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I.-‐ Objetivo:
Identificar la presencia de M. tuberculosis en muestras de Biopsia por PCR en tiempo real.
a. Equipo
• Termociclador
en
tiempo
real.
Ej:
ECO
qPCR
(ILLUMINA).
b. Materiales
y
reactivos
• Placa
Eco
qPCR.
• AmpliGold
Mix.
• Agua
Grado
Molecular
• Control
no
relacionado
• Control
positivo
• Blanco
(mix
sin
DNA)
• Sonda
Msp
y
Mtb.
• Primers
Mtb
• Primers
de
Actina
• Sonda
de
actina
V. Resultados
(-‐)
Las
muestras
que
amplifican
son
positivas.
La
tecnología
Taqman
es
más
específica
por
lo
que
es
solo
necesario
observar
las
curvas
de
amplificación.
Sin
embargo,
el
hecho
de
usar
SYBRgreen
puede
dificultar
el
análisis,
ya
que
es
más
probable
que
se
amplifique
productos
inespecíficos,
por
lo
que
es
necesario
la
curva
de
melting
que
ayude
a
discriminar
el
resultado.
Si
el
patrón
de
melting
se
asemeja
al
control
(+)
la
muestra
es
positiva.
Por
el
contrario
si
se
asemeja
al
patrón
del
control
(-‐)
la
muestra
es
negativo.
Esto
solo
se
aplica
para
sondas
reversibles
como
el
SYBRgreen.
PROBLEMAS
1.-‐
Se
hace
una
extracción
de
ADN
utilizando
columnas
de
unión
a
ADN
(Qiagen)
para
el
estudio
molecular
de
mutaciones
EGFR.
Al
medir
en
el
biofotómetro
se
obtiene
una
concentración
de
850
ng/ul
en
50
ul
de
volumen
de
elución.
Para
la
PCR
se
debe
trabajar
con
un
mix
de
primers
(Forward
y
Reverse)
que
están
a
una
concentración
de
50
uM
y
estos
deben
trabajarse
a
250
nM
como
concentración
final.
Tengo 850 ng/ul en 50 ul, para llevarlo a una concentración menor como 100 ng/ul debo diluirlo.
C1xV1 = C2xV2
V1= es el volumen que debo tomar de mi concentración inicial, es decir mi incógnita.
C2= 100 ng/ul (la concentración a la que quiero llevar el reactivo, conc. Final)
C1xV1 = C2xV2
Por
tanto
para
llevar
al
ADN
a
una
concentración
de
100
ng/ul
debo
usar
58.82
ul
de
mi
stock
de
ADN
y
llevarlo
a
500
ul
con
agua
ultra
pura
(500-‐58.82=
441.18ul)
b.
Indicar
que
volumen
de
ADN
se
debe
tomar
de
la
concentración
final
para
la
PCR
si
se
desea
tener
150
ng
de
ADN
en
la
reacción.
Por
el
enunciado
anterior
ahora
tengo,
mi
ADN
a
una
concentración
de
100
ng/ul
(esta
concentración
ahora
es
mi
concentración
inicial),
pero
deseo
150
ng
en
mi
mix
de
PCR.
c.
Indicar
el
volumen
final
que
se
debe
tomar
de
los
primers
(50
uM)
para
prepararlos
a
250
nM
como
concentración
final
en
la
reacción.
Los
primers
están
a
50
uM
(concentración
inicial)
pero
los
quiero
a
una
concentración
final
(en
el
mix)
de
250
nM.
Lo
primero
que
debo
recordar
es
que
para
hacer
los
cálculos
las
concentraciones
deben
estar
EN
LAS
MISMAS
UNIDADES.
C1xV1 = C2xV2
V1= es el volumen que debo tomar de mi concentración inicial, es decir mi incógnita.
C2= 0.25 uM (la concentración a la que quiero llevar el primer, conc. Final)
V2= el volumen final del mix, por ejm 20 ul
El
volumen
a
usar
sería
de
0.1
ul
por
reacción,
pero
usualmente
se
corre
la
muestra
por
duplicado,
un
control
no
relacionado,
un
control
negativo
(sin
ADN)
y
un
control
positivo,
es
decir
en
este
caso
5
reacciones,
por
lo
que
debería
ser
0.1
x
5=
0.5
ul
en
el
mix.