Soluciones

• Gradilla con 6 tubos de ensayo

•Eritrocitos humanos lavados en solución.
• Salina isotónica
• Solución de azul de metileno al 1.0%
• Cloruro de sodio en cristales (NaCl)
Objetivos
• Balanza granataria
Que el alumno:
Por grupo:
• 1 Microscopio marca Leica.
1. Identifique la existencia de soluciones en
los sistemas biológicos.
Procedimiento
2. Explique los cálculos y procedimientos
1. Hacer los cálculos para preparar una
para preparar soluciones porcentuales,
solución de KCl al 3%.
molares y normales, así como las diferentes
2. Hacer los cálculos para prepara una
diluciones de éstas.
solución de CaCl2 0.25 M se requieren 15 ml.
3. Presente ejemplos de soluciones utilizadas
3. Calcular el volumen de H2SO4 se requiere
en medicina (solución isotónica, Ringer,
para preparar una solución 3N 40 ml volumen
Darrow y Hartman).
final.
4. Hacer los cálculos correspondientes para
Responda a las siguientes preguntas:
comprobar que la solución a 0.9% de NaCl
1. ¿Qué es una solución?
es isotónica con respecto al plasma (ver pag.
2. ¿Cuántas clases de soluciones existen?
92). Considerar que:
3. ¿Qué significan los siguientes términos:
a) El cloruro de sodio se disocia en solución
mol, solución molar y solución normal?
acuosa en los iones sodio y cloruro, por lo
4. ¿Qué significan: v/v, p/v, p/p y ppm?
que la concentración iónica se duplica (1
5. ¿Cuál es la composición de las siguientes
mmol/l = 2 mosm/l).
soluciones: solución isotónica de cloruro de
b) La presión osmótica normal del plasma es
sodio, suero glucosado a 5%, Ringer-lactato?
de 290-310 mosm/l.
6. ¿Cuáles son los tipos de soluciones que
5. Preparar 20 ml de una solución de NaCl a
existen in vivo? Mencionar ejemplos.
4.5% (etiquetar como solución 1).
7. ¿Qué es una solución isotónica?
6. A partir de la solución anterior, preparar 25
8. ¿Qué es una solución osmolar?
ml a 0.9% (solución 2) y 50 ml a 0.045%
9. ¿Cómo se calcula la osmolaridad de una
(solución 3).
solución?
7. Colocar en tres tubos de ensayo las
10. ¿Qué les pasa a los eritrocitos cuando se
diferentes soluciones de cloruro de sodio
ponen en contacto con soluciones salinas de
preparadas en los puntos 1 y 2. Con la ayuda
diferente osmolaridad?
de un gotero (dejando caer lentamente por
11. ¿Qué se entiende por dilución y dilución
las paredes del tubo) 2 gotas de eritrocitos
seriada de las soluciones?
lavados. Mezclar con cuidado y dejar
reposar a temperatura ambiente unos
Material
minutos. Valorar el grado de hemólisis que
Por equipo:
sufren los eritrocitos cuando se ponen en
• 3 vasos de precipitado de 10 ml
contacto con las diferentes soluciones.
• 3 pipetas de 1.0 ml
• 3 pipetas de 5.0 ml
8. Hacer los cálculos necesarios para
• 3 pipetas de 10.0 ml
preparar otras soluciones, por ejemplo: 500
ml de etanol a 45 % (a partir de etanol a 96
%).Expresar en meq/l una concentración de
calcio de 11 mg/dl. Una solución contiene 14
g de glucosa en 25 ml. ¿Cuál es la
concentración molar de la solución?
A un enfermo hay que inyectarle 15 g de KCl
y 126 g de glucosa (C6O6H12).
¿Cuánta agua habrá que añadirles para que
resulte un suero 0.4 osmolar?
9. Calcular la osmolaridad a partir de la
composición de algunas soluciones como
Dextrosa a 10 % en solución salina a 0.45%.
Dextrosa a 5 % en solución salina a 0.2 %.
Hartman, Ringer y Darrow.
10. Hacer la dilución y redilución (dilución
seriada) de la solución de azul de metileno
como se muestra en el siguiente cuadro:
reimpresión de la 2a. ed. México: Editorial
Limusa; 2004.
3. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna.
5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno;
2002: p. 41-56.
4. Holum JR. Fundamentos de química
general, orgánica y bioquímica para ciencias
de la salud. México: Editorial Limusa Wiley;
2001.
5. Farias GM. Química clínica. Décima
edición México: Editorial El Manual Moderno;
1999.
6. Bloomfield MM.Química de los organismos
vivos. México: Editorial Limusa; 1997.

DILUCIÓN SERIADA DE AZUL DE

METILENO
Tubo H2O Sol de azul Volumen de
(ml) de metileno transferencia
1 2 0.5 ml* -
2 2 - 0.5 ml
3 2 - 0.5 ml
4 2 - 0.5 ml
5 2 - 0.5 ml
6 2 - 0.5 ml

*Nota: para mezclar al hacer las diluciones se

debe succionar y soplar con cuidado la pipeta en
cada tubo varias veces antes de transferir la
dilución al siguiente tubo.

Resultados
1. Expresar en forma ordenada los cálculos
efectuados para cada uno de los ejercicios.

2. Deducir el movimiento o no del solvente

cuando se ponen en contacto eritrocitos con
soluciones hipo, hiper e isoosmóticas.

3. Calcular la dilución y la concentración de

azul de metileno en cada uno de los seis
tubos de la dilución seriada (ver pág. 93).
Asegúrese que la coloración obtenida
disminuya gradualmente conforme avanza la
dilución.

REFERENCIAS
1. Villazón SA, Cárdenas CO, Villazón DO,
Sierra UA. Fluidos y electrólitos. México: JGH
Editores; 2000.
2. Peña-Díaz A, Arroyo BA, Gómez PA,
Tapia IR, Gómez EC. Bioquímica. Undécima
 INSTRUCCIONES PARA EL USO
DEL MICROSCOPIO MARCA LEICA

1. Nunca use un adaptador entre el cable y
la fuente de alimentación.
2. Use siempre el microscopio sobre una
superficie dura y estable.
3. Conecte el cable de alimentación del
microscopio a una toma de corriente con
conexión a tierra. Se suministra un cable de
tres terminales con toma a tierra.
muestra con precisión utilizando el mando de
enfoque micrométrico.
11. Ajuste los tubos oculares a la distancia de
los ojos.
12. Al término del uso del microscopio retirar
la muestra de la platina.
13. Bajar la platina hasta el tope y regresarla
a su posición original si es necesario.

4. Encienda el microscopio girando el 14. Colocar el revolver de los objetivos de

interruptor de control de la iluminación manera que el objetivo de 4X sea el que
situado en la parte inferior izquierda del quede en dirección de la lámpara.
instrumento.
15. Desconectar el equipo y enrollar el
5. Coloque el interruptor de control de la cable.
iluminación en el nivel más bajo. El control
de iluminación le permite ajustar la intensidad 16. Limpiar la platina y oculares con un paño
de luz. humedecido con metanol o con un limpia
cristal comercial.
6. Abra completamente el diafragma de
apertura del condensador girando el anillo 17. Colocar al microscopio la funda contra el
hacia el extremo derecho. polvo para mantenerlo en buenas
condiciones físicas y mecánicas.
7. Usando el botón de enfoque del
condensador, suba el condensador hasta el Partes del microscopio:
extremo superior de su desplazamiento. 1) -Oculares.
Iluminación critica únicamente: si el 2) -Revolver con 4 objetivos 4X, 10X, 40X y
desplazamiento del condensador es 100X.
excesivo, limítelo con el tornillo situado 3) -Platina.
debajo de la platina hasta que la lente 4).-Diafragma.
superior del condensador se encuentre 5) -Lámpara.
debajo de la superficie de la platina. 6).-Tornillo de la platina para desplazar la
muestra.
8. Coloque la preparación de la muestra con 7).-Interruptor de control de la iluminación.
la muestra en la platina. 8).-Tornillo macrométrico.
9).-Tornillo micrométrico.
9. Gire el revólver hasta situar el objetivo 4X
en la posición de trabajo. (pag X) 1

10. Suba la platina girando el mando de 2

enfoque macrométrico hasta que observe la
preparación y, finalmente, enfoque la
6

9 3

4
8
Práctica 2
7 5
 Práctica 2
Regulación del equilibrio ácido-base
después del ejercicio muscular intenso y
de la ingestión de bicarbonato de sodio
Objetivos
1. Al finalizar la práctica, el alumno
constatará las actividades reguladoras del
pulmón y el riñón para mantener el equilibrio
ácido-base en condiciones que tienden a
romperlo.
2. Mediante la determinación del pH
observará la variación de la concentración de
hidrogeniones en la orina de un individuo que
ha realizado ejercicio muscular intenso.
3. Relacionará los resultados obtenidos con
los cambios metabólicos originados por el
ejercicio muscular intenso.
Conteste las siguientes preguntas:
1. ¿Por qué es importante que se mantenga
constante, dentro de ciertos límites, el pH en
el organismo?
2. ¿Cuáles son las fuentes de iones H+ en el
organismo?
3. ¿Cuáles son los sistemas reguladores que
facilitan la eliminación del H+ producido en el
organismo con el fin de mantener constante
el pH sanguíneo?
4. ¿Cuáles son las reacciones de formación
del ácido carbónico (H2CO3) a partir de CO2 y
H2O, y de su disociación para formar el ion
bicarbonato? Escríbalas.
5. ¿Qué sistemas amortiguadores participan
directamente en la regulación del pH
sanguíneo?
6. ¿Cuáles son los sistemas extrasanguíneos
que tienden a mantener el pH extracelular?
Escriba la ecuación de Henderson y
Hasselbalch aplicada al sistema
HCO3–/H2CO3 y, con base en ella, conteste la
siguiente pregunta:
1. ¿Cómo participan el aparato respiratorio y
el riñón en el control del pH sanguíneo?
Material
• Diez probetas o vasos de precipitado.
• Orina.
• Potenciómetro.
• Piceta.
Método
Un alumno por equipo desayunará o comerá
normalmente (evitar ingestión de jugos
ácidos); después hará lo que se indica a
continuación:
1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de
la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar
esa orina.
2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente
antes de la clase práctica.
3. Orinar en un vaso de precipitado de 100
ml. Anotar el volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua.
5. Realizar ejercicio muscular intenso, como
subir y bajar varias veces las escaleras de
tres o cuatro pisos u otro ejercicio sugerido
por el profesor.
6. Obtener muestras de orina cada 15
minutos, como en el inciso 3, hasta completar
por lo menos cinco muestras.
7. A cada muestra se le determinará el pH
inmediatamente después de haber sido
obtenida ya que con el tiempo el pH tiende a
aumentar debido a la pérdida de dióxido de
carbono y a que el crecimiento bacteriano
produce amoniaco a partir de la urea.
Análisis de resultados 1. Tomar 250 ml de agua una hora antes de
la clase práctica. Vaciar la vejiga y descartar
Una vez obtenido el valor del pH para cada esa orina.
una de las 5 muestras de orina, trazar una
gráfica de pH contra tiempo; interpretar los 2. Tomar 250 ml de agua inmediatamente
resultados y discutirlos en grupo. antes de la clase práctica.
3. Orinar en una probeta de 100 ml. Anotar el
Segunda parte volumen de la muestra.
4. Ingerir 250 ml de agua con 7.5 g de
Objetivos bicarbonato de sodio.
5. Obtener muestras de orina cada 15
1. El alumno constatará el papel del riñón en minutos, hasta completar por lo menos 5
el mantenimiento del equilibrio ácido-base en muestras.
una situación de alcalosis metabólica 6. A cada muestra se le determinará el pH
provocada por la ingestión de bicarbonato de inmediatamente después de haber sido
sodio. obtenida.
2. Mediante la medición del pH, observar la
variación de la concentración de Análisis de resultados
hidrogeniones en la orina de un individuo que Una vez obtenido el valor del pH para cada
ha ingerido una carga de bicarbonato de una de las cinco muestras de orina, trazar
sodio. una gráfica de pH contra tiempo; interpretar
los resultados y discutirlos en grupo.
Hipótesis
REFERENCIAS
Elabore la hipótesis apropiada. 1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Material Editorial Reverte; 2004.
• Orina. 2. Montgomery R. Bioquímica: casos y texto.
• Solución de bicarbonato de sodio a 3%. 6a. ed. Editorial Harcourt-Brace; 1998: cap.4.
• Potenciómetro. 3. Villazón SA, Cárdenas CO,Villazón

Método

Práctica 3
 Titulación de un aminoácido con una
base y la aplicación de la ecuación de
Henderson y Hasselbalch.
Determinación del pK1 y del pK2
Objetivos
Que el alumno:
1. Experimente y entienda cómo se comporta
un sistema amortiguador de pH.
2. Aprenda el uso de la ecuación de
Henderson-Hasselbalch.
3. Aprenda a calcular el pK de un par ácido-
base.
4. Mida el pH de diferentes sustancias y
calcule su concentración de H+.
5. Aplique estos conocimientos al estudio de
las propiedades de los aminoácidos.
Para lograr lo anterior conteste las
siguientes preguntas y planteamientos:
1. ¿Qué es el pH de una solución?
2. ¿Qué es un sistema amortiguador ácido-
base y para qué sirve?
3. ¿Cuáles son los sistemas amortiguadores
más importantes en biología?
4. Escribir la ecuación de Henderson-
Hasselbalch.
5. ¿Qué es el pK de un par ácido base?
6. ¿Por qué es importante la concentración
de H+ en los seres vivos?
7. Dibujar la fórmula de la glicina, de la lisina,
de la histidina y del ácido aspártico
e identificar a los grupos α -amino y α -
carboxilo de estos aminoácidos, así como su
radical, e indicar la naturaleza del mismo.
8. ¿Qué les pasa a estos grupos funcionales
cuando se someten a pH ácido o básico?
9. ¿Se pueden usar los aminoácidos como
amortiguadores de pH?
10. ¿Son los aminoácidos buenos
amortiguadores a pH de 7.0?
11. ¿Cuál es el punto isoeléctrico de los
aminoácidos que tienen un grupo amino y un
grupo carboxilo?
12. ¿Cuál es la carga eléctrica de los
aminoácidos que tienen dos grupos carboxilo
a pH de 7.0?
13. ¿Cuál es la carga eléctrica de los
aminoácidos que tienen dos grupos amino a
pH de 7.0?
Material
• Cuatro vasos de precipitado de 100 ml.
• Pipeta de 1 ml (para el NaOH).
• Potenciómetro.
• Piceta para enjuagar el electrodo.
• Glicina 0.025 mol/l pH 2.
• Lisina 0.025 mol/l pH 2.
• Ácido aspártico 0.025 mol/l pH 2.
• Histidina 0.025 mol/l pH 2.
• NaOH 1.0 mol/l.
Método
1. Poner 20 ml de la solución de glicina en un
vaso de precipitado de 100 ml.
2. Proceder a la medición del pH.
3. Añadir 0.1 ml de NaOH 1.0 mol/l. Agitar el
vaso y volver a medir el pH; anotar los
resultados.
4. Repetir el paso 3 hasta llegar a un pH
aproximado de 12.
5. Hacer lo mismo (pasos 1 a 4) para los
otros tres aminoácidos.
Análisis de resultados
1. Hacer una gráfica de pH vs volumen en
ml de NaOH gastados luego de tomar en
cuenta que cada 0.1 ml de NaOH diluido en
20 ml aumenta la concentración de OH en 5
mM.
2. Localizar en la gráfica el pI y los
diferentes pK de los aminoácidos.
3. Mediante la ecuación de Henderson-
Hasselbalch cuantificar la relación entre cada
par de especies ionizables de los
aminoácidos a diferentes pH.
4. Identificar a qué pH tienen poder
amortiguador.
Medición del pH y cálculo de la concentración
de H+ en diferentes líquidos
Método
1. Pedir a los alumnos desde la clase
anterior que traigan diferentes muestras,
tales como leche, café, refresco, orina, saliva,
jugo de frutas, etcétera.
2. Colocar los líquidos en un vaso de
precipitado y medir el pH en el
potenciómetro.
Análisis de resultados
Calcular la concentración molar de H+ en
cada uno de las muestras estudiadas.
REFERENCIAS
1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto con
aplicaciones clínicas. 4a. ed. Barcelona:
Editorial Reverte; 2004.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios de
bioquímica. 4a. ed. Barcelona: Ediciones
Omega; 2005
 Práctica 4
Estudio de las proteínas corporales
Objetivos
1. Aplicar los conocimientos generales sobre
las proteínas al estudio de las proteínas
corporales.
2. Conocer las alteraciones más frecuentes
de las proteínas plasmáticas y sus
consecuencias.
3. Conocer los métodos generales para el
estudio de las proteínas plasmáticas.
4. Determinar la concentración sérica de
proteína total y de albúmina e interpretar los
resultados obtenidos.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son polímeros lineales
constituidos por los aminoácidos, que se unen
entre sí por medio de enlaces tipo amida
denominados enlaces peptídicos.
Los polímeros compuestos por dos
aminoácidos forman un dipéptido, por tres, un
tripéptido; cuando el número de aminoácidos
es mayor, oligopéptidos y polipéptidos o
simplemente se denominan péptidos. Las
proteínas son moléculas constituidas por una o
más cadenas polipéptidicas.
Las proteínas pueden ser clasificadas en
función de aspectos tan diversos como su
composición, su disposición espacial, su
función biológica y su localización.
Atendiendo a su localización dentro del
organismo humano, las proteínas pueden
clasificarse en:
• Hísticas o tisulares, son las proteínas de los
tejidos.
• Plasmáticas o hemáticas, son las proteínas
de la sangre.
Aunque las proteínas tisulares son de gran
importancia en el organismo, las localizadas en
la sangre (la hemoglobina en los eritrocitos y
las proteínas plasmáticas), por su gran
accesibilidad, proporcionan con facilidad
información importante y, por lo tanto, son las
más utilizadas en el laboratorio clínico.
Proteínas plasmáticas
La sangre está constituida por formas celulares
en suspensión (eritrocitos, leucocitos y
plaquetas) en un medio líquido llamado
plasma. El plasma se obtiene cuando,
inmediatamente después de extraer la sangre,
se le agregan anticoagulantes como oxalato,
citrato, EDTA o heparina y se centrifuga. Si se
recoge sangre sin anticoagulante y se deja que
ésta coagule, el líquido que se separa se llama
suero. El suero carece de células y de factores
de la coagulación incluyendo la proteína
fibrinógeno, pues ésta ha sido transformada en
fibrina insoluble en el proceso de la
coagulación. El fibrinógeno constituye sólo de
3 a 6% del total de las proteínas en plasma.
El agua constituye 92 a 93% del plasma o
suero y en ella encontramos electrolitos,
metabolitos, nutrientes, hormonas y proteínas
en una proporción de 7 a 8%; de estos solutos
presentes, las proteínas son las que están en
máxima proporción, aproximadamente 6 a 8
g/dl de suero y este valor es 0.2 a 0.4 g/dl
mayor en plasma por la presencia de
fibrinógeno.
Las proteínas plasmáticas son un grupo de Las enzimas se estudian evaluando su
más de 100 moléculas distintas con actividad catalítica o su concentración de masa
características y funciones muy diversas, mediante métodos inmunoquímicos. También
aunque para fines prácticos el término es posible el estudio fraccionado de las
"proteína plasmática" se usa para todas proteínas, para lo que se recurre a otros
aquellas proteínas cuya concentración en el procedimientos más precisos de gran ayuda
plasma sea mayor a 10 mg/dl y que cumplan clínica, como la electroforesis, la
con alguna función específica dentro de él. inmunoelectroforesis y la inmunodifusión radial
Aproximadamente son 20 las proteínas que de proteínas plasmáticas.
cumplen con ambas definiciones. Todas estas
proteínas, a excepción del fibrinógeno, se
Proteína total
encuentran tanto en plasma como en suero.
La suma de las concentraciones de todas y
La mayoría de las proteínas plasmáticas son
cada una de las proteínas presentes en el
sintetizadas por el hígado. Las proteínas del
plasma se conoce como proteínas totales y la
plasma, al igual que otras proteínas del
cifra normal, en promedio, es de 7.1 g/dl,
organismo, son destruídas y reemplazadas
siendo las cifras límite entre 6 y 8 g/dl.
constantemente, con una vida media de
Las proteínas totales están integradas por
aproximadamente 10 días.
albúmina (más de la mitad) y las globulinas;
Las funciones de las proteínas plasmáticas
estas últimas agrupan a todas las proteínas
pueden agruparse en tres grandes grupos: de
que no son albúmina.
transporte como la transferrina, lipoproteínas y
La concentración de las proteínas plasmáticas
la albúmina; de defensa del organismo en el
en un momento determinado es el resultado de
ataque a agentes extraños o para limitar la
tres procesos: la velocidad de síntesis, el
respuesta inflamatoria, como las
volumen del líquido en que se distribuyen y la
inmunoglobulinas, la a1-antitripsina, la
velocidad de degradación. En diversos estados
haptoglobina y el complemento. Por último,
patológicos, estos procesos pueden
para mantener la presión oncótica de la
superponerse. En la práctica, la determinación
sangre, necesaria para prevenir pérdidas de
de la concentración de la proteína total es un
líquido del espacio vascular al intersticial: la
parámetro que sólo refleja los cambios de las
albúmina es el ejemplo más importante de este
proteínas más abundantes, como la albúmina y
grupo.
las inmunoglobulinas.
La determinación de proteína total es útil en el
Métodos para el estudio de las proteínas
diagnóstico de enfermedades del hígado, de
plasmáticas
los riñones y de la médula ósea.
El laboratorio clínico cuantifica en una muestra
de suero las concentraciones de proteína total
En clínica se puede observar hiper o
y de albúmina. A partir de estos datos, se
hipoproteinemias, pero tanto en unas como en
calcula la fracción globulina como la diferencia
otras, frecuentemente existe disminución de la
entre los dos resultados anteriores y la relación
albúmina casi nunca, aumento y generalmente
albúmina/globulina se calcula a partir de
aumento de globulinas, en alguna de sus
estos últimos. La concentración de otras
fracciones.
proteínas se determina por grupos (por
La determinación de las proteínas totales suele
ejemplo, las gamma-globulinas) o
realizarse en el suero que carece de
individualmente por métodos inmunoquímicos
fibrinógeno y de cualquier anticoagulante que
(por ejemplo algunas hormonas o marcadores
pueda diluir levemente las proteínas en el
tumorales).
plasma.
Albúmina
La albúmina es la principal proteína plasmática
y es sintetizada y secretada por el hígado a
razón de 12 g al día. Supone alrededor de 25%
de la producción proteica hepática total y la
mitad de toda su proteína secretada. La
albúmina es una proteína globular compuesta
por 585 aminoácidos en una sola cadena
polipeptídica con 50% de α-hélice y 15% de
estructura β, posee 17 puentes disulfuro y tiene
una vida media entre 14 y 20 días.
En el adulto normal se degradan diariamente
12 g de albúmina que pueden proveer de
aminoácidos para la síntesis de otras
proteínas. Además de esta función nutritiva, la
albúmina ayuda a conservar la distribución
normal de agua ya que produce cerca de 80%
del efecto osmótico de las proteínas
plasmáticas totales, debido a su alta
concentración y bajo peso molecular. La
albúmina interviene en el equilibrio ácido-
básico y se encarga también del transporte de
varias sustancias como son los ácidos grasos,
la bilirrubina, varias hormonas e incluso
algunos fármacos (sulfonamidas, penicilina G,
aspirina, entre otras).
Alteraciones en la concentración de albúmina.
La más común es la disminución en su
concentración o hipoalbuminemia. En general,
la disminución de 1 g de albúmina sérica
equivale a una pérdida de 30 g de proteína
tisular. Las principales causas de
hipoalbuminemia son las enfermedades
renales, la desnutrición por baja ingestión de
proteínas y la síntesis deficiente como
consecuencia de la insuficiencia hepática,
sobre todo en casos de cirrosis. La
manifestación clínica más llamativa de la
hipoalbuminemia es el edema.
Las cifras normales de albúmina son de 4.5
g/dl y las cifras límite entre 3.5 y 5 g/dl. La
relación normal A/G es mayor de uno y es un
indicador importante en algunos estados
patológicos. Una relación A/G baja puede
obtenerse porque existe hiperglobulinemia,
hipoalbuminemia o ambas.
Separación electroforética de las proteínas
del suero
Las técnicas de electroforesis, enfoque
isoeléctrico y cromatografía de intercambio
iónico son algunas de las más importantes
para el estudio de las proteínas basadas en su
carga eléctrica.
En la electroforesis, si se colocan las proteínas
en un soporte (geles poliméricos, almidón o
papel) inmersas en una solución
amortiguadora a un pH determinado dentro de
un campo eléctrico, las proteínas se desplazan
hacia un polo cargado. En función de la
relación entre el pH del amortiguador y el pI de
la molécula, ésta se moverá hacia el cátodo,
hacia el ánodo, o permanecerá estacionaria
(pH=pI), por influencia del campo eléctrico
externo.
Cuando se realiza la electroforesis en papel o
acetato de celulosa a pH 8.6, que es un pH
significativamente superior al pI de las
principales proteínas plasmáticas cuyo peso
molecular oscila entre 66 000 y 700 000, las
proteínas están cargadas negativamente y se
mueven hacia el polo eléctrico positivo. En
función de su velocidad de desplazamiento, las
proteínas del suero se separan en cinco
fracciones principales: albúmina, globulina α-1,
globulina α-2, globulina β, fibrinógeno θ (para
plasma solamente) y globulina γ (Fig. 5.1). La
electroforesis no separa los componentes
proteicos en sustancias químicamente puras:
algunas de estas fracciones representan
decenas a cientos de proteínas individuales y
diferentes que sólo tienen en común la misma
velocidad de desplazamiento electroforético.
Hay que tener en cuenta que la migración a
distinta velocidad en el campo eléctrico,
obedece a la forma y carga de la molécula y
menos a su tamaño o peso molecular.
Las membranas de acetato de celulosa tienen
la ventaja de ser químicamente homogéneas y
poder transparentarse, con lo que las Tabla 5.1 Algunas proteínas cuya
sustancias que se separan pueden concentración se determina en el suero
cuantificarse por densitometría, una vez NOM B RE D E L A g/L P ROP IE D A D E S Y M OTIV O PA RA LA
P ROTE ÍNA F UNC IÓN P RUE B A
teñidas. Este aparato condujo históricamente a
la separación y clasificación operacional de las A lbúmina 35-50 Transporte de D esnutrición
múltiples Hepatopatía
proteínas del plasma humano (Fig. 5.1). El sustancias Neoplasias
área de cada pico determina la concentración
Ig G 8-17 Inmunidad Inmunodeficiencias
de la proteína que posee esa movilidad
hum oral Mielom a
particular.
C3 0.5- P roteína del Obstrucción biliar
0.9 complemento Lupus eritem atoso

P roteína C <0.005 Implicada en la Infecciones agudas

reactiva respuesta
inm une

P roteína fijadora 0.2- Une y D año hepático

de vitamina D 0.55 transporta grave
vitamina D
3

Haptoglobina 0.5- Fija la Hem ólisis

3.2 hemoglobina S índrom e nefrótico

Fibronectina 0.25- P romueve la S epsis

0.4 adhesión Leucemia
celular, une P ancreatitis aguda
fibrina

Transferrina 2.3- Transporte de Hem ocrom atosis

4.3 hierro malnutrición

C eruloplasm ina 0.2- Transporte de D año hepático

La electroforesis separa las proteínas del suero 0.55 cobre grave
en patrones que pueden ser altamente S índrom e nefrótico

específicos para ciertas enfermedades como

sucede en el mieloma, el síndrome nefrótico, La tabla 5.1 describe algunas de las proteínas
la cirrosis o las quemaduras corporales cuya cuantificación es de utilidad clínica.
extensas (Fig. 5.1).
Alteraciones de las proteínas plasmáticas
Proteínas específicas Dada la gran diversidad de funciones
Las proteínas plasmáticas de interés clínico desempeñadas por las proteínas plasmáticas
pueden determinarse por procedimientos en el organismo, son también muchas las
cuantitativos específicos que proporcionan una alteraciones o disfunciones que pueden
información clinica más precisa que los aparecer.
métodos anteriores. La cuantificación se Las alteraciones pueden clasificarse en:
realiza mediante métodos como la • Alteraciones en la cantidad de proteínas
nefelometría, la turbidimetría y la totales.
inmunodifusión radial y métodos de • Alteraciones en las fracciones obtenidas tras
inmunoanálisis con reactivos marcados, como una electroforesis, disproteinemias.
el radioinmunoanálisis, el • Presencia en el plasma de alguna Ig anormal
enzimoinmunoanálisis, el fluoroinmunoanálisis y/o de alguno de sus fragmentos,
y el luminoinmunoanálisis. paraproteinemias.
• Circulación en plasma de Ig que precipitan al total en la muestra. La absorbencia se
descender la temperatura. Crioglobulinemia. determina a 540 nm con un blanco de
• Defectos aislados de alguna fracción. reactivos.

Material Preparar la siguiente serie de tubos:

• Gradilla con 6 tubos de ensayo
• 2 Pipetas de 5 ml, No. de 1. Blanco 2. Estándar 3. Suero
• Pipetas automáticas tubo problema
• Puntas para pipetas automáticas Estándar - 25 µl -
• Reactivo de Biuret para determinación de Suero - - 25 µl
proteína: tartrato de K-Na 15 mmol/l, yoduro de problema
sodio 100 mmol/l, ioduro de potasio 15 mmol/l Reactivo 1 ml 1 ml 1 ml
y sulfato de cobre 5 mmol/l. de Biuret
• Espectrofotómetro a 540 nm.
• Solución reactiva para albúmina: verde de Mezclar e incubar 15 min a temperatura
bromocresol a pH 4.2 ambiente.
• Espectrofotómetro a 630 nm. Leer frente al blanco de reactivos a 540 nm.
• Suero problema. El color es estable durante 30 min.
• Solución estándar de proteínas 7 g/dl.
• Solución estándar de albúmina 5 g/dl. Cálculo:
• Jeringa*, ligadura y torundas con alcohol.
ASuero X [Estándar g/dl] = [Proteína Total g/dl]
Precauciones. Evítese la hemólisis. La A Estándar
concentración de las proteínas del plasma se
modifica por la postura, de forma que existe un Donde A es la absorbencia.
incremento de entre un 10% y un 20% tras 30 El resultado se obtiene en g/dl.
minutos de pasar de la posición acostada a la El método es lineal hasta valores de 15 g/dl
ortostática. Además la aplicación de la ligadura (150 g/l).
para extraer la sangre puede producir un Valores esperados:
aumento significativo al cabo de unos minutos. Recién nacidos 5.2 - 9.1 g/dl
En ambos casos, la modificación se debe a un Niños (hasta 3 años) 5.4 - 8.7 g/dl
aumento del paso de líquido desde el Adultos 6.0 - 8.0 g/dl
compartimiento vascular hacia el intersticial.
Para la determinación de albúmina se requiere
de la fijación específica del verde de
Método
bromocresol a esta proteína a determinado pH
Para la determinación de proteína total se
produciéndose un cambio de coloración, de
utiliza el método de Biuret modificado, el cual
amarillo verdoso a verde azulado. El cambio en
es de gran especificidad y precisión. Los
la coloración es directamente proporcional a la
polipéptidos que contengan, por lo menos, dos
concentración de albúmina en la muestra. La
enlaces peptídicos reaccionan con las sales de
absorbencia se determina a 630 nm con un
cobre en medio alcalino para formar un quelato
blanco de reactivos.
coloreado (violeta) entre el ion Cu2+ y los
átomos de oxígeno del carbonilo y de nitrógeno
de la amida del enlace peptídico. La
concentración de este complejo es
proporcional a la concentración de proteína
 Preparar la siguiente serie de tubos:

No. de 1. Blanco 2. Estándar 3. Suero

tubo problema
Estándar - 10 µl -
Suero - - 10 µl
problema
Reactivo 2 ml 2 ml 2 ml
de
albúmina

Mezclar e incubar 10 min a temperatura

ambiente.
Leer frente al blanco de reactivos a 630 nm.
El color es estable durante 60 min.

Cálculo:

ASuero X [Estándar g/dl] = [Alb’umina g/dl]

A Estándar

Donde A es la absorbencia.
El resultado se obtiene en g/dl.
El método es lineal hasta valores de 6 g/dl (60
g/l).
Los valores mayores de 6 deben diluirse 1:2
con solución salina.
Valores esperado de 3.5 a 5 g/dl (50 g/l).

REFERENCIAS
1. Peters TJ. Clin Chem. 1968; 14: 1147.
2. Murray KR, Granner DK, Mayes PA,
Rodwell VW. Bioquímica de Harper. 16a. ed.
México: Editorial El Manual Moderno; 2004.
3. González de Buitrago JM. Bioquímica
clínica. Madrid: McGraw-Hill Interamericana;
1999.
4. Laguna-Piña. Bioquímica. 4a. ed. México:
Salvat; 1990. Cap. 4.
5. Pacheco Leal D. Bioquímica médica.
México: Editorial Limusa; 2004.
 Práctica 5
Cinética enzimática.
Efecto de la concentración del sustrato
sobre la velocidad de reacción enzimática
Objetivos
El alumno:
1. Explicará el efecto de la concentración de
sustrato sobre la velocidad de una reacción
enzimática.
2. Calculará por métodos gráficos la velocidad
máxima y la constante de Michaelis de una
reacción enzimática.
3. Conocerá los diferentes tipos de inhibidores
que existen y estudiará su efecto sobre la Km y
V máx.
4. Conocerá aspectos básicos de
fotocolorimetría (ver pág, 115).
Para lograr los objetivos de esta práctica
contestar las siguientes preguntas:
1. ¿Qué es la velocidad de una reacción
enzimática?
2. ¿Cómo se define la constante de Michaelis
(Km) de una reacción enzimática?
3. ¿Cómo se define la velocidad máxima (V
máx) de una reacción?
4. ¿Para qué le sirve a un médico la
determinación de la actividad de algunas
enzimas?
5. ¿Cuáles son las enzimas cuya determinación
tiene valor diagnóstico?
Hipótesis
Si la velocidad de una reacción enzimática es
proporcional a la concentración del sustrato;
cuando la concentración del sustrato es muy
alta, por lo tanto la enzima se satura y alcanza
su velocidad máxima.
La enzima que sirve de modelo en esta práctica
es la glucosa oxidasa acoplada a la peroxidasa.
Fundamento
El método se basa en el hecho de que la
glucosa, en presencia del oxígeno del aire
y con la participación de la glucosa
oxidasa, se oxida hasta ácido glucónico.
El peróxido de hidrógeno que se forma
en el curso del proceso se descompone
mediante la peroxidasa. El oxígeno
atómico que se desprende en esta última
reacción se combina con un cromógeno
que se colorea al oxidarse. La intensidad
de la coloración del cromógeno oxidado
es proporcional a la concentración de
glucosa.
La glucosa oxidasa (ß-D-glucosa: oxígeno
óxidorreductasa, EC1.1.2.4) tiene un peso
molecular de 160 000. Existe en forma
dimérica y contiene dos moles de FAD
como grupo prostético por mol de enzima.
La glucosa oxidasa es altamente
específica, hecho que ha permitido su
empleo para el análisis cuantitativo de
glucosa. La reacción consiste de dos
pasos:
1. Glucosa+glucosa oxidasa-FAD
δ–
gluconolactona + glucosa oxidasa-FADH2
2. Glucosa oxidasa-FADH2 + O2
glucosa oxidasa-FAD + H2O2
La δ4-gluconolactona se hidrata
espontáneamente dando ácido glucónico.
La reacción global se expresa:
Glucosa oxidasa
Glucosa + O2 Acido glucónico + H2O2 Leer ambas series de tubos en el
fotocolorímetro; utilizar como blanco el
La peroxidasa cataliza la transferencia de tubo 1.
oxígeno del peróxido a un aceptor que es
cromógeno como la ortotoluidina, la
Resultados (cuadro 5.2)
ortodianisidina, la 2,2-azino-bis (3-
1. Cálculo de la concentración inicial de
etilbencentiazolin-6-sulfónico) o la 4-amino-
sustrato en cada tubo; tomar en cuenta
antipirina (y fenol) que se colorean al oxidarse.
que la solución de glucosa contiene 40
La reacción se expresa:
µmolas ml–1.
E+S ES E+P 2. La velocidad será igual a las unidades
Klett por .5 min-1 de incubación.
Material y reactivos 3. Con los datos obtenidos completar el
• 2 Gradillas con 8 tubos de ensaye cada una. cuadro 5.2 y hacer las dos gráficas en
• 1 Pipeta de 5 ml. papel milimétrico.
• 2 Pipetas de 5 ml. 4. Hacer una segunda gráfica con los
• 1 Matraz Erlemeyer de 100 ml. valores de 1/v vs 1/[S].
• Fotocolorímetro con filtro azul. 5. Calcular el valor de la velocidad
• Solución estándar de glucosa 40 mmol/l y una máxima (Vmáx) y de la constante de
dilución 1:10 de ésta para los tubos 2, 3 y 4. Michaelis (Km) con y sin inhibidor.
• 2 frascos con solución de enzimas: 41.6 Uml–1 6. Determinar el tipo de inhibidor de
de glucosa oxidasa, 4.6 Uml–1 de peroxidasa, acuerdo con las gráficas del punto
ortodianisidina 0.21 mmol/l. anterior.
• Solución de azida de sodio 400 mmol/l como 7. Analizar si los resultados obtenidos
inhibidor. están de acuerdo con la hipótesis
• Gotero con HCl. planteada.

Método I (con azida de sodio) REFERENCIAS

1. En un matraz Erlenmeyer de 100 ml 1. Devlin TM. Bioquímica. Libro de texto
con aplicaciones clínicas. 4a. ed.
preincubar 20 minutos la solución de enzimas
Barcelona: Editorial Reverté; 2004.
con 0.3 ml del inhibidor.
2. Lehninger AL, Nelson, DL. Principios
2. Preparar la siguiente serie de tubos (tabla 1).
de bioquímica. 4a. ed. Barcelona:
3.- Considerar un intervalo de 30 segundos para
Tubo Solución de H2O Soución de
cada tubo al agregar la enzima.
No. glucosa (ml) (ml) enzimas
4.- Agitar cada tubo e incubar 5 minutos
(ml)
temperatura ambiente y de inmediato detener la
1 0.0 1.0 3
reacción agregando 3 gotas de HCl concentrado
2 dil 1:10 0.1 0.9 3
Considerar un intervalo de 30 segundos para
cada tubo al agregar el HCl. 3 dil 1:10 0.25 0.75 3
4 dil 1:10 0.5 0.5 3
5 0.1 0.9 3
6 0.25 0.75 3
Método II (sin inhibidor) 7 05. 0.5 3
1.- Preparar nuevamente una serie de tubos 8 1.0 0.0 3
como lo indica la tabla 1. Ediciones Omega; 2005.
2.- Repetir los paos 3 y 4 del Método I
 3. Mathews CK, van Holde KE. Bioquímica. 3a.
ed. España: McGraw-Hill Interamericana; 2003.
4. Voet D, Voet JG, Pratt C. Fundamentals of
biochemistry. USA: John Wiley and Sons; 1999.

Cuadro 5.2 Resultados

Concentración Velocidad de Velocidad de

Tubo de sustrato la reacción la reacción
No µ molas de unidades Klett con
glucosa inicial 5 min-1 INHIBIDOR
ml-1 ORDENADAS Unidades
ABCISAS (X) (y) Klett 5 min -1
1
2
3
4
5
6
7
8
Cuadro 5.3 Resultados (inverso)

Tubo Concentración Velocidad de la Velocidad de

No. de sustrato reacción la reacción
µ molas de unidades Klett 5 con
glucosa inicial min-1 1/V INHIBIDOR
ml-1 ORDENADAS (Y) 1/V
ABCISAS (X) Unidades
Klett 5 min–1
(Y)
1
2
3
4
5
6
7
8