INSTITUTO TECNOLOGICO DE TUXTLA GUTIERREZ

DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

INGENIERIA BIOQUÍMICA

MANUAL DE PRÁCTICAS DE LA MATERIA:

BIOQUIMICA II
(BIOQUÍMICA DEL NITRÓGENO Y REGULACIÓN GENÉTICA )

AUTOR: DR. REINER RINCÓN ROSALES

TUXTLA GUTIERREZ, CHIAPAS. 2013

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 INDICE: RELACIÓN DE PRÁCTICAS:

PRACTICA TITULO DE LA PRACTICA PAGINA

PROTOCOLO 3

No.1. EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS 4

No.2. ELECTROFORESIS SDS_PAGE PARA PROTEINAS 8

No.3. BIOSINTESIS DE AMINOÁCIDO 13

No.4. EXTRACCIÓN DE ADN BACTERIANO 17

No.5. ELECTROFORESIS EN AGAROSA PARA ADN 21

No.6. PCR (REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA) 24

No.7. HUELLAS GENOMICAS BACTERIANAS 27

No.8. TECNICA ARDRA (ENZIMAS DE RESTRICCION) 30

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PROLOGO.

Este manual de prácticas, tiene como objetivo reforzar los conocimientos obtenidos en las
clases de la materia Bioquímica del Nitrógeno y Regulación Genética. Se han planteado
ocho prácticas. Las dos primeras practicas, están relacionadas con el metabolismo del
nitrógeno, específicamente sobre la fijación biológica de nitrógeno y la biosíntesis de los
aminoácidos; se utilizan técnicas colorimétricas para cuantificar proteínas y se emplea la
electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS_PAGE) para caracterizar perfiles proteicos en
algunas muestras vegetales. En la práctica No. 3, se utiliza la bacteria Corynebacterium
glutamicum, como elemento biológico, para estudiar la biosíntesis del ácido glutamico, un
aminoácido de importancia en la industria farmacéutica y de los alimentos. Considerando
que los procesos bioquímicos y metabólicos están regulados genéticamente, se considero
incluir prácticas que estén relacionadas con la biología molecular y la genética. Por este
motivo a partir de la práctica No. 4, se propone protocolo para la extracción del ADN
bacteriano y posteriormente, mediante la aplicación de la técnica de Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR) se caracterizaran genes cromosomales y plasmídicos, de tal
manera que permitan la identificación taxonómica de las bacterias. También se estudiaran
las huellas genómicas en cepas bacterianas a través del empleo de las técnicas ERIC que
están basadas en el estudio de las secuencias repetidas en espacios intragénicos de
enterobacterias y ARDRA en donde se podrá conocer la importancia de las enzimas de
restricción para el estudio filogenético de especies bacterianas. Todas las prácticas están
estructuradas con base al programa de competencias en las ciencias experimentales, en
donde el alumno pueda adquirir conocimientos de vanguardia, a través de la
experimentación en la investigación científica, en donde desarrollo habilidades, destreza y
capacidad intelectual para el planteamiento de problemas y búsqueda de las soluciones
más adecuadas que permitan su formación y desarrollo profesional.
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PRACTICA No.1. EXTRACCION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS

OBJETIVO: Lograr la extracción de proteínas en muestras vegetales y aplicar técnicas

colorimétricas para la cuantificación.

FUNDAMENTO:

Métodos para la cuantificación de proteínas: Colorimetría (Reyes & Gálvan, 2000)

Determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica es una técnica de

rutina básica cuando se aborda un esquema de purificación de una proteína concreta,
cuando se quiere conocer la actividad específica de una preparación enzimática, para el
diagnóstico de enfermedades, así como para otros muchos propósitos. Existen diferentes
métodos para la cuantificación de proteínas. Muchos de estos métodos se basan en: a) la
propiedad intrínseca de las proteínas para absorber luz en el UV, b) para la formación de
derivados químicos, o c) la capacidad que tienen las proteínas de unir ciertos colorantes.
En la Tabla I se recogen los métodos más usados así como sus respectivas
sensibilidades.

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Método de Biuret

Se basa en la formación de un complejo coloreado entre el Cu 2+ y los grupos NH de los enlaces

peptídicos en medio básico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloración es
directamente proporcional a la cantidad de proteínas (enlaces peptídicos) y la reacción es bastante
específica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del método es muy baja y
sólo se recomienda para la cuantificación de proteínas en preparados muy concentrados (por
ejemplo en suero).

Método de Bradford

Se basa en la unión de un colorante, Comassie Blue G-250 (también Serva Blue) a las proteínas.
El colorante, en solución ácida, existe en dos formas una azul y otra naranja. Las proteínas se
unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción
mayor que el colorante libre. Este método es sensible (1-15 μg), simple, rápido, barato y pocas
sustancias interfieren en su determinación. Entre las sustancias que interfieren están los
detergentes y las soluciones básicas.

METODOLOGIA:

Material:

 Tubos de ensayo de 13 X 100 mm y gradilla

 Microtubos de 1. 5 ml (Eppendorff)
 Pipetas de automáticas regulables de 20-100 μl y de 200-1000 μl
 Espectrofotómetro
 Agua destilada esterilizada
 Papel filtro o muselina

Muestras problema:
 Vegetales (chicharos frescos)
 Leche descremada

Reactivo de Biuret:

Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO 4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700 ml de H2O.
Mientras se agita añadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante. Guardar en frasco de
plástico.

Reactivo de Bradford:

Reactivo preparado del siguiente modo: mezclar 10 mg de Comassie Blue G-250 con 10 ml de fosfórico al
88% y 4,7 ml de etanol absoluto. Añadir H2O hasta 100 ml. Filtrar a través de papel de filtro y guardar en la
oscuridad.

Soluciones estándar de proteínas

Seroalbúmina bovina 20 mg/ml
Seroalbúmina bovina 0,5 mg/ml
Seroalbúmina bovina 0,1 mg/ml

Muestras M1 y M2
La muestra M1 debe tener una concentración de proteínas entre 10 – 20 mg/ml
La muestra M2 debe tener una concentración de proteínas entre 0,1- 0,5 mg/ml

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PROCEDIMIENTO:

Método de Biuret
Añadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estándar y muestras problemas preparadas
como se indica en la Tabla III. Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545
nm frente al blanco. El color es estable 1 hora.

- Representa la curva estándar.

- Calcula el coeficiente de extinción.
- Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras M1 y M2.

Método de Bradford
Añadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras problemas
preparadas como se indica en la Tabla IV.
Dejar a temperatura ambiente y leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. El color es
estable 1 hora.

- Representa la curva estándar.

- Calcula el coeficiente de extinción.
- Calcula las concentraciones de proteínas de las muestras M1 y M2.

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Caracterización de proteínas.

La electroforesis de proteínas se basa en la migración de proteínas a través de un campo

eléctrico. Esta técnica es útil como un método analítico, ya que las proteínas pueden ser
separadas y visualizadas, sean analizadas en su conformación nativa como
desnaturalizada. La electroforesis permite determinar el peso molecular de una proteína o
si está formada por varias subunidades. Estas características pueden determinarse
dependiendo del tipo de electroforesis que se realice. La electroforesis de proteínas es
llevada a cabo generalmente en un gel de poliacrilamida el cual actúa como un tamiz
molecular.

CUESTIONARIO:

1.- Investigue técnicas para la extracción de proteínas en sistemas bacterianos

2. - En qué consiste la técnica WESTERN BLOT. Cuál es su fundamento y aplicaciones.

3.- Relacione casos prácticos en donde se pueda apreciar el estudio y caracterización de

proteínas en el área de la Ingeniería Bioquímica.

BIBLIOGRAFÍA

Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-
254.

Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ, Klenk DC (1985): Measurement of protein using
bicinchoninic acid. Anal Biochem 150: 76-85.

Suelter CH (1985): A Practical guide to enzymology, Editorial, John Wiley & Sons, New
York.

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PRACTICA No.2. ELECTROFORESIS SDS_PAGE PARA PROTEINAS

OBJETIVO: Conocer y Aplicar la electroforesis en SDS_PAGE para la caracterización de

proteínas y estudio de perfil proteínico.

FUNDAMENTO:

Electroforesis SDS-PAGE (Electroforesis en gel de poliacrilamida)

SDS-PAGE es la electroforesis de proteínas más ampliamente usada. Su nombre indica

que la electroforesis en geles de poliacrilamida se realiza en presencia de SDS. El gel
SDS-PAGE está compuesto principalmente por los reactivos Acrilamida y bis-acrilamida y
SDS. Las acrilamidas son agentes que forman polímeros en forma de una red, dejando
poros a través de los cuales pasarán las proteínas. El tamaño del poro depende de la
concentración de estas acrilamidas. El SDS es un detergente que posee carga negativa e
interactúa fuertemente con las proteínas, favoreciendo su desnaturalización. La proteína
desnaturalizada en presencia de SDS es así recubierta por una carga negativa uniforme.
De esta manera las propiedades eléctricas de cualquier proteína se hacen uniformes y la
migración de la proteína en el campo eléctrico no depende de su secuencia particular de
aminoácidos si no de su tamaño.
Eliminadas otras variables, el factor de migración (Rf) de la proteína será función
únicamente de su peso molecular (PM). Al graficar el logaritmo del peso molecular versus
la distancia recorrida se observará una recta.
La preparación de los geles de poliacrilamida para SDS-PAGE se realiza con el
equipo Mini Protean II de Bio-Rad. Dependiendo del tamaño de las muestras que
queramos separar se utilizara un gel separador con diferente concertación de acrilamida.

Rango efectivo de separación de proteínas en geles de poliacrilamida

Rango de tamaños separables % acrilamida-bisacrilamida en el gel
(kDa) separador

36-205 5

24-205 7.5

14-205 10

14-66* 12.5

14-45* 15

* las proteínas más grandes no se mueven significativamente en el gel

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 Componentes para la preparación de dos geles SDS-PAGE

Reactivo Gel concentrador Gel separador Gel separador

(5%) (ml) (12.5%) (ml) (15%) (ml)

Agua 3.4 3.126 2.34

Acrilamida:Bisacrilamida (30:0.8
0.83 4.17 4.95
p/v)

Tris-HCl 1.5 M pH 8.8 -- 2.5 2.5

Tris-HCl 1.0 M pH 6.8 0.63 -- --

SDS 10% 0.05 0.1 0.1

TEMED 0.05 0.2 0.2

APS (10%) 0.005 0.006 0.006

PROCEDIMIENTO

Materiales y Reactivos
Preparación del Gel
- Buffers: Tris-HCl 1.5M pH 8.8 (gel separador) /Tris-HCl 0.5M pH 6.8 (gel apilamiento)
- Buffer de Corrida electroforética (Trizma base 0.025M, SDS 0.1%, Glicina 0.2M)
- Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%
- Persulfato de amonio (APS) 10%
- N,N,N´,N´- tetramethyl etilen diamina (TEMED)
- Solución de Acrilamida:bisacrilamida (30:0.8)

Siembra de muestra
- Buffer de muestra 5X (4.8 ml H2O; 0.5 M Tris-HCl pH 6.8, 1.2 ml; Glicerol 1 ml; SDS al 10%, 2ml; Azul de
bromofenol al 0.1%, 0.5ml), BME ( Beta-Mercaptoethanol)

Tinción del Gel y Decoloración

- Azul de Coomassie 0.25%: 0.25gr de Coomasie Blue R250 en 90ml metanol: H20 (1:1 v/v) y 10ml de
ácetido acético glacial. Filtrar la solución con papel Whatman 1.
- Decolorante: 300ml Agua destilada, 150ml de metanol 30% y 50ml Acido acético 10%.

Equipos y material fungible

- Cámara electroforética y Fuente de poder
- Micropipetas
- Tips, tubos eppendrof
- Guantes, mandil, regla, calculadora, papel milimetrado

Marcadores de Peso Molecular: (Presenta 6 bandas):

 Albumina - 66 KDa
 Ovoalbumina - 45 KDa

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Preparación del gel SDS-PAGE

El gel está compuesto por dos fases (ver figura adjunta):

1) Gel de apilamiento, el cual presenta menor concentración de acrilamida y por lo tanto poros de
mayor tamaño.

2) Gel de separación, de mayor concentración y poros de menor tamaño.

Para la polimerización (gelificación) del gel, se mezclan las acrilamidas, el buffer Tris, el persulfato
de Amonio y el TEMED, en cantidades adecuadas. El persulfato de amonio (APS) dona los
radicales necesarios para la polimerizacion de la acrilamida-bis-acrilamida, reacción que es
acelerada por el TEMED. Esta reacción se inhibe a pH ácido.

NOTA: El APS y el TEMED deben ser agregados justo antes de mezclar y vertir la solución a la
cámara. De otro modo, se gelificará la solución y no podrá formarse el gel de forma adecuada.

Tratamiento de la muestras:
1. Tomar 25 uL de la muestra y mezclar con 15 uL del Buffer de carga (Loading buffer). Se
pueden utilizar otros buffers de diferente concentración.
2. Hervir la muestra por 5 minutos y luego sembrar 20-25 uL en el gel de poliacrilamida.
3. Luego de 1-2 horas aproximadamente detener la electroforesis y colorear con Azul de
Coomassie.

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NOTA: Cuando las proteínas en una muestra están muy diluídas puede realizarse una
precipitación previa:

4. Tomar 500 uL de la fracción de purificación y colocar en un tubo de microcentrífuga

5. Agregar 500 uL de Etanol absoluto
6. Dejar en hielo por 10 minutos
7. Centrifugar a 13000 rpm por 5 minutos.
8. Lavar el precipitado con buffer fosfato
9. Resuspender el precipitado en 30 ul de buffer fosfato

Tinción del Gel y Decoloración.

1. Colocar el gel en un depósito y cubrir éste con al menos 5 veces su volumen de la solución de
coloración, incubar a temperatura ambiente al menos 4 horas con agitación suave y constante.
2. Transcurrido el tiempo remover el colorante y conservarlo para su uso futuro.
3. Decolorar el gel con solución decolorante por 4 – 8 horas.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es la función del gel de apilamiento?

2. ¿Cuál es la función del β-mercaptoetanol?
3. ¿Cuál es el propósito de hervir la muestra antes de la corrida en los geles SDS-PAGE?
4. Usted analiza una mezcla de proteínas: la proteína A es heterodimérica con subunidades de 15
kDa y 75 kDa, y la otra proteína B es homotrimérica con subunidades idénticas de 25 kDa.
Haga un gráfico de los perfiles de corrida que espera encontrar si hace una corrida en gel SDS-
PAGE y una corrida en gel PAGE no denaturante.
5. Usted ha recibido un tubo Eppendorf que contiene una mezcla de 3 proteínas A, B y C que
debe analizar. Según los datos que se presentan en el cuadro de abajo, grafique el patrón de
bandas (indicando la identidad de la banda) que usted esperaría encontrar al correr esta
mezcla en:
a) un gel SDS-PAGE
b) un gel bidimensional.

Muestra Característica Tamaño (KDa) pI

A Homotrímero 90 (tamaño total) 6,5

B Monómero 50 6.5

C Heterodímero 30 y 45 4,5 y 7.3

6. Analice los geles que se han obtenido en la práctica. Qué diferencias observa entre los perfiles
de proteínas obtenidos en el extracto crudo y en las fracciones obtenidas durante la
purificación? Cómo ha resultado la purificación de la Pirazinamidasa? Discuta los resultados.

7. Grafique en papel milimetrado el peso molecular (MW) de las proteínas del Estándar vs el
factor de migración (Rf). Utilizando su gráfico, determine el peso molecular de la enzima
Pirazinamidasa.

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CUESTIONARIO

1.- Indique cuales fueron los aminoácidos detectados en las muestras vegetales
analizadas en esta práctica y mencione las características y propiedades químicas de
cada uno. Así, también mencione la importancia biológica de estos aminoácidos en los
seres humanos.

2.- De los aminoácidos encontrados en este estudio, elija uno de ellos y describa
detalladamente la ruta biosintética.

3.- Describa como se establece la reacción química entre la ninhidrina y los aminoácidos
estudiados y explique a que se debe la diferencia en la coloración entre un aminoácido y
otro.

4.- Investigue cuales son los valores del Rf para los aminoácidos estudiados y compare
con los resultados obtenidos.

BIBLIOGRAFIA.

 Skoog DA & Leary JJ. (1996). Análisis instrumental. 2ª. Ed. Mc. Graw Hill. Madrid,
España. 1875 pp.

 Valcárcel Cases M. (1994). Técnicas analíticas de separación. 3ª.Ed. Editorial

Reverté. México. 1765 pp. Cap. 12: Introducción a la cromatografía. Pag. 333.

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PRACTICA No. 3. BIOSINTESIS DE AMINOACIDOS

OBJETIVO: Estudiar la biosíntesis del ácido glutámico producido por la bacteria Corynebacterium
glutamicum y conocer técnicas de laboratorio que permitan la cuantificación de este aminoácido.

FUNDAMENTO: A nivel industrial la microbiología ha aportado una gran variedad de productos

para nuestro bienestar, una de ellas es la producción de aminoácidos como el ácido glutámico;
este aminoácido se utiliza para generar compuestos saborizantes (Yamada et al., 1972). La
producción del ácido glutámico en grandes cantidades se realiza hoy en día por la bacteria
Corynebacterium glutamicum, que carecen o que tan solo tienen una capacidad limitada para
procesar el intermediario del ciclo de los ácidos tricarboxílicos α-cetoglutarato a succinil-CoA
(Mathews, 2002). Un nivel de biotina bajo controlado y la adición de derivados de ácidos grasos
originan un aumento de la permeabilidad de membrana y la excreción de elevadas
concentraciones de ácido glutámico (Las bacterias mutantes utilizan la vía del glioxilato para hacer
frente a sus necesidades de intermediarios bioquímicos esenciales, especialmente durante la fase
de crecimiento. Cuando el crecimiento se ve limitado por cambios de la disponibilidad de
nutrientes, se produce una conversión molar casi completa (o una conversión del 81.7% en peso)
de isocitrato a glutamato (Prescott et al., 2004).

METODOLOGIA

Material: Medio de cultivo: (gL-1):

Vaso de precipitado de 250 ml 26 gr. Glucosa

Probeta graduada de 100 ml 5 gr. Extracto de levadura
Pipeta graduada de 5 y 10 ml 5 gr. Extracto de carne
Matraz volumétrico de 100 ml 7 gr. peptona
Parrilla de calentamiento 2 gr. Urea
Termómetro de -20-120º C 3 gr. NaCl
Papel filtro 4 gr. NH4Cl
Regla milimétrica 1 gr. KH2PO4
2 gr.K2HPO4
Baño maría 0.4 gr. MgSO4.7H2O
10 mg. FeSO4.7H2O
1 mg. MnSO4.5H2O
1000 ml agua destilada

pH=7.2; agitación: 95-120 rpm

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Preparación de reactivos:

Ninhidrina:

Se disuelven 200 mg de ninhidrina en 50ml de alcohol etílico absoluto.

Se añaden 50 ml de etilenglicol puro.
Se agrega 1 ml de ácido acético glacial.
Se mezcla todo y se mantiene en refrigeración.
Es preferible que este reactivo se prepare al momento de usarlo.

Discos tratados con KOH:

Se prepara una solución de KOH al 3 % en alcohol etílico al 96 %.

El KOH alcohólico se pasa a una probeta de 100 ml en la que se sumergen 8 tiras de papel
Whatman (papel filtro), de 3 cm de ancho.
Las tiras se dejan secar al aire a temperatura ambiente.
Ya secas se cortan en cuadrados de 3cm y se recortan las esquinas para tener discos octagonales
(emplear guantes y tijeras limpias).
Los discos se reparten en 4 lotes (blanco, problema, patrón de 2 μg y de 4 μg, se guardan en sus
respectivas bolsitas de papel aluminio en el desecador hasta su uso.

Discos patrón:

Se pesan 42 mg de ácido glutámico.

Se ponen en un matraz volumétrico de 100 ml y se disuelven en 50 ml de solución de EDTA.
Una vez disuelto se afora en agua destilada.
Se separan 2 grupos de discos octagonales (preparados anteriormente) y se le agrega 0.1 y 0.05
ml de esta solución y se dejan secar; se guardan como los discos patrón tratados con KOH.
Los discos contienen 4 μg y 2 μg de nitrógeno (respectivamente) de ácidos aminados.
Los 2 lotes de discos se guardan en sus respectivas bolsitas de papel aluminio en el desecador
hasta su uso.

Solución de EDTA:

Se disuelven 500 mg de EDTA en 50 o 60 ml de agua destilada, aplicando calor ligero.

Se deja enfriar, el pH se lleva a 7.2 con NaOH al 10% (p/v) y se afora a 100 ml con agua destilada.

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PROCEDIMIENTO:

1.- Inoculación: En un matraz Erlenmeyer que contiene 50 ml de caldo de cultivo nutritivo inocular
de 2 a 3 asadas de la cepa Corynebacterium glutamicum bajo condiciones asépticas y mezclar el
medio cuidadosamente con la ayuda de un vórtex.

2.- Condiciones de cultivo: Colocar el matraz con el inoculo bacteriano en agitación constante a
110 rpm durante 18-20 hrs (tiempo suficiente para que la bacteria produzca el ácido glutamico) a
una temperatura de 28º-30ºC.

3.- Cuantificación de Glutamato.

a. Se toman 2 ml de la muestra (caldo libre de células) se adicionan 2 ml de solución de

EDTA.
b. Se agrega 0.1ml y 0.2 ml de la mezcla anterior en discos tratados con KOH.
c. Los discos se secan con aire caliente (secadora para cabello)
d. Manejando el disco con pinzas se enrollan en espiral y se coloca en un tubo de ensayo de
150x16mm. Se ponen en la misma forma los tubos patrón y el blanco.
e. Se añaden a todos los tubos 5 ml de Ninhidrina.
f. Se cubren con papel aluminio.
g. Se incuban para desarrollo de color por 20 min en agua hirviendo.
h. Los tubos se enfrían a temperatura ambiente.
i. Se añaden 50 ml de alcohol etílico al 50 % (v/v). Se mezclan.
j. Se lee la absorbancia a 570nm. Estableciendo 0 de absorbancia con el blanco. (La
absorbancia del problema se compara con la del patrón más cercano)

ANEXOS:

a). Cálculos: Determinación de la cantidad de Ac. Glutámico

Patrón 2μg:

Abs del problema x 2 x 1000

Abs del patrón 1000 0.5

Por lo que:
Abs del problema x 40 = μg de N de ac. Aminados
Abs del patrón L

Patrón 4μg:
Abs del problema x 80 = μg de N de ac. Aminados
Abs del patrón L

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CUESTIONARIO.

1.- Describa la ruta y explique detalladamente como ocurre la biosíntesis del glutamato en la
bacteria Corynebacterium glutamicum.

2.- Investigue las características bioquímicas del Ac. Glutámico.

3.- Mencione ejemplos, en donde se pueda apreciar la importancia del Ac. Glutámico en la
industria farmacéutica, médica y alimentaria.

4.- Investigar otras técnicas que permitan estudiar y cuantificar la cantidad de aminoácidos en una
muestra biológica.

5.- Cuales los factores físicos y químicos, que pueden alterar o inhibir la síntesis del acido
glutámico en cultivo bactriano.

BIBLIOGRAFIA.

 Mathews Christopher K. (2002).Bioquímica. 3ª. Ed. Ed. Pearson. España. 1368 pp.

 Prescott L.M., Harley J.P., D.A. Klein.(2004). Microbiología. 5ª edición. Mc Graw Hill.
España. P: 1089-1090.

 Yamada, K., Kinoshita, S., Tsunoda, T., Aida, K. (1972). The Microbial Production of Amino
Acids. Wiley, New York. 175 pp.

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PRACTICA No. 4 “EXTRACCION DE ADN BACTERIANO”

OBJETIVO: Conocer y aplicar un protocolo que permita la extracción del ADN de una
cepa bacteriana y estudiar las características moleculares de este importante ácido
nucleico.

FUNDAMENTO: El ADN, ácido desoxirribonucleico, se define como un biopolímero

(compuesto químico formado por unidades estructurales que se repiten) que constituye el
material genético de las células. Está formado por unidades que están ordenadas según
una secuencia y es ahí donde se encuentra la información para la síntesis de proteínas.
Es el responsable del código genético, que determina en gran medida las características
de los seres vivos al nacer (Alberts et al., 2007). La molécula de ADN está formada por
dos cadenas formada por compuestos químicos llamados nucleótidos. Existen cuatro
tipos de nucleótidos diferenciados por sus bases nitrogenadas; adenina, timina, citosina y
guanina. Las cadenas forman una especie de cadena retorcida, lo que permite que el
ADN se pueda desenrollar y hacer una lectura de éste. Cada nucleótido posee una
afinidad química con aquel que se encuentra en paralelo en la otra cadena. Los
nucleótidos están formados por un ácido fosfórico, una desoxirribosa y una base
nitrogenada (Nelson & Cox, 2005). La extracción o aislamiento del ADN permite el
estudio, análisis y caracterización de esta biomolecula. Los pasos necesarios para una
correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: 1.
Lisis de las células. Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de
macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su
desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para
eliminar las membranas. 2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se
consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse
mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. 3.
Purificación. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o
isopropanol y se puede recuperar mediante una centrifugación (Chen & Kuo, 1993). El
alcohol del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente. De todas las
muestras biológicas que podemos someter a un proceso de extracción de ADN, las
suspensiones bacterianas, son quizás las que ofrecen menos problemas por la
homogeneidad y riqueza del material. En particular, las suspensiones densas de bacterias
gramnegativos pueden liberar cantidad suficiente de ADN en condiciones bastante suaves
como pueden ser una simple ebullición, congelación o una combinación de ambas.

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METODOLOGIA.

I.- Medio de cultivo y suspensión bacteriana:

a) Cajas con medio solido PY++

Primero, cepas rizobianas deben ser cultivadas en el medio de cultivo PY-Ca++ (peptona
de caseína y extracto de levadura plus calcio). De acuerdo a los siguientes ingredientes:

INGREDIENTES CANTIDAD (g)

Extracto de levadura 0.3

Peptona de caseína 0.5

Agar bacteriológico 1.5

Agua destilada a pH: 6.8 100 ml

Disolver y calentar perfectamente el medio. Esterilizar en autoclave a 120° C/ 15 min.

Enfriar el medio y adicionar 1 ml de CaCl2 al 0.7 M, previamente esterilizado con la ayuda
de una micropipeta en la campana de flujo laminar. Llenar las cajas de Petri y esperar la
gelificación. Las cajas son sembradas con las cepas y después deben ser incubadas a
28º - 30º C, durante 24-48 hrs.

b) Suspensión bacteriana. Caldo PY++, en tubos para 100 ml de medio.

Se prepara medio de cultivo PY++, de acuerdo a la composición indicada en el cuadro

siguiente. Se colocan 2 ml del medio en tubos de ensayo y se procede a esterilizar en
autoclave a 120º C por 15 min. También debe agregarse 1.0 ml de CaCl 2 al 0.7 M previamente
esterilizado. Los tubos son inoculados con las cepas correspondientes para lograr las
suspensiones bacterianas que se emplean en la extracción del ADN.

INGREDIENTES CANTIDAD (g)

Extracto de levadura 0.3

Peptona de caseína 0.5

18
II. Protocolo de extracción de ADN bacteriano.

Para este fin se utilizara el kit de aislamiento de ADN marca Amershan Biosciences®: el cual
cuenta con los siguientes reactivos: a) Solución de lisis, b) RNasa, c) Solución para precipitar
proteínas y d) Solución de hidratación de ADN. De acuerdo al siguiente procedimiento:

Paso 1: Coloque en un tubo Eppendorff limpio y esterilizado, 200 µl de una suspensión bacteriana.
Centrifugar la muestra a 13,000 rpm durante 30 segundos.

Paso 2: Elimine cuidadosamente el sobrenadante con la ayuda de una micropipeta. Evite tocar el
“Pellet” durante la extracción del sobrenadante.

Paso 3: Adicione 120 µl de solución de lisis al “Pellet” que está depositado en el fondo del tubo
Eppendorff. Resuspenda la muestra (arriba-abajo) con la ayuda de una pipeta, esto para mezclar y
disolver correctamente el paquete celular. Incubar la mezcla a 80º C en un baño maría durante 40
minutos.

Paso 4: Enfriar la muestra a temperatura ambiente y ahora adicione 0.5 µl de la enzima RNasa.
Mezcle muestra invirtiendo los tubos cuidadosamente por lo menos 25 veces.

Paso 5: A continuación adicionar 40 µl de la solución “para precipitar proteínas”. Vortexear

vigorosamente durante 20 segundos.

Paso 6: Incubar la muestra en hielo durante 10 minutos. Al concluir el tiempo centrifugar a 13000
rpm durante 8 minutos.

Paso 7. Cuidadosamente y con la ayuda de una micropipeta, extraiga el sobrenadante y coloque

en un tubo Eppendorff nuevo y limpio (etiquetar el tubo para evitar confusiones). Desechar el
precipitado (proteínas). Nota: cuide el sobrenandante, ya que ahí se encuentra el ADN.

Paso 8: Adicione al sobrenadante 200 µl de isopropanol al 100 % y agite cuidadosamente

invirtiendo la muestra 50 veces. Nota: El ADN es insoluble en este solvente y por lo tanto la
molécula de ADN precipita y se plegara formando una fina hebra.

Paso 9: Centrifugar esta nueva mezcla a 13000 rpm durante 10 minutos. Al terminar la centrifugar,
drenar el sobrenadante y cuidar de no perder el precipitado (ADN) que se encuentra en el fondo
del tubo. Adicionar 200 µl de etanol al 70 % (frio) por las paredes del tubo lentamente para lavar el
pellet (ADN). Invertir la muestra 25 veces para mezclar los componentes químicos.

Paso 10: Centrifugar la muestra a 13000 rpm durante 5 minutos. Al terminar la centrifugación,
drenar el sobrenadante sobre un papel absorbente y dejar secar la muestra durante 30 minutos.

Paso 11: Después de este tiempo de secado, adicionar 25 µl de “solución de hidratación del ADN”
e incubar la muestra a 65º C por 30 minutos en el baño maría.

Paso 12: Finalmente, almacenar los tubos con el ADN a 2-8º C en el ultra-refrigerador.
19
CUESTIONARIO.

1.- Investigue que es el ADN y cuáles son sus características moleculares principales.

2.- Cuales son las propiedades físicas y químicas del ADN, que lo convierten en una molécula
fundamental en la transferencia de la información genética.

3.- Investigue cuales son las características moleculares del ADN bacteriano. Utilice esquemas
para apoyar la respuesta.

4.- Cuales son los factores químicos que pueden alterar o modificar la estructura molecular del
ADN.

5.- Investigue el fundamento bajo el cual se lleva a cabo las diferentes etapas durante el protocolo
de extracción del ADN: a) lisis celular, b) acción de la RNAasa, c) precipitación de la proteína y d)
acción del isopropanol y el etanol.

6.- Mediante un diagrama de flujo, proponga un protocolo para extracción de ADN en muestras
vegetales, detallando los reactivos y condiciones aplicadas en cada etapa de la extracción.

BIBLIOGRAFIA.

 Alberts, B; A, Johnson; J, Lewis; M, Raff; K, Roberts & P, Walter. (2007). Molecular Biology
of the Cell. 5th. ed. Garland Science. N.Y., EE.UU.

 Chen W, Kuo T. (1993). A simple and rapid method for the preparation of gram-negative
bacterial genomic DNA. Nucleic Acids Res. 21: 2260-2264.

 Nelson David L, Michael M. Cox. 2005. Principios de Bioquímica. 4a. Ed. Editorial Omega.
España. 1437 pp.

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PRACTICA No. 5. “ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA”

OBJETIVO: Conocer y aplicar la técnica de electroforesis horizontal en agarosa para

verificar y cuantificar la cantidad de ADN cromosómico extraído de células bacterianas.

FUNDAMENTO: El término electroforesis se usa para describir la migración de una

partícula cargada bajo la influencia de un campo eléctrico (Nelson & Cox, 2001). Muchas
moléculas importantes biológicamente (aminoácidos, péptidos, proteínas, nucleótidos,
ácidos nucléicos) poseen grupos ionizables y existen en solución como especies
cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se van a
separar en función de su carga cuando se aplica un voltaje a través de los electrodos. La
electroforesis en gel es una técnica muy utilizada para separar moléculas o fragmentos de
moléculas de ácidos nucléicos. Los materiales más comunes para separar moléculas de
ácidos nucléicos es la agarosa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y
permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Es importante la
utilización de marcadores de tamaño conocido porque nos permitirán calcular los pesos
moleculares de las muestras de DNA problema. En el caso de los geles de agarosa, se le
añade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las bases del DNA y es
fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se visualiza el
gel con una lámpara de luz UV, y se verán las bandas correspondientes a las muestras de
DNA aplicado y los marcadores de peso molecular (Stryer & Tymoczko, 2003).

METODOLOGIA:

Material: Reactivos:

1 matraz Erlenmeyer de 250 ml. Agarosa tipo I

3 micropipetas (0.5-10 µ l; 20-120 µ l, 100-1000 µl). Colorante Buffer azul
1 kit de puntas para micropipetas. Marcador molecular DNA
1 probeta graduada de 100 ml. TAE 1X
1 Gradilla para tubos Eppendorff. Agua tridestilada
1 Cámara de electroforesis horizontal y accesorios. Bromuro de etidio
1 Transiluminador
1 Foto documentador con cámara digital integrado
1 Balanza analítica.
1 Horno Microondas
Procedimiento:

21
1. Preparación de moldes:
Dependiendo de la cantidad de muestra a verificar, elegir el volumen de agarosa a
utilizar (50, 100, 200 ml) y seleccionar los peines correspondientes; colocar los
accesorios del molde y nivelar el molde y la cámara de electroforesis.

2. Preparación de agarosa:
En un matraz Erlenmeyer de 250 ml, colocar 100 ml de solución TAE 1X y
disolver 0.8 gr de agarosa tipo I, agitar ligeramente, después licuar en el
microondas con el tiempo requerido (hasta que la solución este totalmente diluida,
cero impurezas). Colocar la agarosa en el molde de la cámara de electroforesis
cuidadosamente.

Nota: cuidar que los niveles de los peines de los pozos queden a ¾ del volumen,
eliminar las burbujas que se formen. Y dejar enfriar a 8°C durante 20 minutos.

3. Llenado del gel de agarosa:

Colocar las muestras en cada pozo correspondiente en el gel de agarosa. En el
pozo No. 1 colocar 2 µl del marcador DNA, previamente mezclado con 3 ul de
colorante Buffer azul. De la misma manera coloque las muestras problemas en los
pozos en su respectivo orden consecutivo. En este caso colocar 6 µl ADN y
mezclar con 3 µl de colorante azul.

4. Electroforesis:
Colocar los moldes de agarosa en la cámara de electroforesis y correr a 110 Volts
durante 35 minutos. Nota: El recipiente de la cámara debe llenarse con solución
TAE 1X.

5. Revelado del gel de agarosa:

Cuidadosamente coloque el gel que ha sido tratado en un recipiente que contenga
bromuro de etilio al 5% y revele la muestra durante 10 minutos en la oscuridad.
Después, lavar el gel con agua corriente durante 5 minutos.

6. Verificación del ADN

Analice el gel de electroforesis en un transiluminador a una longitud de 302 nm.
Tome una imagen fotográfica y calcule la concentración de ADN en ng.

Nota importante: En todos los pasos utilizar guantes, especialmente en el

revelado, no hacer contacto con el bromuro de etilio por su poder mutagénico.

22
CUESTIONARIO

1. En que consiste la electroforesis e investigue fundamento para el estudio del

ADN.
2. ¿Cuál es su aplicación en el área de la biología molecular y genética?
3. ¿Cuáles son las características moleculares de la agarosa y del bromuro de
etilio?
4. Investigue en que consiste la electroforesis PAGE-SDS y para que estudios se
recomienda.
5. Investigue las técnicas para la cuantificación de ADN por:
a) Espectrofotometría
b) Usando marcador molecular

BIBLIOGRAFIA:

 Bio-Rad: Protocolo que acompaña al “Quantum Prep Miniprep Kit”.

 Nelson DL, Cox MM (2001): “Principios de Bioquímica”, 3ª ed. Editorial Omega

(Barcelona, España), pp 1119-1128.

 Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): “Bioquímica”, 5ª ed. Editorial Reverté

(Barcelona, España), pp 152-154.

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PRACTICA No. 6. “REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)”

OBJETIVO: Conocer y aplicar la técnica en Reacción en Cadena de la Polimerasa para el

estudio y caracterización de un gen cromosomal bacteriano.

FUNDAMENTO: La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus

siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular
desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias
de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una
única copia de ese fragmento original, o molde (Eardly et al.,2005). Esta técnica sirve para
amplificar un fragmento de ADN; y permite la identificación de bacterias o virus, así como
realizar estudios filogenéticos basada en genes cromosomales, pruebas de clonación de
ADN para la secuenciación, análisis funcional de genes, el diagnóstico de trastornos
hereditarios, la identificación de huellas genéticas y la detección y diagnóstico de
enfermedades infecciosas. Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las
ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras
cada fase de replicación y, a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para
que vuelvan a duplicarlas (Olive & Bean, 1999).

METODOLOGIA.

Material:
 Termociclador
 Vortex
 Tubos Eppendorff de 1.5 ml y 0.2 ml para PCR.
 1 Gradilla para tubos PCR
 3 micropipetas (0.5-10 µ l; 20-120 µ l, 100-1000 µl).
 1 kit de puntas para micropipetas.

Reactivos:
 dNTP´s (dTTP, dGTP, dATP, dCTP).
 Oligonucleotidos: (fd1 y rd1)
 MgCl2-7H2O
 Buffer 10X
 Agua MiliQ.
 Taq polimerasa

24
Procedimiento:

1.- CARGA DE REACCION: Primeramente, debe prepararse la carga de reacción en un

tubo Eppendorff para 25 µl de producto PCR, de acuerdo a las cantidades y proporciones
indicadas en el cuadro No. 1.

REACTIVO 1 TUBO (25 µl)

1. dNTP´s 0.2
2. Primer (Fd1) 0.25
3. Primer (rd1) 0.25
4. MgCl2 0.75
5. Buffer 10X 2.5
6. Taq polimerasa 0.125
7. H2O miliQ. 20.92
VOLUMEN FINAL 25.0

2.- MEZCLA DE REACTIVOS: Inicie la mezcle de los reactivos, colocando primero el

agua MiliQ (7) en el tubo Eppendorff y después adicione el dNTP´s (1), los primer fd1 (2) y
rd1 (3), continúe con el MgCl2 (4) y después agregue el buffer 10X (5) y finalice con la Taq
polimerasa. Ahora, vortexear la muestra y distribuya equitativamente en los tubos para
PCR, colocando 24 µl de la mezcla de reacción y 1 µl del ADN molde (problema).

3.- TERMOCICLADOR: Coloque los tubos de PCR en el termociclador y programe el

equipo para la amplificación del gen 16S rDNA, de acuerdo a las siguientes instrucciones
de amplificación:

Figura 1. Programa para realizar amplificación del gen 16S ADNr mediante la técnica de PCR.

25
4.- EFICIENCIA DEL PCR: La eficiencia de la reacción será estimada por electroforesis
de 5 µl del producto amplificado sobre un gel horizontal de agarosa al 1% (p/v) a 100 Volts
por 35 min. Después de la migración, el gel será teñido en una solución acuosa de
bromuro de etidio (1 mg/ml) y se analizara en un transiluminador UV-260 nm acoplado a
un sistema de fotodocumentación marca Eagle Eye II.

5.- ESTIMACION: Con la ayuda del marcador molecular determine el peso molecular y
tamaño del gen amplificado. Registre la imagen con la ayuda del fotodocumentador.

CUESTIONARIO.

1.- Mediante un gráfico explique en que consiste la PCR.

2.- Cuales son las aplicaciones y/o empleo de la técnica de la PCR en el campo de la
investigación científica.

3.- Investigue en artículos científicos que otros genes pueden ser amplificados con esta
técnica, cuales son las reacciones de carga y los programas usados en la amplificación

4.- En que consiste la técnica del PCR en tiempo real, investigue y explique
detalladamente.

5.- En que consiste la secuenciación masiva de genes.

BIBLIOGRAFIA:

 Eardly, B.D., Nour S.M., van Berkum and Selander K. (2005). Rhizobial 16S rRNA and
dnaK genes: Mosaicism and uncertain phylogenetic placement of Rhizobium galeae. Appl.
Environ Microbiol 71: 1328-1335.

 Olive, D.M., and Bean, P. (1999). Principles and applications of methods for DNA-based
typing of microbial organisms. J Clin Microbiol. 37: 1661-1669.

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PRACTICA No. 7. “HUELLAS GENOMICAS”

OBJETIVO: Conocer y aplicar la técnica ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic

Consensus) para el estudio de las huellas genómicas de un organismo.

FUNDAMENTO: Las secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas (secuencias REP)

y las secuencias concenso repetitivas intragénicas de enterobacterias (secuencias ERIC)
son algunas de las secuencias rep que más se han utilizado en estudios epidemiológicos
de brotes infecciosos (Vila ET AL., 1996). La técnica de REP-PCR se caracteriza por su
simplicidad (no requiere el uso de enzimas de restricción, ni técnicas electroforéticas
especiales), rapidez (menos de 24 h) y su relativo bajo coste, una vez que se dispone de
un termociclador. Para el estudio de las huellas genómicas en microorganismos se
emplea comúnmente la técnica denominada ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic
Consensus). Esta técnica esta basada basada en el DNA, depende de la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y “primers” dirigidos a secuencias de nucleótidos
específicas designadas como secuencias para generar huellas genómicas específicas de
cada cepa bacteriana u organismos en estudio (Welsh & Celland, 1990).

METODOLOGIA.

Material:
 Termociclador
 Vortex
 Tubos Eppendorff de 1.5 ml y 0.2 ml para PCR.
 1 Gradilla para tubos PCR
 3 micropipetas (0.5-10 µ l; 20-120 µ l, 100-1000 µl).
 1 kit de puntas para micropipetas.

Reactivos:
 dNTP´s (dTTP, dGTP, dATP, dCTP).
 Oligonucleotidos: (Eric 1 y Eric 2)
 MgCl2-7H2O
 Buffer 10X
 Agua MiliQ.
 Taq polimerasa

27
Procedimiento:

1.- CARGA DE REACCION: Primeramente, debe prepararse la carga de reacción en un

tubo Eppendorff para 10 µl de producto PCR, de acuerdo a las cantidades y proporciones
indicadas en el cuadro No. 1,

REACTIVO 1 TUBO (10 µl)

1. Buffer 10X 1
2 DMSO 10% 1
3 MgCl2 1.52
4 dNTP´s 1.24
5 ERIC 1 0.2
6 ERIC 2 0.2
7 Taq polimerasa 0.08
8 H2O miliQ. 3.96
VOLUMEN FINAL 10.0

2.- MEZCLA DE REACTIVOS: Inicie la mezcle de los reactivos, colocando primero el

agua MiliQ (8) en el tubo Eppendorff y después adicione el Buffer (1), el DMSO al 10% (2)
y a continuación el MgCL2 (3), de ahí los dNTP´s (4), continúe con los primer´s (5 y 6) y
finalice con la Taq polimerasa (7). Ahora, vortexear la muestra y distribuya
equitativamente en los tubos para PCR, colocando 9.0 µl de la mezcla de reacción y 1 µl
del ADN molde (problema).

3.- TERMOCICLADOR: Coloque los tubos de PCR en el termociclador y programe el

equipo para la amplificación ERIC-PCR, de acuerdo a las siguientes instrucciones de
amplificación:

1 hld 3 tmp 30 Ciclos 2 Holds

95.0 oC 93.0 oC 50.0 Co
65.0 oC 65.0 oC 4.0 oC
3:00 0:45 1:00 8:00 16:00 ∞

4.- EFICIENCIA DEL PCR: Los productos de ERIC-PCR se cargaran en un gel de

agarosa al 1.5 % colocando 5 ul de producto de PCR de cada muestra analizada, 2.5 de
buffer de carga y 2 ul de marcador de peso molecular (1Kb). Las muestras se correrán a
115 volts por 35 minutos. Después de la migración, el gel será teñido en una solución
acuosa de bromuro de etidio (1 mg/ml) y se analizara en un transiluminador UV-260 nm
acoplado a un sistema de fotodocumentación marca Eagle Eye II.

28
CUESTIONARIO.

1.- Mediante un gráfico explique en qué consiste la ERIC-PCR?

2.- Cuales son las aplicaciones y/o empleo de la técnica de la ERIC-PCR en el campo de
la investigación de la biología molecular y medicina.

3.- En qué consisten las técnicas moleculares RFLP y AFLP?

4.- Cuales son los oligonucleótidos o “primer´s”, que mas se emplean para el estudio de
huellas genómicas en los microorganismos bacterianos.

5.- Investigue la técnica empleada para el estudio de las huellas genómicas en los seres
humanos.

BIBLIOGRAFIA

 Vila J, Marcos MA, Jiménez de Anta MT.(1996). A comparative study of different

PCR-based DNA fingerprinting techniques for typing of Acinetobacter
calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex. J Med Microbiol, 44:482-489 .

 Welsh J, Mc Celland M. (1990). Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary

primers. Nucleic Acids Res,18:7213-8 .

29
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PRACTICA NO. 8. “TECNICA DE ARDRA (ENZIMAS DE RESTRICCION)”

OBJETIVO: Conocer y aplicar la técnica ARDRA (Amplified Ribosomal rDNA Restriction

Analysis) para la identificación de especies bacterianas con base en el gen
cromosomal16S rDNA y empleo de las enzimas endógenas de restricción.

FUNDAMENTO: ARDRA (Amplified Ribosomal rDNA Restriction Analysis) es una

técnica de “Fingerprint” o huella de DNA que se usa para caracterizar comunidades y
poblaciones. La técnica consiste en amplificar por PCR el gen de 16S rDNA de la
comunidad total, aislar las diferentes copias que se encuentran en la mezcla y
posteriormente someter a cada una de las copias a digestiones enzimáticas (restricción),
también puede digerirse la muestra total (sin separar las copias). El análisis de restricción
de DNA ribosomal amplificado (ARDRA: primero fue aplicado a la identificación de cepas
importantes medicamente, pero ha sido reportado como una herramienta confiable para
los estudios taxonómicos y filogenéticos de organismos cultivables y no cultivables
provenientes de diferentes habitat´s (Hill et al., 2000). Basado sobre la localización de
sitios de restricción dentro del ADNr 16S permite una comparación rápida de un gran
número de cepas. El ADNr 16S amplificado por PCR es digerido con enzimas de
restricción y luego se hace una electroforesis de los fragmentos resultantes. La
comparación de los patrones generados permite la diferenciación de los aislados y
permite indicar cuales tienen la secuencia ADNr 16S. Este método tiene un amplio empleo
en la identificación de una variedad de especies bacterianas y otros niveles de
organismos (Versalovic et al., 1991). Los patrones de restricción permiten identificar
diferentes grupos (diferentes patrones de restricción no significan necesariamente
especies diferentes) o identificar comunidades distintas. Si el ARDRA se hace con copias
separadas del gen 16S rRNA, el análisis de los diferentes patrones permite hacer
estimaciones de diversidad y/o elegir representantes de los patrones distintos para
obtener las secuencias e identificar los grupos taxonómicos específicos a los que
pertenecen o con los que se relacionan. El problema principal de esta técnica es que dado
el número de clonas que se deben de obtener por comunidad para determinar su
diversidad y abundancia por restricción los costos son casi iguales que si se secuencia la
comunidad.

30
METODOLOGIA.

Material:
 Termociclador
 Vortex
 Tubos Eppendorff de 1.5 ml y 0.2 ml para PCR.
 1 Gradilla para tubos PCR
 3 micropipetas (0.5-10 µ l; 20-120 µ l, 100-1000 µl).
 1 kit de puntas para micropipetas.

Reactivos:
 Enzima de restricción: Rsa I
 Buffer
 Agua MiliQ.

Procedimiento:

1.- CARGA DE REACCION: Utilizando los productos de PCR del gen 16S rDNA
realizar la digestión enzimática de acuerdo a las cantidades y proporciones
indicadas en el cuadro No. 1.

REACTIVO 1 TUBO (10 µl)

Buffer 10X 1.0
Enzima Rsa i 0.3
Producto de PCR 16S 1.5
H2O miliQ. 7.2
VOLUMEN FINAL 10.0

31
2.- DIGESTION ENZIMATICA. Una vez realizada la reacción, incube la muestra a
37oC durante 24 horas.

3.- ELECTROFORESIS ARDRA: Los productos digeridos enzimáticamente se

colocaran en un gel de agarosa al 3 % y se corrieron en una cámara electroforesis
a 130 V durante 40 minutos. Posteriormente el gel debe teñirse en 300 ml de agua
destilada con 40 ul de bromuro de etidio en agitación constante durante 5 minutos.
Estudiar y analizar los patrones de restricción en un transiluminador UV-260 nm
acoplado a un sistema de fotodocumentación marca Eagle Eye II.

CUESTIONARIO.

1.- Mediante un gráfico explique en que consiste la ARDRA

2.- Cuales son las aplicaciones y/o empleo de la técnica de la ARDRA en el

campo de la investigación de la biología molecular y medicina.

3.- Investigue otras técnicas empleadas para la identificación y estudio filogenético

de microorganismos.

BIBLIOGRAFIA.

 Hill GT, Mitkowski NA, Aldrich-Wolfe L, Emele LR, Jurkonie DD, Ficke A,
Maldonado-Ramirez S, Lynch ST, Nelson EB. (2000). Methods for
assessing the composition of soil microbial communities. Appl. Soil Ecol. 15:
25-36

 Versalovic J, Koeuth T, Lupski JR (1991). Distribution of repetitive DNA

sequences in eubacteria and application to fingerprinting of bacterial
genomes. Nucleic Acid Res. 19: 6823-6831.

32