Diario de materiales peligrosos 168 (2009) 400-405

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Diario de materiales peligrosos

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Biodegradación de clorpirifos y su producto de hidrólisis 3,5,6-

tricloro-2-piridinol por Bacillus pumilus cepa C2A1
*
Samina Anwar, Fauzia Liaquat, Qaiser M. Khan, Zafar M. Khalid, Samina Iqbal
Instituto Nacional de Biotecnología e Ingeniería Genética (NIBGE), PO Box 577, Jhang Road, Faisalabad, Pakistán

abstracto
información del artículo
A C2A1 cepa bacteriana aislada a partir del suelo se encontró muy eficaz en la degradación de clorpirifos y su primera
Historia del artículo: hidrólisis metabolito 3,5,6-tricloro-2-piridinol (TCP). Sobre la base de la morfología, las características fisiológicas, pruebas
Recibió el 16 de septiembre de 2008 bioquímicas y análisis de la secuencia 16S rRNA, C2A1 cepa se identificó como Bacillus pumilus. Papel de C2A1 cepa en la
Recibida en forma Revised January 1 de degradación de clorpirifos se examinó bajo diferentes condiciones de cultivo como el pH, la densidad de inóculo, la presencia
febrero de 2009 Aceptado el 10-2009 de fuentes de carbono / nutrientes añadidos y pesticidas concen-tración. Clorpirifos fue utilizado por C2A1 cepa como única
Disponible en línea el 21 de febrero de 2009 fuente de carbono y energía, así como que se co-metaboliza en la presencia de glucosa, extracto de levadura y el caldo de
nutrientes. Máxima pesticida degra-dación se observó a pH alto (8,5) y alta densidad de inóculo cuando se utilizó clorpirifos
palabras clave: como la única fuente y la energía. En presencia de otros nutrientes, la degradación de clorpirifos se mejoró probablemente
Los pesticidas debido a un alto crecimiento en compuestos fácilmente metabolizables que a su vez una mayor degradación. El C2A1 cepa
organofosforado -1
clorpirifos mostró 90% de degradación de TCP (300 mg L ) Dentro de 8 días de incubación.
biodegradación
3,5,6-tricloro-2-piridinol (TCP) © 2009 Elsevier BV Todos los derechos
Bacillus pumilus reservados.

0304-3894 / $ - see front matter © 2009 Elsevier BV Todos los derechos

reservados. doi:10.1016 / j.jhazmat.2009.02.059

1. Introducción

Los pesticidas se introdujeron a la agricultura para satisfacer las crecientes

necesidades alimentarias de la creciente población mundial. Por ahora utilizar
los plaguicidas se ha convertido en un mal necesario, aunque esta práctica
está jugando el caos con las formas de vida humanos y otros. Residuos de
plaguicidas aplicados permanecen en el medio ambiente (aire, suelo, aguas
subterráneas y superficiales) durante períodos de tiempo variables[1-3].
Debido a la larga persistencia de organoclorados (lindano, heptacloro,
diclorodifeniltricloroetano (DDT), etc.) y su tendencia a bioacumularse y su
potencial toxicidad hacia los organismos no objetivo, este grupo de pesticida
ha sido reemplazado por rela-tivamente menos persistente y sin embargo
organofosforado eficaces compuestos (OP). Aunque los organofosforados se
degradan más rápido que los organoclorados, esta clase de pesticidas tiene
neurotoxicidad aguda que se debe a su capacidad para suprimir la
acetilcolinesterasa (AChE). AChE sirve como una enzima reguladora de
nervioso trans-misión mediante la reducción de la concentración de
acetilcolina en la unión sináptica. Cuando se inactiva AChE, por ejemplo,
mediante un pesticida organofosforados-phate, la concentración de
acetilcolina en la unión sigue siendo alto, y la estimulación continua de la
fibra muscular o nerviosa se produce,[4].

*
El primer autor en: Área de Medio Ambiente Biotecnología, Insti-tuto Nacional de
Biotecnología e Ingeniería Genética (NIBGE), PO Box 577, Jhang Road, Faisalabad, Pakistán.
Tel .: +92 41 2651475x294 / 292; Fax: +92 41 2651472.
Dirección de correo electrónico: siqbal@nibge.org (S. Iqbal).
 biodegradación acelerada. Se hicieron varios intentos infructuosos para aislar
un sistema microbiano degradantes clorpirifos por tratamientos o
Clorpirifos (O, O-dietil O- (3,5,6-tricloro-2-piridil) phosp-horothioate) es enriquecimiento de muestras de suelo repetidas[8,9]. Gener-aliado, los
uno de los insecticidas de OP más ampliamente usadas eficaces contra un microorganismos del suelo que encuentran repetidamente o de forma continua
amplio espectro de plagas de insectos de cultivos económicamente impor- productos químicos tóxicos sintéticos desarrollar capacidades para degradar
tantes. También se utiliza para el control de mosquitos (larvas y adultos), estos productos químicos y tales microorganismos con rasgos de reciente
moscas, termitas y diversas plagas del suelo y de los hogares. La vida media evolución han sido implicados en la rápida inactivación de los plaguicidas en
de clorpirifos en el suelo es por lo general entre 60 y 120 días, pero puede suelos prob-lem [10]. Una posible razón de la resistencia de clorpirifos a la
variar desde 2 semanas hasta más de 1 año, dependiendo del tipo de suelo, biodegradación mejorada se atribuyó a los efectos tóxicos de 3,5,6-tricloro-2-
clima y otras condiciones[5]. Inicialmente, se observó degradación de pes-de piridinol (TCP), el producto hidrolítica de clorpirifos [11].
pla- en suelos alcalinos y fenómeno estaba relacionado con su hidrólisis a pH
alto. Sin embargo, cuando los varios suelos de pH alto eran estériles, se
observó inhibición completa de clorpirifos hidrólisis que indica la implicación Singh et al. [12] aislados seis clorpirifos bacterias degradantes
de los microorganismos del suelo[6]. Luego, mismos resultados fueron
de un suelo australiano mostrando la degradación de
confirmados por Singh et al. [7].
clorpirifos mejoradas.
Ha sido problemático para aislar una cepa bacteriana pura capaz de S. Anwar et al. / Diario de materiales peligrosos 16
degradar el clorpirifos porque este organofosforado es resis-tante hacia la
(95%) utilizado en este estudio se obtuvo de Pak China Chemicals, Lahore.
Fuera de seis, una cepa de Enterobacter sp. fue capaz de hidrolizar este Tricloropiridinol (TCP, 99%) se adquirió de Chem. Servicio (Web Chester).
pesticida. Li et al.[13] aislado una cepa que pertenece al género SPH- acetonitrilo grado HPLC se pro-curado de Merck. Todos los demás productos
-1
ingomonas capaces de clorpirifos hidrolizantes (100 mg L ) En 3,5,6- químicos utilizados fueron adquiridos de Sigma-Aldrich, Merck o BDH.
tricloro-2-piridinol (TCP).
Los factores ambientales tales como carac-terísticas físicas y químicas del
sustrato, el estado de nutrientes, pH, temperatura y factores bióticos perjuicio
2.2. Enriquecimiento, aislamiento y selección de cepas bacterianas
densidad tal inóculo el-ment lograr de cualquier proceso de biorremediación
[14,15]. Se informó que una de Pseudomonas sp. tuvo menos éxito en la
Las muestras de suelo recogidas de campos de algodón en el Instituto
degradación de atrazina en el suelo con un pH más bajo y más alto de materia Nacional de Biotecnología e Ingeniería Genética NIBGE (donde el pesticida
orgánica[dieciséis]. Si bien alto pH del suelo juega un papel importante en la en cuestión se pulveriza extensivamente) se utilizaron para el enriquecimiento
biodegradación de clorpirifos [7]. -1 -1
de las cepas de plaguicidas degradar a 30 mg L y 60 mg L pesti-CIDE
(clorpirifos) concentraciones individualmente. aislamientos microbianos se
Del mismo modo el tamaño del inóculo se ha identificado como un llevaron a cabo en medio mínimo sal (MSM, pH 6,8-7,0) con-Taining (g L )
-1
posible rea-hijo para el fracaso o el éxito del proceso de biorremediación de
sitios contaminados con pesticidas cuando se inocula con especies capaces de N / A2HPO4, 5,8; KH2correos4, 3,0; NaCl, 0,5; NUEVA HAMPSHIRE4Cl, 1;
6 8
degradar el contaminante [15]. nivel de inóculo de 10 -10 g de células
-1 y MgSO4, 0,25. Se añadieron aproximadamente 20 g de suelo a 50 ml MSM
suelo era recomendable utilizar para la descontaminación de sitios con-
contaminado de pesticidas [14]. Sin embargo, en un estudio similar, Struthers
et al.
[17] encontrado que los niveles de inóculo de una cepa de Agrobacterium tan
5 -1
bajas como 10 g de células eran adecuadas para degradar rápidamente
atrazina. la concentración del pesticida fue otra de las razones para el fracaso
de biorremediación[18]. Singh et al. [19] también estudió la influencia de
diferentes condiciones Environmen-tal en la biorremediación de clorpirifos y
fenamifos en suelo y agua para estudiar el potencial de bio- remedio de las
cepas aisladas de estos dos pesticidas.

El producto de hidrólisis importante de clorpirifos, 3,5,6-tricloro-2-

piridinol (TCP) tiene una mayor solubilidad en agua que clorpirifos y hace
que la contaminación generalizada en los suelos y en el medio ambiente
acuático. TCP es no sólo persistente hacia la degradación por
microorganismos sino que también limita la biodegradación de chlorpyri-fos
debido a sus actividades antimicrobianas[9,20,21]. En contraste con la
importancia del problema de la degradación de TCP, los estudios en cuanto a
su destino y la degradación en el ambiente son escasos.

En el presente estudio, una bacteria Bacillus pumilus C2A1 CAPA-ble de

degradar no sólo clorpirifos pero también fue aislado TCP. Biodegradación de
clorpirifos y TCP en cultivo líquido bajo diferentes factores ambientales como
diferentes concentraciones de pes-de pla-, pH de los medios y el tamaño del
inóculo de la cepa aislada (en cultivo líquido) fueron investigados para
optimizar las condiciones para biodegra-dación de clorpirifos por esta cepa .
El estudio tiene por objeto dilucidar una posible aplicación de la cepa
bacteriana aislada para la remediación de clorpirifos ambiente contaminado.

2. Materiales y métodos

2.1. productos químicos

Clorpirifos Analytical grado (98,4%) obtenido del Dr. Ehren-Storfer

GmbH (Alemania) se utilizó como un estándar. Clorpirifos de calidad técnica
contenga clorpirifos y se cultivaron en matraces de 250 ml Erlenmeyer en un
agitador rotatorio (a 100 rpm) incubado a temperatura ambiente. Después de
dos semanas, 5 ml de cultivo se recuperó de cada réplica y se transfiere a
-1 -1
clorpirifos frescas HSH que contienen (30 mg L y 60 mg L por separado).
Después, tres sucesivas transferencias se llevaron a cabo en clorpirifos
contienen HSH frescas como la única fuente de carbono por sub cultivo 5 ml
de inóculo cada vez y incu-rendido durante 2-4 semanas cada uno. Los
contenidos de humedad se mantuvieron durante todo el experimento mediante
la adición regular de agua destilada estéril.
Dos semanas después de la última transferencia, se prepararon diluciones
de 10 veces de cul-turas y 100 L de cada dilución se extendió sobre agar
-1
nutritivo (NA) placas que contienen 60 mg L clorpirifos. colonias lated-Iso
se sembraron en estrías en placas NA que contienen clorpirifos y se
purificaron por streaking repetido. Una vez que todos los aislamientos
obtenidos se purificaron, se probaron para el crecimiento y, por tanto,
clorpirifos uti-lización y rayando ellos en placas de agar de MSM que
-1
contienen 50 mg L clorpirifos como única fuente de carbono y energía. Al
mismo tiempo su crecimiento también se monitorizó en MSM que contenga
◦
clorpirifos en matraces de agitación se incubaron a 37 C y 100 rpm.
concentración Resid-ual de clorpirifos en esta etapa se determinó por HPLC.
Una cepa, designada C2A1, que poseía la mayor capacidad degradante, se
seleccionó para más clorpirifos degradantes estudios.
2.3. La identificación taxonómica de la cepa bacteriana
Para la secuenciación del gen 16S rRNA, ADN genómico total se extrajo
de las cepas bacterianas como se describe por Wilson et al. [22]. El gen ARNr
16S se amplificó usando los cebadores Univer-Sal, FD1 (5
-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3; bases coli Escherichia 8-27) y RP1 (5
-ACGGHTACCTTGTTTACGACTT-3, E. coli bases 1507-1492) [23].
productos de PCR que consisten en la 16S rRNA gen frag-ment
amplificados se purificaron con una columna de centrifugado QIAQuick
2.6. condiciones y análisis de HPLC
muestras extraídas se analizaron en un HPLC Varian equipado con una
bomba de gradiente ternario, detector programable de longitud de onda
variable de UV, horno de columna, y la válvula de muestra eléctrica y ODS2
C18columna de fase inversa. Los análisis residuos de plaguicidas se con-
canalizarse usando una fase móvil gradiente de acetonitrilo: agua: ácido
acético como se describe anteriormente[24]. volumen de inyección de
muestra fue de 20 L, la fase móvil se programó a velocidad de flujo de 1 ml
-1
min y clorpirifos se detectó a 290 nm y 320 nm longitud de onda. El tiempo
de retención para clorpirifos y 3,5,6-tricloropiridinol fue 15 min y 7,8 min,
respectivamente.
2.7. Biodegradación de clorpirifos
Se llevaron a Shake estudios matraz para trabajar en los clorpirifos que
degradan la capacidad de la cepa de mejor aislado-hasta el momento, es decir,
-1
C2A1. MSM (30 ml) que contenía 50 mg L clorpirifos (como única fuente
de auto-Bon y energía) se inocularon (2% de inóculo) con C2A1 y se incubó a
◦
37 C y 100 rpm en un agitador rotatorio durante 5 días. En intervalos de 24
horas, las muestras del medio de cultivo se RECOV-Ered asépticamente y la
concentración de pesticida residual determinaron utilizando HPLC. matraces
-1
no inoculados con MSM que contiene 50 mg L clorpirifos sirvieron como
controles. El experimento se realizó por duplicado. Biodegradación de
- contención inóculos
clorpirifos por C2A1 deformación a altas concentraciones, es decir, 100 mg L
1 -1 -1 -1 -1
, 200 mg L , 300 mg L , 500 mg L y 1,000 mg L fue estudiada en
frascos de 500 ml que contenían 150 ml MSM (por duplicado). matraces
duplicados sin inóculo se mantuvieron como controles. Las muestras (10 ml)
- concentración pesticida residual se determinó a intervalos de 24 h.
se recuperaron a los 24 intervalos h de los matraces que contienen 100 mg L
1 -1 -1
, 200 mg L y 300 mg L chlorpyri-fos para 10 días de incubación. En el
-1 -1
caso de 500 mg L y 1,000 mg L , El muestreo se hizo después de cada 4
(QIAGEN) y se clonaron en pTZ57R TA vector de clonación. El vector
clonado se trans-formada en E. coli Top10 y los plásmidos se obtuvieron
mediante el uso de un DNA Purification Kit Miniprep Fermentas para
nucleótidos sequenc-ing.
2.4. preparación del inóculo
El cultivo de siembra de C2A1 cepa se cultivó en medio de caldo de
nutrientes, se recogieron por centrifugación a 4600 × g durante 5 min, se lavó
con N-solución salina esterilizada en autoclave (0,9% de NaCl en agua
destilada) y resus-adjuntas en N-solución salina para establecer una DO 590
-1
nmde 0,7. unidades formadoras de colonias (CFU ml ) De esta suspensión
fueron cuantificados por la técnica de recuento en placa de dilución. El dos
por ciento de esta suspensión se utilizó como inóculo para los estudios de
biodegradación clorpirifos hasta que se indique lo contrario.
2.5. La extracción de muestras (residuos de plaguicidas) para el análisis de
HPLC
Las muestras (5-10 ml) se recuperaron de los matraces de cultivo y se
centrifugaron a 7200 ×g durante 10 min para obtener un medio libre de
células. Clorpirifos y residuos de 3,5,6-tricloro-2-piridinol (TCP) se extrajeron
de sobrenadante utilizando un volumen igual de diclorometano (DCM) dos
veces. Las capas orgánicas de DCM se aspiraron, se agruparon y se
evaporaron a temperatura ambiente bajo nitrógeno. Los residuos se
disolvieron en acetonitrilo de calidad HPLC (1 ml) y después se filtró a través
TM
de flouropore membrana de filtro (0,45 m FH) para eliminar cualquier
partícula. Antes del análisis de HPLC, se diluyeron estas muestras si es
necesario. concentraciones de plaguicidas y TCP de los filtrados se midieron
por HPLC como se describe en la Sección2.6 y los del medio de cultivo se
calculó.
402 S. Anwar et al. / Diario de
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días de incubación. Extracción de residuos de plaguicidas de muestras
representativas y HPLC Analy-sis para la determinación cuantitativa del
pesticida se realizó como se describe en las Secciones2.5 y 2.6.
2.8. Efecto de la fuente de carbono / nutrientes alternativos en la
biodegradación de clorpirifos
La glucosa, caldo nutriente y extracto de levadura se utilizaron para
examen-INE el efecto de los nutrientes y / o fuente de carbono alternativa en
los clorpirifos degradantes capacidad de la C2A1 cepa. El medio mínimo de
sal (30 ml) suplementado con glucosa, caldo nutriente y extracto de levadura
-1
(por separado) y 50 mg L clorpirifos inoculados con C2A1 (por duplicado).
se añadieron Todos los tres nutrientes asep-camente en MSM a la
-1 ◦
concentración final de 1 g L por separado. Los matraces se incubaron a 37 se
determinó C y 100 rpm en un agitador concentración y el pesticida rotatorio.
El crecimiento de bacterias en términos de formación de colonias unidad
(CFU) también se controló.
2.9. Efecto de la densidad de inóculo en la biodegradación de clorpirifos
Los cultivos líquidos de C2A1 cepa en caldo nutriente que contiene cloro-
-1
pyrifos (50 mg L ) estaban preparados. Después de 24 h de incubación, el
medio de cultivo se centrifugó a 4600× g durante 5 min, se lavó con auto-
claved N-solución salina y se volvieron a suspender en N-solución salina para
establecer una DO590 nmde 0,8. CFU de la suspensión se determinó y
9 -1 7 -1 5 -1
ing 1,5 × 10 UFC mL , 1,5 × 10 UFC mL Y 1.5 × 10 UFC mL se
prepararon añadiendo la cantidad apropiada de N-solución salina. Estos
-1
inóculos (2%) se añadieron a MSM que contiene 50 mg L clorpirifos.
2.10. Efecto del pH sobre la biodegradación de clorpirifos
 Clorpirifos capacidad de C2A1 degradantes también se determinó en tres -1
neutro (7.0) y básica (8.5). Las soluciones de Na 2HPO4 (5,8 mg L ) Y
diferentes condiciones de pH de los medios de comunicación de sal mínimo, -1
KH2correos4 (3,0 mg L ) Se mezclaron en una proporción tal de lograr
es decir, ácido (5.5), -1
soluciones tampón en MSM (que contienen NaCl, 0,5 g L ; NUEVA
-1 -1
HAMPSHIRE4Cl, 1 g L ; y MgSO4, 0,25 g L ) A pH 5,5, 7,0 y 8,5. medios
-1
MSM en clorpirifos contienen dif-rentes de pH (50 mg L ) Se inocularon
para estudiar el efecto del pH sobre la degradación de clorpirifos.

2.11. La degradación de 3,5,6-tricloro-2-piridinol (TCP)

-1 -1 -
Diferentes concentraciones de TCP (100 mg L , 200 mg L y 300 mg L
1 ◦
) En MSM se inocularon con y se incubaron a 37 C y 100 rpm en un
agitador rotatorio. residuos de TCP se extrajeron usando diclorometano
después de 2, 4, 6 y 8 días de incubación y TCP residual se determinó por
HPLC.

3. Resultados y discusión

3.1. Aislamiento y caracterización de clorpirifos degradantes

bacteria

Las muestras de suelo recogidas de campos de algodón de NIBGE (ya

expuestos a los pesticidas que pertenecen a diferentes clases químicas, es
decir, organofosfatos, carbamatos, nitro-guanidina y piretroides) fueron
enriquecidos en la presencia de clorpirifos para aislar los clorpirifos bacterias
degradantes. A partir de este cultivo de enriquecimiento, 22 cepas
morfológicamente diferentes se aislaron sobre placas de agar de nutrientes que
contienen clorpirifos. La capacidad clorpirifos utilización de estas cepas se
-1
comprobó en placas / agar de MSM que contienen clorpirifos (40 mg L )
Como única fuente de carbono y energía. De 22 cepas ensayadas, 11 cepas
eran capaces de crecer en HSH / placas de agar-flexibles mentado con
-1
clorpirifos. Estas cepas se inocularon en MSM que contiene 50 mg L
◦
clorpirifos y se incubaron a 37 C. capacidad de utilización de plaguicidas se
confirmó por análisis HPLC cuantitativo del pesticida residual. Dos cepas
C2A1 y C2A2 fueron capaces de crecer en este medio la utilización de 74% y
69% clorpirifos plazo de 3 días de incubación. En los presentes estudios, se
empleó C2A1 cepa (mostrando más alta degradación) para clorpirifos
detallados estudios de degradación bajo varias condiciones de cultivo.
Aislabie y Jones[25]propusieron que las bacterias presentes en el campo son
capaces de utilizar el pesticida como un sustrato para el crecimiento y sus
números se han mejorado en la aplicación posterior. Esto está relacionado con
un aumento en la capacidad de bio-lógica del suelo para degradar estos
productos debido a la proliferación de microorganismos utilizando el pesticida
como fuente de carbono y energía. Este fenómeno se llama mejorada
biodegra-dación de los plaguicidas[10,26].

3.2. La identificación de la cepa C2A1

Las colonias de C2A1 cepa en placas de agar de nutrientes aparecieron

circu-lar con elevación convexa y margen entero (par). Esta cepa fue móviles,
gram positivo en forma de barra y pequeño. Las pruebas bioquímicas para
C2A1 cepa se describen entabla 1. El análisis de secuencia del gen 16S rRNA
utilizando BLAST mostró que la cepa C2A1 era B. pumilus. Para nuestro
conocimiento, este es el primer informe para la biodegradación de chlorpyri-
fos por B. pumilus, una bacteria gram positiva. Anteriormente, B. pumilus ha
informado de degradar carbofurano[27] y bisfenol A [28].

3.3. La degradación de clorpirifos por B. pumilus C2A1

estudios de curso de tiempo para la degradación de clorpirifos por B.

pumilus C2A1 indicaron que sólo el 6% del plaguicida añadido se degradó en
24 h después de lo cual la rápida degradación comenzó. Después se logró la
finalización de la degradación experimento 82%, dejando 9 mg L-1 clorpirifos
en medio de cultivo. También disminuyó la tasa de degradación
S. Anwar et al. / Diario de materiales peligrosos 16
tabla 1
Características bioquímicas de C2A1 Bacillus pumilus. (7) arginina dihidrolasa (ADH) Negativo
(8) La lisina descarboxilasa (LDC) Negativo
prueba bioquímica resultado
(9) La ornitina descarboxilasa (ODC) Negativo
s
(10) El sulfuro de hidrógeno (H2 S) Negativo
(1) catalasa Positivo
(11) El triptófano desaminasa (TDA) Negativo
(2) licuefacción de gelatina Positivo
(12) indol Negativo
(3) Voges Proskauer- Positivo
(13) Utilización de citrato Negativo
(4) utilización de arabinosa Positivo
(5) utilización de manitol Positivo
(6) galactopiranosido O-nitrofenil (ONPG) Negativo
Figura 2. La degradación de clorpirifos por Bacillus pumilus C2A1 cepa en medio de sal
-1
mínimo (HSH) que contienen 50 mg L clorpirifos como la única fuente de carbono y energía ()
significativamente cuando se alcanzó una concentración más baja que podría
y en presencia de otros nutrientes, es decir, extracto de levadura (), caldo nutriente (), glucosa ()
ser debido a la elevada expresión de enzimas en Concentra-ciones más altas. y de control ().
No se observó degradación en control no inoculado. Esto demostró que la
cepa C2A1 era competente para la biodegradación de clorpirifos. Cuando se
expone a mayores concentraciones de chlorpyri-fos, B. pumilus C2A1
-1 -1 -1 3.4. Efecto de la fuente de carbono alternativa y nutrientes
mostraron degradación eficiente. En 100 L mg , 200 mg L y 300 mg L
sobre la degradación de clorpirifos
concentraciones, la degradación de pesticidas comenzaron después de 2, 2 y 3
días de incubación, respectivamente, y 73%, 83% y 87% de los clorpirifos
-1
añadido fue degradado dentro de los 10 días (Figura 1). A concentraciones El C2A1 cepa inoculada en MSM que contiene 50 mg L comenzado
-1 -1 degradar clorpirifos después de 24 h de incubación. Se degrada el 82% de
relativamente más altas, es decir, 500 mg L y 1,000 mg L , La degradación
-1
clorpirifos comenzó después de 7 y 10 días de incubación degradar 88% y pesticida dentro de los 5 días de incubación dejando 9 mg L de chlorpyri-fos.
89% de pesticida respec-tivamente después de dos semanas (datos no Cuando extracto de levadura, caldo nutriente y la glucosa se añadieron al
mostrados). Hay informes con respecto a la degradación microbiana de medio de cultivo, bacteria utiliza 86%, 92% y 100% de pesticida
pesticida como etoprofos y otros en altas concentraciones[29-31]. respectivamente (Figura 2). En presencia de los tres nutrientes casi el 50% de
concentración Sin embargo máxima de clorpirifos en la que se ha informado clorpirifos degradan dentro de las 24 h de incubación. La glucosa aumentó la
-1
la degradación microbiana de este plaguicida es de 250 mg L [12]. Por lo velocidad de degradación de aislado, ya que degrada completamente el
que sabemos C2A1 B. pumilus es el primer informó cepa que puede tolerar / pesticida dentro de 3 días de incubación. Este resultado contrasta con los
-1 hallazgos previos de Singh et al.[12] quien informó que con adi-ción de
degradar de cloro-pyrifos hasta 1000 mg L . Durante los estudios de
degradación a altas concentraciones de clorpirifos, se observó fase de retraso fuentes de carbono, una cepa de Enterobacter detuvo clorpirifos degradantes y
más largo con el aumento de concentración de pesticida. Karpouzas y después de 3 días de incubación se inició la utilización de clorpirifos nuevo.
Walker[29]propone que la fase de latencia más larga en una concentración Nuestros resultados revelaron que el Bacillus prefiere utilizar clorpirifos,
más alta podría ser debido a que se necesita un mayor número de bacterias incluso en presencia de ambiente rico en nutrientes y su capacidad degradante
para iniciar la degradación rápida de pesticida. Posiblemente biodegradación fue influenciada positivamente por la presencia de las fuentes de nutrientes
comienza lentamente y requiere un período de aclimatación antes de que suplementarios. Esto podría ser debido a que, potencialmente, el clorpirifos
ocurra una rápida degrada-ción. Se ha sugerido[32] que en la biomasa enzimas de degradación en B. pumilus se expresan incluso en presencia de
constante o bajos niveles de sustrato, la velocidad de degradación es fuentes de carbono fácilmente disponibles. No se observó degradación
proporcional a la concentración de sustrato residual, que cae fuera continu- apreciable de clorpirifos en ninguna de las muestras no inoculadas.
aliado.

En este experimento, también se controló el crecimiento bacteriano en

-1
términos de colonia unidad de forma ing. Se observó que CFU ml de los
cultivos que contienen glucosa, caldo nutriente y extracto de levadura (SEPA-
rado) junto con clorpirifos fue mayor que los cultivos que contienen
clorpirifos como única fuente de carbono y energía (Fig. 3).

3.5. Efecto de la densidad de inóculo sobre la degradación de clorpirifos

Clorpirifos se degradan por B. pumilus C2A1 durante INCUBA-ción con

probaron todas las tres densidades iniciales de inóculo. En cultivos inoculados
9 -1
con más alta densidad celular inicial, es decir, 10 UFC mL , La degradación
de cloro-pyrifos comenzó rápidamente a medida que se observó la utilización
dentro de 24 h de incubación, aparentemente no hubo fase de latencia y la
degradación de más del 80% se deliberó después de 5 días de incubación (Fig.
5
4). Sin embargo en cultivos con densidades de inóculo más bajas, es decir, 10
-1 7 -1
UFC mL y 10 UFC mL de B. pumilus C2A1 hubo períodos de retardo
más largos como clorpirifos degradación comenzaron después de 1 y 2 días de
incubación y resultaron en 50% y 72% de degradación de pesticida
respectivamente después de 5 días de incubación.

En general, una densidad de inóculo más pequeño resultó en fases de

Figura 1. La degradación de clorpirifos por Bacillus pumilus C2A1 cepa en medio de sal retardo más largos antes de la rápida degradación de clorpirifos comenzó. Se
mínimo (HSH) que contienen clorpirifos como la única fuente de carbono y energía a ha sugerido que el periodo de aclimatación durante la degradación de xeno
-1 -1 -1
concentraciones 100 mg L (), 200 mg L () Y 300 mg L (), Y el control sin inóculo (). 404 S. Anwar et al. / Diario de
materiales peligrosos 168 (2009) 400-405
Fig. 3. De crecimiento (unidades formadoras de colonias; CFU) de C2A1 Bacillus pumilus en
-1
medio de sal mínimo (HSH) que contienen 50 mg L clorpirifos como la única fuente de
carbono y energía () y en presencia de otros nutrientes, es decir, extracto de levadura (), caldo
nutriente () y glucosa ().
antibióticos reflejan el tiempo requerido para la multiplicación de una
pequeña población activa a un cierto nivel que es suficiente para degradar
rápidamente el xenobiótico en cuestión [33]. se observó correlación similar
(como se encuentra en el presente estudio) entre la longitud de periodo de
aclimatación y la densidad de inóculo cuando se inocularon cultivos líquidos
que contienen 2,4-D con diferentes densidades de inóculo de Pseudomonas
BRI6001 cepa cepacia, una 2,4-D bacteria degradantes [34].
3.6. Efecto del pH del medio en la biodegradación de clorpirifos
Un factor importante, que influye en la capacidad degradante de
microorganismos capaces de compuestos xenobióticos degradantes, es pH.
Los clorpirifos capacidad de C2A1 cepa degradantes se estudió en tres
condiciones diferentes de pH, es decir, ácido (5,5), neutro (6.8) y básico (8.5)
-1
en MSM suplementado con 50 L mg clorpirifos junto con el control. B.
pumilus C2A1 mostraron degradación en absoluto el pH (ácido a alcalino)
ensayar. Sin embargo, a pH ácido se observó la degradación casi el 50% con
fase de retardo más largo. A pH relativamente más alto se observó ninguna
fase de latencia y clorpirifos se degradó de manera más eficiente en básica,
así como pH neutro con lo que se degrada más del 80% del plaguicida
añadido (Fig. 5).
Singh et al. [7] informó rápida degradación de clorpirifos por un
Enterobactor sp. a pH alto mientras que era muy lenta a pH ácido. Sin
embargo, Karpouzas y Walker[30] informaron de que dos cepas de
Fig. 4. La degradación de clorpirifos por Bacillus pumilus C2A1 cepa en medio de sal mínimo
-1
(HSH) que contienen 50 mg L clorpirifos como la única fuente de carbono y energía en varias
5 -1 7 -1
densidades de inóculo, es decir, 1,5 × 10 UFC mL (), 1,5 × 10 UFC mL () Y 1,5 × 10
-1
UFC mL (), Y el control no inoculado ().
Fig. 5. La degradación de clorpirifos por C2A1 Bacillus pumilus en medio de sal mínimo (HSH)
-1
clorpirifos que contienen (50 mg L ) Como la única fuente de carbono y energía a varios pH
medio, es decir, 5,5 (), 7,0 () y 8,5 (), y el control no inoculado ().
Pseudomonas putida (Epi y EPII) rápidamente etoprofos degradada (un
pesticida organofosfato) en medio mínimo a pH de 5,5 a 7,6. En los presentes
estudios, máximo degradación se logró a un pH alto. Es posible que algunos
enzima clave (s) respon-sible para la degradación clorpirifos tienen su
actividad enzimática óptima a un pH alto.
3.7. Biodegradación de tricloropiridinol (TCP)
Para el estudio de biodegradación de tricloropiridinol (TCP) que es el
primer metabolito después de la hidrólisis de clorpirifos, B. pumilus C2A1 se
-1 -1 -1
inoculó en MSM que contiene 100 mg L , 200 mg L y 300 mg L TCP. La
utilización metabolito por esta cepa se con-confirmado por análisis de HPLC.
-1
Se encontró que 90% de la TCP añadido (300 mg L ) Se degradó el plazo de
8 días de incubación (Fig. 6). Se ha sugerido[9] que el clorpirifos hidroliza
para TCP y que debido a que el TCP tiene efectos tóxicos, no se produce
normalmente la degradación potenciada de clorpirifos. Sin embargo, en los
presentes estudios degra-dación de clorpirifos y TCP fueron tanto logrado por
la misma cepa que es un hallazgo raro. Yang et al.[35] informó de un
-1
Alcaligenes faecalis capaz de degradar ambos clorpirifos y TCP (100 mg L ).
B. pumilus C2A1 mostraron utilización tanto de clorpirifos y TCP hasta una
-1
concentración de 300 mg L que era tres veces mayor que la informada para
A. faecalis [35]. Feng et al. [36] informó de una Pseudomonas sp. que pueden
mineralizar TCP en medio líquido pero
Fig. 6. La degradación de 3,5,6-tricloro-2-piridinol (TCP) por C2A1 Bacillus pumilus en medio
de sal mínima (MSM) que contiene TCP como la única fuente de carbono y energía a
concentraciones 100 mg L-1 (), 200 mg L -1 () y 300 mg L-1 (), y el control sin inóculo ().
S. Anwar et al. / Diario de materiales peligrosos 16
9
no clorpirifos. Debido a sus propiedades antimicrobianas, la degradación
microbiana de TCP se observa raramente / informado. Potencialmente, recal-
citrance de TCP podría atribuirse a la presencia de tres átomos de cloro en el
anillo de piridinol que debe ser eliminado antes del anillo se rompe[21]. En
nuestro estudio se encontró B. pumilus C2A1 para degradar no sólo
clorpirifos, pero su principal metabolito, así TCP. Además, durante los
estudios de biodegradación de clorpirifos (Secciones3.5 y 3.6) bajo diferentes
condiciones, no se encontró acumulación de TCP que mostró la eficacia de
esta cepa para degradar ambos clorpirifos y TCP.
4. Conclusión
Los estudios actuales revelan que los cambios en pH del medio de cultivo
y el inóculo degradación densidad afectado clorpirifos por B. pumilus C2A1.
pH alcalino y de alta densidad de inóculo fueron esenciales para lograr la
degradación máxima en este sistema experimento discontinuo. B. pumilus
C2A1 cepa fue capaz de degradar clorpirifos más de una amplia gama de pH
particularmente a pH tan bajo como 5,5. Esta es una característica importante
de un organismo que va a emplearse para bioremedia-ción de ambientes
variables. B. pumilus C2A1 era capaz de tolerar la concentración clorpirifos
-1
tan alto como 1000 mg L . Otra característica impor-tante que vale la pena
mencionar es que esta cepa particular era capaz de degradar TCP. La
degradación de este compuesto por la misma cepa que degrada clorpirifos es
muy importante porque TCP es generalmente antimicrobiano, y si no se
degrada sería acumularse en el medio de cultivo y suprimir el crecimiento
microbiano y por lo tanto la degradación del compuesto parental a través de la
represión catabólica. La información aquí proporcionada se puede utilizar
para condiciones de degradación Opti-Mize en el campo. Sin embargo, el
trabajo continúa para estudiar las condiciones para la biorremediación en situ
en clorpirifos suelos contaminados.
Expresiones de gratitud
Los autores reconocen el apoyo del Dr. M. Afzal Ghauri y el Dr. Kalsoom
Akhtar, BPT División NIBGE para conceder el acceso a la instalación de
HPLC en sus laboratorios.
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