0 15 2,0
Concentración de aditivo M
Figura 3.13
Efecto de los aditivos sobre la fracción de hélice de soluciones

de gelatina.
( ) Adición de urea en ausencia de SOS
( • ) Adición de SDS en ausencia de urea • mM.
( A. ) Adición de SOS en presencia de urea IM.
83
a disminuir, aunque en distinta magnitud, el contenido helicoidal de la proteína. Sin embargo, la
presencia simultánea permite algún grado de recuperación del parámetro medido.
A partir de los resultados viscosimétricos de soluciones de gelatina, se observa un
efecto análogo al producido sobre la fracción de hélice. De la figura 3.12 se desprende que la adición
de SDS a una solución gelatina/urea, produce un incremento en la viscosidad de la solución. Los
valores de viscosidad relativa obtenidos en presencia simultánea de ambos aditivos son intermedios
entre los que se obtienen separadamente.
111.7.- Colágeno: Curvas de hinchamiento y de transición de fase.
La determinación de la temperatura de transición desde la fase cristalina a la fase
amorfa del colágeno fue realizada mediante representación gráfica del largo de los tendones en función
de la temperatura. La temperatura de contracción Te, corresponde al punto medio de la curva de
transición. Cuando desciende la temperatura sólo se obtiene una recuperación parcial del largo inicial
(fig. 3.14).
En la figura 3.15 (a, b y c) se presentan datos relativos a los cambios de volumen o
volumen de hinchamiento experimentados por el colágeno cristalino en presencia del detergente. El
volumen de hinchamiento corresponde a la razón entre el volumen medido bajo las condiciones
experimentales, sobre el volumen del tendón seco.
Tales cambios de volumen se pueden producir a temperaturas inferiores a la
correspondiente transición de fase; es decir, el colágeno a temperatura ambiente ya experimenta ciertos

84
u,
02
58 60 62 64 6€ 63 70 72
T, OC
Figura 3.14
Curvas que representan el largo versus temperatura de

tendones entrecruzados a pH 6,0 y concentración de SDS
indicada.
85
14
12
10
>
5 12 15 20 25 30
Concentración del aditivo. mM
Figura 3.15
Grado de hinchamiento para tendones entrecruzados versus

la concentración de ( u ) SDS, ( • ) metilsulfato de sodio.
Determinado a 44 o c y pH 6,0.
86
5
>
>
4
C
o 10 15 20
Figura 3.15b
Grado de hinchamiento para tendones entrecruzados versus la

concentración de ( a ) SDS, ( • ) metilsulfato de sodio.
Determinado a 25°C y pH 6,0.
87
3C
25
20
-u
>
1c
e 1 C 15 20 25 3C
Figura 3.15 c
Grado de hinchamiento para tendones entrecruzados versus

la concentración de ( a ) SDS, ( • ) metilsulfato de sodio.
Determinado a 25°C y pH 2,5.
88
cambios de volumen por la presencia del detergente. Las temperaturas seleccionadas para estudiar los
volúmenes de hinchamiento frieron 44 oc y 25 oc a pH 6,0 y 25 °c a pH 2,5.
Los aspectos más relevantes del conjunto de resultados son los siguientes:
i) Un gran incremento en el volumen de hinchamiento = V/Vd, de casi 7 veces , resultante de la
transición cristalino-amorfo, a 44 °c, pH 6,0 a una concentración de SDS de alrededor de 7 mM.
ji) Un gran incremento en V/Vd en agua pura, cuando el pH disminuye desde 6,0 a 2,5 (comparar
V/Vd = 1,75 en la figura 3.15b con V/Vd27 en la figura 3.] 5c)
iii) Un fuerte deshinchamiento promovido por el SDS a pH=2,5 y concentración de SDS inferiores y
cercanas a 2 mM.
Los resultados permiten comparar el efecto del pH, en ausencia de aditivos, sobre el
volumen de hinchamiento. Por ejemplo a pH 2,5 se alcanza un gran volumen que corresponde a un
incremente de alrededor de 13 veces en el área transversal, acompañado de una reducción en el largo
de sólo un 10%. En cambio a pH 6,0 los incrementos de volumen van acompañados por una
disminución en el largo de los tendones.
En la figura 3.16 se presentan los diagramas de pseudo fase para la transición que
experimenta el colágeno desde la fase cristalina a la fase amorfa a pH 6,0. Estos diagramas han sido
construidos graficando las temperaturas de transición de fase a cada concentración de aditivo.

89
ílle
80
c
o 70
>
60
.2
50
40
o
30
20
lo
o
30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
T,
Figura 3.16
Variación de las temperaturas de contracción de colágeno cristalino

(tendones), con la concentración de SDS, metilsulfato de sodio o sulfato
de sodio a pH 6,0.
( a Tendones no entrecruzados en SOS
( • ) Tendones entrecruzados en SOS
( ) Tendones entrecruzados en metilsulfato de sodio
y ) Tendones entrecruzados en sulfato de sodio.
En este diagrama se han incluido también los resultados correspondientes a la sal del detergente,
metilsulfato de sodio y la sal sulfato de sodio cuyo efecto es conocido de la literatura.
Como se observa en la figura 3.16 a pH 6,0, tanto los tendones entrecruzados como
los no entrecruzados ven continuamente disminuida la Te, cuando se incrementa la concentración del
detergente. Los tendones que han sido entrecruzados exhiben una Te mayor. Por ejemplo, para una
concentración de SDS de 10 mM, se observa que la Te es alrededor de 35 °C para tendones no
entrecruzados, en cambio es superior a 40 °C si se trata de tendones entrecruzados.
La depresión debida al metilsulfato de sodio es bastante más pequeña que la promovida
por SDS. Ambos, el detergente y la sal correspondiente aumentan el campo de estabilidad de la fase
amorfa. La adición del sulfato de sodio produce un efecto predominantemente del tipo "salting out", tal
como se esperaría para el ion sodio y los iones sulfato en la serie de Hofineinster (Puett y Rajagh,
1968)
Como se observa en la figura 3.17 a pH 2,5, en ausencia de aditivos la Te corresponde
a 45 °C, en tanto que a pH 6,0 (figura 3.16) dicha temperatura es de 68 °C. Es decir 23 grados más
que la temperatura de contracción lineal observada a pH 2,5 para tendones entrecruzados.
Una diferencia notable entre las curvas a ambos pH es que, a pH 2,5, la Te es primero
ligeramente incrementada a medida que aumenta la concentración de detergente y luego disminuida. Se
observa por ejemplo, que a una concentración 8 mM de SDS la Te es sólo 5 grados inferior al valor
correspondiente en ausencia de aditivos, en cambio a pH 6,0 la Te se ve sistemáticamente disminuida.

15
E
o
>
0 10
a,
c
a)
o
o
o
38 40 42 44 4b 4t5 DU
30 32 34 36
T, o
Figura 3.17
Variación de las temperaturas de contracción para tendones

entrecruzados a pH 2,5 en presencia de:
( • ) SOS, o ( • ) metilsulfato de sodio.
La línea discontinua corresponde a la CMC del SOS en agua.
92
111.8.- Cuantificación de la asociación del SDS al colágeno
La disminución en la temperatura de transición estaría relacionada con los datos de
asociación presentados en las figuras 3.18 a y b. La constante de asociación se expresa como:
(y
K= ( V) ec.3.5
donde y es el número promedio de SDS enlazado por mol de proteína y n es el número de sitios totales
de enlace. Es posible calcular K y n, a partir de gráficos de v/Csl)s versus. y.
Los resultados obtenidos a pH 6,0 y 70 oc representados en términos de la ecuación
3.1 no producen lineas rectas satisfactorias. Analizando los resultados obtenidos a pH 2,5 en términos
de la ecuación 3. 1, se obtienen líneas rectas con valores de K aproximados de 1500 M' y n
correspondiente a un sitio cada diez residuos.
En la figura 3.18 a y b, se presentan los resultados correspondientes a las isotermas de
adsorción del detergente al colágeno tanto a pH 6,0 como a 2.5. Se observa que únicamente para el
colágeno desnaturalizado a pH 6,0 el fenómeno de asociación presenta cooperatividad. En tanto que a
pH 2,5 se alcanza cierta saturación tanto para el colágeno desnaturalizado como para el que no lo está.
El gráfico de Langrnuir de los datos a pH 2,5 y 20 °C, produce una línea recta
satisfactoria (ver figura 3.19) y puede analizarse en términos de 0, la fracción adsorbida a saturación:
93
C)
TI-
O 20 40 60 80
[Sos] lib.
re
10
Figura 3.18a
Isotermas de adsorción, SDS (mM/(g de gelatina)) adsorbidos

versus [SDS] libre, a pH 6,0, para tendones en el estado:
( o ) nativo, ( • ) desnaturalizado.
94
Ir
o
C) io 20 30 40
[SDS] libre * 10-4 M
Figura 3.18b
Isotermas de adsorción, SDS (mM/(g de gelatina)) adsorbidos

versus [SDS] libre, a pH 2,5 para tendones en el estado:
( • ) nativo, ( • ) desnaturalizado.
95
Figura 3.19
700C
6000
5000
• 4000
(1)
o
CO
3000
2000
1000
o 2000 4000 6000 5000 10000

([SDS] Ubre)
En la figura se representa el inverso de SDS adsorbido sobre el colágeno versus

el inverso de SDS libre. Del intercepto se puede determinar la concentración de
SDS adsorbido a saturación.
(KxOXCSDS.-1)
1+-
[o—KxwxCsDs ) 2 + 4XKXCflÇ
ec.3.6
2
donde co es el parámetro de cooperatividad y K es la constante de equilibrio intrínseca. Kco representa
la constante de equilibrio para la asociación a un sitio adyacente a uno ya ocupado. Para la
concentración C SDS en el punto medio donde P =0,5 se cumple que:
CSDS = ec.3. 7
(Kxo)
Ci)
ec. 3.8
8 Ifl(CsDS) 4
En la figura 3.20, se representa 0 = ( ads./ads. a saturación) en función del logaritmo de
la concentración de SDS libre.

97
1,0
u
1
U) 0,6
U)
u
'u
0,2
-42 -40 -3 -3 -34 -32 -3,0 -2,8 -2,6
Log[SDS] libre
Figura 3.20
0
En la figura se representa versus el Logaritmo de la concentración de
SOS libre, lo que permite evaluar el parámetro de cooperatividad «
98
Un ajuste del gráfico de 0 versus el log de la concentración de SDS libre proporciona
un valor de K aproximado de 1800 M'. El valor de w es aproximadamente 1 para las isotermas a pH
2,5
111.9.- Diagrama de fases de geles en solvente orgánico:
En la figura 3.21 se presenta el diagrama de fases correspondiente al sistema pseudo
ternario: agua/AOT, isooctano, gelatina.
Se considera que se ha producido la transición sol-gel cuando la muestra no fluye bajo
la fuerza gravitacional al invertir el tubo que la contiene.
La transición desde el estado gel hasta la situación en que se producen dos fases se
manifiesta simultáneamente por la aparición de una fase fluida sobre la fase gel y porque el propio
estado gel deja de ser transparente y presenta la turbidez propia de un sistema de dos fases. No se
determinó la fuerza de gel de los geles obtenidos. Sin embargo, se observó de manera cualitativa que la
fase gel de los sistemas separados en dos fases son más rígidos que los geles que se obtienen formando
una sola fase.
Para llegar a obtener el diagrama señalado fue necesario preparar alrededor de 60
muestras.
Se prepararon algunos sistemas en composiciones tales que se esperaba una separación
de fases. Por ejemplo para R=55,5, AOT 0,1 M, una concentración de gelatina superior a 3,7%
conduce a la formación de dos fases; una fase gel, no completamente transparente y una solución
fluida. Cuando el sistema se encuentra en estas condiciones, presenta complejidades adicionales,
fundamentalmente en lo que respecta a reproducibilidad. En particular, muestras preparadas por
triplicado rara vez presentan el mismo volumen de fase fluida separada. Esto sucede cada vez que se
99
Figura 3.21
%AGUAt AOT
GEL
SOL
2 FASES
lo o
1
xl ..00CTANO 10 20 %GELATINA
Región estudiada del diagrama de fases pseudoternario: isooctano,

gelatina y (Agua + AOT), a una razón (Agua] AOT) constante.
o ) n-butanol
. ) n-octanol
loo
produce separación de fases y a pesar de las precauciones tomadas en relación con i) el tiempo de
agitación, u) el control de la temperatura máxima de trabajo, iii) el tiempo de espera para realizar las
mediciones (48 hrs.) y iv) en particular con la velocidad de enfriamiento. Para tener el control de
este conjunto de variables, todas las muestras fueron sometidas al mismo procedimiento de
calentamiento y agitación. Inmediatamente después del tratamiento se llevaron a la temperatura de
trabajo de 20 °C.
Dado el valor de R considerado no es posible prolongar el diagrama de fases a
concentraciones del componente acuoso (agua +AOT) menores que un 10%, puesto que permanece
como una fase más la gelatina sólida. A altas concentraciones del componente acuoso el contenido de
gelatina en el sistema puede llegar a duplicarse (de 5 a 10%), sin que el sistema separe fases.
Es notable también el hecho que la concentración de gelatina mínima para que se
produzca la transición sol-gel es sólo ligeramente modificada por el cambio en la concentración de los
otros componentes.
A pesar del inconveniente que significó que las muestras no fuesen completamente
reproducibles, se midió el contenido de AOT presente en la fase fluida de las muestras preparadas, a
través de determinaciones espectrofotométricas. Los resultados obtenidos señalan que la concentración
de AOT en la fase fluida es inferior a 5*10-3 M. El contenido de agua presente en esta fase tampoco es
reproducible. Las muestras presentan concentraciones de agua en la fase fluida que fluctúan entre 0,03
y 0,3 M Es interesante notar que aquellas muestras cuyo volumen de fase fluida separada es menor,
presentan tanto un mayor contenido de AOT, como también un mayor contenido acuoso.
En la figura 3.21 se pueden observar las modificaciones que sufre el diagrama cuando
las muestras son preparadas en presencia de una concentración constante de alcohol. Los alcoholes
101
considerados en la construcción del diagrama de fases son n-butanol y n-octanol. La concentración de
alcohol en las muestras es 10 mM.
Como se observa en dicho diagrama, la transición sol-gel no se ve alterada por la
presencia de alcoholes. El efecto más importante de la presencia de los alcoholes se manifiesta en el
desplazamiento de la línea de transición entre el gel y el sistema que separa en dos fases, siendo más
notorio el efecto para el alcohol de cadena más larga.
En aquellas muestras que fueron preparadas en presencia de un alcohol específico y
que separan en dos fases, se determinó cromatográficamente el contenido del alcohol respectivo en la
fase fluida. Los alcoholes considerados en el estudio de incorporación al gel van desde 1 -hexanol hasta
1-nonanol. En la tabla II se resumen un conjunto de resultados que expresan el alcohol total y el
alcohol incorporado al interior de los geles. El contenido de alcohol al interior del gel es
aproximadamente un 30 a un 50 % del alcohol total; sin embargo, estos resultados son escasamente
reproducibles. Incluso la misma muestra, sometida al procedimiento de calentar, agitar y enfriar
rápidamente, presenta respuestas distintas.

102
Tabla II
Incorporación de alcoholes en la interfase agua/AOT al interior de los organogeles.
Hexanol (mM) Incorporado (mM)

1.6 0.5
4.0 1.9
8.0 5.6
Heptanol (mM)
1.4 0.4
3.5 1.1
7.0 3.4
Octanol (mM)
1.3 0,3
3.1 0.7
6.4 2.4
Nonanol ( mM)
1.1 0.2
2.9 0.8
5.8 1.4
103
Capitulo IV
DISCUSION
Con el propósito de ofrecer un análisis claro de los resultados obtenidos, este capítulo
será enfocado separando los sistemas en discusión de una manera análoga a la presentación de dichos
resultados analizando : i) el efecto de detergentes adicionados a geles de gelatina al 2% y
complementado tal análisis a la luz de algunas propiedades micro y macroscópicas en soluciones de
gelatina cercanas a la concentración crítica de gelificación (0,7%), u) soluciones más diluidas del
polímero (0,5%) en ausencia y presencia de agentes tales como SDS y urea, iii) la interacción entre el
polímero rígido, colágeno, con SDS y iv) el sistema correspondiente a geles de gelatina basados en
microemulsiones.
[V. 1.- Formación de microdominios en geles de gelatina.
Un análisis de la disminución en la razón 11/13 de la fluorescencia del pireno
incorporado a los geles de gelatina, representado en la figura 3.1 indicaría que con el incremento de la
concentración de gelatina el pireno es desplazado a microambientes cada vez menos polares. Estos
datos pueden ser interpretados en términos de incorporación parcial o total (a altas concentraciones de
gelatina), de moléculas de pireno en microdominios relativamente hidrofóbicos. Lo anterior sería
corroborado con el ligero decrecimiento en la razón 11113 observado a 50 °C, condiciones bajo las
cuales las cadenas de la macromolécula se encontrarían aisladas, con un escasa probabilidad de formar
estructuras helicoidales triples.
La incorporación de las moléculas de pireno en microdominios de mayor
hidrofobicidad estaría también de acuerdo con los datos mostrados en la figura 3.2. El notable
104
incremento de la emisión excímera producida por adición de gelatina estaría indicando que el pireno se
encuentra concentrado en un reducido número de microdominios.
El descenso en la razón excímera/monomérica observado a concentraciones de
gelatina superiores al 2% estaría también de acuerdo con esta interpretación, ya que en tales
condiciones de concentración, al interior del gel se dispondría de un mayor número de sitios
hidrofóbicos capaces de solubilizar la sonda, permitiendo que ésta se distribuya, disminuyendo así la
formación de excímeras. Esto contribuiría a desplazar alguna proporción de la componente excimera
hacia la monoménca, disminuyendo con ello la razón E/M.
Las propiedades de los microdominios que se estarían formando al interior del gel,
pudieron ser visualizadas evaluando la velocidad de desactivación por oxígeno de la fluorescencia del
pireno
Como se observa en la tabla 1, a concentraciones de 2% de gelatina se obtiene un
valor más bajo de constante de velocidad de desactivación, lo que es compatible con un aumento en la
rigidez del microdominio donde se habría incorporado el pireno.
IV.2.- Efecto de la adición de detergentes sobre los microdominios formados en los geles
El efecto de los tensoactivos utilizados, DTAB o SDS, sobre la constante de velocidad
de desactivación por oxígeno en los geles de gelatina, debe ser analizado en forma separada debido a
que los resultados obtenidos responden de manera diferente a la carga sobre el detergente.
A concentraciones de DTAB superiores a la CMC la velocidad de desactivación
pseudo unimolecular de pireno excitado por oxígeno es muy cercana a las velocidades determinadas
105
para micelas de este detergente en agua pura, lo que indicaría que el pireno se desplaza desde la
gelatina hacia agregados micelares.
El incremento progresivo en la velocidad de desactivación por oxígeno, producido por
la adición de SDS a los geles al 2% de gelatina, como se observa en la figura 3.4b, es compatible con
una fluidización de los microdominios. Los valores obtenidos para las constantes de desactivación son,
en este caso, intermedios entre aquellos observados en las micelas de SDS en agua pura y micelas
soportadas sobre PVP (Abuin el al., 1985).
En relación con parámetros fotofisicos sensores de polaridad, tal como el tiempo de
vida de la fluorescencia del pireno bajo nitrógeno, se encuentra que la adición de DTAB produce un
pequeño incremento sobre este parámetro. A altas concentraciones de DTAB los valores son cercanos
a los que presentan las soluciones micelares de este detergente en agua pura, de manera que la
información entregada por esta propiedad parecería indicar que no existen cambios en los
microdominios de gelatina promovidos por el detergente. De manera diferente, el SDS induce cambios
notables sobre el tiempo de vida bajo nitrógeno y sobre la estructura electrónico vibracional del pireno
(ver figuras 3.3 y 3.4a), lo que indicaría que el pireno está siendo localizado en microdominios de
polaridad decreciente. Los valores obtenidos a altas concentraciones de detergente son muy cercanos a
aquellos publicados en la literatura para micelas de SDS tanto en agua pura como soportados sobre
polímeros no cargados. En definitiva, los resultados estarían señalando que cuando los geles están en
presencia de SDS, el pireno se encontraría incorporado en microdominios menos polares y más fluidos
que en ausencia de este detergente.

106
IV.3.- Asociación de detergentes con gelatina
De acuerdo con antecedentes de literatura los resultados obtenidos a partir de estudios
realizados en soluciones diluidas de gelatina, indican que los detergentes aniónicos presentarían una
asociación a las proteínas más fuerte que aquella que presentan los detergentes catiónicos del mismo
largo de cadena (Fruhner y Kretzschmar, 1989; Tavemier, 1983).
La naturaleza fuertemente electrostática de la interacción se ha visto también
manifestada en procesos de asociación con moléculas pequeñas, sin embargo, el aporte hidrofóbico al
proceso se hace presente en el hecho que la asociación de colorantes aniónicos a la proteína crece con
el crecimiento del largo o el tamaño de su parte hidrofóbica (Gautam y Schott, 1994).
El análisis de los resultados, indica que en el caso del detergente catiónico la presencia
del gel no modifica la fuerza electromotriz que presenta DTAB en relación con la respuesta obtenida
en solución acuosa (ver figura 3.5 b). Este hecho sugiere que la asociación DTAB/gelatina es muy
pequeña y que de formarse agregados de tipo micelar, corresponderían más bien a micelas con
características análogas a las que se forman en agua pura, que no interactuarían con el polímero. Esta
visualización del fenómeno se ve reforzada si se hace un análisis en conjunto con los resultados
fotofisicos, que sugieren que el pireno se encontraría en microdominios con características similares a
las micelas formadas en solución acuosa.
Los datos mostrados en la figura 3.5a, obtenidos en soluciones acuosas de SDS en
ausencia de gelatina y en geles de gelatina al 2% estarían indicando que a concentraciones de
detergente muy por debajo de la CMC se produciría una asociación fuerte entre SDS y la gelatina.
El tipo de dependencia obtenida al representar la cantidad de SDS asociado a la
gelatina en función de la actividad del detergente libre (ver figura 3.6) indicaría que la asociación es
107
altamente cooperativa, particularmente a concentraciones del detergente superiores a 0,8 mM. Es
decir, una vez asociados los primeros monómeros a la proteína, la asociación de los monómeros
siguientes se ve favorecida. Considerando que la asociación sobre el polímero es fuerte en virtud de la
asociación cooperativa y teniendo en cuenta los efectos producidos sobre la fotofisica del pireno, es
posible analizar el fenómeno de asociación en términos de la formación de agregados micelares sobre
la gelatina. Los agregados formados podrían corresponder al menos a dos tipos: i) agregación tipo
micela del detergente sobre regiones de la proteína ya estructurada, (por ejemplo regiones de triple
hélice), ji) formación de nuevos agregados que involucren al detergente y cadenas de gelatina no
estructuradas previamente.
IVA- Modificación estructural del gel por efecto del detergente
Los datos de viscosidad obtenidos en soluciones fluidas de la proteína cercanas a la
concentración crítica de gelificación y las fuerzas de gel medidas a concentraciones de gelatina de un
2%, en función de la adición de SDS o DTAB (figuras 3.7 y 3.8a y 3.8b), son cualitativamente
diferentes para ambos detergentes.
El moderado decrecimiento que produce la adición de DTAB sobre ambas propiedades
puede ser interpretado en términos del debilitamiento o ruptura parcial de la estructura de hélice triple
de la proteína. Es interesante notar que la estructura de gel permanece aún a concentraciones de DTAB
tan altas como 50 mM, condición bajo la cual se estaría en presencia de micelas en solución acuosa.
108
En el caso de detergente aniónico (figuras 3.8a y 3.8b), su presencia en soluciones o
geles de gelatina produce un incremento inicial de ambas propiedades, seguido por un decrecimiento
dramático en la viscosidad y una ruptura total del gel a una razón SDS/gelatina 4.6x10-4M/g.
Es interesante notar del análisis de los resultados de carácter macroscópico, que el
incremento en la viscosidad y el aumento en las fuerzas de gel, se producen a razones
detergente/gelatina tales que, desde el punto de vista microscópico la rigidez de los microdominios y la
estructuración de los segmentos helicoidales estaría decreciendo (Wustneck el al., 1988, 1989,
Seeboth el al., 1990).
Los resultados obtenidos en esta etapa del trabajo, en lo relativo a la asociación del
detergente sobre la proteína, refuerzan datos previos de literatura (Fruhner y Kretzschmar, 1989) en los
que se señala que los detergentes aniónicos son más fuertemente adsorbidos sobre gelatina que sus
homológos catiónicos. También presentan un buen acuerdo con resultados informados a partir de
mediciones de dicroísmo circular, que señalan que la adsorción de detergentes jónicos modifica la
estructura de los microdominios de triple hélice de la proteína. (Wustneck el al., 1988, 1989).
IV.5.- Formación de microdominios en soluciones diluidas de gelatina:
Un parámetro de la fotofisica del pireno no considerado hasta ahora en la discusión se
refiere a la desactivación de su fluorescencia por un desactivante selectivo, tal como acrilamida. La
incorporación del pireno en microdominios hidrofóbicos al interior de las soluciones de gelatina
(0,5%) puede asegurarse a través de la desactivación selectiva de la fluorescencia de las moléculas de
pireno emitiendo desde la fase acuosa y/o desde sitios altamente expuestos al agua (por ejemplo
adsorbidos sobre una sola cadena del polímero). Como se observa en las figura 3.9 este parámetro de
la fotofisica del pireno en soluciones de gelatina en ausencia de aditivos, indica que bajo adición de
109
gelatina, las moléculas de pireno son extraídas desde el agua e incorporadas en microdominios en los
cuales la desactivación por acrilamida es menos eficiente que en el agua o se encuentra totalmente
impedida.
En la figura 3.10 los resultados han sido representados en términos de la ecuación de
Lehrer. A una concentración de gelatina al 0,5%, la fracción de fluorescencia no suprimida es 0,28.
Este resultado indicaría que a esta concentración de gelatina, el 28% de la emisión del pireno
correspondería a moléculas localizadas en microdominios hidrofóbicos. Estos microdominios
hidrofóbicos podrían corresponder a regiones de triple hélice, de modo que el pireno allí incorporado
no se vería afectado por el agente desactivante.
IV.6.- Efecto de la adición de urea sobre microdominios en solución
El decrecimiento observado en la fracción de fluorescencia del pireno protegida de la
desactivación por acrilamida, que se observa en la figura 3.9 cuando se está en presencia de urea,
puede ser comprendido considerando que la urea como agente desnaturalizante podría manifestarse a
través de dos efectos diferentes. Por un lado podría inducir un decrecimiento en la magnitud de los
microdominios hidrofóbicos (triple hélice). En otro sentido podría modificar la capacidad que tienen
estos microdominios para incorporar moléculas de pireno, es decir, disminuir la constante de
asociación de la sonda. En cualquiera de las dos situaciones, la urea sería responsable en disminuir las
ftierzas hidrofóbicas en la proteína.
El grado de desnaturalización promovido por la urea y visualizado a través de la
fotofisica del pireno, queda claramente manifestado a partir de los resultados obtenidos mediante
mediciones de rotación óptica.

110
Las mediciones de rotación óptica permitieron evaluar la fracción de hélice presente a
distintas concentraciones de urea. Los resultados obtenidos en la figura 3.11, se encuentran graficados
en función de la fracción de fluorescencia del pireno protegido de la desactivación por acrilamida. Los
datos muestran una relación lineal entre ambos parámetros, sugiriendo una correspondencia muy
estrecha entre la extensión de las regiones helicoidales y la incorporación del pireno a microdominios
desde los cuales la emisión fluorescente de esta molécula se encuentra protegida de la desactivación.
Si se analizan de manera conjunta los resultados que se entregan en las figuras 3.13
relativos a la fracción de hélice y de la figura 3.12 relacionados con los cambios inducidos sobre las
viscosidades relativas de las soluciones de gelatina debidos a la presencia de urea, se observa que el
decrecimiento en la cantidad de microdominios estructurados que induce la urea se ve acompañado por
un decrecimiento substancial de las viscosidades relativas. Este resultado contrasta con la expansión de
las cadenas que debiera estar asociado a un decrecimiento en las interacciones hidrofóbicas y sugiere
que los microdominios hidrofóbicos existentes en las soluciones al 0,5% previos a la adición de la urea
son predominantemente intermoleculares.
IV.i.- Efecto del SOS sobre microdominios en solución
De acuerdo con los resultados obtenidos en la desactivación de la fluorescencia del
pireno por acrilamida (figura 3), se puede establecer que la adición de pequeñas cantidades de SDS,
del orden de 1 mM en soluciones al 0,5 % de gelatina decrece dramáticamente la eficiencia de
desactivacióri por acrilamida. Bajo estas condiciones la rotación óptica de la proteína se ve
escasamente modificada, indicando que el grado de estructuración en triple hélice no es
significativamente alterado por el detergente. El contenido de hélice recién comienza a decrecer a
concentraciones de detergente superiores a 2 mM.

111
Analizados en conjunto, los resultados provenientes de la fotofisica del pireno, de las
fracciones de hélice determinadas y de las mediciones viscosimétricas, indican que a bajas
concentraciones (menores que 2mM), el SDS promueve la formación de microdominios altamente
hidrofóbicos, pero es incapaz de generar un cambio significativo en el contenido de triple hélice de la
proteína.
El hecho que la viscosidad de la solución aumente con la concentración del detergente
puede interpretarse de manera análoga al modelo de interacción propuesto por Greener y Contestable,
(1987) a altas temperaturas. Vale decir, el modo de interacción que mejor se ajusta al comportamiento
viscosimétrico sería aquel en el cual los microdominios se forman a partir de múltiples cadenas de
gelatina. De acuerdo con esta visualización el efecto del SDS podría ser comprendido en términos de
un incremento en la asociación intermolecular de la gelatina, que conduciría a la formación de "nudos"
estabilizados por interacciones hidrofóbicas y/o electrostáticas con el detergente. (En el esquema 1.6d
se ve representada una situación análoga a una temperatura de 45 °C).
IV.8.-. Efecto de la adición simultánea de urea y SDS a soluciones de gelatina.
La discusión anterior implica que cuando se añade urea o SDS a las soluciones de
gelatina, la naturaleza de los microdominios y las fuerzas involucradas en los cambios observados son
diferentes. En este sentido ha resultado interesante estudiar el efecto que produce la adición de ambos
aditivos en forma simultánea.
Los resultados de la figura 3.10 para el sistema urea 2 M y SDS 1 mM indicarían que
aún bajo condiciones de fuerzas hidrofóbicas bastante reducidas (2 M de urea), la asociación del SDS a
la proteína proporcionaría regiones de suficiente hidrofobicidad como para incorporar la sonda
fluorescente en forma casi cuantitativa.

112
La información obtenida a través de las mediciones de viscosimetría y rotación óptica
que se encuentran representados en las figuras 3.12 y 3.13, estaría relacionada con el efecto de la
asociación del SDS sobre el grado de triple hélice y sobre la asociación intermolecular en condiciones
en que las fuerzas hidrofóbicas se encuentran disminuidas (debido a la presencia de urea).
Desde el punto de vista de las viscosidades, los efectos opuestos ejercidos sobre este
parámetro, cuando se añade urea a soluciones de gelatina-SDS, o cuando se añade SDS a soluciones
de gelatina-urea, pueden ser interpretados simplemente en términos de los efectos opuestos de urea y
SDS sobre la asociación intermolecular de las cadenas polipeptídicas. Es decir el SDS, promovería la
formación de "nudos" intermoleculares y la urea aunque es capaz de desnaturalizar gran parte de la
estructura de la proteína, no es capaz de competir con el SDS ni de evitar la formación de los "nudos".
En relación con el contenido helicoidal, la evidencia experimental indicaría que la
adición de urea a sistemas gelatina-SDS decrece aún mas la fracción de hélice. Sin embargo la adición
de SDS a las soluciones gelatina-urea la incrementa o más bien, impide que la urea ejerza un efecto tan
drástico.
El comportamiento anómalo recién descrito es compatible sin embargo con los
diferentes mecanismos de desnaturalización de proteínas promovidos por ambos aditivos. La urea
estaría impidiendo la agregación de las cadenas, el SDS no favorecería la agregación hacia estructuras
helicoidales, pero generaría puntos de "nucleación" de varias cadenas de la proteína. La extensa
interacción intermolecular de las cadenas de gelatina promovidas por la adición de SDS aún en la
presencia de urea, actuaría como un "protector" de dominios de tres cadenas.
Se debe hacer notar que, con los datos disponibles, es dificil establecer firmemente si la
organización de la proteína toma lugar en los mismos centros hidrofóbicos promovidos por el
detergente o involucra otros fragmentos de las cadenas, cuya organización sea favorecida por la
113
proximidad de regiones donde la asociación de las cadenas proteicas entre sí haya sido propiciada por
MIII
En la figura 4.1 se presenta un esquema de los distintos tipos de organización que se
estarían produciendo en presencia de diferentes concentraciones de ambos aditivos estudiados,
teniendo en cuenta los cambios viscosimétricos, las modificaciones en la fracción de hélice y la fracción
protegida de la desactivación por acrilamida.
En esta figura se señala que en presencia de urea, la proteína pierde su estructura triple
helicoidal (disminuyendo por tanto la fracción de hélice) y la fracción de pireno protegido de la
desactivación por acrilamida. La adición de pequeñas cantidades de SDS sobre la gelatina ya
desnaturalizada con urea, recupera la viscosidad y la fracción de hélice junto con disminuir la eficiencia
de la desactivación por acrilamida. A su vez el agregado de SDS en ausencia de urea incrementa la
viscosidad y la fracción protegida sin alterar la fracción de hélice. Estos dos últimos hechos se
interpretan en el esquema de manera conjunta, propiciando en forma paralela la formación de dominios
de triple hélice y/o regiones de nudos con la participación de varias cadenas de la macromolécula
promovidos por el SDS. Por último, altos contenidos de SDS traerían como consecuencia la pérdida
de fracción de hélice, permitiendo sólo la existencia de algunos "nudos", que justificarían una alta
protección de la fluorescencia del pireno frente a la desactivación por acrilamida.
IVA- Interacción entre SDS y colágeno
El fenómeno de interacción entre el detergente aniónico y la proteína en estado nativo
se analiza a partir de los resultados relativos a la determinación de los campos de estabilidad de las
fases cristalina y amorfa, los efectos sobre el volumen de hinchamiento y la asociación del detergente a
las formas cristalina y amorfa del polímero.

114
Figura 4.1
urea
'')
fh y n decrecen L
bajo [SDS]
fp, n crcen
fh casi ctej VB
alto [S D S]
pérdida de >
fh
En el esquema (A) representa el efecto de una baja [SDS]

condición en la que fh, fp y n crecen; (B) representa el efecto
de la adición de urea, condición bajo la cual fh, fp y n decrecen.
E Dominios de triple hélice
• Dominios de gelatina SDS de composición variable y de

reducida organización local.
Dominios ricos en SDS que incorporan más de una mo-
lécula de gelatina
115
La identificación de las temperaturas de transición en la figura 3.14 presenta algunas
dificultades en relación con las condiciones de verdadero equilibrio termodinámico. Tales
complicaciones tienen que ver con una reversibilidad incompleta y efectos de tiempos residuales al
realizar las mediciones. A pesar de lo anterior el uso del modelo de transición de fases asociado con el
encogimiento de los tendones ha sido ampliamente validado en la literatura (Fiory y Garret, 1958).
Teniendo en cuenta que las moléculas de detergente consideradas en este trabajo
pueden presentar interacciones electrostáticas e hidrofóbicas, es posible analizar su rol sobre la
estabilidad del colágeno haciendo comparaciones con las sales correspondientes a la vez que con
alcoholes alifliticos de distinto largo de cadena.
El fenómeno de depresión en la temperatura de contracción (así como también en la
temperatura de transición hélice-cadena al azar) es típica (en condiciones isoeléctricas) de agentes
"salting-in" tales como KSCN o CaCl2, a concentraciones 1 M. Para agentes "salting-out", como
NaCl o CsC1, se observa a concentraciones menores que 0,1 M, una depresión en las temperaturas de
contracción lineal, que es seguida invariablemente, a concentraciones superiores, por un incremento de
la misma (Ciferri el al., 1965; 1967).
El efecto que se observa por adición de SDS a pH 6,0 es similar al efecto que produce
la sal bajo condiciones no isoeléctricas, pero para concentraciones salinas superiores a 0,6 M.
La fuerte depresión en la temperatura de transición cristalino-amorfo que puede
observarse en la figura 3.16, es comparable a la depresión inducida en las temperaturas de transición
por los alcoholes aIifticos. Por analogía con el proceso de interacción alcohol-polimero, esta seria la
primera evidencia de la asociación entre el SDS y la proteína. El fenómeno de hinchamiento podría
estar dando cuenta de un efecto de dilución por parte del solvente una vez que la asociación se ha
producido.
116
Experimentalmente se ha demostrado que la asociación de agentes "salting-in" a los
enlaces peptídicos, ocurriría a la temperatura de transición desde el colágeno cristalino al amorfo. Esto
se originaría en que los enlaces peptídicos se encontrarían más expuestos al solvente durante la
transición (Ciferri etal., 1967 a).
En el caso de los alcoholes se ha encontrado que los grupos OH son capaces de
asociarse a los enlaces peptidicos, (Russell el al., 1959). Sin embargo, el hecho que este fenómeno se
vea incrementado de acuerdo a la serie metano!, etanol, propanol, revela una interacción directa entre
la porción hidrofóbica de los alcoholes con los grupos apolares del colágeno que llegan a estar
expuestos durante la fusión.
En el sistema en estudio se observa que bajo condiciones isoeléctricas la depresión de
la Te debida al metilsulfato de sodio se puede comparar con aquella producida por los agentes "salting-
in" y con los alcoholes, en tanto que la adición de SDS, aún a bajas concentraciones exhibe una
depresión considerablemente mayor. Un ejemplo de este hecho es que las depresiones en la Te desde
agua pura a SDS a una concentración 0,1 M es aproximadamente 3 5'C, en tanto que desde agua a
metilsulfato de sodio a la misma concentración es de 15 °C.
La depresión observada está de acuerdo con los datos de asociación que aparecen en la
figura 3.18a; en ella se muestra que se produce una asociación más eficiente del SDS a la proteína
desnaturalizada que en estado nativo.
Considerando que los aniones sulfato no se asocian a los enlaces peptídicos (Puett y
Rajagh, 1968), cabe esperar que las cabezas polares de las moléculas del detergente interactuarán
principalmente con los residuos e- amino de la proteína. Sin embargo, bajo condiciones isoeléctricas, la
exposición de los grupos e- aminos no se ve muy afectada por la conformación. Entonces la
componente que favorecería la desnaturalización sería la interacción directa de las cadenas apolares del
117
SDS con algunos de los residuos apolares del colágeno que llegarían a estar expuestos durante la
transición.
La transición a 44°C en condiciones isoeléctricas y en presencia de SDS, (figura
3.1 5a), se ve acompañada por un gran cambio en V/Vd. El pequeño incremento en VIVd que ocurre al
mismo pH a 25 o c (figura 3.15c) es similar a los pequeños incrementos observados con sales y puede
ser asociado a interacciones electrostáticas con los grupos sulfato.
A pH 2,5 la depresión de la Te en ausencia del detergente (figura 3.17) es atribuida a
una desestabilización de la hélice debido a una carga neta positiva sobre la proteína (alrededor del 5%
de los residuos son lisina o hidroxilisina) y al efecto Donnan asociado que se manifiesta en el gran
hinchamiento observado.
La pequeña depresión en la Te que causa la presencia de SDS a este pH, puede ser
atribuida a una asociación que estaría ocurriendo en primer término en los sitios - aminos, cuya
exposición es independiente de la conformación. Esto también explicaría porque no se observa ninguna
diferencia notable entre los datos de asociación obtenidos a 20y a 70 °C.
El hecho que la magnitud de la asociación sea mayor a pH 2,5 que a pH 6,
particularmente a concentraciones de SDS menores que 0,5 M, pone de manifiesto la gran fiLerza de las
interacciones electrostáticas.
El fuerte deshinchamiento del colágeno producido al añadir SDS a pH 2,5 tiene
características de cooperatividad. El fenómeno de cooperatividad no puede ser descrito simplemente
como un efecto causado por el apantallamiento usual de cargas electrostáticas acompañado por una
reducción del efecto Donnan, ya que no se observa ningún deshinchamiento tan grande cuando se
añade metilsulfato de sodio o NaCl en lugar de SDS. No obstante, el deshinchamiento puede ser
explicado a través de un modelo en el cual las cadenas hidrofóbicas del detergente se encuentren
118
magnificando el apantallamiento usual, reduciendo con ello la constante dieléctrica local y favoreciendo
una fuerte asociación con cargas fijas sobre el polimero.
En relación con interpretaciones de esta naturaleza, Khoklov y Kramarenko (1994)
han invocado recientemente la formación de pares iónicos en mezclas de agua-solvente orgánico, para
describir el fenómeno de colapso en geles, el cual es acompañado por una transición de las cadenas
flexibles desde el estado de cadena abierta al azar a la condición de ovillo.
En la literatura se ha sugerido también que el SDS contribuye a la estabilización
interhélice a través de asociación directa o interdigitación de las cadenas hidrofóbicas del detergente
asociado (Cifeni, 1994). Tyabina y colaboradores (1990) han informado que en soluciones de
polielectrolitos, la adsorción de detergentes conduce al colapso del enrejado. Estos autores sugieren
que se produce la formación de agregados entre el detergente y el enrejado los que podrían tener forma
micelar o laminar a una CMC mucho menor que las soluciones acuosas del detergente.
Un análisis de los datos de la figura 3.18b expresados en términos de la ecuación 3.5,
entregan un valor de K de 1500 M' y un n correspondiente a la asociación de 1 monómero cada 10
residuos. Es decir, alrededor de dos veces el número de grupos - aminos, considerando la
composición aminoacídica del colágeno. El hecho que los datos de adsorción a pH 6,0 y 70 oc no
produzcan una recta satisfactoria puede atribuirse a la presencia de más de una clase de sitios de
asociación o bien a la cooperatividad del proceso que se evidencia por la curvatura hacia arriba en la
figura 3.18a.
Para explorar los detalles de los agregados, se consideró hacer un análisis de la
cooperatividad exhibida por los datos de asociación de la figura 3.18b. Un ajuste de los gráficos de B
versus el log de la concentración de SDS libre para las isotermas a pH 2,5 (representado en la figura
3.20 de acuerdo a la ecuación 3.8) proporciona un valor de K aproximado de 1800 M' El valor de o,
119
parámetro relativo a la cooperatividad del proceso, es aproximadamente 1, revelando una fuerte
asociación, pero no cooperatividad. Los datos a pH 6,0 pueden ser tratados sólo en una forma
aproximada, ya que no se alcanza la saturación. Sin embargo, los datos obtenidos a 70 °C evidencian
una alta cooperatividad. El hecho que la magnitud de la asociación sea mayor a pH 2,5 que a pH 6,0
refleja la gran fuerza de las interacciones electrostáticas.
La falta de cooperatividad exhibida a pH 2,5 estaría en contraste con observaciones
realizadas en relación con la asociación de detergentes a polielectrolitos flexibles. Estos procesos son
usualmente cooperativos, como es el caso de la asociación a poli(L- lysina) (Hayakawa y Kwak, 1982)
oaADN (ShirahaniaeiaL, 1985).
El factor principal que incidiría en la falta de cooperatividad a pH 2,5 podría estar
relacionado con una baja densidad de carga en la triple hélice rígida. Esto generaría sitios de asociación
muy alejados entre si como para posibilitar una interacción hidrofóbica entre las cadenas del detergente
que permitiesen desarrollar cooperatividad. En este sentido se puede citar un trabajo realizado por Wei
y Hudson (1993) quienes han investigado la asociación de SDS a quitosano catiónico. Estos autores
han encontrando que el parámetro de cooperatividad decrece cuando el grado de diacetilación (que es
una medida de la densidad de carga) decrece.
La interacción hidrofóbica cooperativa entre ligandos electrostáticamente cargados es
analizada generalmente como un refuerzo de las interacciones coulómbicas entre los grupos cargados.
Shirahama y colaboradores (1985) han mostrado que la asociación de cationes
dodedilpiridinio a ADN exhibe dos etapas cooperativas. Estos autores sugieren que la asociación
electrostática permitiría la formación de una primera capa de "colas" hidrofóbicas seguido por un
proceso de interdigitación en presencia de un exceso de detergente. El tensioactivo formaría una
bicapa, con sus grupos catiónicos expuestos hacia el agua, que ayudarían a mantener el ADN
120
estabilizado en la solución acuosa. Por último, se ha sugerido (Ciferri, 1994) que este mecanismo de
interdigitación podría conducir a la formación de agregados solubles involucrando a varias moléculas
de ADN.
Se puede hacer una asimilación del mecanismo propuesto para el fenómeno ocurrido
en este caso a pH 2,5. A partir de la figura 3.15c queda en evidencia que a 25 oc, se produce una gran
reducción del volumen a concentraciones de SDS cercanas a 1 mM es decir cuando la asociación del
SDS ( fig. 3.18b) está cercana a la saturación. Es plausible que en el sistema esté ocurriendo una
segunda etapa de interdigitación en el proceso de deshinchamiento, contribuyendo al carácter
cooperativo de la transición.
Los resultados de asociación SDS-colágeno presentados en esta parte del trabajo,
analizados en conjunto con los datos obtenidos a través de mediciones de fluorescencia de las etapas
precedentes revelan que sólo cuando las proteínas están en la condición isoeléctrica y al azar pueden
formarse agregados tipo micela. Ya que el SDS y el colágeno en condiciones isoeléctricas se
encuentran asociados solo por interacción hidrofóbica, las micelas resultantes deberían poseer una
organización bastante inusual, con porciones de la cadena polimérica formando "loops" y porciones en
el interior hidrofóbico.
LV.10.- Análisis de los diagramas de fase de Organogeles.
El diagrama de fase pseudo temario representado en la figura 3.21 ha sido construido
bajo el supuesto que agua y AOT pueden ser considerados como una sola fase; si la razón agua/AOT
permanece constante puede considerarse que la suposición es válida. Naturalmente este cuociente será
constante en tanto el sistema presente una sola fase sea ésta el estado sol o una fase gel transparente.
121
El proceso de formación del gel puede explicarse de la siguiente manera: a bajas
concentraciones la gelatina se encontraría incorporada al interior de las gotas de la microemulsión, a
concentraciones mayores de gelatina, las gotas se adaptarían al proceso de crecimiento y estructuración
en hélice de la proteína, formando canales que se interconectan para dar el gel. Estos canales existirían
en equilibrio con nanogotas libres de gelatina. Dicho equilibrio con nanogotas acuosas permitiría
absorber fluctuaciones en el gel haciéndolo estable. Para cierta concentración de gelatina más alta el
sistema presenta separación de fases. Este hecho puede entenderse sabiendo que la proteína no es
soluble en el solvente, de modo que si la concentración de la proteína aumenta, el sistema debe
readecuarse estructuralmente para solubilizar la macromolécula. La proteína siempre debería estar
disuelta en el agua y su interacción con el solvente debiera ser mediada y sostenida por el AOT.
Un modelo que se ajustaría a los cambios que debe sufrir el sistema para alcanzar su
nueva condición de equilibrio sería que la gelatina puede empacarse al interior de los canales con
agregación lateral de triples hélices, generando canales de mayor sección transversal. De esta manera el
agua y el AOT disponibles, cuyas concentraciones no han aumentado, se estarían ocupando de la
manera más eficiente. Ahora bien, si los canales que forman el enrejado aumentasen de tamaño
(sección) el volumen disponible para atrapar solvente en el interior del gel tendría que disminuir y cierta
cantidad de solvente sería expulsado del gel dando origen a la separación de fases.
Una segunda interpretación podría sugerir que en presencia de concentraciones tan
altas de gelatina, se podría formar un mayor número de canales formando una red más compacta que
expulsa solvente.
Ambos modelos darían cuenta de un aumento en la rigidez del gel (algo que se observa
al trabajar con los geles). El segundo modelo no toma en cuenta el hecho que se necesitaría una mayor
122
concentración de agua y AOT para sostener una mayor interfase entre los canales y el solvente. El
primer modelo es el que mejor explica la aparición de turbidez con la separación de fases.
El ensanchamiento de la región gelificada a medida que aumenta el contenido de agua y
AOT, es consecuente con un aumento en la capacidad del sistema de solubilizar la gelatina. La región
gelificada aumentaría porque seguiría siendo posible la formación de agregados de gelatina (regiones
de hélice triple de acuerdo con la literatura) que pueden permanecer estables por estar rodeados por
agua de solvatación y a su vez esta agua puede ser sostenida por el detergente en estructuras tipo
canal.
De acuerdo al diagrama y dado ese valor de R, la concentración de gelatina necesaria
que permite la transición sol-gel es casi independiente del contenido de agua y AOT; sin embargo, el
proceso de transición desde el gel hacia la separación en dos fases podría venir dado (en ese intervalo
de concentraciones) por la razón entre el contenido de gelatina y el contenido de componente acuoso.
Por ejemplo, cuando la concentración de gelatina es 3,7%, la razón gelatina/(agua + AOT) vale 0,36;
si el contenido de componente acuoso aumenta hasta un 23%, el contenido de gelatina máximo para
formar gel en una sola fase sube a 7,6%, originando una razón igual a 0,33.
La fase fluida separada es virtualmente solvente puro, sin embargo las determinaciones
de agua y AOT en dicha fase indican la presencia de pequeñas cantidades de ambos componentes.
Considerando que la concentración de agua puede llegar a ser de 0,33 M, esta agua debería
encontrarse en forma de nanogotas sostenidas por AOT.
Ya se ha señalado que cuando la concentración de gelatina es lo suficientemente alta, el
sistema llega a una separación de fases con una escasa reproducibilidad en el volumen de fase que se
separa. Junto con ello el contenido de agua y AOT en la fase fluida es mucho mayor cuando el
volumen separado es pequeño. Estos resultados aparentemente anómalos pueden ser comprendidos si
123
se supone que cuando se alcanza el equilibrio el sistema tiende a formar el máximo numero de
nanogotas posible. Esto explicaría el hecho que cuando se produce la separación de fases y se separa
un pequeño volumen de fase fluida, ésta sea mas concentrada en agua y AOT que cuando el volumen
de fase fluida es mayor. Esto a su vez estaría en estrecho compromiso con el hecho que cuando todo el
volumen de muestra gelifica, se debiera llegar a un sistema con la máxima concentración de nanogotas
posible, apoyando el modelo propuesto por Atkinson etal. , (1989).
El efecto producido por el n- octano¡ sobre los fenómenos de transición sol-gel y gel-
dos fases, que se manifiesta en el diagrama de fases a través del aumento del campo de estabilidad de la
fase gel, no puede ser analizado simplemente como si el alcohol jugase el mismo rol del AOT, o como
si el valor de R fuese modificado por la presencia de alcohol como "cosurfactante".
De acuerdo a la literatura, una variación de R de un lO%, desplaza tanto la transición
sol-gel como gel-dos fases a concentraciones de gelatina un 3% mayores (Haering y Luisi, 1986). Sin
embargo, como se desprende del diagrama, la adición de alcoholes en concentraciones del orden de
lx 1ff2 M (que sería la concentración equivalente a modificar el R en un lO%), desplaza solamente la
transición gel-dos fases a concentraciones de gelatina un 4% superiores a aquellas producidas en
ausencia del alcohol y no modifica la transición sol-gel. Junto con ello, como se desprende de la figura
1.9 para un valor de R=50, es necesario aumentar en un 40% la concentración del detergente para que
la concentración de gelatina (expresada como porcentaje en la fase acuosa), necesaria para la
gelificación sea un 3% menor.
Las posibles regiones donde estaría presente el alcohol son tres: como monómero libre
en el solvente orgánico, en el interior de las micelas reversas y en la interfase que recubre la gelatina. El
diseño de la experiencia, es decir la pequeña alicuota de fase fluida tomada para el análisis, no permite
determinar cual seria la proporción de dicho alcohol que se encuentra libre en el solvente y cuanto se
124
encuentra formando parte de las micelas. Ahora bien, se supone que la concentración de alcohol en la
fase fluida es del mismo orden que aquella que existe en las regiones de solvente orgánico al interior del
gel, entonces el alcohol restante debe estar asociado al enrejado que contiene la gelatina.
De acuerdo a la literatura cabría esperar que la incorporación a las micelas reversas
(nanogotas) fuese mayor para los alcoholes de cadena más corta (Lissi y Engel, 1992). Al parecer esto
no es necesariamente cierto cuando el alcohol dispone también de la interfase gelatina-agua-AOT.
Ya se mencionó que dos de las posibles regiones de incorporación del alcohol son la
interfase del enrejado y las micelas reversas. Un análisis de la tabla II, en la que se presenta la
concentración de alcohol total versus alcohol incorporado a la interfase del enrejado, sei.ala que desde
n-hexanol hasta n-nonanol, habría poca diferencia por parte de los alcoholes en incorporarse
preferencialmente en dicha interfase y que el alcohol de cadena más corta (es decir aquel que produciría
un menor efecto sobre la transición gel-dos fases) se encontraría proporcionalmente más asociado a la
interfase que aquellos de cadena más larga. Lo último puede ser interpretado suponiendo por una
parte que la presencia del alcohol permite desplazar AOT desde las nanogotas o el solvente hacia la
interfase o que el efecto del alcohol no viene dado por su grado de incorporación a la interfase sino es
estrictamente un efecto del largo de la cadena. Vale decir el alcohol de cadena más larga sería capaz de
estabilizar mejor la interfase colaborando con ello a estabilizar la fase gel.
El hecho que el alcohol de cadena más corta (n-butanol) se encuentre más incorporado
a la interfase del canal (extrapolando este resultado a partir de lo que ocurre con los alcoholes desde
n- hexanol hasta n- nonanol) y a pesar de eso no contribuya a aumentar el campo de estabilidad del gel
podría deberse a que en la medida que disminuye el largo de la cadena hidrocarbonada el alcohol juega
un rol cada vez más similar al agua. Cabría esperar que si se tratase de metano], éste estuviera
completamente en la interfase y aún así no tuviese efecto sobre el campo de estabilidad del gel.
125
El efecto nulo del alcohol sobre la transición sol-gel estaría relacionado con el hecho
que cuando se produce dicha transición el sistema estaría disponiendo del agua y el detergente
suficiente para su estructuración. En cambio, durante la transición gel-dos fases se privilegiaría el uso
óptimo del AOT disponible.

126
CONCLUSIONES
Las propiedades fotofisicas del pireno ponen en evidencia la presencia de microdominios
hidrofóbicos al interior de los geles de gelatina. Estos microdominios se harían más compactos con el
aumento de la concentración de gelatina, por lo que corresponderían a regiones de triple hélice.
En estado gelificado el polímero es capaz de asociarse fuertemente al tensioactivo aniónico
SDS, en cambio se asocia muy débilmente al detergente catiónico, DTAB, del mismo largo de cadena.
Esto permite suponer la existencia de interacciones específicas entre la proteína y el SDS. Las
características cooperativas del proceso sugieren un modelo de asociación con formación de agregados
micelares soportados sobre las cadenas poliméiicas.
La débil asociación del DTAB a la proteína y la presencia de microdominios de fluidez
similar a la que presentan las micelas libres, permite concluir que se estarían formando micelas libres
al interior del gel.
En soluciones fluidas de gelatina en presencia de urea y SDS los resultados permiten deducir la
presencia de a lo menos dos tipos de microdominio: un tipo de sitio hidrofóbico muy protegido del
solvente acuoso y otro tipo de sitio más expuesto al agua.
La adición de urea sobre soluciones fluidas de gelatina produce una disminución de la
viscosidad y del contenido de hélice. El grado de desnaturalización de la proteína, expresado en
términos de la fracción de hélice presenta una relación lineal con la fracción de fluorescencia del
pireno protegida de la desactivación por acrilamida.

127
El efecto protector de la estructura helicoidal que ejerce el SDS frente a la desnaturalización
inducida por urea se debería a los distintos mecanismos de interacción de ambos agentes. En
particular a la capacidad del SDS de inducir la formación de agregados premicelares donde confluirían
múltiples cadenas de la proteína.
El SDS aumenta el campo de estabilidad de la fase amorfa de la proteína, tanto a pH 6,0 como
a pH 2,5. A pH 6,0 la asociación SDS polímero es un proceso cooperativo que estaría promovido por
una interacción directa entre las cadenas del detergente y residuos apolares del colágeno.
La falta de cooperatividad a pH 2.5 sería consecuencia de la baja densidad de carga en la triple
hélice y el deshinchamiento observado sería una consecuencia del apantallamiento entre las cargas.
El estudio de geles basados en microemulsiones permite concluir que en el intervalo de
concentraciones estudiado, la transición sol-gel no se ve modificada por un aumento de agua y/o
AOT. Sólo un aumento considerable de ambas concentraciones aumenta el campo de estabilidad de la
fase gel
La adición de alcoholes de cadena larga (hasta 8 átomos de carbono) favorecería el
desplazamiento del campo de estabilidad del gel, en particular de la transición gel - 2 fases. Los
alcoholes de cadena más larga proporcionarían una mayor estabilización de la interfase y/o
favorecerían el desplazamiento de moléculas de AOT desde el solvente hacia la interfase.

128
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UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD DE QUIMICA Y BIOLOGIA

ESTUDIO DE LA INTERACCION ENTRE

Marcia Gloria Henríquez Bustamante

Marcia Gloria Henríquez Bustamante

Trabajo de graduación presentado a la Facultad de Química

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

Marcia Gloria Henríquez Bustamante

Este trabajo de graduación fue preparado bajo la dirección de la profesora

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

A la vida, por haberme presentado caminos alternativos y la posibilidad de elegir;

A los profesores Elsa Abuin y Eduardo Lissi de quienes he aprendido que en

A Juan Guerrero y a Ana María Campos, por lo saludable que me ha resultado su

Quiero expresar además mis agradecimientos a Conycit por haberme otorgado

Los resultados presentados en esta tesis están relacionados con el estudio de la

Las etapas contempladas en el desarrollo del trabajo son:

Los métodos experimentales utilizados han sido: técnicas fotofisicas,

Los diferentes mecanismos de acción desnaturalizante de urea y del detergente

En los geles de gelatina formados en microemulsiones, la presencia de alcoholes

The foliowing steps were considered:

b) Study on synergism and / or antagonism of two denaturants, urea and an anionic

c) Study of the interaction betwen an anionic detergent and collagen.

d) Effect of addition of alkanols on gelatin geis formed in microemulsions.

Experimental methods employed were: photophysical techniques, selective

-Introducción .......................... . ..................... .... ................................................................ ..1

1.1 -Moléculas tensoactivas................................................................................................. 4

1.2.-Macromolécula en estudio ...................................... . ................................ . .................... 5

1.3.-Modelo para el fenómeno de gelificación ...................................................................... 10

1.4.-Antecedentes previos del comportamiento de la gelatina ............ ... ................ ............... 12

1.5.-Interacción polímero-detergentes .................................... . ................. .... ..............

1.6.-Colágeno en presencia de aditivos, antecedentes .........

1.7.-Rol desnaturalizante de la urea..................................................................................... 25

1.8.-Geles de gelatina en solvente orgánico......................................................................... 27

1.9.-Uso de técnicas fotofisicas en el estudio de interacciones............................................. 34

-Parte Experimental. ........................................................................................................... 39

11. 1 .-Reactivos y solventes ................ ... . ............................................................................... 39

11 .2.-Métodos ............................................. . ... . ....... . ............................ ... .............................. 40

11.2.1 -Preparación de geles de gelatina en solvente acuoso.....................................................40

¡1.2.3.-Actividad de los iones de detergente al interior del gel ................................................42

11.2.4.-Mediciones de Fuerza de gel ... ... ........ . .............................. . ................................. .. ........ 45

11.2.6.-Desactivación de la fluorescencia del pireno en soluciones de gelatina ................... ... .... 47

11.2.7.-Rotación Optica .............................................................................. . ...... . ....................... 47

11.2.8.-Viscosidades relativas .............. ... . .......... . ....................................................................... 48

11 .2.9.-Obtención de tendones ................................................................

11.2.10.-Temperaturas de transición cristalino amorfo...............................................................49

11.2.11 -Grado de hinchamiento ................................................................................................ . 50

11.2.13.-Preparación de geles en solvente orgánico ....................................... .. ........................... 53

11.2.14. -Construcción de diagramas de fases ........................ . ........ ........... . ............................... 53

11.2.15.-Determinación de la incorporación de alcoholes a los organogeles............................ 54

11.2.16.-Determinación del contenido de bis(etil-hexil) sulfosuccinato de sodio....................... 55

11.2.17.-Determinación del contenido acuoso en los geles en solvente orgánico ..................... 56

Resultados............... . .................................................... . ......................................................... 57

ifi. 1.-a) Fotofisica del pireno en geles de gelatina. ..................................................................... 57

b) Efecto de los detergentes ........................................................................................... 62

111.2.-Actividad de los detergentes al interior del gel................................................................. 66

111.3.-Efecto de los detergentes sobre la fuerza de gel............................................................. 66

111.4.-Efecto de la adición de urea a soluciones de gelatina .................................................. . ...... 74

¡11.5 -Efecto de la adición de dodecil sulfato de sodio a soluciones de gelatina........................... 81

111.6.-Efecto de la adición simultánea de urea y dodecil sulfato de sodio ..................................... . 81

111.7.-Colágeno: curvas de hinchamiento y de transición de fase ................. .... ............................ 83

111.8.-Cuantificación de la asociación del dodecil sulfato de sodio al colágeno .................... .. ....... 92

- Discusión ............................................................................................................................. 103

IV. 1.-Formación de microdominios en soluciones y geles de gelatina.. ................................. . .... 103

IV.3 . -Asociación de detergentes con gelatina............................................................................ 106