INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
“DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL”

LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL

MÉTODO DE LOWRY

NOMBRE

GRUPO

SECCIÓN
 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL
MÉTODO DE LOWRY

INTRODUCCIÓN

El método de Lowry (1951) es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas. A

la muestra se añade un reactivo que forma un complejo coloreado con las proteínas, siendo la
intensidad de color proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Lambert-Beer A=
ε.l.c. Este método consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las proteínas formando complejos con los
átomos de nitrógeno de los enlaces peptídicos. Estos complejos Cu2+-proteína tienen un
color azul claro. Además, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la
proteína, exponiéndose los residuos fenólicos de tirosina que van a participar en la segunda
etapa de la reacción. El Cu2+ se mantiene en solución alcalina en forma de su complejo con
tartrato.
2) La reducción, también en medio básico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos
fenólicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayoría de las proteínas, actuando el
cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el ácido
fosfomolibdotúngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los grupos fenolicos da lugar
a un complejo de color azul intenso.

Figura 1. Reacción entre la proteína y reactivo de Folinpor el método de Lowry.

OBJETIVOS

 Determinar la cantidad de proteína (hemoglobina) utilizando el método de Lowry y obtener

la curva de estandarización.
 Demostrar el nivel de precisión ejecutada durante el método mediante un análisis estadístico.
 Analizar los efectos de sustancias no proteicas en la absorbancia mostrada por hemoglobina.
 Conocer las ventajas del método de Lowry con respecto a otros métodos para la
determinación de proteínas.
RESULTADOS

Tabla 1. Curva de calibración de hemoglobina por método de Lowry.

Tubo No. Cantidad de A590

Proteína (µg) Serie A Serie B
1 25 0.068 0.044
2 50 0.140 0.123
3 75 0.199 0.159
4 100 0.200 0.222
5 125 0.249 0.238

Figura 2. Curva tipo para hemoglobina por el método de Lowry.

Tabla 2. Replicas para el análisis estadístico del método Lowry.

Tubo No. A590 Cantidad de proteína (µg)
1 0.169 77.640
2 0.147 65.539
3 0.161 73.240
4 0.161 73.240
5 0.143 63.339
6 0.145 64.439
7 0.150 67.189
8 0.147 65.539
9 0.156 70.490
10 0.157 71.040
Tabla 2.1. Resultados del análisis estadístico del método de Lowry
X S S2 %CV µ
69.170 4.676 21.865 6.760 65.655<µ<72.345

CÁLCULOS

[Hemoglobina]
C.V.= (S/X)*100
y=mx+b C.V.= (4.676/69.170)*100
y = 0.001818*x + 0.02785 C.V.= 6.760
x=(y-b)/m
𝒕𝒔
µ=𝑿 ±
√𝒏
Tubo 1. (2.262)(4.676)
x=[0.169-(0.02785)]/(0.001818) µ= 69.170 ±
√10
x=77.640 µ= 72.345
µ= 65.655
Tubo 2.
x=[0.1.47-(0.02785]/(0.001818)
x=65.539

Tabla 3. Efecto de algunas susancias no proteicas en el metodo de Lowry

Tipo de
Cantidad de
Tubo No. Sustancia A590 interferencia
proteína
generada
1 Tris 1M, pH 7.0 0.118 49.587 Negativa (-)
2 Glicerol al 1% (v/v) 0.171 78.740 Positiva (+)
3 Detergente comercial al 1% 0.182 84.791 Positiva (+)
4 SDS al 1% 0.148 66.089 Sin interferencia
5 Ácido tricloroacético al 5% 0.150 67.189 Sin interferencia

DISCUSIÓN

En la práctica se llevó a cabo la curva de calibración en la cual se obtuvo un coeficiente de correlación

de r= 0.9637 el cual es un valor aceptable, pero al visualizar la gráfica se observan los puntos
alejados de la linealidad y esto puede deberse a que el día de la realización de la práctica, durante
la medición de volúmenes para agregar a los tubos se presentaron uno o varios errores de tipo
sistemático, tal como la variabilidad en la medición de volúmenes de reactivos y proteínas, lo cual
pudo ser una de las posibles fuentes de error. En cuanto a la curva de calibración se observó en la
figura 2, se cumple con la Ley de Bouguer-Beer en el intervalo de (50 – 100) ϻg donde se observa
que la cantidad de proteína es directamente proporcional a la absorbancia, los valores que quedaron
fuera en la regresión lineal se deben a errores de medición del laboratorista que llevo a cabo el
ensayo.

Así mismo se determinó la precisión del experimento mediante 10 réplicas bajo las condiciones del
tubo 3 de curva tipo, los resultados de dicha determinación fueron las siguientes X= 69.170 S=4.676
S2=21.865 %C.V.= 6.760 y µ=65.655<µ<72.345. Los datos anteriores se utilizaron para determinar
el tipo de interferencia generada por 5 diferentes sustancias no proteicas en la absorbancia de la
solución de hemoglobina, específicamente haciendo uso de los límites de confianza de la media
(µ=65.655<µ<72.345); por lo que se obtuvo que Tris 1M, pH 7.0 genera una interferencia negativa;
glicerol y detergente comercial por su parte generan interferencias positivas, lo cual se puede
interpretar en que aquellas sustancias no proteicas son soluciones que favorecen la reacción; en
cuanto que SDS al 1%y TCA al 5% no generaron ninguna interferencia en nuestras
absorbancias en el método de Lowry por lo cual esto significaría que su presencia en el método
puede no afectar y si lo hace no es de manera significativa.

CONCLUSIONES

 El método de Lowry es un método fotométrico muy sensible que obedece la “Ley de

Bouguer-Beer”, se caracteriza por medir en el espectrofotómetro una absorbancia a 595nm
y 100%T.
 La ecuación de la recta para la curva tipo del método de lowry es y = 0.001818*x + 0.02785
 Se obtuvo que Tris 1M, pH 7.0 genera una interferencia negativa; glicerol y detergente
comercial interferencias positivas, en cuanto que SDS al 1%y TCA al 5% no generaron
interferencias.

PREGUNTAS EXTRA

1.- Cite otros métodos para la determinación de proteínas, así como las ventajas y desventajas
de dichos métodos.
Método Absorción Mecanismo Ventajas Desventajas
Incompatible con
Pequeño volumen
Absorción de tirosina y detergentes y agentes
Absorción UV 280 nm de muestra, rápido,
triptófano desnaturalizantes, alta
económico
variabilidad
Compatible con
Reducción de cobre (Cu2+ a detergentes y
Ácido Compatibilidad con agentes
562 nm Cu1+), Reacción del BCA con agentes
bicinconínico reductores baja o nula
Cu1+ desnaturalizantes,
baja variabilidad
Ácido sulfúrico concentrado que
efectúa la destrucción oxidativa
Interfieren compuestos
de la materia orgánica de la
Ampliamente nitrogenados no proteicos.
muestra y la reducción del
Kjeldahl utilizado Robusto Uso de catalizadores tóxicos
--- nitrógeno orgánico a amoníaco
De fácil aplicación. o caros.
el amonio es retenido como
Método Oficial Elección del factor de
bisulfato de amonio y puede ser
conversión.
determinado in situ o por
destilación alcalina y titulación.
Incluye nitrógeno inorgánico.
Requiere pequeñas
Combustión con
cantidades de muestra 5-50
Se caracteriza por pirólisis oxígeno puro, sin
mg, finamente dividida y
completa de la muestra y reactivos metálicos
homogénea para minimizar
medición del contenido de como oxidantes
Dumas --- el error de muestreo.
nitrógeno de los gases de adicionales
Este método no puede
combustión. Gran flexibilidad en
aplicarse a material húmedo
tipos de muestra.
por lo que debe efectuarse
Rápido.
un secado previo.

Costos más bajos Interfieren las

que método Kjeldahl concentraciones altas de
Leve mayor sales de amonio.
ColorimétricoFormación de
precisión. Se debe estandarizar con
Biuret 540 nm complejo entre iones cúpricos y
No detecta cantidades conocidas de
los péptidos
Nitrógeno de proteína. Interfieren
fuentes no cantidades altas de lípidos o
proteicas. CHO ocasionando turbidez.
2.- Mencione algunas ventajas y desventajas del método de Lowry

Ventajas:
 Muy sensible (0.2 µg/mL)
 Menos afectado por la turbidez de la muestra
 Más específico que la mayoría de otros métodos
 Relativamente rápido

Desventajas:

 El color varias con diferentes proteínas (mas que Biuret)

 Sacarosa, lípidos, buffers fosfato, monosacáridos y hexoaminas interfieren con la reacción
 Altas concentraciones de azúcares reductores, sulfato de amonio y compuestos con
sulfhidrilo interfieren con la reacción
 Reducido rango de pH
 Requiere calibración cuidadosa
 El color no es estrictamente proporcional a la concentración

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr y R.J. Randall. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951)
 Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al. which is more
generally applicable. Analytical Biochemistry 83, 346-356
 Instrumentos y técnicas de Bioquímica, T. Cooper. Ed. Reverte.
 Skoog, Douglas A.; F. James Holler; T.A. Nieman. 2001. Principios de Análisis Instrumental.
5a ed., Editorial Mc Graw Hill Interamericana de España, Madrid, España.
 http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html
 https://www.achipia.gob.cl/wp-content/uploads/2016/06/4-M--todos-Proteina-Lic.-Q.-
Marcela-Torres.pdf