Cuantificación de glucósidos cianogénicos en

plantas de consumo habitual a través de la

reacción de Guignard y titulación alcalina.

Universidad Nacional Autónoma de México

Laboratorio de Toxicología, Sección de Bioquímica y Farmacología Humana, Facultad de Estudios Superiores
Cuautitlán, Universidad Nacional Autónoma de México

Cruz, S. Martínez, M. Medina, L.

Estado de México 27 de agosto de 2014

Grupo 1751 Eq. 8

Resumen
La presente investigación experimental trata de proporcionar una visión general sobre los
glucósidos cianogénicos y la poca información general existente sobre los mismos,
cuantificando los niveles de HCN contenido en diferentes muestras de plantas
cianogénicas habituales en los alimentos.
Mediante la utilización de técnicas como la reacción de Guignard y la titulación alcalina se
identificó y cuantificó el cianuro en semillas de frutos de consumo común en la población
mexicana. Encontrado como valor más alto 4.2ug de cianuro en 1 gramos de frutos
(alrededor de 6 piezas) de Nectarina, seguido de 3.8ug de cianuro en 1 gramo de semillas
de manzana (amarillas, verdes y rojas). Sin embargo se conoce que el valor LD50 por
ingestión del cianuro de hidrógeno es de 50-200 miligramos, o de 1-3 miligramos por kilo
de peso. Se concluye que una posible intoxicación por cianuro en humanos es poco
probable.
Palabras Clave
.
Abstract
.
Keywords
.

albaricoques, melocotones, almendras y

Introducción
Muchas plantas sintetizan compuestos
llamados cianogénico glucósidos, que
son capaces de liberar cianuro de
hidrógeno tras hidrólisis [1]. Esta
capacidad, conocida como
cyanogénesis, ha sido reconocida desde
hace siglos en las plantas, tales como
otras plantas alimenticias importantes [2].
Hay por lo menos 2.650 especies de
plantas que producen cianoglucósidos.
El cianuro es fuertemente tóxico para los
humanos. Puede ingresar al cuerpo por
inhalación, ingestión o absorción a través
de los ojos y la piel. Una exposición
aguda al HCN culmina con la inhibición
de la oxidación mitocondrial a través de
la detención por el HCN de la cadena de
transporte de electrones de la membrana
interna mitocondrial [3]. El ion de cianuro
inhibe las enzimas asociadas con la
oxidación celular y causa la muerte a
través de la pérdida de energía. Los
síntomas, que se producen en unos
minutos, pueden ser dolor de cabeza,
náuseas, vómitos, vértigo, palpitaciones,
y seguidamente disnea, bradicardia,
inconsciencia y convulsiones violentas,
seguido de la muerte [4].
El grado de toxicidad del cianuro de
hidrógeno (HCN) para los humanos
depende del tipo de exposición. La
inhalación de altos niveles de cianuro
causa la muerte en 10 a 60 minutos,
teniendo en cuenta que mientras más
alta sea la concentración más rápido se
produce la muerte. La inhalación de
2.000 partes por millón de cianuro
hidrogenado puede ser fatal en tan solo
un minuto. El valor LD50 por ingestión
del cianuro de hidrógeno es de 50-200
miligramos, o de 1-3 miligramos por kilo
de peso. En contacto con la piel normal,
el valor LD50 es de 100 miligramos por
kilo de peso. [5] El cuerpo posee
diversos mecanismos para expulsar el
cianuro de forma efectiva. El cianuro
reacciona con el tiosulfato y produce
tiocianato en reacciones catalizadas por
enzimas de azufre como la rodanasa. El
tiocianato es liberado por la orina en
cuestión de días. Si bien el tiocianato es
siete veces menos tóxico que el cianuro,
en concentraciones altas provenientes de
una exposición crónica al cianuro puede
afectar la glándula tiroides. El cianuro
tiene más afinidad por la
metahemoglobina que por la citocromo
oxidasa, y juntos forman
cianometahemoglobina.
La ingestión crónica de ácido
hidrociánico, a dosis tóxicas subagudas,
puede estar implicada en la patogénesis
de ciertas afecciones, incluida la
alteración de la función tiroidea y
neuropatías. Las poblaciones que
consumen plantas cianogénicas o
derivados de las mismas corren un
elevado riesgo de presentar síntomas
oftalmológicos y neurológicos que están
asociados con la exposición al ácido
hidrociánico. [6]
Informes previos han aducido que la
ingestión de raíces de yuca procesadas
deficientemente está asociada con la
aparición de neuropatía atáxica (konzo)
en países africanos. [7].
En la experimentación se utilizó la
reacción de Guignard que detecta la
presencia de ácido cianhídrico (CNH) al
actuar éste sobre una tira de papel
absorbente impregnada con ácido pícrico
y carbonato de sodio (picrato de sodio).
Los reactivos de Guignard, son
compuestos que están formados por una
parte orgánica y otra metálica, se
preparan a partir de un halogenuro de
alquilo y magnesio en éter o
tetrahidrofurano (THF) como disolvente.
Es uno de los reactivos más versátiles e
importantes en la química orgánica, de
forma general se conocen como RMgX o
ArMgX donde R y Ar denotan grupos
alquilo o arilo, respectivamente.
La reacción de Guignard es una reacción
química organometálica en la que
haluros de alquilo arilmagnesio agregan
a un grupo carbonilo en un aldehído o
cetona. El radical R de reactivo de
Guignard actúa como un nucleófilo
adicionándose al carbono del grupo
nitrilo, el agua proporciona el oxígeno
necesario para la formación del grupo
carbonilo de la acetona que es lo que
medimos al espectrofotómetro. [8]
En la titulación alcalina se lleva acabo La
hidrolisis de los nitrilos conduce a la
formación inicial de una amida y luego a
acido carbónico. En este caso desprende
amoniaco como producto secundario. La
reacción ocurre en medio acido o medio
básico. [9]
La presente investigación experimental
trata de proporcionar una visión general
sobre los glucósidos cianogénicos y la
poca información general existente sobre
los mismos, cuantificando los niveles de
HCN contenido en diferentes muestras
de plantas cianogénicas habituales en
los alimentos.
Materiales y Métodos
Material:
- 1 Vaso de precipitado de 50 mL
- 1 Vaso de precipitado de 200 mL
- Matraz Erlenmeyer de 150 mL
- 1 Tubo de ensaye grande
- 2 Tapones de hule
- Un mortero
- Aparato de destilación
- Mechero
- Matraz de bola de 500 mL
- 1 Bureta de 15 mL
- Espectrofotómetro
- 1 Probeta de 50 mL
Reactivos:
- Semillas de sorgo
- Semillas de manzana verde
- Cloroformo
- Agua destilada
- HCL 0.5N
- Solución patrón de HCN
- Tiras reactivas
- NaOH
- NH4OH 6N
- KI al 5%
- AgNO3 0.02 N.
Reacción de Guinard: Se pesó un gramo
de almendra de la muestra problema. Se
trituró en un mortero hasta obtener una
papilla fina. Se introdujo a un matraz
Erlenmeyer con 25 mL de agua
destilada, 1 mL de HCl 0.5N y 2 gotas de
cloroformo. Se colocó con cuidado la tira
de papel reactivo humedecida y se tapó.
Se mantuvo en u n baño de agua a 40°C
por una hora, agitándolo cada 15
minutos. Pasado este tiempo, si la tira
adquirió siquiera una leve coloración
café-rojiza, se consideró como positiva y
se introdujo a un tubo de ensaye con 20
mL de agua destilado, se tapó y agitó
vigorosamente. Se filtró y se determinó la
absorbancia de la muestra filtrada a 520
nm.
Titulación alcalina: Se pesaron 15
gramos de semilla de sorgo, se colocó en
un matraz de bola de 500 mL con 200
mL de agua destilada y se tapó. Al día
siguiente se destiló la muestra en un
vaso de precipitado con una solución de
0.5 g de NaOH en 20 mL. Se tomaron
dos alícuotas de 100 mL y se le adicionó
9 mL de NH4OH 6N y 2 mL de solución
de KI al 5% a cada una. Se tituló la
mezcla con una solución de AgNO3
0.02N, en el punto final de la titulación se
observó una turbidez verde lechosa. Se
calculó la concentración de HCN de
acuerdo a la siguiente equivalencia:
( )
Resultados Sin
7 Uva roja - -
-Técnica de Guignard cambio
Manzana Café
Tabla 1.- Relación entre el número de 8 0.050 1:10
verde rojizo
equipo, la muestra que se trabajó, el Manzana Rojo
color que se obtuvo en la prueba de 9 0.050 1:10
roja ladrillo
Guignard, la dilución que se hizo para
poder cuantificar y la absorbancia Tabla 2.- Relación entre la concentración
correspondiente. de cada sistema de la curva patrón y su
Equipo Muestra Color Abs Dilución absorbancia registrada.
Manzana Rojo
1 0.050 1:10 Concentración Absorbancias
amarilla ladrillo
Naranja (µg/ml)
2 Pera 0.005 -
tenue Blanco 0
Café 0.4 0.052
3 Durazno 0.055 1:10
rojizo
0.8 0.099
Sin
4 Almendra - - 1.2 0.118
cambio
Café 1.6 0.162
5 Nectarina 0.073 1:10
rojizo 2 0.167
Café
6 Ciruela 0.089 1:2
rojizo

Gráfico 1.- Curva patrón que muestra la absorbancia registrada con respecto a la
concentración en los sistemas.
0.2
0.18
0.16
Absorbancia

0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6
Concentración (µg/ml)

*Cálculos concentración de CN en la muestra que

Mediante regresión lineal se conoce: se trabajó.
r: 0.9774 Mediante sustitución de las absorbancias
Por lo tanto, no se descarta ningún punto en la ecuación resultante de la regresión
en la curva patrón. Sí: lineal se conocen las concentraciones de
a: 0.015 cada muestra. Sin embargo
b: 0.0845 posteriormente se realizan los siguientes
Entonces podemos ocupar [µg/ml]: 0.015 cálculos tomando en cuenta las
+ 0.0845(abs) para conocer la diluciones usadas:
 ( ) µg/ml 4 Tallo sorgo 1.19
5 Yuca 1.35
6 Sorgo 1.04
( )( ) 7 Semilla sorgo 1.00
= 3.8µg en 20 ml 8 Semilla sorgo -
Es decir, existen 3.8µg en 1 gramo de 9 Yuca 1.14
semillas del fruto.
Éstos resultados se realizaron con los
datos de las respectivas muestras
encontrando las siguientes Discusión
concentraciones: Las muestras empleadas en esta técnica
Tabla 3: Concentraciones reales de las son pertenecientes a la familia de las
muestras usadas. rosáceas. Al macerar las semillas de
Concentra estos frutos comienza la liberación de
Concentra ción c/ glucósidos cianógenos Estos
Equi Muest Ab
ción dilución
po ra s compuestos están formados por un
(µg/ml) (µg/ml
µg/ml) azúcar y una cianhídrica El HCN se
Manza libera a partir de la interacción entre un
na 0.0 glucósido cianogénico (no tóxico) y una
1 0.019 3.8
amarill 50 enzima hidrolítica (β-glucosidasa), en un
a proceso conocido como cianogénesis. El
0.0
2 Pera
05
0.015 0.015 hecho de que el glucósido y la enzima se
Duraz 0.0 encuentren en compartimentos diferentes
3 0.019 3.8
no 55 de la planta restringe su contacto y así, la
Almen liberación de HCN. Por lo tanto, la
4 - - -
dra
ruptura de las células de la planta sería
Nectar 0.0
5 0.021 4.2 necesaria para la interacción entre estos
ina 73
Ciruel 0.0 compuestos y, consecuentemente, para
6 0.022 0.44
a 89 liberar el HCN.
Uva Para poder cuantificar los mg de HCN
7 - - -
roja
Manza
presente en las diferentes muestras se
0.0 utilizó la técnica de Guignard la cual se
8 na 0.019 3.8
50
verde produce cuando los gases cianhídricos
Manza 0.0 reaccionan sobre una banda de papel
9 0.019 3.8
na roja 50
impregnada con ácido pícrico y
carbonato de sodio. En estas
-Titulación alcalina condiciones, el picrato de sodio (amarillo)
se reduce a isopurpurato de sodio (rojo).
Tabla 4.- Cantidad de mg de HCN [11] Si no se presenta un cambio la
encontrados en las diferentes muestras prueba es considera negativa. En este
en cada equipo. caso las únicas muestras que dieron
Equipo Muestra mg HCN negativas fueron las semillas de
1 Hoja sorgo - almendra y uva roja. Sin embargo en la
2 Yuca - literatura se reporta que en las semillas
3 Hoja sorgo -
de almendra se puede encontrar hasta 785ppm; como se muestra en la tabla 5

Tabla 5: Comparación de la concentración total de HCN en plantas utilizando hidrolisis

ácida y picrato. [12]
cianogenico venenoso; la linamarina Con
La titulación alcalina se realizó con la destrucción de las células que
muestras de yuca y sorgo, se trabajaron componen la yuca se produce la
distintas partes de la panta; hoja, raíz, liberación de la linamarina que estaba
tallo e interior de la corteza. Este método dentro de las células del vegetal. De este
está basado en la formación del ion proceso salen la linamarina (97%) y la
complejo Ag(NO)2 por la adición de lotaaustralina (3%) los dos componentes
nitrato de plata a la solución a analizarse, cianogenicos. [13]
teniendo la siguiente reacción: En cuanto al sorgo, es importante tener
2CN- + Ag+  Ag(CN)2 en cuenta que el mayor potencial toxico
En el momento en el que la reacción se se encuentra en los sorgos jóvenes, los
completa, el exceso de plata precipita cuales tienen mayor concentración de
como AgCN o reacciona con el indicador glucosidos cianogenicos y enzimas y, por
(KI) para formar AgI. En ambos casos, el lo tanto, vana a ser potencialmente
punto final de la titulación lo proporciona letales después de haber sufrido daño
la aparición de una turbidez permanente celular. Existe una importante variación
opalescente. [8] genética en el potencial toxico de los
La Yuca es una planta de la familia de la distintos materiales de sorgo. En
eufirbiaceas nativa de las Américas términos generales los sorgos graníferos
tropicales donde se cultiva extensamente tienen un mayor potencial tóxico que los
al igual que en Asia y África tropicales. forrajeros. Es necesario tener presente
Tanto las hojas como las raíces que la maleza sorgo de Alepo tiene
contienen cantidades apreciables de también un elevado potencial tóxico,
glucósidos cianogenicos y deben ser además de los sorgos cultivados. [14]
procesadas adecuadamente para evitar En la tabla 6 aparecen los alimentos para
la aparición de efectos tóxicos. La planta los seres humanos y animales que
de yuca produce una sabia o jugo contienen cianuro, entre ellos las dos
lechoso que contiene el glucosido plantas estudiadas; sorgo y yuca.
 identificación y cuantificación de cianuros
en semillas de frutas de la familia
Rosaceae, para conocer si dichos frutos
pueden llegar a ser potenciales fuentes
de intoxicación por cianuro. Encontrando
que
Referencias:
Tabla 6. Alimentos para los seres
humanos y animales que contienen 1. D. J. Ballhom, ―Cyanogenic
cianuro [14] glycosides in nuts and seeds,‖ in
Para la yuca el JECFA concluye que un Nuts & Seeds in Health and
nivel hasta 10 mg/kg de HCN permite su Disease Prevention, V. R. Preedy,
consumo [10] cantidad que no está R. R.Watson, and V. B. Patel,
asociado con toxicidad aguda. Sin Eds., pp. 129–136, Academic
embargo el JECFA no ha establecido un Press is an imprint of Elsevier,
nivel inocuo de ingestión para los London, UK, 1st edition, 2011.
glucósidos cianogénicos de las demás 2. D. S. Seigler, ―Isolation and
especies trabajadas. characterization of naturally
Una dosis de entre 30 y 210 mg de HCN occurring cyanogenic
puede causar la muerte de una persona compounds,‖ Phytochemistry, vol.
adulta. Además la ingestión continua de 14, no. 1, pp. 9–29, 1975.
esta substancia, en la utilización de estos 3. Cheeke PR. (1989) ―Toxicants of
alimentos como como básicos sin plant origin‖. Volume II.
procesarla adecuadamente, puede tener Glycosides. CRC Press Inc.
consecuencias muy graves para la salud.
4. EFSA (2004) ―Opinion of the
[15] Se puede observar en las tablas 3 y Scientific Panel on Food
4 de los resultados que ninguna de las Additives, Flavourings,
muestras rebasan los 5mg/g de muestra. Processing Aids and Materials in
Lo cual indica que una intoxicación por la
Contact with Food (AFC) on
ingesta de estos alimentos es poco hydrocyanic acid in Flavourings
probable. Sin embargo la base de datos and other Food Ingredients with
relativa a la toxicidad del ácido Flavouring‖ Properties. Question
cianihídrico y los glucósidos no EFS-Q-2—3-0145. EFSA
cianogénicos es incompleta y limitada, en
Journal.
particular en lo referente a la ingestión 5. A. E. Burns, J.H. Bradbury, T.R.
crónica o al consumo habitual de estos Cavagnaro, and R.M. Gleadow,
alimentos que forman parte de las ―Total cyanide content of cassava
costumbres gastronómicas o medicinales food products in Australia,‖
de diversas poblaciones. Journal of Food Composition and
Analysis, vol. 25, no. 1, pp. 79–
82, 2012.
6. Ravi S, Padmaja G. (2007)
Conclusiones
―Mechanism of cyanogen
Se aplicó la reacción de Guignard y
reduction in cassava roots during
titulación alcalina como técnicas de
 cooking‖. Journal of the Science
of Food and Agriculture. 75: 427-
432.
7. Teles F. (2002) ―Chronic
poisoning by hydrogen cyanide in
cassava and its prevention in
Africa and Latin America‖. Food
and Nutrition Bulletin 23: 407-412.
8. Nava. Alonso, F, 2007 enero-
febrero ―Análisis químico del
cianuro en el proceso de
cianuración; revisión de los
principales métodos‖ Revista de
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electrónico disponible en pdf en fi-
le:///C:/Users/YuritzY/Downloads/
48-48-1-PB.pdf
9. Castillo García, Encarna, 2007,
Manual de Fitoterapia, Editorial
Elsevier Masson, Barcelona,
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10. Hernández T, Lundquist P,
Oliveira L, Pérez Cristiá R,
Rodriguez E, & Rosling H. (1995)
―Fate in humans of dietary intake
of cyanogenic glycosides from
roots of sweet cassava consumed
in Cuba‖. Nat Toxins. 1995;
3(2):114-7
11. Trabajo Práctico: Detección de
Ácido Cianhídrico en Plántulas de
Sorgo, Universidad Nacional de
Mar del Plata Facultad de
Ciencias Agrarias Bioquimica II,
documento electrónico en pdf,
Disponible en
http://www.mdp.edu.ar/agrarias/gr
ado/710_Bioquimica_II/archivos/p
racticos/10_a_TP_deteccion_cian
hidrico_sorgo_2014.pdf
12. M. Rezaul Haque, J. Howard
Bradbury, ―Total cyanide
determination of plants and foods
using the picrate and acid
hydrolysis methods‖ Analytical,
Nutritional and Clinical Methods
Section; Food Chemistry 77
(2002) 107–114.
13. Zanivic Vladimir 2003, ―Posible
asociación de algunas
enfermedades neurológicas con
el consumo excesivo de yuca mal
procesada y de otros vegetales
neurotóxicos‖ Colombia Medica,
vol. 34 num.2 Universidad del
Valle Colombia.
14. Bretscheneider Gustavo , 2008,
―Intoxicación del ganado con
ácido cianhídrico‖ EEA INTA
Rafaela, Santa Fe, Argentina,
documento electrónico en pdf ,
disponible en
http://www.produccion-
animal.com.ar/sanidad_intoxicac
iones_metabolicos/intoxicacione
s/106-cianhidrico.pdf
15. JECFA (1993) ―Cyanogenic
glycosides. In: Toxicological
evaluation of certain food
additives and naturally occurring
toxicants‖. Geneva, World Health
Organization, 39th Meeting of the
Joint FAO/WHO Expert
Committee on Food Additives
(WHO Food Additives Series 30).
Available at
http://www.inchem.org/documents
/jecfa/jecmono/v30je18.html
 REACCIÓN DE GUIGNAR

Semillas problema secas y

sin cáscara

Pesar 1g

Mortero

Triturar cuando la curva estándar esté lista

Matraz, agua destilada,

cloroformo HCl 0.5 N

Agregar a un matraz con 25 mL de agua

destilada, 2 gotas de cloroformo y 1 mL de HCl
0.5 N

Tira de papel reactivo

Colocar la tira de papel reactivo humedecida,

tapar.

Colocar el matraz en baño maría a 40°C por 1Hr

agitando cada 15 min.

Las tiras de las muestras problema positivas

(aunque sea una leve coloración café-rojiza) se
R1 y R2
introducen a un tubo de ensaye.

Agua destilada, papel

whatman

Se le adicionan 20 mL de agua destilada, se R2

tapa se agita y filtra

Se filtra y el filtrado se lee a 520 nm R3

FIN
 MÉTODO DE TITULACIÓN ALCALINA

Sorgo o yuca, matraz de bola

de 500 mL y agua destilada

En el matraz adicionar entre 10 y 20 g de

muestra y 200 mL de agua destilada. Tapar y
dejar en reposo un día

Aparato de destilación, NaOH

Destilar el contenido del matraz a un vaso con

0.5g de NaOH en 20 mL de agua destilada.
Recibir 150 mL R4 y R5

Matraz aforado de 250 mL

Aforar

NH4OH 6N y solución de KI
5%

Tomar 2 alícuotas de 100 mL y adicionar 8

mL de NH4OH 6N y 2 mL de solución de KI
5% a c/u

AgNO3 0.02N

Titular con AgNO3 0.02N. El punto final de la

titulacion es una turbidez verde lechoza. R6

Calcular la concentración de HCN de acuerdo

a:

FIN
R1: Cloroformo, ácido clorhídrico – Depositar en un frasco de vidrio debidamente
identificado.
R2: Tiras de Gignard – Depositar en la basura municipal.
R3: Picrato de sodio, carbonato de sodio y ácido picrámico – Depositar en un frasco de
vidrio debidamente identificado.
R4: Residuos de sorgo o yuca – Depositar en la basura municipal.
R5: Agua con la que se remojó el sorgo o yuca – Verter a la tarja.