Ñame Libro PDF

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NAME: PRODUCCION DE
SEMILLAS POR
BIOTECNOLOGÍA
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NAME: PRODUCCION DE
,
SEMILLAS POR
BIOTECNOLOGÍA
Editores: Mónica Guzmán Barney, Ph. D.

Profesora Asociada
Gustavo Buitrago Hurtado
Profesor Asociado
Instituto de Biotecnologia
Universidad Nacional de Colombia
ÑAME: Producción de semillas por biotecnología

Instituto de Biotecnología
Editores:
Mónica Guzmán Barney
Autores:
Andrés Aguas A.
Andrés Álvarez S.
Javier D. Beltrán
Gustavo Buitrago H.
Rodrigo O. Campo A.
Amaury Espitia
Marta Fontanilla
Galo Gamero V.
Mónica Guzmán B.
Margarita Perea D.
Jorge Romero F.
Primera edición: junio de 2000
ISBN: 958-8051-88-6
Concepto gráfico:
Patricia Cervantes
e-mail: patricia.cervantes@usa.net
Diseño y diagramación:
Hugo Plazas
e-mail: plazas@montevideo.com.uy
Preparación editorial e impresión:

EDITORIAL UNlBIBLOS
Teléfonos: 3681437-3681443 • Telefax: 3684240
Santafé de Bogotá, D.C. Colombia
Con el apoyo de:
Sp.ela' pro,ro",,,,.
Ilotoeh"oloo .''11
~ Dewelo,,,,.". e.op.r.tloft
Ministry ofForeign Affairs, Directorate General,

International Cooperation. Tbe Hague, Tbe Netherlands. ~
Centro de Estudios Ganaderos y Agrícolas, CEGA

CEGA
Colaboraciones:

Instituto de Biotecnología
Universidad de Córdoba
Universidad de Sucre
Corporación Colombiana de Investigación

Agropecuaria, Corpoica
índice
El Programa de Biotecnologia Agrícola
Holanda-Colombia
Gustavo Buitrago Hurtado 11
Aplicación de la biotecnología
agrícola al cultivo del ñame
Margarita Perea Dallos
Gustavo Buitrago Hurtado 17
Prácticas agronómicas para el

cultivo del ñame
Andrés Alvarez Soto 33
Utilización de los sistemas in vitro

para la obtención de plantas de ñame
(Dioscorea spp.) libres de patógenos
Margarita Perea Dallos 41
Caracterización y diagnóstico del género

Cofletotrichum causante de la antracnosis
en ñame y otros cultivos
Javier D. Beltrán 55
La antracnosis, enfermedad limitante

del cultivo del ñame
Rodrigo Orlando Campo Arana 67
Algunos virus vegetales y del ñame

Mónica Guzmán Bamey
Marta Fontanilla 71
Aclimatación de plantas in vitro de ñame

espino (Dioscorea rotundata), japónico
(Dioscorea japoníco) y chocoano
(Santhosoma sagittífolíum) en la·costa caribe
Andrés Aguas A
Galo Gamero V.
Jorge Romero F.
Amaury Espitia 103
EL PROGRAMA DE BIOTECNOLOGÍA
AGRÍCOLA HOLANDA ..COLOMBIA

Profesor, Instituto de Biotecnología
Este libro nació de la iniciativa del grupo responsable del proyecto

"Programa Regional de Producción de semillas de ñame empleando
algunas variedades de la Costa Atlántica colombiana", integrado por
investigadores de las w1iversidades de Córdoba, Nacional, Sucre y
Regional 2 de Corpoica. Por esta razón, cada capítulo del libro fue
elaborado por miembros de los subgrupos de investigación integrados a
cada institución y acorde con las responsabilidades y funciones que
tienen con respecto al proyecto. Como iniciativa interinstitucional, el
proyecto y este libro obedecen al reconocimiento que hace el grupo de
la importancia de aunar esfuerzos y complementar capacidades de
investigación y desarrollo para alcanzar el objetivo central: producir un
impacto social sobre las comunidades campesinas cultivadoras de ñame
en la región Caribe de Colombia.
El proyecto se enmarca en el Programa Colombiano de Biotecnología

Agrícola que se adelanta desde 1997 con el apoyo del gobierno de
Holanda, administrado por el Centro de Estudios Ganaderos y Agrícolas
(CEGA). La cooperación internacional que Holanda desarrolla,
contempla además de Colombia, a Zimbabwe, India y Mozambique.
Con este programa el gobierno de Holanda busca orientar sus esfuerzos
de cooperación internacional hacia comunidades campesinas pobres,
para llevar desarrollos en biotecnología a la producción agrícola. En
Colombia se organiza el programa gracias a las gestiones del doctor
Piet Spiejkers ante el Ministerio de Cooperación de Holanda, al igual
que el interés manifiesto de Colombia, tanto por instituciones
gubernamentales como por representantes de la sociedad civil.
Delegados de ambos países hacen una evaluación de las regiones, para

seleccionar a cuál de éstas se orientarán los esfuerzos del Programa. Por
medio de indicadores técnicos y sociales, se estableció que éste debe
centrarse en la región de la Costa Atlántica colombiana, en los
departamentos de Atlántico, Bolívar, Cesar, Córdoba, La Guajira,
Magdalena y Sucre. Se evaluaron las capacidades de la región y del país
para soportar las acciones en investigación y desarrollo ligadas al
12 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIOIECNOLOGíA
Programa, identificando las comunidades y las organizaciones campesinas que

podrían ser receptoras de su ejecución y la capacidad para apropiarse de los
resultados del mismo. Se establece en general la organización y el soporte que
podrían ofrecer entidades públicas y privadas para el Programa Colombiano de
Biotecnología Agñcola, bajo el criterio primordial de que su orientación es hacia
resolver o mitigar problemas o limitaciones de índole tecnológico y, en general, de
la cadena de producción y c0!1sumo de los principales cultivos de sustento de
estas comunidades.
La organización local del Programa acoge la iniciativa holandesa de organizar

proyectos regionales bajo el esquema de investigación participativa, para lo cual
conforma dos comités. El Comité regional campesinQ, que genera espacios para la
participación directa de productores y líderes campesinos de las principales
localidades; sus aportes se orientan a la organización de los productores para que
participen en los proyectos y para ir construyendo los modelos de organización
campesina que se apropien de los resultados y desarrollos tecnológicos.
Adiéionalmente, se integra el Comité directivo con la participación de entes

públicos como el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, el Departamento
Nacional de Planeación, Colciencias y Corpoica; de la academia, representadas
por el Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia y tres
miembros del Comité campesino elegidos a su interior.
Esta caracteñstica del Programa orienta y favorece a campesinos pobres recurriendo

a tecnologías de punta, recoge experiencias que ha tenido el gobierno de Holanda
y organismos multilaterales como el Servicio de Intermediación en Biotecnología
(lBS) dependiente del Servicio Internacional para la Investigación Agrícola Nacional
(lSNAR). El ISNAR fue creado por el Grupo Consultivo en Investigación Agñcola
Internacional (CGIAR) y se enfoca específicamente al desarrollo institucional
dentro de los sistemas nacionales de investigación agñcola.
De esta manera, el Programa de Biotecnología Agñcola orienta esfuerz~ de

cooperación internacional, aunados a las capacidades de investigación y desarrollo
en agricultura del país, hacia el mejoramiento de la sostenibilidad y la solución de
los problemas de las comunidades campesinas pobres de la Costa Atlántica. De la
misma manera propicia el crecimiento en la organización campesina y la integración
entre los grupos de investigación y desarrollo que pueden apoyar el Programa, con
el propósito de afianzar aún más las posibilidades de éxito.
Los acuerdos entre los dos gobiernos establecen que la responsabilidad de orientar
y desarrollar el Programa tanto en lo técnico como en lo financiero sea del Comité
directivo, ente que debe mantener nexos muy estrechos con el Comité regional y
debe reunirse periódicamente, individual y conjuntamente.
La componente técnica del Programa inicia con la defmición de prioridades, para

la cual se contó con la amplia participación de los dos comités. Como resultado de
este ejercicio, se establecieron como cultivos de interés el plátano, la yuca y el
ñame, y como limitante más importante la no disponibilidad de semillas de calidad
en los tres cultivos. Como segundo nivel de prioridad, se establece el desarrollo y
uso de variedades resistentes a zigatoca negra en el plátano, el gusano trozador en
la yuca y la antracnosis en el ñame.
LPROGRAMA DE BIOIECNOLOGfAAGRfCOLA HOLANDA-COLOMBIA 13
La biotecnología en la agricultura
La imagen general de la biotecnología es que se desarrolla en países que cuentan
con amplios recursos para investigación y desarrollo. Esta imagen del público
general, se acentúa por la difusión y la interpretación que hacen los medios de
commJicación sobre hallazgos y descubrimientos biotecnológicos asociados a la
salud o a resultados con implicaciones éticas o que modifican conceptos que para
nosotros estaban establecidos. Por ejemplo, las investigaciones sobre el genoma
humano y las solicitudes de patentes que han hecho investigadores norteamericanos,
o la clonación de mamíferos, o en su momento la transformación genética de
microorganismos, plantas y animales, son casos en los que se ha dado una difusión
en los medios sesgada, parcializada o alarmista, desconociendo el rigor científico
con que se realizan las investigaciones que dan origen a estos resultados y el
beneficio social que generan estos desarrollos tecnológicos.
Debe tenerse presente que uno de los paradigmas de cualquier grupo de

investigación y desarrollo (I&D) que trabaja en biotecnología, es la generación de
productos o servicios que tengan un impacto social medible, que produzcan efectos
favorables sobre una comunidad, una industria, un sector de la producción, o sobre
una entidad gubernamental en relación con las políticas, las estrategias o la
aplicación de las normas en un determinado campo del Estado.
Colombia ha establecido que la biotecnología es un campo del conocimiento

importante para el país y lo ha incluido en sus prioridades al crear un Programa
Nacional de Biotecnología (PNB), dentro de los 11 programas que creó el Consejo
Nacional de Ciencia y Tecnología. En este contexto, en nuestro medio se han
emprendido actividades de investigación en biotecnología que apuntan a generar
conocimientos. Muy pocos de estos trabajos están dirigidos al desarrollo de
tecnologías, y la mayoría se constituye como ejercicio académico que incide en
indicadores como la formación de recursos humanos, las publicaciones
(especialmente proyectos o tesis de grado) o la participación en congresos;
indicadores todos ellos importantes pero que no reflejan en forma plena la incidencia
que tiene la ciencia y la tecnología en la sociedad.
El Consejo del Programa Nacional de Biotecnología (CPNB) es el ente

responsable de la ejecución del PNB. Recientemente realizó una convocatoria
especial para proyectos en fases avanzadas de la I&D, con propósitos como:
propiciar la interacción entre grupos de investigación y empresas, tránsferencia
de tecnologías desarrolladas parcial o totalmente en el país, o establecer
mecanismos de fomento a los grupos de I&D de las empresas y a las empresas
mismas para que sus iniciativas tengan un soporte desde el Estado. Sin duda que
esta forma innovadora de establecer mecanismos de fomento a la utilización de
biotecnologías en el país deberá redundar en beneficios y constituirse en retos
para los grupos de investigación, ya que sus iniciativas tendrán mayores
posibilidades de aprobación, si se formulan conjuntamente con empresas o con
centros de desarrollo tecnológico que se encarguen de la gestión tecnológica
asociada a los proyectos.
Por otro lado, el CPNB defmiólas prioridades de investigación de la biotecnología

en Colombia, con la participación de varias entidades nacionales y de CamBiotec,
una iniciativa para América auspiciada por el CnD de Canadá. De este ejercicio, y
de trabajos anteriores, se concluye que las urgencias y necesidades del país son
interminables y que, en general, se llega al planteamiento de estrategias poco
específicas por lo abrumador de las necesidades. De esta manera se acepta que las
14 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMilLAS POR BIarECNOLOGÍA
propuestas de proyectos tengan todas las opciones y coberturas que actualmente

necesitan, diferente a acciones concertadas que propicien la integración de
esfuerzos, la racionalización en el uso de los recursos y el establecimiento de
criterios que tengan que ver con el impacto social que se busca con un proyecto.
Todos estos elementos exigen modificar nuestros modelos de I&D y establecer

programas nacionales relacionados con temáticas específicas, para que sean formas
de organización de I&D que aúnen esfuerzos, que sumen capacidades y que tengan
el fmne propósito de hacer aportes tangibles a la solución de necesidades de
comunidades o sectores de la producción.
La biotecnología en Colombia debe desarrollarse en el marco de programas como el

que se adelanta en cooperación con el gobierno de Holanda, en el cual se identificó la
región del país sobre la cual incidirá el Programa, las comunidades para las que se
buscará incorporar mejoras tecnológicas en la producción agrícola, los cultivos que
son la base del desarrollo sostenible para esas comunidades, los problemas que limitan
la producción en dichos cultivos y los grupos de I&D que cuentan con conocimientos
y experienciasen relación con la problemática y que son invitadosa formular propuestas
en el marco de proyectos de investigación participativa. Otro factor importante en este
Programa es la creación y consolidación de capacidades regionales con relación al
sector agrícola, para lo cual se busca fortalecer las universidades y los centros de
investigación regionales, crear o integrar formas de organización (por ejemplo
cooperativas) con capacidad para asumir funciones estratégicas como la producción
de semillas de calidad o el desarrollo de agroindustrias o, en general, las acciones que
den un mayor valor agregado a los productos de la región.
El modelo que plantea el Programa de Biotecnología Agrícola Holanda-Colombia

debe interpretarse como un programa que se enfoca a lograr en estas comunidades
mayor capacidad de desarrollo sostenible, ligada a mejoras en la tecnología de
producción, a contar con grupos regionales con capacidad para apoyar y soportar
actividades de investigación y desarrollo que beneficien socialmente e incidan
sobre la cadena agroalimentaria asociada a cada cultivo, yen general a mejorar el
nivel de vida de los campesinos.
Capacidades de Colombia para alcanzar el

desarrollo sostenible
La sostenibilidad se refiere a la capacidad de una sociedad, ecosistema o cualquier
sistemaen crecimiento, de continuar funcionandoen el futuro sin ser forzada a reducirse
por declinación en los recursos. Si aplicamos este concepto al sector agrícola, se
establecería que la agricultura sostenible busca utilizar los recursos naturales para
satisfacer las necesidades agroalimentarias de una sociedad, sin deteriorar, reducir o
mermar la capacidad de dichos recursos para las generaciones futuras.
El Institute of Management Development (IMD) con sede en Lausane, Suiza, ha

desarrollado un modelo de competitividad con el cual se han monitoreado 46
países. Colombia está dentro de este grupo, con resultados que plantean serios
retos a los sectores público y privado para mejorar las condiciones de competitividad
del país en el concierto mundial.
El IMD desarrolla el concepto de competitividad basado en 3 factores: creación de

cadenas de valor agregado, generación de prosperidad, y sostenibilidad a largo
plazo. Estos factores establecen que la competitividad en un país se mida por dos
~LPROGRAMA DE BIarECNOLOGÍAAGRÍCOLA HOLANDA-COLOMBIA 15
aspectos, la competitividad empresarial y la competitividad de las naciones (entorno).

Los parámetros que se toman para medir la competitividad de una nación son: la
economía doméstica, la internacionalización, el Gobierno, las finanzas, la
infraestructura, la gestión, los recursos humanos y la ciencia y tecnología. La tabla
1 muestra la variación de la calificación dada al país entre los años 1994 y 1997.
Tabla 1. Competitividad colombiana
PARÁMETRO 1994 1995 1996 1997
Gestión 27 29 27 33
Gobierno 22 26 26 37
Ciencia y tecnología 27 32 32 39
Internacionalización 39 36 38 40
Economía doméstica 36 33 31 43
Infraestructura 42 34 37 43
Recursos humanos 37 38 36 43
Finanzas 35 41 38 44
Consolidado 35 33 33 42
El caso colombiano es preocupante, dada la competitividad al ocupar el puesto 42

entre 46 países en el año 1997. Sin embargo, el estudio registra algunas fortalezas
importantes de Colombia, como las que se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Fortalezas de Colombia para alcanzar

mayor competitividad
PARÁMETRos PUESTO
Tasa de tributación 3
Horas de trabajo/empleado 9
Proyección macroeconómica 20
Ingenieros calificados 20
Iniciativa privada 22
Control al sistema fmanciero 28
Estos indicadores muestran que el país es competitivo desde el punto de vista de los
recursoshumanos (iniciativaprivada,ingenieroscalificados,horasde trabajopor empleado).
También se aprecian indicadores económicos favorables (proyección macroeconómica,
tasa de tributaciónefectiva y control al sistema financiero),pero es desfavorableen cuanto
a la evasión de impuestos en la que ocupa el deshonroso puesto 41.
El informe del IMD llama la atención por la urgencia de asumir estrategias para
mejorar los aspectos clave de la competitividad, como los que se relacionan en la
tabla 3. Es evidente que la capacidad de desarrollo de un país ya no se mide en
16 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMlLLAS POR BIOfECNOLOGÍA
función de parámetros macroeconómicos asociados a la riqueza económica, ni a la

riqueza en recursos naturales, sino en factores como la calidad de vida, la
sostenibilidad y en general el bienestar de la población. Por tanto el reto es que
toda la sociedad colombiana ayude a cambiar esta situación tan desfavorable,
hacia una nueva condición en la que la participación de la sociedad civil se
constituya como factor determinante para alcanzar condiciones de competitividad
que promuevan el desarrollo del país.
Tabla 3. Factores que hacen menos

competitiva a Colombia
RETO PUESTO
Imagen internacional 46
Transparencia estatal 46
Costo de capital 46
Exportación de bienes y servicios 44
Propiedad intelectual 44
Administración aduanera 43
Infraestructura 43
Calidad de vida 43
Nivel de ahorro 42
Economía paralela 41
Las capacidades en ciencia y tecnología (C&T) -indicador muy importante de la

competitividad de un país- presentan una tendencia constante a disminuir. El
esfuerzo que ha hecho Colombia en C&T se ha visto al interior del país como muy
importante y ese parece ser el sentir de la comunidad académica. Sin embargo, no
es suficiente y se puede explicar al menos desde dos perspectivas. De un lado está
la gran importancia que dan otros países contemplados en la muestra del IMD, al
fortalecimiento de su sistema de C&T, lo cual es evidente en países asiáticos,
además de ser un sector vital para los países desarrollados, lo que da como resultado
grandes inversiones en C&T, mucho mayores que las que hace nuestro país. De
otro lado está el esfuerzo evidente de Colombia por incrementar la participación
del sector en la destinación de recursos, lo cual se ha manifestado en las políticas
que apuntan a que se destine el 1% del PIE al sector. Surge aquí la preocupación
por la eficacia de esas políticas, la continuidad en la asignación de recursos a los
programas que se han implantado en los últimos años y al crecimiento real del
sistema nacional de C&T, que ha sido proporcional al esfuerzo que ha hecho el
país en este sector.
APLICACIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍA
AGRÍCOLA AL CULTIVO DEL ÑAME
\1argarita Perea Dallos, Ph.D.

)epartamento de Biología
~acultad de Ciencias
Jniversidad Nacional de Colombia
3ustavo Buitrago Hurtado,

~.Sc.
nstituto de Biotecnología
Jniversidad Nacional de Colombia
El ñame pertenece a la familia Dioscoreaceae, género Dioscorea. Se

encuentra distribuido en las regiones tropicales de alta pluviosidad,
contiene fécula abundante y constituye un importante alimento en las
regiones tropicales. Los metabolitos secundarios más comunes de estas
especies son las saponinas esteroidales, precursoras importantes en la
síntesis de hormonas esteroidales. Esta planta se presenta como una
enredadera y se caracteriza por la presencia de tubérculos subterráneos
y/o aéreos (bulbillos), los cuales junto con la papa, la yuca, la arracacha
y la batata ocupan un lugar preponderante dentro de la alimentación
humana. Las especies más cultivadas corresponden a Dioscorea alata,
D. rotundata, D. cayennensis, D. esculenta, D. bulbífera y D. trífida, de
las cuales la primera es la preferida en la producción de tubérculos para
consumo humano. El área mundial cultivada comprende tres regiones
principales: África occidental, sur de Asia incluyendo parte de China,
Japón, Oceanía y los países del Caribe (Ammirato, 1984). Entre los
países africanos el principal es Nigeria con el 73% de la producción
mundial de ñame. En América, el ñame es sólo importante en Brasil,
Colombia, Haití, Venezuela y Antillas Francesas; su superficie de cultivo
es reducida en Jamaica, República Dominicana, Panamá, Barbados,
Puerto Rico y Santa Lucía.
La familia Dioscoreaceae posee 5 géneros y unas 750 especies. En general

las plantas pertenecientes a esta familia se caracterizan por poseer
tubérculos carnosos O rizomas llamados ñames. Las hojas suelen tener
forma de flecha, flores dióicas, fruto en cápsula o baya. Los géneros
pertenecientes a esta farnilia son: Dioscorea con más de 600 especies,
Tamus con 5 especies, Rajana con 25 especies y Stenomeris con 2 especies.
18 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIarECNOLOGÍA
El cultivo del ñame en Colombia

En Colombia, el cultivo del ñame se ha visto afectado en los últimos años por
algunas enfermedades y plagas, causando una drástica reducción del área cultivada.
En la década de los ochenta, el ñame Dioscorea alata presentó una baja
significativa en la producción, en especial en la Costa Atlántica. La causa principal
de este fenómeno fue la presencia de la antracnosis (Colletotrichum
gloesporioides), sumada a la susceptibilidad de las variedades cultivadas frente a
este hongo. Esta enfermedad, de difícil control químico en las condiciones de la
Costa Atlántica colombiana, causó efectos desfavorables limitando los
rendimientos hasta en un 70% y causando disminución en el área sembrada, que
en 1992 llegó a 1.400 ha (Corpoica, 1995). Esto afectó negativamente la economía
campesina regional, produciendo un gran impacto social, además de incidir en las
líneas de exportación. De forma paralela, se notó un ligero incremento en el área
cultivada de ñame espino (D. rotundata) que presenta resistencia en campo a la
antracnosis, pero que resultó susceptible a Xystus sp, un insecto minador del tallo
que, según resultados preliminares, puede reducir notoriamente los rendimientos
(Corpoica, 1995).
Los productores destinan aproximadamente entre un 3% y un 10% del total de la

producción para utilizarla como semilla. Considerando que el uso de semilla de
mala calidad (infestada por patógenos y/o insectos) es la causa más común de
presencia de factores negativos en los primeros estados de desarrollo del cultivo,
se ha estimado que el 20% de la producción se ve afectada por enfermedades
virosas, máxime si se tiene en cuenta que el ñame pasa obligatoriamente por un
periodo de almacenamiento mínimo de dos meses. En tal sentido, la aplicación de
los sistemas in vitro se presentan como una alternativa viable para resolver estos
problemas en un tiempo relativamente corto.
El ñame comestible aporta hasta un 12% de los recursos energéticos para los
habitantes de regiones caribeñas y africanas. Es rico en carbohidratos y en vitaminas
tales como ácido ascórbico, riboflavina, tiamina y pro-vitamina A (Conlan et al.
1995).
La base de la alimentación de la población ubicada en la Costa Atlántica colombiana

se fundamenta en el plátano, el arroz, la yuca y el ñame. De acuerdo con un estudio
adelantado por Corpoica (1995), tomando en consideración los datos para el
período 1982-1994 se proyectó la tendencia para el año 2000 en la cual se estima
que serán producidas 1.7 millones de toneladas de maíz, ñame, plátano y yuca para
cubrir las necesidades de esta región del país. De esta cantidad, 810.000 toneladas
corresponderán a yuca (47,4%); 460.000 toneladas a maíz (27%); 276.000 toneladas
a plátano (16,6%) y 162.000 toneladas a ñame (9%). El consumo per cápita de
ñame en la Costa Atlántica se calcula en 27 Kg/año. De las 162.000 toneladas que
se producirán de ñame en el año 2000, el41 % (78.000 toneladas) se destinarán al
consumo, para lo cual habrá que dedicar una superficie de cultivo de 6.000
hectáreas. La producción restante se destinará a la exportación. A escala mundial
la producción ha sido estimada en 34 millones de toneladas por año (FAO, 1996)
de las cuales el 95% proviene de los países de África del Sur.
En Colombia el ñame no se cultiva solo sino en asociación con maíz y yuca. En la

región en estudio los cultivos más comunes son: ñame criollo x maíz l/yuca y
ñame espino // yuca. Los costos totales para la producción de estos cultivos, a
precios de 1996, están estimados en $1.147.000 por hectárea para el primer caso y
PLICACIÓN DE LA BIOfECNOLOGÍAAGRlCOLA AL CULTIVO DEL ÑAME 19
de $1.634.000 para el segundo. Estos costos toman en consideración labores como

siembra y cosecha que equivalen al 50% del costo, siendo las labores más costosas
la siembra, el control de malezas y la cosecha, que constituyen el 62% de los
costos totales. La mano de obra requerida por hectárea y por ciclo de cultivo es de
140 jornales. Cuando se calculan los ingresos totales sobre los costos totales en la
producción de ñame se obtiene una cifra de 2.0, lo que indica que el cultivo del
ñame es una actividad rentable.
El principal problema que enfrentan los productores de ñame en la región de la

Costa Atlántica colombiana se relaciona con la ausencia de variedades resistentes
y/o tolerantes a la presencia de virus y hongos que afectan adversamente la
producción de este importante insumo alimentario. Esto podría resolverse en alguna
medida con la producción de semillas libres de patógenos que garanticen un
incremento sustancial en la productividad de este cultivo.
Aun cuando actualmente se le conoce en todo el mundo, en Colombia el ñame se

ha caracterizado como producto de cultivo y consumo tradicional en la Costa
Atlántica. Su condición de alimento regional que no se sitúa como de primera
necesidad ha estancado su explotación, que se realiza generalmente en predios de
economía campesina con bajo nivel de tecnificaciÓn.
Factores limitantes de la producción de ñame

En el mundo se conocen varias especies de ñame; sin embargo, en nuestro país las
más cultivadas son la Discorea alaJa y Dioscorea rotundata; éstas se han sembrado
cíclicamente a través del tiempo utilizando una selección superficial por parte de
los cultivadores. Este proceso de propagación consecutiva sin ningún programa
de mejoramiento desemboca en degeneración genética de la planta, con obvio
deterioro en su sistema de adaptación y resistencia, panorama agravado por la falta
de investigación al respecto.
Desde el punto de vista de sanidad del cultivo, si bien son varias las plagas reportadas
que afectan el cultivo del ñame, en la actualidad la atención se centra en las
enfermedades de origen fungoso, principalmente la antracnosis causada por
Colletotrichum gloesporioides. Esta afección registra en Colombia un alto índice
de daño agronómico-económico, por lo cual es corriente encontrar en las estadísticas
pérdidas hasta del 100% en producción.
De otro lado, el ñame no está considerado como producto prioritario, situación

que no ha permitido un adecuado desarrollo de tecnología en tomo a este
promisorio tubérculo. Hasta el momento la investigación originada en Colombia
es escasa, está atomizada y no se ha difundido lo suficiente. El ñame, a pesar de
haber sufrido una disminución en su área de siembra en las décadas anteriores,
contaba en 1993 en los departamentos de Córdoba, Sucre, Bolívar y Atlántico con
un total de 4.976 Ha sembradas, de las que dependían 4.834 agricultores, cantidad
significativa, si se recuerda la limitada zona de producción del ñame en Colombia
(Corpoica, 1995).
A pesar de los problemas expuestos, el Ministerio de Agricultura reporta la

exportación de 27.492 toneladas de tubérculos entre 1988 y 1990, que incluyen
a las dioscoreáceas.
Además de las pérdidas que sufre el ñame durante su periodo de cultivo y

recolección, la producción tanto comercial como para semilla sufre pérdidas
20 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIarECNOLOOÍA
importantes (20-30%) durante la post-cosecha, en especial durante el

almacenamiento, puesto que los métodos y la infraestructura utilizados para tal fm
son rudimentarios. De otra parte, se debe a la falta de investigación que permita la
utilización y modernización a escala industrial para lograr mejores alternativas de
conservación y disminución de pérdidas.
El ñame, cultivo promisorio para exportación

Dentro de las estrategias que ha seguido Colombia en sus planes de desarrollo, se
han identificado cultivos que podrían constituirse en renglones de exportación.
Uno de éstos es el cultivo del ñame, por su consumo en Estados Unidos y el Caribe
y porque el país tiene experiencia y ha logrado una posición importante en el
mercado local y ha posicionado el producto en el mercado externo en años recientes.
El Plan Nacional de Desarrollo "Cambio para construir la paz", propone para el
sector agrícola exportador el desarrollo de cadenas productivas que capten el
apoyo público, como el incentivo a la capitalización rural y la coordinación de
actividades de agentes públicos y privados, como es el caso del Programa de
Biotecnología Agrícola Holanda-Colombia. Se propone el diseño y montaje de
formas innovadoras de inversión, como los fondos de compensación al riesgo o
fondos de inversión para zonas rurales, y el estímulo a proyectos productivos
novedosos. Se plantea, en últimas, hacer un esfuerzo para orientar la reactivación
del sector agrícola con una visión de mercado externo, para lo cual deben diseñarse
planes de exportación específico.s para productos como el ñame fresco o procesado,
de tal manera que este renglón de la producción contribuya al logro de metas
cuantitativas de incrementar las exportaciones durante la vigencia del Plan de
Desarrollo (Corporación Colombia Internacional, 1999).
El cultivo del ñame se localiza frecuentemente en zonas deprimidas, es intensivo

en mano de obra y demanda innovaciones tanto en aspectos técnicos como de
índole empresarial, para incorporar valor agregado al producto y para identificar y
penetrar nuevos mercados. Es necesario, entonces, que se orienten recursos públicos
al ajuste, a la validación y transferencia de tecnología, a desarrollar proyectos
sobre información e inteligencia de mercados y al mejoramiento de la capacidad
empresarial a nivel de producción y de empresas exportadoras. Sin duda el ñame es
un cultivo con gran potencial de exportación, que podría expandirse en el corto
plazo. Otra ventaja es que no tiene barreras fitosanitarias para su ingreso a los
mercados, lo que permite iniciar procesos de exportación de inmediato. La
exportación de ñame requiere un programa especial a nivel de producción;manejo
postcosecha, diseño de empaques y logística adecuada para el transporte, creación
de empresas especializadas en exportación y acciones orientadas a posicionar el
producto en los mercados de destino (Corporación Colombia Internacional, 1999).
El comportamiento de los precios del ñame

Durante el año de 1998 el comportamiento de los precios de los alimentos en
Colombia estuvo afectado por factores climáticos, como la terminación del
fenómeno de El Niño, y por la reactivación de las siembras originada por el
mejoramiento de los precios relativos de muchos productos durante el primer
semestre de 1998. Por esta causa se presentó en el segundo semestre una oferta
abundante en todas las ciudades del país, originando una baja en los precios a
partir del mes de julio. Adicionalmente, se presentó una disminución de la demanda
como consecuencia del alto nivel de desempleu que hizo que la población fuera
mesurada en sus gastos y redujera sus compras (Corporación Colombia
Internacional, 1998).
PLICACIÓN DE LA BIOIECNOLOOÍAAGRÍCOLA AL CULTIVO DEL ÑAME 21
Dentro de los grupos de alimentos, uno de los que presentó mayor variación fue el
de tubérculos, especialmente por el peso que tiene la papa en el índice de precios
al consumidor (IPC). En este grupo también se encuentra el ñame, que tiene una
baja ponderación sobre el IPC, dado que su consumo es regional. En la tabla 1 se
presentan las variaciones en el IPC de los tubérculos, por semestre y el acumulado
del año.
Tabla 1 Variaciones en el índice de precios

de tubérculos en 1998
PRODUCID Variación acumulada en 1998
Enero-Junio Julio- Diciembre Enero-Diciembre
Pana 101.0 -1\1'\ R ·12fi
Ñame 58.5 -46.7 -15.5
Yuca 3.0 --6.7 -3.9
Fuente: Corporación Colombia Internacional, 1998.
Estos productos tienen como característica que su consumo preferencialmente es

en fresco y que presentan un reducido comercio exterior, tanto en exportaciones
como en importaciones. Estas características bacen que los precios de estos
productos varíen significativamente de mes a mes, lo que no sucede con productos
como la lecbe, los buevos, el aceite de cocina o los alimentos procesados. Por esta
razón los alimentos que más inciden en la canasta familiar son los productos
frescos como el ñame, de manera que una opción para estabilizar y mejorar su
precio es procesándolo, con las ventajas adicionales que genera el mayor valor
agregado incorporado al producto. Estas características del comercio de nuestro
producto bacen que deba dedicarse esfuerzos importantes al estudio del
procesamiento del ñame.
La biotecnologia en el cultivo del ñame

La biotecnología constituye el conjunto de sistemas que permiten la manipulación
de microorganismos, células y tejidos en condiciones controladas y totalmente
asépticas. Los procesos biotecnológicos fundamentados en la aplicación de los
sistemas in vitro y el creciente interés que en los últimos años ba despertado la
biotecnología vegetal, contribuyen de manera efiCaz a la solución de algunos
problemas en cultivos de interés para la agricultura (perea, 1990).
Los sistemas de propagación clonal son considerados uno de los aspectos más
avanzados y de aplicación práctica para la producción de semilla asexual con las
características deseables de sanidad. Sin embargo, para la mayoría de las plantas
cultivadas y de interés económico, es muy importante aplicar algunas metodologías
orientadas al mejoramiento de los cultivos, ya sea para obtener mejor calidad del
producto o con el propósito de crear o transformar un nuevo grupo de plantas que
posean características de interés para el establecimiento de nuevos cultivos.
Los sistemas in vitro ban demostrado que los cultivos celulares obtenidos a partir
de fragmentos de tejidos son capaces de producir y/o aumentar la variabilidad
genética preexistente (Larkin y Scowcroft, 1981). Estas condiciones ban generado
la identificación de características agronómicas deseables, permitiendo incluso la
selección in vi/ro de variantes genéticas resistentes a enfermedades, herbicidas,

altos niveles de salinidad, sequía, etc.
La biotecnologia como complemento en el mejoramiento

del ñame (Dioscorea spp.)
El primer aporte de la biotecnología al cultivo del ñame es la producción de

semilla libre de patógenos. La <>btenciónde plantas sanas mediante la utilización
de los sistemas in vi/ro, ofrece la posibilidad de prodUCirmaterial libre de patógenos,
mejorando sustancialmente la productividad de un cultivo.
El cultivo de meristemos permite la eliminación de virus y viroides utilizando el

domo apical. Cuando este sistema no es suficiente en la erradicación de estos
patógenos, se recurre a los tratamientos con termoterapia y quimioterapia en
combinación con el cultivo de meristemos.
La propagación a través de yemas apicales y/o segmentos nodales es uno de los

métodos más utilizados en la propagación vegetativa o micropropagación. Cada
una de las yemas que se encuentran en las axilas de las hojas (nudo), son idénticas
a las del ápice del tallo, pueden aislarse en condiciones asépticas en un medio de
cultivo adecuado.
Ammirato (1976) hace énfasis en que la propagación por nudos en ñame es una vía
de excelencia para la regeneración de plantas. Los trabajos de Chatuverdi y
colaboradores (1982) demostraron la regeneración de plantas con un alto grado de
unifonnidad en Dioscorea atata variedad Gemelos. Otra de las ventajas de los
cultivos in vitro, es la regeneración de plantas a través de yemas axilares, las
cuales presentan uniformidad fenotípica, permitiendo el establecimiento de nuevos
cultivos en regiones donde por una u otra razón ya están extinguidos.
La mayoría de las plantas herbáceas son propagadas vegetativamente, es decir

mediante la utilización de esquejes como método convencional. Se hace necesario
recurrir al empleo de metodologías modernas que permitan la propagación masiva
de material sano; con este fm y desde hace algunas décadas se viene utilizando el
cultivo de meristemos (perea, 1986). Una de las ventajas en la utilización de esta
metodología es sin lugar a dudas la obtención de material sano. Este sistema
revolucionó la agricultura francesa, permitiendo a los investigadores desarrollar a
escala comercial los sistemas de propagación masiva de algunas especies hortícolas.
Los métodos de propagación sexual y asexual en el cultivo de ñame presentan
numerosos problemas; siendo esta planta dióica, las probabilidades de encontrar
semillas fértiles son muy reducidas; adicionalmente, este cultivo presenta un bajo
porcentaje de floración; en ocasiones las flores son imperfectas al igual que la
producción de algunos frutos, sumado a la poca viabilidad de la semilla. La
propagación vegetativa a través de tubérculos es el método tradicional de los
agricultores. También se han experimentado otros métodos utilizando segmentos
de hojas y tallos, cuyos resultados apenas alcanzan el 30% y la calidad del tubérculo
no es aceptable.
Microtuberización de ñame
La microtuberización de ñame es considerada como otro de los sistemas de

propagación vegetativa, el cual permite un fácil transporte y manipulación de la
semilla básica. Estas metodologías permiten la conservación de material genético
PLICACIÓN DELA BIOfECNOLOOfAAGRÍCOLA AL CULTIVO DEL ÑAME 23
básico de clones madres libres de enfermedades en un espacio reducido sin

necesidad de hacer operaciones costosas para recolectar ñame en el campo. Además,
facilitan el intercambio de material a nivel nacional e internacional, evitando los
riesgos de introducir nuevos patógenos, permitiendo el establecimiento de
programas de producción y certificación de semillas de alta calidad. Uduebo (1982)
logró la formación de microtubérculos a partir de segmentos de nudos en Dioscorea
bulbífera. Los trabajos de Ammirato (1976, 1982) reportan la formación de
microtubérculos en Dioscorea bulbífera y Dioscorea alata. En un experimento
colectó 37 tubérculos en 9 frascos que luego fueron transferidos a campo regenerando
plantas con tubérculos.
Mejoramiento genético: obtención de variedades de ñame

resistentes a enfermedades
Tradicionalmente, la producción de nuevas variabilidades por métodos clásicos

ha sido el resultado de recombinaciones accidentales. Una de las bases para el
mejoramiento genético es la ampliación de variabilidad. En la búsqueda de
soluciones a estos problemas, se hace necesario aumentar la base genética del
material parental para mantener un espectro amplio de variabilidad enfocado a los
programas de mejoramiento, teniendo como objetivo una excelente calidad con
una resistencia que permita la disminución en el uso de agroquímicos en el cultivo.
Es así como la manipulación biotecnológica, combinada con los programas

tradicionales de mejoramiento, ofrece la posibilidad de resolver los problemas que
se presentan en el cultivo del ñame.
En la inducción de mutaciones y variabilidad, los objetivos están enfocados a la

eficiencia de inducción, identificación y selección de mutantes útiles, variación
somaclonal y mutaciones inducidas por radiación, ya sea para uso inmediato como
cultivares mejorados, o como material parental para los programas de mejoramiento
tradicionales.
Cuando se emplean dosis que inducen un alto grado de daño primario y poca
supervivencia, generalmente se producen fenotipos muy aberrantes. La
identificación de mutantes se enmascara debido a la presencia de virus y
micoplasmas; ésta se supera mediante las técnicas in vitro (cultivo de meristemos,
termoterapia, etc.). La utilización de material libre de virus se recomienda para
evitar dificultades en la identificación y selección de mutantes.
Así, el mejoramiento genético por mutación en especies ornamentales y hortícolas

que se propagan vegetativamente, genera un método rápido, económico y
competitivo para mejorar un genotipo bien establecido, al alterar uno o varios
rasgos sin detrimento del cultivar parental en la mayoría de sus características.
Stavarek y Rains (1984) revelan la importancia de ampliar la variabilidad genética

intervarietal mediante la combinación de mutaciones y la regeneración in vitro de
mutantes de ñame, para obtener variedades mejoradas en las cuales se evidencia la
producción y calidad en cuanto a vigor de la planta y, preferiblemente, a la
resistencia de plagas y enfermedades.
Los trabajos de Noriega y Sondahl (1992) reportan la regeneración de plantas de

rosa a partir de embriones somáticos. Este sistema es considerado como una
alternativa para el mejoramiento genético debido a que ofrece mayores
posibilidades de variabilidad. No son muchos los trabajos enfocados al
24 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIOrECNOLOGÍA
mejoramiento genético empleando esta técnica en el caso del ñame; esto se debe
en especial a la poca producción de flores y a la caída de las escasas semillas que
logran formarse (Montaldo, 1983).
Las variedades de ñame que actualmente se cultivan en las diferentes zonas

productoras se han logrado a través de una selección clonal recurrente efectuada
por mucho tiempo. Una alternativa para el mejoramiento de este cultivo la ofrecen
los sistemas in vi/ro, que comprenden desde la inducción de variabilidad genética
hasta las transformaciones de lá planta.
Los avances de la biotecnología de plantas han demostrado resultados prácticos

como en el caso del tomate, en el que se incrementó la calidad del fruto; en papaya,
la inserción del gen resistente al Ring Spot Virus (PRV) y en papa, la producción de
plantas resistentes a heladas, para no citar más ejemplos. Sin lugar a dudas, en el caso
del ñame es prioritario emplear estas modernas, técnicas en asocio con las
tradicionales, para lograr nuevas variedades resistentes a la antracnosis y a los virus.
Programa agrobiotecnológico sobre el cultivo de ñame
Este tipo de enfoque biotecnológico permite desarrollar un programa de

mejoramiento genético en ñame, para luego ofrecer a los agricultores plantas libres
de patógenos y/o resistentes a enfermedades y condiciones del medio ambiente,
que posteriormente deben ser seleccionadas, multiplicadas y evaluadas. De la
misma manera se establecerán programas de producción de semillas y se generarán
conocimientos sobre aspectos agronómicos relacionados con el cultivo de ñame
(véase figura 1).
Los productores de ñame de la Costa Atlántica colombiana se han visto abocados

a bajos rendimientos ocasionados por enfermedades y plagas, además de no contar
con paquetes tecnológicos apropiados para la región, debilidades en cuanto a la
comercialización del producto (en algunas zonas) y el poco valor agregado que en
este momento tiene el ñame por falta de industrialización. Teniendo en cuenta
estas limitaciones, se adelanta en la actualidad un Programa Regional de Producción
de Semillas de Ñame, en el marco del Programa de Biotecnología Agrícola Holanda-
Colombia. El proyecto se propone desarrollar trabajos que incorporen aspectos
agronómicos, biotecnológicos e industriales asociados al cultivo del ñame con
miras a favorecer la producción, la comercialización y el mejoramiento de las
condiciones socioeconómicas de los productores del ñame.
El Programa se ha propuesto adelantar actividades de investigación y desarrollo

orientadas a:
Obtención de semillas libres de patógenos, objetivo central de este proyecto.
Estudios sobre aspectos agronómicos, fisiológicos y morfológicos en
diferentes variedades de ñame.
Mejoramiento genético de variedades de ñame a través de la biotecnología,
para obtener plantas resistentes a antracnosis.
Estudios tendientes a generar un mayor valor agregado de la producción de
ñame por medio de la obtención de metabolitos secundarios y el desarrollo
de agroindustrias.
Promoción del establecimiento de formas asociativas que faciliten la incor-
poración de tecnologías y la comercialización de los productos.
En la figura 1 se presenta un esquema con los tipos de actividades que se han

propuesto. Teniendo este marco de referencia, en la actualidad se adelanta un
primer proyecto orientado al establecimiento de un Programa Regional para la
APLICACIÓN DE LA BIarECNOLOGÍAAGRÍCOLA AL CULTIVO DEL ÑAME 25
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26 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIOIECNOLOGÍA
Producción de Semilla de Ñame (Dioscorea alata y Dioscorea rotundata) libre de

patógenos, utilizando algunas variedades de la Costa Atlántica. En este proyecto
participan productores de la región, las universidades de Córdoba. Sucre y Nacional,
y la Regional 2 de Corpoica.
Plan de producción de semillas de ñame

La producción de semillas de ñame libres de patógenos requiere establecer métodos
de diagnóstico que permitan detectar la presencia de los virus que lo infectan. El
material vegetal se debe manejar en la primera etapa de la propagación en
condiciones in vitro, asegurando la sanidad relacionada con bacterias, hongos y
nemátodos. Los sistemas de diagnóstico viral emplean técnicas de inmunodetección
como la de ELISA, que se aborda con profundidad en un capítulo posterior. Esta
técnica emplea antisueros específicos y plantas indicadoras y debe emplearse en
diferentes etapas de la propagación del material vegetal, tal como se muestra en la
figura 2.
Micropropagación
Una vez seleccionadas las variedades que se manejarán por el Programa Regional
de Producción de Semillas de Ñame, se procederá a obtener plantas libres de
patógenos utilizando para ello el cultivo de meristemos y los métodos de
diagnóstico antes establecidos. El material de las variedades seleccionadas se
llevarán a invernadero y laboratorio, para realizar los procesos de desinfección,
asepsia y micropropagación.
Los medios de cultivo que se emplean en la micropropagación de ñame se basan

en los trabajos realizados por Mantell (1980), NG (1986), Arnmirato (1984), Perea
(1994 y 1995), Twyford (1996). Utilizan como medio básico Murashige y Skoog
(1962) considerado como exitoso. La adición de algunos reguladores de
crecimiento es requerida, dependiendo del objetivo propuesto. En la tabla 2 se
especifican los componentes de estos medios y las condiciones ambientales para
la propagación in vitro de ñame.
Para el cultivo de meristemos se separan los primordios foliares hasta observar el

domo (meristemo) de un tamaño entre 0.2 y 0.5 mm, luego se transferieren al medio
de cultivo fase I. Adicional al cultivo de meristemos y para incrementar la eficiencia
en la eliminación de virus, es conveniente hacer tratamientos de termoterapia. En
algunos casos como en la papa (Wambugu et al., 1985) se utiliza la quimioterapia
incorporando ribavirina con resultados exitosos.
APLICACIÓN DE LA BIOTECNOLOGÍAAGRÍCOLA AL CULTIVO DEL ÑAME 27
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Tabla 2. Composición de los medios de cultivo y

condiciones ambientales para propagación de ñame
Fase I: Cultivo de Meristemos
MedioM&S
ANA (ácido naftalen acético) 0.5 ppm
BAP (Bencil aminopurina) 0.2 ppm
Ácido giberélico (AG) 0.1 ppm
Sacarosa 30 gil
pH 5.8
Fase II: Propagación de nudos
M&S
BAP 1 ppm
GAO.5ppm
Fase III: Enraizamiento
M&S
ANA 0.05 ppm
Condiciones ambientales para cultivos in vitro de ñame:
fotoperiodo 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad
temperatura 24 a 27°C
intensidad de luz: 1.000 Lux en la fase I
2.000 Lux en la fase II
1.000 Lux en la fase III
Propagación masiva
La propagación clonal implica la reproducción de plántulas en condiciones

asépticas. Las características fenotípicas y genotípicas pennanecen idénticas a las
de la planta original. Se ha desarrollado un sistema productivo de propagación en
ñame mediante la subdivisión de plantulas (nudos) obtenidas del cultivo de
meristemos, subcultivando en un medio fresco los nudos cortados para el desarrollo
de nuevas plantas.
Una segunda metodología se relaciona con la proliferación de brotes a partir de

nudos; es decir, una yema apical y/o axilar genera en el mismo tiempo tres brotes, de
tal manera que se podría triplicar la producción de plantas a través de este sistema.
Formación de microtubérculos
El fenómeno de tuberización in vitro se estableció en D. bulbifera y D. alata

(Uduebo, 1971; Ammirato, 1976, 1984; NG, 1986a, y Perea et al., 1994 y 1995)
utilizando segmentos nodales como explantes. Esta tecnología además de ser
considerada como un eficiente sistema de propagación, pennite conservar y
mantener el gennoplasma de ñame, puesto que el mantenimiento de colecciones
in vivo es complejo y costoso.
La utilización de yemas axilares y segmentos nodales en un medio e~pecíficamente

establecido para cada variedad, facilita generar la fonnación de micro tubérculos
con doble propósito: de un lado, para complementar los bancos de gennoplasma y
de otro, para evaluar la producción de semillas elite en invernadero, como primera
etapa de un programa de producción de semillas de ñame.
APLICACIÓN DE LA BIOIECNOLOOíAAGRÍCOLA AL CULTIVO DEL ÑAME 29
Transferencia de plántulas de in vitro a invernadero
Las plántulas libres de virus provenientes de micropropagación, así como los

microtubérculos, deben ser transferidos a invernadero para propagación del material. El
invernadero debe reunir las condiciones de "casa de mallas" para impedir la infestación
de insectos transmisores de enfennedades. En esta fase se deben evaluar parámetros de
acuerdo con las variedades seleccionadas: genninación de microtubérculos, precocidad,
vigor, distancia de siembra entre plantas, producción de tubérculos por planta, número,
peso y calidad, entre otros.
Obtención de semillas de ñame en campo
En esta etapa llega el material obtenido por micropropagación y endurecido bajo

condiciones de invernadero (3 a 4 semanas), el cual se llevará a parcelas de producción de
semilla. Una segunda opción es llevar a campo materiales provenientes de la propagación
en invernadero hasta tuberización. Las pruebas de campo deben ser supervisadas por el
personal técnico, y es preciso hacer muestreos en diferentes etapas de desarrollo del
cultivo, para evaluar -con las pruebas de diagnóstico establecidas anterionnente- la
presencia de patógenos. Las semillas obtenidas a partir de la primera generación en campo
se propagan nuevamente en campo para obtener la semilla certificada que será utilizada
por los productores comerciales.
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PRÁCTICAS AGRONÓMICAS
PARA EL CULTIVO DEL ÑAME
Andrés Álvarez Soto

Departamento de Agronomía
Facultad de Ciencias Agrícolas
Universidad de Córdoba
Generalidades
Bajo el nombre de ñame, Dioscorea sp, se conocen más de 600 especies
caracterizadas por ser plantas primitivas, de hábito trepador y que
normalmente se propagan en forma vegetativa (Ayensu, 1972). De las
600 especies pertenecientes al género Dioscorea sólo 12 son cultivadas
a nivel comercial, entre las cuales Dioscorea alata L. es la más
ampliamente distribuida a nivel mundial (Coursey, 1976). Esta especie,
originaria del Sudeste Asiático, se cultiva en América y en Colombia
desde la llegada de los primeros barcos españoles cargados de esclavos
africanos; por tanto es normal encontrar este cultivo asociado con las
culturas negras (lITA, 1983).
TAXONOMÍA
División: Espermatofita
Subdivisión: Angiosperma
Clase: Monocotiledonea
Orden: Dioscoreales
Familia: Dioscoreaceae
Género: Dioscorea
Especie: Varias
El género Dioscorea ha sido dividido en varias secciones entre las que

sobresalen Enantiophyllum (D. alata y D. rotundata), Combillium (D.
esculenta), Lassiophyton (D. dumetorum), Osophyton (D. bulbifera) y
Macrogynodium (D. tr(fida).
Especies de ñame cultivadas en Colombia

En Colombia se pueden encontrar varias especies de ñame como el ñame
criollo (Dioscorea alata), ñame espino (Dioscorea rotundata Poir), ñame
papa (D. bulbifera Burkill), ñame azúcar (D. esculenta) y ñampÚl (D. tr(fida
L.). Se considera que D. alata y D. rotundata son las especies de mayor
34 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMilLAS POR BICITECNOLOGÍA
importancia tanto por el área sembrada, como por la demanda del tubérculo, seguidas por
D. trífida Las otras especies figuran como simples curiosidades.
El cultivo del ñame criollo, D. alata L. presentó un notable incremento en la Costa

Atlántica a partir del año 1973, pa ando de 6.000 ha en ese año a 25.000 ha en
1989 (Ministerio de Agricultura, 1991). El incremento del área de siembra se vio
estimulado por la apertura de las exportaciones del tubérculo que en 1975
alcanzaron las 6.000 toneladas. por un valor de 2.5 millones de dólares, lo cual
resultaba estimulante para este sector de la economía campesina (Ministerio de
Agricultura, 1977). Los principales mercados internacionales fueron Estados Unidos
y Aruba en América, Holanda, Inglaterra y Alemania en Europa, países en los que se
empleaba en la producción de Diosgenina y algunos corticosteroides.
Por otra parte, la siembra de ñame espino, D. rotundata, se incrementó a fines de la

década de los ochenta como consecuencia de la fuerte incidencia de la antracnosis,
enfermedad foliar que afectó grandes extensiones de ñame criollo (Álvarez, 1991),
Zonas productoras
El cultivo del ñame se considera restringido a la Costa Atlántica. Las áreas de
mayor producción son: la zona costera del departamento de Córdoba, la subregión
natural de los Montes de María en los departamentos de Sucre y Bolívar, y algunos
municipios de los departamentos del Cesar y La Guajira. Sin embargo, se tiene
conocimiento de la siembra de esta planta en áreas como Ungía y Acandí en el
departamento del Chocó y en algunos departamentos de los Territorios Nacionales,
lo cual es una clara evidencia de la aceptación que tiene este tubérculo. En un
futuro se espera un aumento de la demanda interna de este producto.
Por otra parte, se tienen evidencias arqueológicas que indican que en Colombia se
consumían algunos ñames, posiblemente Dioscorea trífida L., 7,.000 años antes de
nuestra era (Correal, 1989). Estas evidencias concuerdan con la teoría expuesta
por Coursey (1976), quien afirma que algunos ñames americanos se desarrollaron
por evolución divergente a partir de un ancestro común. Las afumaciones de Correal
sugieren además que el consumo de ñame en Colombia ha tenido mayor aceptación
que lo que normalmente se ha creído.
Descripción de la planta
El ñame es una planta monocotiledonea, que presenta algunas características de
las dicotiledóneas; su tallo es herbáceo y trepador, y puede alcanzar varios metros
de longitud. Se caracteriza por presentar cuatro pliegues o alas que tienen una
coloración rojiza en la parte basal. Sus hojas son de tamaño mediano, largamente
pecioladas y de forma acorazonada; se disponen de manera opuesta y/o alterna en
la misma planta. La parte aprovechable de la planta es un tubérculo de forma y
tamaño variable dependiendo del cultivar. Este tubérculo tiene la capacidad de
formar su sistema caulinar a partir de una capa de células meristemáticas localizadas
en la corteza. Esta característica se aprovecha para la propagación vegetativa de la
especie a partir de secciones de tubérculos.
El ñame es una planta dióica, con flores imperfectas producidas en plantas diferentes
(Ammirato, 1984); por tanto, existen plantas masculinas y plantas femeninas. Como
se trata de una especie de propagación vegetativa, se tienen clones o cultivares
masculinos y femeninos, y otros que no florecen (Abraham et al., 1987). Debido a
que ésta es una especie introducida en Colombia, sólo se han identificado algunas
PRÁCTICAS AGRONÓMICAS PARA EL CULTIVO DEL ÑAME 35
plantas masculinas y se han reconocido pocos cultivares femeninos, razón por la

cual no se han realizado cruzamientos y los trabajos de mejoramiento genético han
estado limitados a evaluaciones agronómicas de los materiales existentes en dos
pequeñas colecciones localizadas en el municipio El Carmen de Bolívar en el
departamento de Bolívar y otra en la Universidad de Córdoba en Montería.
En general se considera que las dificultades para obtener reproducción sexual en

el ñame se deben fundamen1.atmente a fenómenos de poliploidía que han llevado
a la especie a una virtual esterilidad sexual (Martín y Delphin, 1969).
Condiciones edafoclimáticas para la

producción del ñame
Para obtener una buena producción de ñame en los trópicos se requieren suelos
sueltos, profundos, fértiles, con alto contenido de materia orgánica y bien drenados,
ya que esta especie no resiste el encharcamiento. Sin embargo, este tipo de suelo no
se encuentra con mucha frecuencia debido a que las altas temperaturas que
predominan en la región aceleran el proceso de degradación de la materia orgánica.
En cuanto a las condiciones climáticas se pueden generalizar las siguientes variables:
Temperatura: para una óptima producción se requieren temperaturas que oscilen

entre 25-30° C. Temperaturas superiores afectan la acumulación de carbohidrato s
en los tubérculos debido a que se intensifica el proceso de respiración. Temperaturas
inferiores a 20°C retardarían el metabolismo de la planta, disminuyendo la tasa de
acumulación neta (Acosta, 1980).
Intensidad de luz: todas las especies tropicales de ñame necesitan abundante luz
para obtener mayor producción. Parece ser que el uso de tutores está estrechamente
relacionado con la necesidad de captar luz y con la susceptibilidad del tallo a
sufrir daños producidos por el recalentamiento del suelo.
Fotoperiodo: aunque en las regiones productoras de Colombia no se presentan

limitaciones por fotoperiodo, se sabe que las especies tropicales de ñame responden
mejor bajo condiciones de 12 horas luz ¡día o menos. Un mayor número de horas
luz se traduce en formación de tallos y follaje vigoroso, pero poca acumulación de
sustancias de reserva en el tubérculo.
Régimen pluviométrico: el ñame requiere abundante lluvia durante los primeros

ocho meses de su cultivo. Se considera que 1.500 mm de precipitación bien
distribuidos durante el ciclo vegetativo son suficientes para obtener una buena
cosecha.
Si se hace un detenido análisis de los requerimientos del cultivo del ñame y de las
condiciones edafoclimáticas que predominan en la mayor parte del territorio de la
Costa Atlántica colombiana, se puede concluir que el cultivo de esta especie se
realiza bajo cierto grado de marginalidad, lo cual podría ayudar a explicar la
obtención de rendimientos considerados bajos si se comparan con los obtenidos
en otros países productores, como Puerto Rico y Costa Rica.
Prácticas de cultivo
A continuación se hace una breve descripción de las labores que se requieren para
obtener una buena cosecha de ñame.
36 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMilLAS POR BIOIECNOLOOÍA
Preparación del terreno: en este caso es necesario distinguir si se trata de cultivos

mecanizados o de siembras tradicionales. En el primer caso se requieren suelos de
topografía plana y libres de árboles, troncos o piedras que obstaculicen el paso de la
maquinaria. La preparación consiste en una arada profunda seguida de dos o tres
pases de rastra y una caballoneada; de esta manera queda el terreno listo para la
siembra. Si se trata de cultivos tradicionales, la preparación consiste de una desyerba
inicial, eliminación de troncos o cualquier otro residuo de madera y la hoyada.
Preparación de la semilla: aunque de manera eventual el ñame puede propagarse

por semilla sexual o mediante la utilización de segmentos del tallo aéreo 01ásquez
y Meza, 1997), se reconoce que la propagación a nivel comercial se hace empleando
tubérculos enteros o secciones de éstos, los cuales son denominados "semillas".
Esta semilla debe cumplir ciertos requisitos como un estado fisiológico apropiado,
es decir, haber superado el periodo de dormancia, contener suficiente área cubierta
por la corteza del tubérculo para que se produzca la formación de yemas que van a
originar el tallo aéreo y contener suficientes reservas alimenticias que le permitan
sostener la nueva planta durante las primeras semanas de su ciclo vegetativo.
Además debe estar libre de plagas y enfermedades. Para fines comerciales y
dependiendo de las condiciones del suelo y del clima, se cortan semillas con un
peso que oscila entre 100-150 gramos. Luego de cortada, la semilla se debe tratar
durante cinco minutos con una mezcla de un fungicida con un insecticida con el
fm de protegerla del ataque de plagas y enfermedades. Después del tratamiento de
protección se deja secar a la sombra y queda lista para la siembra.
Siembra: la siembra consiste en depositar la semilla en el fondo de un hoyo de

10 cm de profundidad. La semilla se coloca con la corteza hacia abajo para
facilitar la emisión del tallo, las raíces y el nuevo tubérculo. Las nuevas plantas
germinarán 20-30 días después de la siembra. Se recomienda una densidad de
población de 10-15 mil plantas por hectárea dependiendo de las condiciones de
suelo y del destino final del producto cosechado.
Control de maleza: en términos generales, el cultivo de ñame debe permanecer

libre de malezas durante todo un ciclo vegetativo, ya que se evita la competencia
de las malas hierbas y se facilita la realización de otras prácticas de cultivo. Para un
eficiente control de malezas se recomienda integrar varios métodos como el control
químico, el mecánico y el control cultural.
Thtorado: como se mencionó al principio, el ñame es una planta trepadora exigente

en luz; por tanto se le debe colocar un tutor con una altura de 2.0 metros
aproximadamente, con el fm de que la planta pueda captar la mayor cantidad de luz,
además de facilitar el desplazamiento en el lote. Cuando el ñame se siembra asociado
con otros cultivos como el maíz, éste debe desempeñar el papel de tutor. La variedad de
maíz que se utilice para asociar con ñame debe presentar las siguientes características:
porte bajo, caña gruesa y permanencia en pie por varios meses después de cosechado.
En algunos casos cuando la siembra se realiza en laderas muy inclinadas susceptibles
a la erosión, se puede utilizar como tutores algunas especies de leguminosas arbóreas
como el guandul (Cajanus cajan) y la Leucaena (Leucaena leucacephala).
Fertilización: en términos generales, el ñame consume grandes cantidades de

nitrógeno y potasio; por tanto, la fertilización debe basarse sobre estos elementos
sin desconocer la información derivada del análisis de suelos. La aplicación del
fertilizante debe ser fraccionada para un mejor aprovechamiento de los nutrientes.
PRÁCTICAS AGRONÓMICAS PARA EL CULTNO DE ÑAME 37
Control de plagas: el ñame es un cultivo relativamente sano, afectado por pocas

plagas; éstas se pueden clasificar en: plagas que afectan el tallo y el follaje, y
plagas que afectan el tubérculo. En el primer grupo tenemos:
- Honniga arriera (Atta colombica Guerin). Estos insectos cortan secciones de

hojas y partes tiernas del tallo, afectando considerablemente el crecimiento de
la planta. Su ataque se presenta a manera de focos localizados en los bordes del
lote. Para su control se deben localizar los honnigueros y aplicar el insecticida
apropiado en la entrada de éstos.
- Áfidos (Aphis gossypii Glover). La importancia de este insecto radica en la

capacidad de transmitir virus al alimentarse en plantas enfennas y posterionnente
en plantas sanas. No existen recomendaciones específicas sobre el control de
esta plaga.
- Crisomélidos. Existen varios crisomélidos que producen perforaciones en la

lámina foliar del ñame sin alcanzar el umbral de daño económico, razón por la
cual no se han fonnulado recomendaciones para controlar esta plaga.
- Iguanas (Iguana iguana). Este reptil consume grandes cantidades de follaje y

tallo de ñame, ataca especialmente en los bordes del cultivo cerca de árboles
frondosos. No existen recomendaciones para su control.
- Picudo negro (Xystus sp). La larva de este curculiónido barrena el tallo del ñame
espino produciendo el debilitamiento o la muerte parcial de la planta. No se
tienen datos acerca de las pérdidas económicas producidas por este insecto y no
existen recomendaciones para su control.·
Entre las plagas que atacan el tubérculo antes de la cosecha tenemos:
- Ñeque (Dasyprocta agonti): este roedor en vía de extinción, daña el tubérculo

en el campo consumiendo la parte superior del mismo, facilitando la infestación
por hongos y otros microorganismos que dañan el resto del tubérculo. No existen
recomendaciones para su control.
- Ratas (Ratus ratus): estos roedores consumen parcialmente los tubérculos

almacenados, iniciando su ataque por los sitios que han sufrido heridas o golpes
durante la cosecha o el transporte. El material atacado generalmente sufre la
invasión de microorganismos que causan la pérdida total del tubérculo afectado.
Se recomienda realizar control localizado empleando los raticidas disponibles
en el mercado.
- Coleópteros (posiblemente Heteroligus sp): el daño es realizado tanto por la

larva corno por el adulto; barrenan el tubérculo almacenado dejando una serie
de galerías de color negro que demeritan la calidad comercial del ñame. Se ha
observado que la presencia de esta plaga incide sobre el incremento del ataque
de ratas. Debido a que se desconoce la biología de este insecto, no existen
recomendaciones para su control.
Control de enfermedades: el ñame es afectado por pocos patógenos; las

enfermedades más importantes son: antracnosis, producida por el hongo
Colletrotrichum gloesporioides, que ataca el tallo y las hojas de las variedades
susceptibles, produciendo lesiones de fonna irregular y de color marrón, reduciendo
drásticamente los rendimientos al disminuir el área fotosintética. El uso de clones
resistentes al patógeno se presenta como la opción más económica para controlar la

enfermedad.
Marchitéz, producida por el hongo Fusarium oxysporum. Esta enfermedad se

caracteriza por el marchitamiento repentino de las plantas, que adquieren una
coloración amarillenta y fmalmente mueren. Se puede observar necrosamiento de
las raíces y parte del cuello donde el tallo se une con el tubérculo. Como medidas
de control se recomiendan la rotación de cultivos, la quema de residuos de tallos y
tubérculos después de la cosecha, el uso de semilla sana y la siembra de variedades
resistentes. Entre otras enfermedades fungosas, se han reportado varias como la
mancha Phyllosticta, la mancha Cercospora y la mancha Zonificada, las cuales no
han alcanzado niveles de daños económicos, pero cuya evolución debe ser
monitoreada para evitar epidemias (Osorio y Ramírez, 1989).
Virosis: durante los últimos cinco años se ha observado el incremento del número
de plantas afectadas por sintomatologías como el mosaico, moteado, bandeamiento
y deformación de la lámina foliar que indican la presencia de virus en el cultivo
del ñame. Sin embargo, no se han cuantificado las pérdidas producidas por esta
afección. El uso de semillas provenientes de tubérculos producidos por plantas
enfermas, se ha convertido en la causa principal de diseminación de esta enfermedad.
Igualmente, se tienen reportes que indican que algunos áfidos y nemátodos obran
como vectores de los virus. Hasta ahora la única medida de control recomendada
es la utilización de semillas sanas, provenientes de plantas sin síntomas.
Cosecha: el ñame se cosecha manualmente con ayuda de algunas herramientas,

para evitar que se produzcan heridas o rupturas en los tubérculos, lo cual hace
esta labor dispendiosa. Una vez cosechados los tubérculos, se juntan formando
pilas, las cuales deben ser cubiertas con material vegetal, para evitar daños
producidos por los rayos solares.
Transporte: luego de la cosecha, los tubérculos se empacan en costales de

aproximadamente 50 kilogramos de capacidad y se transportan hasta el sitio de
acopio. Después se sacan del costal y se ubican cuidadosamente en bodegas
apropiadas donde pueden permanecer almacenados hasta por cuatro meses. Las
bodegas deben ser frescas y bien ventiladas para evitar pudriciones.
Comercialización: la mayor parte del ñame producido en el país se consume a nivel

regional; los mayores centros de consumo son las ciudades de Barranquilla y
Cartagena; un porcentaje menor de la producción se alcanza a exportar principalmente
a Estados Unidos, para satisfacer las necesidades de la población de origen latino.
PRÁCTICAS AGRONÓMICAS PARA EL CULTIVO DE ÑAME 39
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UTILIZACIÓN DE LOS SISTEMAS IN
VITRO PARA LA OBTENCIÓN DE
PLANTAS DE ÑAME (DIOSCOREA
SPP.) LIBRES DE PATÓGENOS
Margarita Perea Dallos

Departamento de Biología
Facultad de Ciencias
INTRODUCCION
El ñame (Dioscorea spp.) es una planta de importancia económica en
regiones pluviosas tropicales y subtropicales. Los tubérculos del ñame
son considerados como producto esencial en la alimentación de
millones de personas en África, Asia, y América Latina.
A pesar de los obstáculos que presenta el cultivo del ñame en la Costa

Atlántica colombiana, como son las enfermedades de origen fungoso,
viral y el ataque de algunas plagas, se realizan esfuerzos por parte del
Programa de Biotecnología Agrícola Holand'a-Colombia, para
suministrar al pequeño agricultor plantas de ñame de diferentes
variedades, libres de patógenos y de gran vigor, Para alcanzar este
propósito se ba recurrido, a los sistemas in vitro con el empleo del
cultivo de meristemos, la propagación clonal y la microtuberización.
El incremento en los cultivos alimenticios e industriales se ha logrado

a través de la selección clonal efectuada a través de cientos de años
desde su domesticación. El desarrollo de la industria alimentaria de alta
tecnología en el siglo XX impuso nuevas exigencias al agricultor, quien
se vio obligado a mejorar sus cultivos.
Los avances recientes en el desarrollo de la agricultura responden al aumento

de la producción y mejoramiento de la calidad de los cultivos, debido a los
avances en el conocimiento de la célula, su fisiología genética y al uso de
herramientas de biología molecular. En efecto, basados en la utilización de
nuevas tecnologías que incluyen el cultivo de tejidos vegetales y la
manipulación genética, se abren nuevas expectativas para el complemento
de las técnicas convencionales de selección, las cuales son consideradas
como valiosasberramientasen el hallazgode clonesde interésen la agricultura.
En Colombia, el ñame es estimado como uno de los productos

alimenticios básicos de la dieta para los babitantes de la Costa Atlántica.
Sin embargo, mantener la producción rentable y permanente es bastante
difícil debido a la incidencia de bongos, bacterias, virus y nemátodos.
Los estudios obtenidos con el empleo de los procesos in vitro han
42 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIOfECNOLOGÍA
permitido avances científicos en la producción de plantas de excelente calidad y

libres de patógenos. Para el cultivo del ñame, estas aplicaciones permiten ofrecer
al agricultor plantas de mejor calidad.
Distribución y cultivo del ñame

El género Dioscorea tuvo una amplia dispersión mundial a fines del Cretáceo.
Como resultado de evoluciones posteriores en el viejo y nuevo mundo, se
desarrollaron en los dos hemisferios secciones separadas del género de las cuales
ninguna está representada en ambos. La separación de las formas ancestrales
asiáticas y africanas ocurrieron en el Mioceno (Coursey, 1976).
Dioscorea alata L. es nativa del Sudeste Asiático de donde se extendió a Indonesia,

África y América tropical. Este tipo de ñame constituye el tubérculo comestible
más familiar. Dioscorea rotundata Poir es la variedad más popular en África
especialmente en Nigeria y Ghana. La más alta producción de ñame en el mundo
está en ese continente, los rendimientos oscilan entre 3.000 y 15.000 libras/acre
(Oke, 1972). Actualmente la especie asiática Dioscorea alata, a través de diversos
culuvares, ocupa la mayor superficie cultivada en los trópicos. Siguen en
importancia: D. cayenensis, D. bulbifera, D. trífida y D. esculenta.
La importancia de los ñames en la economía de África Occidental es obvia; esto se

debe probablemente al hecho de que los ñames dan mejores rendimientos que los
cereales bajo las altas condiciones de pluviosidad en estas áreas. En Nigeria, el ñame
hace parte de la herencia 'religiosa de varias tribus étnicas y en la actualidad,
desempeña un papel importante en ceremonias religiosas y eventos sociales, como
la celebración del festival del ñame en Costa de. Marfil, Benin, Ghana, Nigeria,
Camerún y también algunos países de África Oriental que representan la mayor
producción del ñame (Coursey y Coursey, 1971).
Los tubérculos del ñame son una excelente fuente de carbohidratos; contienen
vitaminas como carotenos, tiamina, riboflavina, niacina y ácido ascórbico. Además
poseen la mayor parte de los aminoácidos esenciales: arginina, leucina, isoleucina y
valina; en menor cantidad se encuentran histidina, metionina y triptófano. El
contenido de proteínas es del 11,21%, considerando que la cantidad de ñame que se
consume en Africa es suficiente para proveer la tercera parte de la proteína básica
requerida por un adulto (Ayensu y Coursey, 1972). Sin embargo, por el contenido de
taninos en los tubérculos, el valor nutricional del ñame tiende a reducirse como
verdadera fuente de proteínas, pues el tanino puede combinarse con la proteína y
convertirse en un alimento no disponible (Eka, 1985). El ñame es rico en minerales
como el calcio, el hierro y el fósforo (véase tabla 1). El contenido de fibra es del
9,47% representado en materia seca (Oyenuga, 1968).
Estado actual del cultivo del ñame en Colombia

La cultura del cultivo del ñame en la Costa Atlántica colombiana se remonta a varios
siglos y es considerado como un producto no prioritario, situación que no ha
permitido un adecuado desarrollo tecnológico en tomo a este tubérculo promisorio.
Según reportes de la FAO (1996), la producción del ñame ha sido estimada en 34

millones de toneladas por año; de éstas el 95% proviene de los países africanos,
ocupando Nigeria el primer lugar de producción global con el 73%. En América
Latina, el ñame es importante en Brasil, Colombia, Haití, Venezuela, los países de
América Central y las islas caribeñas incluyendo Puerto Rico.
OBTENCIÓN DE PLANTAS DE ÑAME LIBRES DE PATóGENOS 43
Tabla 1. Composición de raíces de ñame (Dioscorea

spp.) en 100 gramos de rizomas (base húmeda)
COMPOSICIÓN RIZOMAS
Valor energético 100 calorías

Humedad 72,6%
Proteína 2,0 g
Grasa 0,2 g
Carbohidratos 24,3 g
Fibra 0,6 g
Cenizas 0,9 g
Calcio l4,Omg
Fósforo 43,0 mg
Hierro l,3mg
Vitamina A Trazas
Tiamina 0,13 mg
Ribofavina O,02mg
Niacina 0,40 mg
Ácido Ascórbic 3,00 mg
Fuente: Wu Leung, el al., 1961.
El ñame se propaga únicamente en forma vegetativa; las tasas de multiplicación

obtenidas a partir de segmentos de los tubérculos es muy baja. Además, este sistema
constituye un medio de transmisión de plagas y enfermedades, especialmente
aquellas que son causadas por organismos sistémicos.
La incidencia de virus en los cultivos del ñame puede presentarse en forma

latente; gradualmente afectan no sólo el crecimiento y la forma general de la
planta, sino también su rendimiento.
Para ayudar a resolver estos problemas, surge en los últimos años el empleo de los
sistemas in vitro, que se considera la nueva tecnología para despejar ciertas
incógnitas o para alcanzar determinados objetivos en la agricultura, horticultura e
industria. Tenemos entonces la posibilidad de propagar vegetativamente el ñame
a través del cultivo de meristemos, el cual se considera un excelente método para
la producción de plantas sanas partiendo de materiales infectados.
En Colombia, el cultivo del ñame se ha visto afectado en los últimos años por
algunas enfermedades y plagas, lo cual ha ocasionado una drástica reducción del
área cultivada. En las dos úlumas décádas, el ñame Dioscorea afata presentó una
baja significativa en la producción causada por un fuerte ataque de antracnosis.
Ante la dificultad del control químico para esta enfermedad -debido a los altos
costos de los fungicidas y dificultades de acceso para el pequeño agricultor-, se
pone de manifiesto la necesidad de adoptar técnicas complementarias de
mejoramiento desde el punto de vista sanitario y genético de las variedades
comerciales del género Dioscorea, a través de la biotecnología.
Botánica
El cultivo del ñame es en esencia un cultivo tropical. El género Dioscorea presenta
más de 600 especies y son plantas dioicas de flores pequeñas, rosadas o crema. Es
una planta monocotiledonea anual y su cultivo produce después de 8 a 10 meses.
Los tubérculos del ñame tienen un periodo de dormancia de 3 a 4 meses.
44 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMil..,LASPOR BIarECNOLOGÍA
Las flores masculinas se encuentran en gran número sobre panojas, constan de un

cáliz con tres sépalos y una corola con tres pétalos; normalmente presentan
verticilios cada uno con dos estambres. El fruto proviene de la flor en forma de
cápsulas trinoculares, secas y transparentes, y las semillas que contiene son pequeñas,
de color claro y aplanadas.
La mayoría de las especies de Dioscorea tienen hojas simples cordadas y soportadas

por un peciolo largo. La distribución de las hojas alrededor del tallo, es decir la filotaxis,
puede ser opuesta o alterna; en ía parte baja del tallo es alterna y opuesta en la parte
joven. Los tallos son generalmente bastante débiles e incapaces de soportar su propio
peso, por lo que requiere un buen tutor para su crecimiento (Montaldo, 1983).
Existen muchos criterios de los cuales depende la clasificación del ñame, tales
como: tamaño, color de las hojas y tubérculos, calidad de cocción, periodo de
maduración, dureza del tubérculo, etc.
Sanidad vegetal
Las pérdidas en los cultivos de importancia económica son generadas por
microorganismos que en la mayoría de los casos causan enfermedades en las plantas,
impidiendo la producción de mejor y mayor calidad de alimentos y en ocasiones
aniquilan sus rendimientos (perea, 1999). Las enfermedades causadas por virus
constituyen uno de los problemas más serios en la agricultura. Su incidencia y control
en algunos casos ha sido difícil debido a los medios de transmisión, y a la carencia de
métodos químicos para su control. En el caso de control de bacterias, hongos y ne-
mátodos, se dispone de compuestos químicos específicos para cada uno de estos
patógenos, razón por la cual este sistema hace parte integral en los cultivos comerciales.
Después de la segunda guerra mundial, los avances en el conocimiento de la

célula vegetal han proporcionado la base de tecnologías que constituyen la
biotecnología de plantas.
Sistemas In vitro en Dioscorea spp.

Cultivo de meristemos
La aptitud de las plantas para la multiplicación vegetativa es considerada como

una característica fundamental de las células que conforman los meristemos. La
contribución del cultivo de meristemos en la obtención de plantas libres de
patógenos es, sin lugar a dudas, uno de los aportes más significativos en la solución
de los problemas agronómicos (véanse fotografías 1 y 2).
Las enfermedades virales generan un sinnúmero de obstáculos, especialmente para los

cultivos que se propagan vegetativamente como ñame, papa, yuca, caña de azúcar y
algunas plantas bulbosas. En estos cultivos, los virus se transmiten de generación en
generación, sin ser eliminados durante la producción de semillas (véanse fotografías
3y4).
Los estudios de las enfermedades virales, especialmente en lo referente a su

naturaleza, modo de transmisión y la variedad de hospedantes, deben formar parte
integral del control por medio del cultivo de meristemos. El empleo del cultivo de
OBTENCIÓN DE PLANTAS DE ÑAME LIBRES DE PATóGENOS 45
Fotografías I Y2. Cultivo in vi/ro de Dioscorea ala/a.

Características nonnales de las plántulas.
Fotografías cortesía del Centro de Biotecnología, Universidad de Córdoba.
Fotografías 3 Y4. Cultivo in vitro de Dioscorea alata.

Características anormales del desarrollo de la planta.
Falta de vigor, clorosis, enrollamiento, pigmentación anormal.
Fotografías cortesía del Centro de Biotecnología, Universidad de Córdoba.
OBlENCIÓN DE PLANTAS DE ÑAME LIBRES DE PATóGENOS 47
meristemos como un sistema para la limpieza y saneamiento del material clonal,

ha hecho que sea el cultivo de tejidos una de las técnicas más importantes desde el
punto de vista económico (Roca y Jayasinghe, 1982).
La hipótesis basada por Limasset y Cornuet (1949) en que puntualizan que la

concentración de virus disminuye relativamente hacia el meristemo apical, dio
surgimiento a la posibilidad de producir clones limpios a partir de plantas infectadas.
Las investigaciones realizadas en Francia por Morel y Martin (1952) utilizando
meristemos apicales a partir de plantas infectadas de virus, permitieron obtener en
poco tiempo plantas completas libres de virus en dalia y papa. Este método está
siendo aplicado en numerosos países y ha tomado gran expansión; desde entonces,
asistimos a una verdadera revolución en la agricultura moderna.
Los trabajos realizados en ñame aparecen publicados por Mantell y colaboradores

(1980), quienes al utilizar meristemos apicales de Dioscorea alata en el medio
básico Murashige y Skoog (1962) adicionando 0.5-1.0 mg/I de ácido naftalen
acético (ANA) y 0.1-0.2 mg/l de bencil amino purina (BAP), lograron regenerar
plantas de ñame en un periodo de 15-20 semanas. Ng (1984, 1986) aisló meristemos
de D. rotundata y D. alata, logró regenerar plantas utilizando el medio básico
M&S suplementado con 0.12 mg/l de BAP, 0.2 mg/l de ANA y 0.08 mg de ácido
giberélico, 20 mg/I de cisteína y como solidificante agar-agar al 0,6%.
En nuestro caso se aislaron meristemos de D. alata (nombre común "canilla de

muerto") y D. rotundata ("espino") utilizando el medio básico M&S con 0.08
mg/l de ácido giberélico. Después de 20 días se observó el desarrollo de la
plántula de un tamaño de 2-3 centímetros.
Tratamientos por termoterapia
La termoterapia se refiere a la terapéutica mediante el frío o el calor. El principio

básico de la termo terapia se relacionOa con la inactivación y/o eliminación de los
microorganismos a temperaturas y tiempos que lesionan ligeramente al hospedante.
En síntesis, es la íntima relación de la multiplicación viral con el metabolismo
celular y la sensibilidad diferencial de estos procesos al calor, lo que hace posible
el uso del calor como método terapéutico (Roca y Jayasinghe, 1982).
Estos tratamientos, al afectar el metabolismo celular, alteran la síntesis del virus;

por tanto, el éxito de la termoterapia depende de la capacidad del tejido de la
planta para soportar periodos largos de altas temperaturas que inactiven los virus
sin afectar significativamente el crecimiento de la planta (Quak, 1977).
El método consiste en someter a la planta, tubérculo, bulbos o partes infectadas a

temperaturas entre 30 a 40 co, ya sea por inmersión en agua caliente o con aire
caliente. Los tratamientos con agua caliente son por lo general de corta duración
(10-30 minutos). Para utilizar aire caliente es necesario disponer de cámaras adecuadas,
pudiéndose practicar el tratamiento en forma continua o fraccionada durante dos,
cuatro o seis semanas, dependiendo del tipo de planta, estado fisiológico, contenido
de agua en el material vegetal y el tamaño de éste (Roca y Jayasinghe, 1982).
Entre los trabajos pioneros con termoterapia se encuentra el empleo de agua

caliente para el tratamiento de estacas de caña de azúcar. Posteriormente,
Kassanis y Posnette (1961) concluyeron que la mayoría de las plantas hortícolas
infectadas por virus podrían ser inactivadas mediante tratamientos con calor;
el caso de la papa ha dado excelentes resultados.
48 ÑAME: PRODUCCIÚN DE SEMILLAS POR BIOIECNOLOOÍA
El material de ñame proveniente de campo (tubérculos) se hizo germinar en el

laboratorio y después de transferirlos a condiciones in vitro para la regeneración
de plántulas de D. alata (canilla) y D. rotundata (espino), éstas fueron sometidas a
tratamientos de termoterapia.
Propagación clonal
Los métodos básicos utilizados para la propagación vegetativa como es el caso de

emillas, esquejes, estolones, injertos, rizomas, bulbos, bulbillos (Margara, 1982),
no son suficientes para necesidades tales como el establecimiento o renovación de
cultivos, debido a que son demasiado lentos y en ocasiones no son viables. Entre
los cultivos que se propagan vegetativamente, como es el caso del ñame, el riesgo
de transmitir virus, viroides y micoplasmas es evidente debido a que estos patógenos
son en su mayoría sistémicos.
La capacidad de los vegetales para los procesos de multiplicación clonal es

considerada como característica fundamental de las células vegetales que
conforman los meristemos. La propagación clonal implica la reproducción de
plantas en condiciones asépticas cuyas características son idénticas a la planta
original (Krikorian, 1982).
Recientemente, la necesidad de producir plantas libres de patógenos a través del

cultivo de meristemos y el desarrollo de los sistemas actuales de propagación masiva
en el cultivo del ñame ha tomado gran interés para los pequeños agricultores de la
Costa Atlántica colombiana. Los trabajos de investigación participativa que se
realizan a través del Programa de Biotecnología Agrícola Holanda-Colombia han
permitido el desarrollo de plantas libres de patógenos, la propagación clonal, y la
microtuberización de algunas variedades de ñame de interés para los agricultores.
Los sistemas de propagación clonal son considerados como uno de los aspectos
más avanzados y de aplicación práctica para la producción de semilla asexual con
características deseables de sanidad. Sin embargo, para la mayoría de plantas
cultivadas y de interés económico es muy importante aplicar algunas metodologías
orientadas al mejoramiento de los cultivos, ya sea para obtener mejor calidad del
producto o con el propósito de crear un nuevo clon que posea características de
interés en los cultivos comerciales.
En las últimas décadas, el potencial de multiplicación de plantas in vitro ha tomado

enorme interés debido a las ventajas obtenidas por estos sistemas, como la
uniformidad, el vigor, la velocidad de propagación y el número de plantas
regeneradas. Para el éxito en la aplicación de estos sistemas de propagación clonal,
es importante tener en cuenta el genotipo de la planta, su estado fisiológico, la
selección del explante (parte de la planta), el suministro de nutrientes al medio de
cultivo, el empleo de reguladores de crecimiento y las condiciones ambientales
para el desarrollo de las plántulas (perea, 1999).
Sistemas de propagación clonal para el ñame
El énfasis en la importancia de la propagación clona! para la reproducción de cultivares

mejorados a través de cualquier sistema permite el desarrollo de una agricultura
sostenible, que integra la sanidad y mejoramiento de los cultivos, de los cuales se
logra obtener gran número de plantas en un tiempo relativamente corto (véanse
fotografías 5 y 6). Entre los sistemas de propagación clonal en ñame están:
OBTENCIÓN DE PLANTAS DE ÑAME LIBRES DEPPJ'OOENOS 49
Fotografía 5. Propagación clonal de D. alata a partir de microtubercúlos.
Fotografía 6. Formación de callos a partir de segmentos de hoja de ñame.

50 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMilLAS POR BIOIECNOLOGÍA
• Multiplicación de yemas apicales y/o axilares

• Segmentos nodales
• Microtuberización
Multiplicación de yemas: las yemas apicales provenientes del cultivo de meristemos

deben ser previamente indexadas para virus y viroides. Este material certificado, es
decir, libre de patógenos, se utiliza para la propagación masiva. En las últimas décadas,
el desarrollo de tecnologías parl}la multiplicación y mantenimiento de las plantas
en cultivos asépticos recibió un gran impulso debido a la capacidad de la estructura
meristemática en la proliferación de brotes (Arditti, 1997).
Este método, es aconsejable para obtener una rápida multiplicación, que se ha aplicado
a una gran variedad de especies herbáceas y leñosas. En estos casos, el empleo de las
citoquininas como reguladores de crecimiento es primordial para el ñame, y con el
propósito de mejorar la tasa de propagación, se utilizaron yemas apicales de la variedad
D. rotundaJa("espino") utilizando el medio básico M&S suplementado con 3 mg/l de
BAP; se observó la emisión de yemas a las seis semanas en número de 3 -4 por explante.
Segmentos nodales: la utilización de yemas junto con una porción de tallo es

considerada como otro proceso de propagación rápida. Cada una de las yemas que
se encuentran en las axilas de las hojas son idénticas a las de ápice del tallo y
pueden ser aisladas en un medio de cultivo para su desarrollo in vitro. Éste es el
método más natural de propagación vegetativa de las plantas in vitro, pudiendo
ser aplicado también in vivo (Pierik, 1990).
Mantell y colaboradores (1978) fueron los primeros en reportar la regeneración de

brotes a partir de segmentos nodales en D. rotundata, utilizando únicamente el
medio básico M&S, sin reguladores de crecimiento. Resultados posteriores de
Cortes- Monllor y Un (1982) en D. rotundata variedad Habanero utilizando kinetina
y ANA, Y Chatuverdi (1979) también lograron la regeneración de plantas en D.
jloribunda utilizando BAP y ANA como reguladores de crecimiento. En nuestras
investigaciones con D. rotundata ("espino") a partir de segmentos, con el empleo
de 3 mg/l de BAP observamos el desarrollo de tres yemas por nudo. Con el empleo
de Thiadiazuron se utilizaron segmentos nodales de la misma variedad, logrando
una mayor cantidad de brotes; estos trabajos continúan en investigación.
Microtuberización: la producción in vitro de microtubérculos ha tomado mucho

interés en los últimos años para las plantas tuberosas. En el caso de la papa, algunos
método han sido desarrollados y están disponibles para la inducción de este
proceso ( tallknecht y Farnsworth, 1982; Hussey y Stacey, 1984; Bajaj, 1987). En
el Centro Internacional de la Papa (CIP) en Lima, Perú, Dodds y colaboradores
(1992) desarrollaron un método efectivo utilizando Chlorocholine Chloride
(e.C.e.) y sacarosa, demostrando que este sistema no sólo es rápido y eficiente,
sino que también es aplicable a un alto rango de genotipos de papa (véase foto-
grafía 5).
En nuestro ca o, las investigaciones preliminares han sido realizadas en D. atata

variedad "oso" y Dioscorea rotundata variedad "espino" utilizando
hlorocholine Chloride además de otros parámetros como adición de reguladores
de crecimiento (Arnmirato, 1984; Uduebo, 1971), concentración de sacarosa
(Forsyth y Van Staden, 1984; Ng, 1988), adición de nitrógeno (Mantell y Hugo,
1989; Asahira y Yazawa, 1979). El medio basal y las condiciones de cultivo han
sido imilares a las utilizadas en los procesos de microtuberizaciÓn.
OBTENCIÓN DE PLANTAS DE ÑAME LIDRES DE PJXfÓGENOS 51
Mejoramiento genético: obtención de variedades

de ñame resistentes a enfermedades
La variabilidad genética constituye la base en todos los sistemas de mejoramiento;
ésta puede ser aumentada en corto tiempo al utilizar los sistemas in vitro, al
complementarse con los métodos tradicionales de fitotecnia, para alcanzar variaciones
en los cultivos disponibles o desarrollar cultivares novedosos (perea, 1999).
Los programas de mejoramiento del ñame por las vías convencionales han sido
muy difíciles de realizar, debido a que las variedades de ñame disponibles no
florecen o en algunos casos lo hacen de manera ocasional.
En la búsqueda de soluciones a estos problemas, se hace necesario aumentar la

base genética del material parental para mantener un espectro amplio de variabilidad
enfocado a los programas de mejoramiento, teniendo como objetivo una excelente
calidad con una resistencia que pennita la disminución de agroquímicos en el
cultivo. Es así como la manipulación biotecnológica, combinada con los programas
tradicionales de mejoramiento, ofrecen la posibilidad de resolver los problemas
que se presentan en el cultivo del ñame.
52 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIOIECNOLOOÍA
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CARACTERIZACIÓN Y DIAGNÓSTICO
DEL GÉNERO COLLETOTRICHUM
CAUSANTE DE LA ANTRACNOSIS EN
ÑAME Y OTROS CULTIVOS
Javier D. Beltrán Ph.D.

Universidad de Sucre
INTRODUCCIÓN
El diagnóstico en las enfermedades de plantas es uno de los procesos
más importantes para defInir el estado patológico, ya sea de una planta
individual o de un grupo de plantas en un cultivo. En cualquier sistema
natural o artificial, donde las plantas están involucradas en un programa
de diagnostico, es una herramienta invaluable para detectar enfermedades
en las plantas. La diagnosis es el procedimiento básico y primario para
definir las medidas de control en organismos que son sujetos de riesgo
real o potencial por patógenos.
La alteración que ha producido el hombre sobre los ecosistemas, en especial

los asociados a las actividades agropecuarias, induce la formación de
cepas actuales y nuevas de micoplasmas, virus, bacterias y hongos,
capaces de atacar y causar daños en variedades de plantas tolerantes y
resistentes, o podrían también volverse resistentes a los métodos de control
químico desarrollados por el hombre. Entonces, para prevenir la
destrucción de las plantas por patógenos, es necesario realizar una labor
permanente en el proceso de detección, aislamiento, identificación y
estudio de los ciclos de vida de estos organismos; de esta manera se
pueden tomar las medidas necesarias de control. Por otra parte, estaríamos
expuestos al desastroso efecto de los patógenos en las plantas, como
aquellos que fueron responsables de la destrucción de la papa en Irlanda,
la destrucción del olmo en Estados Unidos y la destrucción del café por
efecto de la roya en África y Suramérica.
Sin embargo, la diagnosis desempeña un papel clave en el proceso que

conlleva a controlar una situación anormal originada por organismos
capaces de producir enfermedades. Una diagnosis correcta debe ser
realizada iguiendo algunos procedimientos muy bien definidos para
hacer la correcta identificación del patógeno. En general, el proceso
diagnóstico se inicia con el acopio y presentación de las muestras, que
deben ser tomadas en las cantidades necesarias y condiciones apropiadas.
Usualmente éstas deben ir acompañadas de un formato especial en el
que se regi tre la información sobre los síntomas de la enfermedad y la
persona interesada. Estas muestras deben ser remitidas a los centros de diagnóstico
especializados disponibles en la región. Los resultados de la identificación de la
enfermedad se informarán a la persona interesada y se mantendrán en el archivo
del centro de diagnóstico y, cuando sea del caso, deberá informarse a las autoridades
sanitarias respectivas.
Con este proceso, la mayoría de las plantas son diagnosticadas apropiadamente.

En algunas ocasiones la identificación del patógeno puede demandar un trabajo
más elaborado para el experto, que requiere el uso de algunas técnicas específicas
para confirmar la identidad del patógeno. Actualmente, estas técnicas pueden ser
de dos tipos generales: clásicas y modernas.
Las técnicas clásicas usan la caracterización morfológica del patógeno. Algunas

de estas características son la forma y tamaño de la conidia, producción de
esporodoquia, tipo de apresorio, setas, rango de hospederos, patogenicidad de los
aislamientos y, menos frecuentemente, algunas características físicas como la
temperatura de crecimiento.
Las técnicas modernas permiten complementar los métodos clásicos de clasificación

de especies o subespecies de Colletotrichum spp. Estas técnicas usan componentes
muy estables de las células fungosas, como la caracterización de proteínas y ácidos
nucleicos, para los análisis de carácter bioquímico, inmunológico y molecular.
A continuación se desarrollan las acciones para la introducción de estas técnicas

clásicas y modernas en el proceso de diagnóstico o identificación de patógenos,
en particular del hongo filamentoso ascomicetes, del genero Colletotrichum y
algunos de sus más importantes representantes entre los cuales está el Colletotrichum
gloeosporioides, causante de la antracnosis del ñame.
Métodos clásicos
Características morfológicas: desde fmales del siglo XIX con la descripción de la
conidia de C. gloeosporioides por Sacardo en 1884 (Bonde et al., 1991) hasta el
presente, con la visualización y descripción de C. graminicola (Mercure et al., 1995),
la caracterización morfológica del género Colletotrichum aún continúa en uso (véase
fotografías 1 y 2).
La mayoría de estas características morfológicas no se usan solamente para clasificar

diferentes especies, sino también para diferenciar aislamientos delltro de la misma
especie, como sucedió con los aislamientos C capsici del frijol caupi (Vigna
unguiculata), frijol común (Phaseolus vulgaris) y la enredadera Betle (Piper betle).
Estos tres aislamientos o cepas fueron distinguidos con base en el análisis de
carácter cuantitativo, como largo y ancho de la conidia, largo y ancho de las setas
y la velocidad de crecimiento del micelio tal como fue reportado por Pring (1995).
Otros investigadores utilizaron en sus estudios diferentes criterios descriptivos

como la respuesta a la temperatura medida como la tasa de crecimiento de la
colonia. Este criterio fue usado para la descripción de cuatro especies de
Colletotrichum: C. fragariae, C. acutatum, C. gloeosporioides y C. demiatum. La
especie C. acutatum se puede diferenciar fácilmente porque las cepas crecen
lentamente en medio papa-dextrosa (PDA), en tanto que C. gloeosporioides y C.
fragariae crecen más rápidamente (Denoyes y Baudry, 1995). También en el trabajo
de Pring y colaboradores (1995) se usó la presencia de peritecio como un criterio
CARACTERIZACIÓN DEL GÉNERO CAUSANfE DE LAANIRACNOSIS 57
Fotografías 1 Y2. Síntomas de antracnosis en hojas de ñame.

Puntos rojizos con halo amarillo, ennegrecimiento de nervaduras,
manchas necróticas irregulares, necrosis de la hoja.
adicional para la identificación de C. gloeosporioides. Peritecio con ascas y

ascosporas es típico de Glomerela singulata, el cual es el teleomorfo de C.
gloeosporioides. También ha sido usado el tipo de apresorio defmido en su tamaño
(largo y profundidad) y su forma, para diferenciar aislamientos de c.-
gloeosporioides (Agostini et al., 1992).
Es importante resaltar que uno de los criterios morfológicos más usados ha sido la
forma de la conidia, que se ha clasificado en tres grupos generales (Denoyes y
Baudry, 1945), aunque otros investigadores, como Agostini y colaboradores (1992)
usan sólo dos de estos grupos para diferenciar especies de Colletotrichum. Los tres
grupos de conidia son:
l. Conidia cilíndrica, con ambos extremos redondeados.

2. Conidia intermedia, con un extremo en ángulo agudo y el otro redondo.
3. Conidia con ambos extremos en ángulo agudo.
Con base en este criterio se ha encontrado que la conidia cilíndrica predomina en

C. gloeosporioides, que la conidia intermedia predomina en C. fragarie y los
aislamientos de C. aculatum muestran dominancia de la conidia con extremos
agudos (Denoyes y Baudry, 1995). Respeto del carácter de tamaño del conidia, los
datos reportados han mostrado grandes diferencias, lo cual hace muy difícil usar
este criterio para aislar las diferentes cepas del hongo en diversos grupos o especies.
La patogenicidad del hongo es otro parámetro importante que se incluye en el

proceso de diagnóstico y clasificación de los aislamientos. Ésta es defmida como
la habilidad de la cepa para producir manchas necróticas en el tejido del huésped,
usando tejidos intactos o tejidos lesionados (Agostini et al., 1992; Pring et al.,
1995). Las reacciones de la enfermedad en el huésped se han usado como base para
describir las diferentes razas fisiológicas de Colletotrichum (Wasilwa el aL, 1993).
Uno de los problemas con esta técnica es la respuesta inconsistente de las
evaluaciones de virulencia en invernaderos y en campo. Ésta debido a la estación
en particular del año y a la variabilidad de otros factores adicionales como la edad
del huésped, el estado nutricional del huésped, temperatura ambiental, humedad
relativa así como la hora y método de inoculación.
El medio de cultivo: éste es muy importante, especialmente en la identificación y

comparación de los diferentes métodos y resultados reportados en varias
publicaciones. Se han divulgado diferentes tipos de medios de cultivo para
aislamiento y siembra de este género; algunos de los medios más comunes
reportados por la literatura son los siguientes:
• agar papa-dextrosa (PDA), usado por Sreennivasaprasad y colaboradores (1992),

Pain y colaboradores (1992) y Alahakoon y colaboradores (1992)
• medio de extracto de levadura usado por Guthire y colaboradores (1992)
• agar fríjol verde (GBA) usado por Walsilwa y colaboradores (1993)
• medio Mathur's (MS) reportado por Freeman y colaboradores (1993)
• medio nutritivo papa-dextrosa (PDB) usado por Liyanage y colaboradores (1992)
• medio V8 reportado por Bonde y colaboradores (1991).
En general los métodos clásicos de diagnóstico contemplan los siguientes pasos:
• Identificación del huésped del cual es obtenido el material enfermo.

• La colección del material enfermo de la planta, aislamiento y caracterización del
patógeno.
:ARACfERIZACIÓN DEL GÉNERO CAUSANIE DE LAANfRACNOSIS 59
• Identificación del tejido afectado .

• Evaluación de la infección por el sistema cruzado.
• Desarrollo del crecimiento del hongo a partir de una espora de la cepa .
• Evaluación de la patogenicidad del aislamiento en el huésped original y en los
huéspedes alternativos.
El proceso de aislamiento involucra la extracción de tejidos de las áreas infectadas.

Luego de un lavado cuidadoso con agua o esterilización superficial con cloruro de
mercurio o hipoclorito de sodio (Alahakoon et al., 1994), los tejidos son incubados
en un medio nutritivo, como PDA con o sin antibióticos, de acuerdo con el respectivo
protocolo. En la literatura se describen diferentes condiciones ambientales y de
medio aplicadas en esta etapa de incubación. Una vez se desarrollan las colonias,
se observan al microscopio para realizar la descripción morfológica del aislamiento;
ésta consiste en la descripción del crecimiento de la colonia y la caracterización de
la conidia o apresoria, en los cuales el tamaño, forma y color son parte importante
de la descripción (Agostini et al., 1992). A continuación debe hacerse el cultivo
monoconidial de las cepas aisladas de cada uno de los huéspedes, para obtener
cultivos puros que serán utilizados en las pruebas de patogenicidad. Se preparan
suspensiones conidiales para realizar la inoculación de los tejidos. Uno de los
tejidos a evaluar es aquel del cual el patógeno fue aislado, ya sean hojas o flores
(Liyanage et al., 1992).
Aunque los caracteres morfológicos son muy importantes para distinguir y clasificar
los diferentes miembros del género Colletotrichum, éstos pueden alterarse por factores
medioambientales en la expresión genética y el fenotipo del hongo, haciendo difícil
su clasificación. Por tanto, una separación e identificación confiables de algunas
especies sólo se pueden obtener con el uso de técnicas modernas o moleculares.
Técnicas modernas
Actualmente, las nuevas técnicas son parte de la solución a la confusión e incer-
tidumbre que existe alrededor de la apropiada identificación y clasificación de
algunas especies de Colletotrichum.
Técnicas bioquímicas: la electroforesis de isoenzimas ha sido utilizada para

estudios de relaciones genéticas, procesos de identificación e interelaciones entre
isoenzimas y marcadores morfológicos, tanto del patógeno (Kjellsson y Simonsen,
1994) como de la planta huésped, en el caso del ñame (Hamon y Toure, 1982). En
la actualidad esta técnica está siendo usada por los micólogos y fitopatólogos en
el proceso de colección de datos de importancia taxonómica, identificación de
cepas desconocidas del hongo, producción de huellas digitales (finger printing)
de las cepas, y determinación del rango de variación genética dentro y entre las
poblaciones del hongo (Bonde et al., 1991).
A continuación se hará una breve descripción de acuerdo con la literatura de la

técnica de electroforesis de isoenzimas de uso actual, para la caracterización del
género CollelOtrichurn.
Técnica cnzimática:
l. Inicialmente el hongo se cultiva en medio sólido de 3 a 5 días, para luego
inocularlo en medio líquido y crecerlo por 4 días a 18°C, bajo luz fluorescente
continua.
2. Se aísla el micelio del medio líquido por filtración al vacío y se conserva en

nitrógeno líquido para uso posterior en comparaciones isoenzimáticas.
3. Muestras retiradas del nitrógeno líquido son puestas en hielo y extraídas en
solución tampón.
4. Las muestras con las soluciones tampón se mezclan y centrifugan 15 minutos a
1.000 g (gravedad) en condiciones refrigeradas.
5. El sobrenadan te de cada muestra se absorbe en pequeñas piezas de papel filtro
y se utilizan en la electroforesis con geles de almidón (12%).
6. Los geles son teñidos para enzimas específIcas cuando se sumergen en la
solución apropiada de substrato y reactivos a 37°C.
7. Evaluar las cepas por lo menos dos veces para cada enzima. Incluir cepas de
referencia cuando compara diferentes especies.
En la evaluación de los resultados para la nomenclatura genética, se recomienda

seguir la propuesta por Micales y colaboradores (1986). Para los análisis de datos
se pueden usar programas de computador como "Allozyme", para determinar los
coeficientes de similaridad-CS (Bonde, el al., 1991).
Técnicas serológicas: el uso de anticuerpos policlonales y monoclonales (Mac)

para la selección e identificación de patógenos es de gran aplicabilidad porque es
una técnica muy rápida y precisa, siempre y cuando el anticuerpo específico esté
disponible (Kjellsson y Simonsen, 1994; Miller y Joaquin, 1993; Pain el al., 1992).
Se han utilizado anticuerpos monoclonales para diferenciar razas fisiológicas del
hongo de la antracnosis en fríjol (c. lindemulhianum), las cuales se consideran
capaces de interactuar con diferentes hospederos (paint el al., 1992).
El procedimiento para la obtención de los anticuerpos monoclonales se describe

a continuación:
1. Cultive las cepas de 5 a 7 días.

2. Colecte y homogenice el micelio en tampón fosfato y almacene a -40°C.
3. Tome una muestra de micelio y homogeneice de nuevo para determinar contenido
de proteína.
4. Para homogeneizar tubos germinados, una suspensión de esporas es agitada
hasta que la mitad de las conidias germinan (tubos germinativos de 20-150 J..lIIl
de largo). Colecte las esporas germinadas con filtro de nylon de 15 J..lIIl Y
resuspenda en el tampón fosfato con sucrosa. Homogeneice y determine el
contenido de proteína antes de conservar a -20°C.
5. Para el proceso de inmunización inocule intraperitonealmente un ratón hembra
con 200 JlI del homogeneizado anterior (30-50 ~g de proteína) cada dos semanas.
6. La fusión de las células del bazo del ratón con las células del mieloma produce
hibridomas que son seleccionados para la producción de anticuerpos con ELISA
indirecta en platos recubiertos con homogeneizados del micelio.
7. Las líneas celulares seleccionadas son clonadas por dilución, limitada por la clase
de inmunoglobulina y subclase seleccionada de Mac que se determina con equipo
de referencia para anticuerpos monoclonales de ratón (pain el al., 1992).
Técnicas moleculares: en la actualidad las especies de Colletotrichum se

distinguen aplicando análisis morfológicos y moleculares. Estas técnicas se han
convertido en métodos disponibles de alta sensibilidad y precisión en el proceso
de detección e identificación de patógenos, complementando así las limitaciones
de los métodos clásicos en diagnosis.
CARACTERIZACIÓN DEL GÉNERO CAUSANTE DE LAANfRACNOSIS 61
Algunas de estas técnicas -como polimorfismo por fragmentos de restricción

(RFLP), amplificación al azar del ADN polimórfico (RAPD) y reacción en cadena
de la polirnerasa (PCR)- son ahora reportadas corrientemente en la literatura
relacionada con la descripción de especies del hongo (Henson y French, 1993;
Kjellssen y Simonsen, 1994; Koufman el al., 1995; Lander y Waterman, 1995;
Mounir, 1993; Mullis el al., 1994).
Dentro del género Colletotrichum, la especie C. gloeosporioides se distingue por

ser un patógeno que presenta alta variabilidad; esto ha hecho que los expertos y
taxonomistas hallan tenido muchas dificultades en el proceso de caracterización
de las especies del grupo. Para resolver este tipo de problemas, las técnicas modernas
se han presentado como parte de su solución.
Cepas de C. gloeosporioides aisladas de naranjo dulce (Citrus cinensis) y limón

tahití (Cilrus auranlifolia), fueron caracterizadas utilizando polimorfismos del
ADN, tamaño de los minicromosomas y variaciones dentro de cada tipo (Linayage
el al., 1992). Una caracterización con minicromosoma también se realizó con otra
cepa aislada de C. gloeosporioides, la cual afecta la leguminosa forrajera tropical
Slylosanlhes guianensis (Masel el al., 1993).
Otros autores reportan el uso de RH.P en aislamientos de C. gloeosporioides obtenidos

de frutos de aguacate, mango y papaya; estos estudios han concluido que las cepas
aisladas no tienen el mismo ADN ribosómico (ADNr) o mitocondrial (ADNmt).
Adicionalmente, variantes del mismo hongo han sido distinguidos y caracterizados
con la combinación de las técnicas de PCR y RAPD (Alahak:oon el al., 1992).
Descripción de las técnicas moleculares: las técnicas moleculares basadas en el

análisis del ADN se fundamentan en el hecho de que las variaciones en las secuencias
del ADN son independientes de la expresión genética. En el género Colletotrichum,
el ADN es extraído de cepas obtenidas de tejido enfermo yen diferentes ambientes
(porteus el al., 1994). Para caracterizar las cepas se pueden usar diferentes tipos de
ADN: ADN genómico, ADN mitocondrial y ADN ribosómico (Alahak:oon el al.,
1992, 1994; Guthrie el al., 1992; Correl el al., 1993; Linayaje el al.,1992;
Sreenivasaprasad el al., 1992, 1994).
El análisis molecular busca marcadores genéticos (polimorfismos) o RFLP que

permitan diferenciar las cepas aisladas. Estos polimorfismos son clasificados de
acuerdo con Guthrie y colaboradores (1992) en tres tipos característicos:
l. Longitud del fragmento

2. Presencia o ausencia de bandas, y
3. Intensidad de la banda.
El método general se describe brevemente a continuación:
Extracción del ADN genómico del micelio crecido en medio líquido (Roeder
y Broda, 1985).
Los ADN ribosómico y mitocondrial son aislados del ADN total por cen-
trifugación fraccionada en cloruro de cesio (Alahak:oon el al., 1994).
La digestión del ADN se hace por enzimas de restricción y los fragmentos
son separados en geles de agarosa con pesos moleculares de referencia.
Los fragmentos separados son transferidos a una membrana de nylon para
proceder con la hibridación (de ADN: Southern; o de ARN: Northern) usando
las diferentes sondas disponibles. Generalmente estas sondas son clonadas
en plasmidos que contienen diferentes fragmentos de ADN como unidades
repetitivas del ADN ribosomal o genes de Neurospora crassa, como el de la

antranilata sintetasa, glutamato deshidrogenasa, histidinil de hidrogenasa,
13-tubulina(Linayaje el al., 1992); también unidades repetitivas del ADN
ribosomal del Saccharomyces carlsbergensis, minisatélites humanos,
sondas sintéticas de oligonucleótidos-CAT (Correl el al.,1993; Cisar el
al., 1994) y el GcpRl, elemento repetitivo del ADN de C. lindemulhianum
(Freeman el al., 1993).
Finalmente, los patrones de hibridación son analizados para reconocer la
presencia de polimorfismos y, en consecuencia, para defmir las diferencias
entre las cepas aisladas.
Las técnicas de RFLP, RAPD o PCR están basadas en el ADN como una molécula
muy estable no influenciada directamente por el medio ambiente, como sí ocurre
con los caracteres de tipo morfológico. Cepas de C. gloeosporioides han sido
diferenciadas usando esta técnica por Liyanaje y colaboradores (1992); igualmente,
cepas de C. orbiculare han sido caracterizadas por Correll y colaboradores (1993).
El método de PCR involucra la desnaturalización del ADN a trabajar, seguido por

el alineamiento de cadenas cortas de oligonucleótidos (cebadores), los cuales son
complementarios al ADN bordeando la región que se va a amplificar. El ADN
molde con el cebador es extendido usando una ADN-polirnerasa (Tag) termoestable.
Se realizan ciclos repetitivos por desnaturalización con calor, alineamiento de
cebadores y extensión del ADN, resultando un incremento exponencial en el ADN
a amplificar (Lander y Waterman, 1995).
Es muy importante tener en cuenta que el ADN-polimerasa puede cometer errores

a una muy baja tasa pero fmita durante la amplificación con PCR. Los errores
producidos por la ADN-polimerasa (Tag) son básicamente sustituciones de bases
individuales. La tasa de error puede ser más alta que 10.3 y menor que 10-6; esto
depende de las condiciones de reacción. Otras enzimas con capacidad de
autoedición, tales como la polimerasa Vent, reporta que genera errores con mucho
menor frecuencia (Mullis el al., 1994).
En la amplificación con PCR en Colletotrichum se usan diferentes tipos de

amplificaciones. Una de éstas es descrita como amplificación al azar, por el uso de
cebadores al azar (Rapas) para la selección de variantes genéticos de C.
gloeosporioides (Alakahoon el al., 1992). Otros autores como Freeman y
colaboradores (1993) reportan cebadores arbitrarios en PCR como un método
confiable para la diferenciación entre cepas aisladas de 10 especies diferentes de
Colletotrichum. Milis y colaboradores (1992) reportan el uso de cebadores
específicos, los cuales son nombrados como espaciadores internamente transcritos
o regiones ITS del ADN ribosomal de C. gloeosporioides.
Es muy importante reconocer que otros investigadores usan diferentes condiciones

para el PCR, ya que existen reportes en los cuales se describen distintos tiempos y
temperaturas para el proceso de desnaturalización-alineamiento-polimerización.
Para el tratamiento de desnaturalización del ADN se reportan tiempos tan largos
como 5 minutos a 9SOC(porteus el al., 1994; Freeman el al., 1993) o periodos más
cortos como 2 minutos a 85°C (Correll el al., 1993). Otros autores como Milis y
colaboradores (1992) usan diferentes condiciones dependiendo del tipo de
cebadores; para cebadores dirigidos usan un número menor de ciclos (30) y para
cebadores al azar utilizan un número mayor de ciclos (45).
CARACTERIZACIÓN DEL GÉNERO CAUSANfE DE LAAN1RACNOSIS 63
Conclusiones
La caracterización morfológica de las cepas aisladas de Colletotrichum es todavía
una metodología muy importante. Actualmente ésta se usa en combinación con
nuevas tecnologías y equipos como microscopia electrónica para aumentar
considerablemente la resolución y descripción de este hongo patógeno.
La variabilidad fenotípica de isoenzimas puede ser considerada como un sistema

de diagnóstico barato, rápido y preciso, y con menor sensibilidad que la evaluación
isoinmunológica, pero con un costo y capacidad similares. Estos métodos permiten
la evaluación de más de 200 muestras o especies individuales por día.
Los métodos moleculares son en defmitiva unas de las tecnologías más confiables
para el diagnóstico. Estos métodos permiten el análisis directo del material genético,
en contraste con los métodos inmunológicos, isoenzimas o marcadores
morfológicos, los cuales sólo analizan productos del material genético.
En el futuro cercano y lejano, los resultados de la presente era de oro de la

investigación molecular nos conducirán a incrementar la sensibilidad, sofisticación
y precisión de los sistemas actuales de diagnóstico y caracterización de especies.
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LA ANTRACNOSIS, ENFERMEDAD
LIMITANTE DEL CULTIVO DEL ÑAME
Rodrigo Orlando Campo Arana

Ing. Agrónomo. MSc.
Facultad de Ciencias Agricolas,
Departamento de Agronomía Universidad de Córdoba.
El ñame, el cual es afectado por varias enfermedades de origen fungoso,

presenta a la antracnosis como la más limitante para los rendimientos y
la calidad del tubérculo. Las variedades de ñame que se cultivan en la
Costa Atlántica colombiana pertenecen a las especies Dioscorea alata
(conocidas como ñames criollos) y D. rotundata (conocidas como ñame
espino), siendo la primera una de las más cultivadas y susceptibles a la
antracnosis (Campo y Luna, 1988).
La antracnosis
En la Costa Atlántica colombiana, la antracnosis del ñame es una enfermedad
endémica. En algunas variedades criollas de D. alata se presenta una alta
susceptibilidad; los rendimientos se reducen en más 00150% si no se estable-
cen medidas efIcaces de manejo de la antracnosis (Campo y Luna, 1988).
La antracnosis del ñame es llamada por los agricultores mancha de hierro

o quemazón. A pesar de que inicialmente se reportó como enfermedad sin
importancia económica, año tras año se ha ido dispersando en las diferentes
zonas ñameras, al punto que en 1989 se presentó en forma epidémica en
el genotipo criollo "concha de coco", arrasando más del 80% de las áreas
sembradas. Esto ocasionó que para 1990 se redujera el área de siembra de
20.100 a 4.547 hectáreas con la consiguiente quiebra de más de 5.000
familias productoras de ñame, en los departamentos de Córdoba, Sucre y
Bolívar (Negrete y Redondo, 1997).
Etiología
La antracnosis es causada por el hongo Colletotrichum gloeosporiodes

Penz., perteneciente a la clase Deuteromicetes, orden melacolaniales,
familia melanconiaceae; produce conidios incoloros unicelulares en forma
de bala; los acérvulos son subepidérmicos en forma de disco de color
oscuro y presentan septas oscuras. Los acérvulos emergen a través de la
superficie; los conidióforos son cortos y erectos (Laberry y Lozano, 1988).
68 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIOTECNOLOGÍA
Sintomatología
La enfermedad se puede presentar en hojas, peciolos y/o tallos. Inicialmente, las hojas
afectadas presentan en el haz puntos rojizos de apariencia hendida con halo amarillo;
en el envés se observa ennegrecimiento de las nervaduras. Luego las lesiones crecen en
forma irregular y se unen entre sí ocasionando finalmente necrosis en la hoja. Otro
sÚltoma de la enfermedad es el ennegrecimiento y muerte apical de los tallos,
ocasionando la muerte descendente de la planta. En algunos casos ocurre necrosis en
el peciolo, lo cual produce defoliación de la planta (Negrete y Redondo, 1997).
Epifitiología
La germinación, el crecimiento y la penetración del hongo se ven favorecidos por la

alta humedad relativa y temperaturas, 80°C y 28°C, respectivamente. Para causar la
enfermedad, el hongo sólo requiere humedad superficial en los tejidos para
colonizarlos. Los conidios son liberados cuando los acérvulos se encuentran húmedos
y son dispersados por el agua, el aire o por insectos, entre otros medios de transmisión.
Se ha observado que periodos esporádicos de lluviasjunto a las altas temperaturas

son suficientes para que ocurra la antracnosis en la región ñamera de la Costa
Atlántica. En el departamento de Córdoba, los primeros sÚltomas de la enfermedad
se manifiestan a partir del mes de junio. La máxima severidad se presenta entre los
meses de agosto a octubre, época en la cual el tubérculo está en pleno desarrollo y
requiere alta sanidad del follaje para un adecuado suministro de carbohidratos al
rizoma, causando grandes epifitias en genotipos susceptibles.
Una vez terminado el ciclo vegetativo del cultivo, el hongo ivema sobre restos de la
vegetación en forma de conidios, o en el suelo en forma de esclerocios, lo cual hace
difícil el manejo de la enfermedad, teniendo en cuenta que el agricultor ñamero no hace
una rotación adecuada de los suelos (Nwankiti y Ene, 1984; Negrete y Redondo, 1997).
Manejo de la antracnosis
Se han realizado trabajos encaminados al manejo de la antracnosis a través de
métodos químicos y de resistencia genética. El primero, a pesar de ser efectivo, no
ha tenido aceptación entre los agricultores, quienes prefieren usar genotipos con
resistencia a la enfermedad. Indudablemente el manejo debe ser integrado, teniendo
como base la epifitiología de la enfermedad.
Resistencia genética
Algunos agricultores siembran genotipos de ñame resistentes o tolerantes a la

antracnosis, como el espino (D. roturuiata) que evita la enfermedad. Sin embargo, esta
especie es muy delicada ya que las heridas ocurridas en los tubérculos al momento de
la cosecha, le ocasionan pérdidas significativas durante el almacenamiento, momento
en el cual se pudren. En países como Nigeria, Guyana, Costa Rica y Colombia, se
trabaja evaluando la resistencia a la antracnosis a partir de los materiales depositados
en bancos de germoplasma. Las evaluaciones se realizan en condiciones de campo, en
lotes donde la enfermedad se manifiesta en forma endémica; de esta manera se
seleccionan los genotipos con resistencia a la enfermedad (Minucci et al., 1988).
Desde 1996, investigadores de la Universidad de Córdoba han trabajado en la

identificación de genotipos de ñame con resistencia y/o tolerancia a la antracnosis.
Desde 1998 se viene evaluando la accesión 070, llamada comercialmente Diamante
LAANfRACNOSIS, ENFERMEDAD LIMITANfE DEL CULTIVO DE ÑAME 69
22, la cual posee excelentes características tanto para el mercado nacional como el
internacional (Campo y Luna, 1988).
Selección de genotipos resistentes
La selección de genotipos resistentes bajo condiciones naturales de campo,

requiere varios años de evaluación en los diferentes ambientes, para evitar escapes
de la infección. Desde hace aproximadamente 10 años, se tiene en Las Guyanas
el programa de evaluación de la resistencia del banco de germoplasma a la
antracnosis, en el que se han obtenido varios materiales promisorios; trabajos
similares se están adelantando en Colombia por parte del ICA, Corpoica y la
Universidad de Córdoba (Morales y Saumeth, 1993).
La selección de genotipos resistentes bajo condiciones de campo es muy valiosa y

bastante compleja, si se tiene en cuenta que el hongo CollelOlrichum sp. tiene la
capacidad de producir razas con diferentes grados de virulencia. Luego, un genotipo
que sea resistente en una región, puede ser susceptible en otra. La forma más segura
de escoger genotipos con resistencia a la enfermedad es a través de inoculaciones
artificiales en invernadero (Degras el al., 1984; Minucci el al., 1985; Nwankiti el
al., 1987; Nwankiti y Ene, 1984).
Manejo integrado
El manejo de la enfermedad en genotipos susceptibles se debe hacer teniendo
como base la epifitiología de la enfermedad; se destacan los siguientes aspectos:
• El patógeno es severo en la época lluviosa

• La planta es más susceptible a partir de los tres meses de edad, que corresponde
al inicio de la tuberización, y
• El ciclo de formación del tubérculo fmaliza aproximadamente a los seis meses.
Con estos criterios se recomienda el siguiente manejo (Morales y Swmeth, 1993;Osorio

y Ramírez, 1989; Minucci el al., 1988; Negrete y Redondo, 1997; Osario, 1989):
l. Antes de la siembra se debe tratar la semilla mediante inmersión durante 5

minutos con la mezcla del fungicida Mancozeb 6g/l con el insecticida malathion
l.5g/1.
2. Sembrar el ñame en lugares altos, en zonas no inundables.
3. Fertilizar de acuerdo con el análisis del suelo, 45 días después de la siembra.
4. Inspeccionar el cultivo constantemente con el fm de detectar los primeros
síntomas de la enfermedad.
5. Iniciar aplicaciones de fungicidas cuando la incidencia de la enfermedad esté
presente en el 50% del cultivo y la severidad promedia alcance un 10% del área
total necrosada. Las aspersiones deben iniciarse con un producto sistémico a
base de benomyl y alternarlo 3 semanas después con un ditiocarbamato, a base
de mancozeb.
6. Las aplicaciones deben realizarse solamente durante los primeros 6 meses del
cultivo, ya que después de esa edad el tubérculo ha alcanzado su desarrollo.
70 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIOTECNOLOOÍA
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en la región Caribe colombiana. Rev. ICA Informa. 23(1): 13-19.
ALGUNOS VIRUS
VEGETALES Y DEL ÑAME
Mónica Guzmán Barney M.Sc, Ph.D.

Profesora Asociada, Instituto de Biotecnología
Marta Fontanilla, Ph.D.

Profesora Asistente, Instituto de Biotecnología
Aspectos generales de los virus

Reseña histórica
El origen de los virus es desconocido, aunque probablemente ocurrió

en tiempos remotos. En el siglo XIX, se hizo evidente que los agentes
causantes de ciertas enfermedades infecciosas no se podían ver con el
microscopio de luz, ni podían ser cultivados en los medios que se
usaban para crecer bacterias. Trabajos separados realizados en la última
década del siglo XIX permitieron las primeras observaciones de estos
agentes. En 1886, Adolfo Mayer por vez primera indujo la enfermedad
del mosaico del tabaco en plantas sanas, usando extractos vegetales
hervidos obtenidos de plantas con síntomas, aunque existen registros
del siglo XVIII que indican la existencia de partículas indetectables,
asociadas con enfermedades de los tulipanes (Gibbs y Harrison, 1976).
En 1892, Dimitri Iwanowski reportó que el agente etiológico del
mosaico del tabaco no era retenido por filtros usados en la época para
aislar bacterias (Gibbs y Harrison, 1976); sin embargo, este investigador
atribuyó sus observaciones a fallas propias del filtro empleado. Fue
Martinus Beijerinck en 1898 quien afirmó que las partículas
infecciosas no filtrables causantes del mosaico del tabaco eran
novedosas (Gibbs y Harrison, 1976); por esta razón él es considerado
el padre de la virología. Beijerinck denominó a la partícula nueva
contagium vivumfluidum debido a su no f1ltrabilidad.
En la misma época, agentes infecciosos similares fueron asociados con

la enfermedad de los pies y boca del ganado, y la fiebre amarilla de los
humanos. Entonces, el término virus remplazó la denominación de
Beijerinck de estas partículas no vivientes, no observables y no filtrables.
En la segunda década del siglo XX se aislaron virus transmisibles de
cultivos bacterianos lisados, y con ellos se establecieron tres grupos de
agentes dependiendo del huésped: animales, vegetales y bacterianos.
La información recogida en los años siguientes indicando la habilidad
de los virus para pasar a través de algunas pero no todas las membranas
de colodión, su velocidad de sedimentación y la observación directa de
72 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BICJIECNOLOGÍA
los mismos con el microscopio electr6nico permiti6 confirmar su reducido tamaño.

Observaciones posteriores señalaron que los virus estaban conformados
principalmente por ácidos nucleicos y proteínas. La primera forma cristalina de un
virus, el del mosaico del tabaco, fue obtenida en 1935 ya éste le siguieron otros
virus de plantas. S610 a partir de 1955 pudo ser aislado el primer virus humano
causante de la poliomielitis (Gibbs y Harrison, 1976).
En los últimos 40 años, el ,desarrollo de la biología molecular ha contribuido

grandemente a esclarecer aspectos relacionados con la estructura y replicaci6n de
los virus. El entendimiento de las interacciones virus-hospedero, los mecanismos
usados por estas partículas infecciosas para establecerse en su huésped y las estrategias
empleadas por los virus para evadir los mecanismos de defensa del organismo atacado,
son campos explorados ampliamente por los vir610gos. Ante tan exitosos enemigos
de las diferentes formas vivientes, la tendencia actual es aumentar el conocimiento
que se tiene de ellos; ésta es la razón de existir de este capítulo.
N aturaleza de los virus
Los virus son partículas constituidas por ácido nucleico y proteínas, que requieren
de los ribosomas, de ARN de transferencia (ARNt), de enzimas y de factores de la
célula hospedera para la síntesis de proteínas virales y para su reproducci6n; sin
embargo, los virus poseen la replicasa, enzima que les permite replicar su material
genético. El ácido nucleico conforma el genoma y es el responsable de la infectividad
de los virus, ya que contiene la informaci6n necesaria para asegurar su replicaci6n.
De hecho, la inoculaci6n de ácido nudeico viral en células sanas induce la síntesis
del genoma y de proteínas virales. Las proteínas se asocian con el genoma para
formar una capa protectora denominada cápside; adicionalmente, glicoproteínas
pueden encontrarse formando la envoltura de algunos virus (Matthews, 1991). Las
proteínas suelen ser los constituyentes más abundantes de los virus y pueden
encontrarse formando parte de la estructura viral, como proteínas estructurales o
como proteínas no estructurales, las cuales pueden presentarse en forma nativa,
glicosiladas o asociadas con Iípidos. El genoma viral está conformado por ácidos
nucleicos, ADN o ARN, de cadena doble o sencilla (Burrows, 1973), circulares o
lineares, con polaridad positiva o negativa (Matthews, 1991; Joldik, 1997). La
estructura compuesta por el genoma y la cápside es denominada nucleocápside. Los
genomas virales pueden ser simples o complejos, ya que hay virus que poseen s610
4 genes mientras que otros pueden tener hasta 250, como el caso de algunos virus
animales de la familia Poxviridae (Brooks el al., 1995). El producto fmal de la
multiplicaci6n viral se denomina viri6n o partícula viral infecciosa (Matthews, 1982).
La característica principal de la cápside es que está compuesta por subunidades

repetidas arregladas en patrones defmidos y precisos. Las subunidades más simples
están conformadas por una sola molécula de proteína, generalmente la misma, y las
complejas, por varias moléculas de proteínas que pueden ser idénticas o diferentes.
Las subunidades complejas se conocen con el nombre de caps6meros y pueden ser
visualizadas con el microscopio electr6nico. Las proteínas de la cápside muestran
una tendencia fuerte a la asociaci6n, y mucha de la informaci6n que determina su
forma e tá contenida en la secuencia de los aminoácidos que la conforman (Gibbs y
Harrison, 1976). En general, las proteínas de la cápside viral son altamente
antigénicas, lo que ha permitido la obtenci6n de diversos anticuerpos (Hampton el
al., 1990).
El tamai'ío de los virus e muy pequei'ío;por tanto, su visualizaci6n con el microscopio

de luz e impo iblc. Sin embargo, en algunos casos es posible observar con esta
ALGUNOS VIRUSVEGETALES Y DEL ÑAME 73
microscopía inclusiones citoplasmáticas (Cn de agregados proteicos, características

del agente viral causante de la infección. Lo que se sabe acerca de la morfología de
los virus ha sido determinado usando el microscopio electrónico. Las observaciones
realizadas han permitido establecer que los tamaños de las partículas virales oscilan
entre 10 a 2.000 nm con una morfología variada. Actualmente se sabe que el arreglo
de la(s) proteÚla(s) que recubre(n) al ácido nucleico viral determina la diversidad de
formas (cúbicas, esféricas, icosaédricas, pentagonales, filamentosas, bacilares y
cilÚldricas) observadas en los virus (Gibbs, 1976; Matthews, 1991).
Muchas características comunes han sido reconocidas en virus animales, vegetales

y humanos. La mayoría del trabajo morfológico se ha realizado con virus vegetales
mientras que el trabajo genético, de biología molecular y bioquímico, se ha
adelantado principalmente en virus bacterianos y humanos.
Característícas de los vírus vegetales
Hasta el año de 1968 el ácido nucleico encontrado en los virus vegetales estudiados
era de ARN; sin embargo, en este mismo año se describió que el virus del mosaico del
coliflor (CaMV) poseía una cadena doble de ADN (Gibbs y Harrison, 1976; Franck el
al., 1980). En el momento se conocen varios ejemplos de virus de cadena doble de
ARN o ADN. Un porcentaje alto de los virus vegetales de ARN poseen una cadena
sencilla positiva que puede ser reconocida por los ribosomas y ser traducida a proteÚlas.
De otra parte, algunos de los virus que afectan cultivos de importancia económica
poseen cadenas sencillas de ARN negativo, es decir, ARN con sentido contrario al ARN
mensajero que debe ser transcrito a otra hebra de ARN complementaria antes de poder
ser reconocido por los ribosomas. Dentro de los virus vegetales también es posible
encontrar genomas de ADN unicatenarios (Gibbs y Harrison, 1976; Matthews, 1991).
La gran mayoría de los virus vegetales posee genomas pequeños entre 5 kb Y 20

kb, que codifican entre cuatro y 17 proteínas, las que a su vez actúan en las diversas
etapas del ciclo invasivo. Algunas participan en la replicación del ácido nucleico
viral, otras en el transporte viral y otras en la adaptación de la partícula invasiva a
la planta hospedera. Comparativamente, el porcentaje de ácidos nucleicos es menor
que el de proteínas, es decir, entre el 5 y el 45% del virus vegetal está constituido
por ácido nucleico (Gibbs y Harrison, 1976).
La cápside de los virus vegetales puede ser cilÚldrica, esférica o ftlamentosa y estar
compuesta por cap ómeros constituidos por un solo tipo o varios tipos de proteÚlas
(Gibbs y Harrison, 1976; Matthews, 1991). Las partículas virales más complejas
contienen más de un polipéptido en la cápside, como es el caso del virus del enanismo
amarillo de la papa que posee cuatro tipos de polipéptidos (Gibb el al., 1976). Los
polipétidos de los virus complejos pueden estar glicosilados y/o asociados con lípidos.
Las proteínas de la cápside cumplen funciones importantes para la supervivencia

viral; se encargan de proteger al ácido nucleico durante el proceso de desplazamiento
del virus de una célula a otra, y de una planta a otra, a través de vectores específicos
(MatU1ews, 1991; Atreya el al., 1990). Por ejemplo, las proteínas de la cápside
determinan la especificidad del vector, como en el caso del virus del moteado de la
vena del tabaco en que el cambio de un aminoácido de la proteÚla de la cubierta del
virus elimina su Leanmisibilidad por áfidos (Atreya el al., 1990); este hallazgo
también ha sido informado para el virus de la tristeza de los cítricos (crV) (Cambra
el al., 1993; Mawassi el al., 1993; Guzmán-Bamey, 1998). Es entonces importante
anotar que un virus descubierto (sin proteínas de la cápside) no es funcionalmente
infectivo y requiere, además de la proteÚla de la cápside, otras proteínas relacionadas
74 ÑAME: PRODUCCIÚN DE SEMilLAS POR BIarECNOLOOÍA
con el movimiento viral de célula a célula, vía plasmodesmos, o para el movimiento

de larga distancia a través de los vasos conductores (Gibbs y Harrison, 1976).
Aunque los virus vegetales comparten características con los virus que infectan
otros reinos, existen diferencias en su modo de acción. Una de ellas es que los virus
vegetales sólo infectan las plantas a través de heridas debido a que las plantas
poseen una pared celular impermeable a los virus (Gibbs y Harrison, 1976; Torres,
1997). Contrariamente, los virus de mamíferos pueden infectar las células de un
animal o de un ser humano que no esté herido y propiciar una infección sistémica
(Joklik, 1997). Como las plantas están desprovistas de anticuerpos o células del
sistema inmune que neutralicen y clarifiquen al agente infeccioso, una vez se
infectan con virus, permanecen con éstos por siempre. Ésta es la razón por la cual
algunas medidas importantes de control de las infecciones virales en los cultivos
son la destrucción de todas las plantas que presenten síntomas y la propagación
vegetativa de material libre de virus. Otros métodos de control pueden ser: establecer
mecanismos de protección cruzada (en el cual cepas virales suaves pueden proteger
de cepas más severas) o utilización de plantas híbridas resistentes a la infección
viral (Broadbent et al., 1991). Los virus pueden invadir todos los tejidos de las
plantas hospederas con excepción, de los tejidos meristemáticos y de los brotes
apicales. De allí, que la obtención de microplántulas a partir de tejido meristemático
sea un procedimiento efectivo para la propagación de material sano (Gibbs y
Harrison, 1976; Torres, 1997; Matthews, 1982; Mantell et al., 1980).
Diseminación de los virus vegetales
Los virus pueden llegar a limitar la producción de un cultivo y ocasionar daños

enormes a la cosecha y pérdidas significativas para los cultivadores. El
mecanismo de transmisión natural es la infección a través de vectores que inyectan
el virus directamente en el floema de la planta. Existe un rango amplio de vectores
que cubre áfidos, grillos, moscas, piojos, mariposas, hongos, nemátodos,
cochinillas, etc. Es interesante anotar que, a pesar de este amplio espectro, los
vectores que transmiten un tipo particular de virus por lo general están
taxonómicamente relacionados (Gibbs, 1976). Además, en la transmisión natural
otro agente propagador de la infección viral es el hombre, quien al utilizar
herramientas contaminadas (transmisión mecánica), realizar injertos con yemas
o tubérculos infectados, o al inocular los virus con [mes investigativos puede
contribuir con la dispersión viral (Roistacher, 1991; Gottwald, 1993).
La rapidez y el modelo de diseminación de un virus dependen de la relación

virus-vector, los tipos de vector, el huésped, la edad del cultivo, cultivos
asociados, clima, etc. De hecho, el tipo de vector puede predecirse determinando
el patrón de expansión del virus y los huéspedes preferenciales (Gibbs y Harrison,
1976). Usualmente, el vector de transmisión de un virus es identificado cuando
se correlaciona la diseminación del virus con la presencia y actividad de los
posibles vectores presentes en la zona, y luego usando el vector más probable en
experimentos de transmisión. Es importante conocer los vectores de transmisión
de un virus, ya que una medida eficaz de control es atacarlos.
Además del aspecto anterior, es necesario considerar el movimiento y dispersión

del virus dentro de la planta una vez ésta ha sido infectada. Para que el virus pueda
infectar y perpetuarse, debe moverse dentro de la planta usando para ello rutas
propias que la planta emplea en el transporte de las macromoléculas requeridas
para su funcionamiento y subsistencia (Harrison et al., 1971). Adicionalmente, los
virus requieren una proteína víral denominada de movimiento (MP) para pasar de
ALGUNOS VIRUS VEGETALES Y DEL ÑAME 75
una célula a otra (Zaitlin el al., 1973). Las tres etapas del movimiento de un virus
en un sistema vegetal se enuncian a continuación:
a. Movimiento intracelular: el transporte intracelular del genoma viral que se

replica en el citoplasma es facilitado por las MP y las microfibrillas del
citoesqueleto celular (Shaw el al., 1986).
b. Movimiento intercelular: este movimiento, ocurre a través de puentes
protoplasmáticos o plasmodesmos, complejos estructurales que establecen la
continuidad citoplasmátiéa entre las células vecinas. El proceso de
desplazamiento a través del plasmodesmo no es pasivo, puesto que estas
estructuras seleccionan las macromoléculas transportadas. Un ejemplo
interesante del enunciado anterior es el hecho de que los ribosomas no se mueven
dentro del plasmodesmo, pero virus isométricos del mismo tamaño sí (Carríngton
el al., 1996; Citovski el al., 1981). El transporte a través del plasmodesmo
requiere energía, como lo demuestra el hecho de este proceso en el virus del
mosaico del tabaco (TMV) y el virus de la mancha en anillo de los cítricos es
dependiente de GTP (Zaitlin el al., 1987).
c. Movimiento de larga distancia: una vez el virus abandona el sitio de entrada
a la planta, el plasmodesmo provee la conectividad entre las células epidermales
y mesófilas y las células parenquimatosas asociadas al sistema vascular (Zaitlin
el al., 1973). En el floema, el virus se desplaza rápidamente haciéndose más
fácil este desplazamiento hacia las regiones apicales y los puntos de utilización
de nutrientes, como los tubérculos y rizomas (Gunning el al., 1983).
Algunos conceptos de susceptibilidad, tolerancia y

resistencia del huésped
La constitución genética o genotipo de la planta es el determinante principal en los

eventos infecciosos del virus. Términos como susceptibilidad, tolerancia y resistencia
se usan para describir la expresión del genotipo de una planta. Se considera que la
susceptibilidad opera en tres niveles: i) infección subliminal, en la que el virus es
capaz de replicarse en las células infectadas inicialmente, pero no es capaz de diseminarse
a las células adyacentes; ii) susceptibilidad limitada, en la que el hospedero limita el
virus a células cercanas al punto de entrada causando la muerte de las células en el sitio
de infección. Esta reacción se conoce como respuesta de hipersensibilidad (HR) de la
planta y se manifiesta como lesiones necróticas pequeñas (Aor, 1956). Las reacciones
HR pueden ser fenotipícamente diversas, variando desde una sola área pequeña de
necrosis hasta áreas grandes que pueden expandirse (Keen, 1990); iii) susceptibilidad
total, caracterizada por la infección de la mayoría de las células de la planta.
Otras interacciones planta-patógeno llevan a la respuesta del hospedero, conocida

como tolerancia. Este término se usa para describir la respuesta de la planta que
resulta en la inexistencia de síntomas como producto de la infección, a pesar de que
el virus logra alcanzar títulos importantes dentro de la planta (Staskawicz, 1995;
Agrios, 1998). La tolerancia se presenta en la ausencia de la resistencia gen-por-gen
y su tendencia es a ser efectiva en un amplio rango de cepas patógenas (Fraser, 1990).
De otra parte, la resistencia se refiere a la presencia de genes específicos en la planta
que impiden la replicación viral (Mattbews, 1991; Fang el al., 1998). Estos genes
actúan cuando determinados patógenos, al interactuar con el huésped, inducen en
éste una respuesta de defensa. Si no hay reconocimiento del patógeno por el huésped
debido a la falta de genes de resistencia en la planta o a la falta de genes de avirulencia
en el patógeno, la respuesta de resistencia no es inducida y la infección se establece
como enfermedad (Li el al., 1996; Baso el al., 1993).
76 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMllLAS POR BIarECNOLOGÍA
Efectos de los virus en las plantas
Existen estudios que indican los efectos de los virus en la respiración, fotosíntesis y
producción de metabolitos secundarios de la planta. Es reconocido que la infección
viral desata una cascada de eventos, algunos de los cuales se describen a continuación.
a. Fotosíntesis y cloroplastos: uno de los efectos principales de la infección viral

es la supresión de la síntesis de ARN ribosomal en los cloroplastos (Mussel,
1996; Cooper el al., 1983). Los síntomas descritos como clorosis,
amarillamientos, bandearnientos, mosaicos, son todos atribuibles a deficiencias
de los cloroplastos; sin embargo, no existe evidencia que señale a los cloroplastos
como el sitio principal de replicación de los virus (Lee et al., 1996).
h Citopatología: las alteraciones celulares más notables observadas después de

que ocurre la infección especialmente con virus filamentosos, son acumulaciones
en el citoplasma de proteínas inducidas. Estas inclusiones cilíndricas (Cl) son
estructuras complejas tridimensionales que se forman en el citoplasma de las
células infectadas.
Sintomas producidos por los virus
El término síntoma se define como la variación macroscópica y/o microscópica

(forma, color, tamaño, etc.) manifiesta en la planta como consecuencia de acciones
patogénicas, deficiencia de nutrientes, condiciones ambientales adversas, etc. Los
íntomas más evidentes producidos por los virus son los que se observan en las
hojas, aunque algunos virus pueden causar también síntomas en tallo, frutos, raíces
y otras partes de la planta. Además, un síntoma común causado por los virus es la
reducción de la tasa de desarrollo, manifestada a través de grados de achaparrarniento
o enanismo. Además, casi todas las enfermedades virosas causan reducciones en los
rendimientos totales. Los efectos pueden ser severos y fácilmente perceptibles, o
pueden ser insignificantes y pasar desapercibidos. En casi todas las enfermedades
virosas que ocurren en el campo, el virus está presente en toda la planta (infección
sistémica). Otros virus pueden causar pequeñas lesiones necróticas o cloróticas en el
punto de infección (infección local). Muchos virus pueden infectar ciertos hospederos
sin causar el desarrollo de síntomas evidentes, denominándose al virus como latente
y al hospedero como asintomático. Los síntomas después de la infección pueden ser
muy severos hasta conllevar la muerte de la planta (Jayasinghe y Salazar, 1993).
Los síntomas producidos en plantas por infección viral se pueden dividir en:
a Síntomas locales: lesiones isométricas que se pueden contar, dentro de las que
se encuentran las manchas cloróticas, puntos cloróticos, anillos cloróticos,
manchas necróticas, puntos necróticos y anillos necróticos.
b. Síntomas sistémicos: en los que se pueden encontrar las manifestaciones en mosaico
o alternancia de áreas verdes normales con áreas cloróticas. Esta alternancia es
irregular y no sigue un patrón; algunas veces comienza con aclaramiento de
nervaduras. Dentro de los síntomas de mosaico se puede hablar de moteado,
estrías cloróticas, bandeamiento de nervaduras. Otra manifestación sistémica es el
amarillarniento o clorosis parcial o generalizada. En este tipo de amarillamiento
se puede hablar de clorosis, clorosis intervenal, amarillamiento de nervaduras,
etc. La tercera manifestación sistémica es la necrosis, que puede presentarse más
comúnmente en los extremos apicales, o en hojas y/o tallo, o en forma de anillos.
c. Síntomas que conllevan anormalidades del crecimiento: pueden manifestarse
en algunos órganos, como encrespamiento, rugosidad o en sectores de la planta,
hasta la situación generalizada en la cual se puede observar un claro enanismo

de la misma (Jayasinghe y Salazar, 1993)
Respuesta de la planta hospedera
a. Reacción de hipersensibilidad (HR): como se mencionó anteriormente, las

plantas exhiben la HR como una forma de resistencia que muy frecuentemente da
como resultado lesiones necróticas locales en los sitios primarios de infección.
Los virus se restringen a la lesión necrótica y a unas pocas capas de células que
limitan con los bordes de la lesión. El número de lesiones puede ser directamente
proporcional a la concentración viral (Hirai el al., 1969). La resistencia inducida
por la HR previene la infección cuando ocurre una segunda exposición con el
mismo virus o uno diferente, debido a que lesiones nuevas no pueden desarrollarse
en o cerca de las lesiones viejas (Mohamed el al., 1972). Dependiendo de la cepa
viral, la HR de la planta puede desencadenar la expresión de toxinas que se
difunden a diferentes órganos de la misma, causando su marchitamiento o
declinamiento (Ben-ze'ev el al.,1988).
h Resistencia sistémica adquirida (SAR): esta resistencia es una ruta de traducción

de señales que desempeña un papel importante en la habilidad de defensa de la
planta contra patógenos. Después de la formación de una lesión necrótica, ya sea
como parte de una HR o como síntoma de una enfermedad, la ruta SAR se activa
posibilitando la síntesis de una proteína denominada proteína relacionada con el
patógeno (PR). Este tipo de proteínas se identificaron porque se acumulaban en
las hojas del tabaco, después de la infección con el virus del mosaico del tabaco
(TMV). Una proteína se clasifica como PR cuando su presencia y actividad se
correlaciona estrechamente con el mantenimiento del estado de resistencia
(Martelli el al., 1985).
Algunos virus y viroides vegetales que afectan cultivos de

importancia económica
La mayoría de los virus vegetales son inicialmente reconocidos por las enfermedades
que causan en las plantas. Por ejemplo, el virus que causa un moteado o mosaico de
áreas oscuras y claras en el tabaco, es conocido como virus del mosaico del tabaco
(TMV). Otras características como el tipo de ácido nucleico (ADN, ARN) Y la forma, la
variabilidad en las proteínas de la cápside y/o la presencia o ausencia de la envoltura,
también permiten agrupar a los virus. Sin embargo, para algunos virus vegetales se ha
dificultado la clasificación dentro de los grupos existentes debido a que poseen
características muy particulares (Matthews, 1991).
A continuación se mencionan algunos grupos virales vegetales, sus características

generales y algunos representantes (Gibbs y Harrison, 1976; Matthews, 1982). La
figura 1 (a y b) muestra algunas microfotografías de virus y los diagramas más
generales de los mismos.
Virus helicoidales construidos en forma de partículas filamentosas o tubulares.

Son virus que se transmiten por la savia, muchos de los cuales causan síntomas de
mosaico y amarillamiento de las plantas afectadas. Dentro de este grupo se
encuentran:
• Tobravirus. Este virus está compuesto por partículas tubulares de dos tamaños,
grande y pequeña. Las partículas pequeñas no infectan solas a la planta, pero
contienen la información que codifica para la proteína de la cubierta, que es la
78 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMilLAS POR BICJIECNOLOGÍA
misma en las dos partículas. Son virus de ARN de cadena sencilla y sentido
positivo, que tienen un amplio rango de hospederos. El prototipo es el virus de
la sonaja del tabaco.
• Tobamovirus. Estos virus incluyen el virus del mosaico del tabaco y el virus
del mosaico del tomate, siendo el primero el virus de plantas que ha sido más
estudiado. Son partículas tubulares rectas con un amplio rango de hospederos,
en los que se manifiestan con síntomas necróticos y de mosaico. Están
constituidas por ARN de cadena sencilla y sentido positivo.
• Potexvirus. Este grupo incluye el virus X de la papa y son partículas fllamentosas con
un estrecho rango de hospederos que causan síntomas de mosaico en las plantas
afectadas. Están constituidas por ARN de cadena sencilla y sentido positivo.
• Potyvirus. Es el grupo viral más grande que se conoce hasta el momento, e incluye
más de 200 especies de virus que atacan cultivos de importancia económica (papa,
lechuga, fríjol). Son partículas filamentosasque contienen ARN de una sola cadena de
sentido positivo yes transmitido mecánicamente y por vectores.Las plantas infectadas
generalmente presentan síntomas de mosaico.
• Carlavirus. Son virus de ARN de una sola banda de sentido positivo que no
posee envoltura. El virus latente del clavel es el más representativo del grupo.
• Closterovirus. El virus de la tristeza cítrica (CIV) y el virus de amarillamiento de la
remolacha (BYV) hacen parte de este grupo; poseen ARN de una sola banda de
sentido positivo, una cápside conformada por dos proteínas y no presentan envoltura.
Están considerados como el grupo de virus más largos que infectan a las plantas.
Virus con partículas isométricas. Los virus de este grupo poseen partículas
isométricas de diferentes formas, con tamaños que fluctúan entre 15 y 80 nm. En
general producen síntomas de mosaico y de forma menos generalizada, de necrosis,
enanismo y otras malformaciones. Los exponentes más representativos de este
grupo se describen a continuación:
• Cucumovirus. El virus del mosaico del cocombro (CMV) pertenece a esta clase
de virus. Están constituidos por partículas isométricas de 30 nm de diámetro,
compuestas por ARN de una sola banda y no poseen envoltura. El CMV infecta
plantas de por lo menos 40 familias de angiospermas; de hecho, es uno de los
virus de plantas más comunes en los cultivos de regiones templadas.
• Timovirus. El prototipo de éstos es el virus del mosaico amarillo del nabo
(TYV). Estos virus poseen partículas redondas isométricas con un diámetro
aproximado de 25 a 30 TIm.Están constituidos por ARN de una sola banda con
cápside pero sin envoltura. Estos virus poseen un rango estrecho de hospederos,
causan síntomas de mosaico pero muy raramente de necrosis.
• Comovirus. Estos virus se encuentran diseminados mundialmente. Poseen
partículas angulares isométricas, de diamétro entre 25 a 30 nm. Son virus de
ARN de una sola banda, recubiertos por una cápside proteica pero sin envoltura;
el exponente más representativo es el virus del mosaico del guisante.
• Nepovirus. El nombre de estos virus se debe a que son transmitidos por
nemátodos y poseen partículas poliédricas de cerca de 30 nm de diámetro.
Contienen ARN de una sola banda y no poseen envoltura; el virus de la mancha
anillada del tabaco es uno de los más conocidos.
• Geminivirus. La mayoría de los geminivirus están restringidos principalmente
al floema y células asociadas. Algunos de los miembros de este grupo afectan
cultivos de cereales y tienen un rango amplio de hospederos. Son virus de ADN,
en los que no se ha reportado la transmisión a través de semilla; sin embargo se
pueden trasmitir mecánicamente pero con gran dificultad.
Figura 1(a). Microfotografía electrónica de virus vegetales. Tomado de Guzmán-

Bamey, 1998 y Matlhews, 1991.
80 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIOIECNOLOGL
I ds· ONA 1 1 ss· ONA

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c: 000 CUCUMOVIRUS
CAPILLOVIRUS BROMOV1RUS
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t:=:::::::::::::::::==::::=::::::::::::::::::::=======::::::::::::::,
POrYVlRUS
0000 Al!alfa MO$aic Vi(us
Q~:::::::::===========::::::::::::::;¡
wil1l envelopes
Iss . RNA (-) I [~- RNA ±
RHA800VlR¡OAE Tomato
o
Spolted Will Virus
100nm
Figura l (b). Diagrama de las familias y grupos virales que infectan a las plantas.
Tomado de Matthews, 1991.
• Caulimovirus. Uno de los únicos virus vegetales constituidos por ADN de

doble banda sin envoltura hace parte este grupo, cuyo representante es el virus
del mosaico del coliflor (CaMV).
• Virus satélite. Son los virus vegetales más pequeños (18 nrn); se caracterizan
por depender de virus más grandes para su replicación. Poseen ARN de cadena
sencilla y no tienen envoltura. Uno de los miembros más representativos es el
virus satélite de la necrosis del tabaco. Otros virus de este grupo son los
Hordeivirus (virus del mosaico rayado de la cebada); Diantbovirus (virus de la
mancha anillada del clavel); Bromovirus (virus del mosaico de las bromelias);
Tombusvirus (virus del enanismo moteado del tomate).
De otra parte, los viroides son pequeñas partículas circulares de ARN descubiertos,
que poseen un alto grado de estructura secundaria, es decir, de cadenas dobles de
ARN en ciertas regiones del genoma viral. El ARN no codifica para ningún
polipéptido y se replica independientemente de cualquier otro virus asociado con
las plantas, usando sólo la maquinaria replicativa del huésped. Los viroides son
importantes porque causan enfermedades en cultivos de enorme importancia
económica. Además, son las partículas infecciosas más pequeñas que se conocen.
Dentro de este grupo se encuentran viroides que atacan la papa, cítricos, tomate,
manzana y coco (Mattbews, 1990).
Virus que infectan al cultivo del ñame

Introducción
Desde hace más de 20 años, Harrison y colaboradores (1971) informaron la

asociación de partículas viraJes con síntomas presentes en el ñame, como la mancha
café en el tubérculo. Posteriormente, también se ha informado la asociación entre
algunos virus y plantas que exhiben síntomas variados como puntos cloróticos y/
o necróticos conspicuos, amarillamiento y clorosis general, prominencia de las
venas primarias y secundarias, necrosis interven al severa, ahuesamiento de las
hojas (hojas delgadas y alargadas), encrespamiento o enrollamiento del borde del
limbo de las hojas, e incluso la necrosis del tallo y de las flores. De otra parte, se ha
informado de la presencia de partículas virales en plantas asintomáticas o con un
moteado leve y de diferente intensidad (Brunt el al., FAO).
Aunque se acepta que el ñame es una planta de origen africano, el posible origen de los
virus que infectan a esta planta es todavía incierto. La distribución geográfica de los
virus es amplia y los síntomas de mosaico y moteado de la hoja se han descrito tanto en
el Caribe como en Suramérica, África y en Asia (Harrison el al., 1971; Tbouvenel y
Fauquet 1979-1986; Brunt, 1992; Goudou-Urbino el al., 1996). Hasta el presente, lo
que queda claro a partir de la literatura citada es que aún no se cuenta con una completa
caracterización biológica, serológica y molecular de los diferentes tipos viraJes que
infectan al ñame, ni de la repercusión económica de cada uno de éstos para el cultivo
en general yen particular en determinadas regiones de la Tierra.
Algunos tipos virales que afectan diferentes variedades de ñame, que han sido
informados en diferentes regiones del planeta, se presentan a continuación:
a. Virus del mosaico necrótico del ñame chino (CYNMV): es una partícula
fJ.1amentosade 13X660 nm, reportada solamente en estudios realizados en China
y Japón. Los síntomas se presentan como manchas necróticas y cloróticas severas
en las intervenas y en el folíolo (Brunt el al., FAO). El virus se transmite
eficientemente por áfidos (Aphis gossyii) de una manera no persistente.
h Virus del mosaico del cocombro (CMV): a pesar de que este virus está
directamente relacionado con la enfennedad del mosaico del cocombro y pertenece
al grupo de los cucwnovirus, se ha detectado también en un rango de especies
vegetales amplio, entre ellas Dioscorea alata. Las infecciones de cultivos de
ñame por este virus se han infonnado solamente en el África Occidental. El CMV
es una partícula isométrica de ARN de una sola banda, sin envoltura, de 30 nm de
diámetro y que es transmitida eficientemente por un amplio rango de áfidos de
una manera no persistente (Thouvenel y Fauquet, 1986).
c. Virus de Dioscorea alata (YVn: es una partícula flexuosa-filamentosa de 12X
750 nm, posiblemente del tipo potyvirus pero que no reacciona con anticuerpos
antivirus del mosaico del ñame (YMV). Las plantas infectadas tienen hojas
asintomáticas y no se ha detenninado el vector de transmisión (Hughes, 1986).
d Virus baciliforme de Dioscorea (DBV): como su nombre lo indica, es una
partícula bacilifonne de 28 X 130 nm que presenta una amplia distribución en
Dioscorea bulbifera y en Dioscorea alata (variedad Lisbon), que ha sido
infonnada en la región de Barbados. Los síntomas incluyen clorosis severa
intervenal en D. bulbifera y manchas café del tubérculo en Dioscorea alata. En
este caso, tampoco es conocido un vector de transmisión (Harrison et al., 1971)
ni su clasificación dentro de un tipo viral detenninado.
e. Virus latente de Dioscorea (DLV): es una partícula ligeramente filamentosa y
flexuosa de II X 485 nm, que pertenece al grupo de los potexvirus. Aunque no
se ha encontrado una sintomatología clara asociada y no se ha detenninado el
vector de transmisión, el virus se ha detectado en Dioscorea jloribunda y
Dioscorea composita en la región de Puerto Rico (Waterwoorth et aL, 1974;
Phillips and Brown, 1988).
f. Virus del mo aico del ñame (YMV): es uno de los virus que infectan al ñame
más estudiados. El YMV es una partícula flexuosa-filamentosa de cerca de 12 X
750 nm, que ha sido clasificado dentro del grupo de los potyvirus. Su genoma
esta constituido por ARN de cadena sencilla que contiene 10 kb, con una cápside
de un solo tipo de proteína confonnada por 2.000 copias, que presenta Un peso
molecular estimado de 34 Kd. En ciertas variantes virales se ha detectado una
deleción de 12 aminoácidos con una proteína de la cápside de 29 Kd (fhouvenel
y Fauquet, 1979; Goudou-Urbino et aL, 1996; Aleman et aL, 1996), la cual ha
sido evidenciada por secuenciamiento de nucleótidos y por la técnica de
"Westem Blot"(Goudou -Urbino et aL, 1996). A nivel molecular se ha establecido
que el YMV utiliza el mecanismo de expresión de genes vía poliproteínas, y un
procesamiento pos-transduccional que pennite la obtención de 8 productos
proteicos, entre ellos tres proteinasas (NIa, PI, HC) (Aleman et aL, 1996). La
figura 2 esquematiza el genoma y la expresión de genes propuesto para el YMV.
El YMV se ha encontrado en Dioscorea rotundata-cayenensis y Dioscorea esculenta,

variedades ampliamente distribuidas en África Occidental y en el Caribe.
Ocasionalmente, se ha infonnado Dioscorea alata en el Pacífico Sur. Sus síntomas
más característicos son el enrollamiento o distorsión y clorosis de la hoja. La
Dioscorea rotundata-cayenensis se puede infectar fácilmente por inoculación
mecánica y desarrollar síntomas entre las 4 y las 6 semanas. Los síntomas pueden
diferir ampliamente en diferentes hojas de una misma planta. En general, los síntomas
del ñame asociados a la presencia de potyvirus son: un moteado con mayor o menor
grado de clorosis, hasta la clorosis completa de las hojas, encrespamiento (flecking)
del borde del limbo, diferentes grados de achaparramiento de la planta, zonas
cloróticas y necróticas, y el pronunciamiento de venas, producidas por el green
banding vein virus (GBW) que se puede observar en Dioscoreajloribunda. Para las
plantas indicadoras como Nicotiana benthamiana el achaparrarnianeto o enanismo,
el moteado y la clorosis son los síntomas más conspicuos (Thouvenel y Fauquet,
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1986). La variabilidad de síntomas observados en las plantas infectadas con el YMV

pueden ser explicadas, bien sea por polimorfismo morfológico del ñame (ferauchi et
al., 1992), por infección de mezcla de diferentes virus o por variabilidad genética del
YMV (Aleman et al., 1996; Mumford y Seal, 1997; Dallot et al., 1998).
Se ha logrado la transmisión experimental del virus por medio del pulgón Aphis
gossypii, de una manera semipersistente. También el YMV es transmitido por otros
pulgones como Toxoptera citrjcidus, Aphis crassivora y Phopalosiphum maidis.
(Thouvenel y Fauquet, 1979). La transmisión semipersistente de los virus quiere
decir que el pulgón vector adquiere el virus después de unos minutos de
alimentación sobre una planta infectada, y posteriormente, durante las siguientes
24 horas, puede continuar la infección de otras plantas. Al cabo de las 24 horas, el
pulgón pierde la capacidad de transmitir el virus y tiene que volver a alimentarse
de una planta contaminada. La figura 3 muestra ejemplos de los áfidos mencionados
anteriormente (Thouvenel y Fauquet, 1979-1986). Además, se ha informado la
transmisión del YMV por el tubérculo ("semilla").
Se ha informado de aislados virales del ñame comestible, de las variedades D.

cayenensis-rotundata, D. alaca, D. trífida y D. esculenta, que son similares al
YMV en su morfología, citopatología y rango de huéspedes. También es el caso
del virus del mosaico del ñame de la Costa de Marfil (Tbouvenal and Fauquet,
1979), del virus del mosaico y bandeamiento de la vena de Dioscorea en Togo
(Reck:haus and Nienhaus, 1981), del virus del ñame de Nigeria(Terry, 1976), de un
potyvirus informado en Burkina Faso (Goudou- Urbino et al., 1996) Y del virus que
infecta Dioscorea trífida en el Caribe y Suramérica (Boeglin et al., 1993). Estudios
recientes que han utilizado anticuerpos monoclonales desarrollados contra el YMV
de aislados de la Costa de Marfil, han permitido establecer que existe variabilidad
antigénica de tubérculos y de hojas infectadas de D. cayenensis-rotundata, D.
alaca, D. trífida y D. esculenta teniendo en cuenta los aislados virales de África,
Inglaterra, el Pacífico Sur, el Caribe y Suramérica. Así mismo, se estableció que la
variabilidad es independiente del origen geográfico de los aislados y del huésped
(Goudou-Urbino et al., 1996; Mumford y Seal, 1997). Estos resultados son
demostrativo de la diversidad de cepas del YMV. Además, recientemente se ha
identificado una cepa suave del virus del mosaico, la cual se ha denominado como
yammild mosaic virus (YMMV) (Mumford y Seal, 1997; Dallotet al., 1998) y otra
variente informada en Japón recientemente (Fuji y Nakamae, 1999).
Variabilidad de los aislados virales y algunos métodos de

detección
Una muestra vegetal infectada por un virus determinado contiene en realidad una
colección de cepas virales con propiedades bioquímicas similares. Por tanto, al
enfrentar una infección viral en una planta, los interrogantes que se podrían generar
serían: ¿Cómo detectar el virus?, ¿cómo saber si dos aislados de la planta contienen
diferentes virus o cepas de un mismo virus?; o de otra parte, ¿cómo saber si dos
aislados virales son idénticos o no?
En general, dos criterios se pueden utilizar para el reconocimiento de cepas virales.

Por una parte, un criterio estructural basado en las propiedades de las partículas
virales en sí misma (densidad, forma, tamaño) y de sus componentes (ADN, ARN,
cápside). Por otra parte, un criterio biológico basado en la expresión de síntomas
en plantas indicadoras y en las plantas huésped naturales, pero también en la
capacidad de que los virus puedan ser o no transmitidos por un vector específico.
No hay que descartar aquellas interacciones complejas entre el virus, la planta
hué ped y los vectores (Matthew , 1991). Entonces, la detección de aislados virales
ALGUNOS VlRUS VEGETALES Y DEL ÑAME 85
y la acertada discriminación entre cepas de un tipo viral depende de la

implementación de diferentes metodologías biológicas, moleculares y serológicas,
que permiten armar los criterios para la caracterización viral.
Es importante utilizar metodologías bioquímicas-moleculares para ampliar los

criterios de clasificación viral. Entre estas metodologías se pueden mencionar los
perfiles de ARN, los perfiles de restricción con enzimas específicas, la amplificación
de genes por medio de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la detección
de polimorfismos de cadena simpÍe (SSCP), la hibridación con sondas específicas
marcadas o el secuenciamiento de nucleótidos. En estos casos se requiere extraer
el ADN o ARN del genoma viral o con la purificación de la partícula viral (Doods
el al., 1983; Rubio el al., 1997; GiUings el al., 1993; Nolasco el al., 1993; Duterme
el al., 1996;YU el al., 1989;Pappu el al., 1993).
Adicionalmente, la implementación de metodologías serológicas con el uso de

anticuerpos policlonales y/o monoclonales específicos son de uso frecuente para
la detección, el diagnóstico y caracterización de un virus determinado. Las técnicas
de ELISA (Enzyme Linked Immunosorbeanl Assay), Ouslerlonay, immunoblol o
Weslern Blol son de uso frecuente entre otras metodologías.
Estas técnicas están basadas en las propiedades antigénicas de la(s) proteína(s)

que conforman la cápside viral. Los antígenos son moléculas de proteínas y/o
polisacáridos presentes en la cápside viral, que desencadenan una reacción
inrnunogénica. Los anticuerpos (IgG) son proteínas capaces de unirse y reconocer
específicamente al antígeno. Entonces, la interacción antígeno-anticuerpo es la
base de las pruebas serológicas (Kuby, 1992). Se han desarrollado diferentes
metodologías serológicas para la detección de bacterias y virus (Hamptom el al.,
1990). Hacia 1977, Clark y Adams adaptaron la técnica de detección serológica
de ELISA para la detección serológica de virus de plantas. Posteriormente se han
desarrollado diferentes variantes de la técnica ELISA (Cambra el al., 1993;
Mikaelova el al., 1996). Así pues, las técnicas serológicas se han convertido en
una herramienta muy útil para el diagnóstico viral y para estimar la incidencia
de la infección tanto en plantas de campo como mantenidas in vitro. En la figura
4 se esquematiza la reacción antígeno-anticuerpo basado en el protocolo general
de ELISA-DAS. La figura 5 muestra la fotografía de una placa de ELISA con
evidencia de reacción positiva (amarillo intenso o intermedio) a potyvirus. Los
pozos negativos no muestran coloración intensa con una tonalidad clara similar
al control negativo.
Presencia de potyvirus en cultivos de ñame de la

Costa Atlántica colombiana
Introducción
El ñame es un cultivo tradicional de la zona caribeña colombiana, especialmente de

los departamentos de Córdoba, Sucre y Bolívar. Es una planta con altas calidades
nutricionales y culinarias utilizada en sopas, fritos, dulces y rica también en esteroides.
Sin embargo, los cultivos no son altamente tecnificados y, en general, hacen parte de
cultivos mixtos, alIado del maíz, algodón, melón, etc., con un alto grado de malezas
asociadas. De allí la posibilidad de transmisión de diferentes virus entre los cultivos
comprometidos, dependiendo de la presencia de los vectores naturales adecuados.
Los cultivos de ñame pueden ser infectados por diferentes grupos virales, entre los
que se destaca el grupo de los potyvirus que comprende alrededor de 180 posibles
86 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIarECNOLOGíA
Figura 3. Aphis goosypii. Uno de los vectores naturales de los polyvirus.

Tomado de Guzmán-Barney, 1998.
IgG-PAL
IgG
Figura 4. Esquema de la detección viral antígeno-anticuerpo

basado en el protocolo de ELISA-DAS.
Figura 5. Placa ilustrativa de la prueba de ELISA. El amarillo intenso indica una

reacción positiva. Los pozos negativos no muestran una coloración intensa.
88 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMilLAS POR BIOfECNOLOOÍA
miembros, de los cuales 4 se han informado para el ñame (Thouvenel y

Fauquet, 1979; Riechman et al., 1992). Como se mencionó, el principal potyvirus
para el ñame es el virus del mosaico del ñame (YMV). Importantes pérdidas
económicas se han informado para algunas regiones de África y del Caribe por la
reducción del tamaño del tubérculo y, en general, del rendimiento y de la producción
del mismo (Thouvenel y Fauquet, 1976-1979). En la Costa de Marfil, en el
continente africano, la producción del tubérculo se estimó en 2.550.000 toneladas
para 1985; sin embargo, no se cuenta con un estimativo real de las pérdidas
producidas por la virosis del ñáme.
En 1995, los estudios serológicos y moleculares realizados en 11 aislados de

ñame, recolectados en las regiones de Sucre, Córdoba y Bolívar de la Costa
Atlántica colombiana, demostraron la presencia del YMY. Además, se determinó
la posible presencia de otros tipos virales en uno de los aislados analizados, y
una homología de la secuencia de nucleótidos de alrededor del 90% al 95%,
entre algunos de los aislados y aquellos informados en la literatura (Torres,
1997).
A partir de 1996 se estableció un programa participativo entre las Universidades

Nacional, de Córdoba y de Sucre y la Regional 2 de Corpoica, para la obtención de
semillas (tubérculo) de ñame sanas a partir de su propagación in vitro.
Consecuentemente, uno de los objetivos específicos importantes que se plantearon
fue la detección de patógenos encontrados tanto en las plántulas in vitro, como en
las plantas madres.
Por la significación a nivel de las posibles pérdidas económicas en la producción

del tubérculo de ñame, el objetivo del presente trabajo fue diagnosticar la presencia
de potyvirus transmitidos por áfldos (entre ellos el YMV) en una muestra preliminar
de plantas de ñame obtenidas in vitro a partir de yemas, de una colección de
plantas madres de ñame y de algunas malezas asociadas a los cultivos.
Materiales y métodos experimentales para el diagnóstico

de virus en ñame
a. La muestra: 100 muestras de ñame pertenecientes a la especie Dioscorea alata

variedad Diamante fueron traídas de la colección de la Universidad de Córdoba.
Adicionalmente, 20 muestras de maleza asociadas al cultivo de ñame fueron
traídas de la localidad de Cereté (Córdoba). Las muestras se mantuvieron a 4°C
durante 24 horas, hasta su utilización. Además, 50 muestras de cultivos in vitro
correspondientes a clones de la variedades Canilla, Diamante y Oso, provenientes
de la Sección de Cultivo de Tejidos de la Universidad Nacional de Colombia,
sede de Bogotá y de la Universidad de Córdoba también fueron analizadas (las
denominaciones Canilla y Oso hacen referencia al nombre común utilizado en
la región). Como control positivo se utilizó un liofilizado rehidratado (kit Agdia)
y como control negativo se utilizaron plántulas in vitro y ex vitro de papa libres
de potyvirus.
h Antígeno viral: los extractos vegetales se realizaron por maceración en
un buffer carbonato de extracción (dilución de l: 10 y 1: 100). La muestra
se maceró dentro de una bolsa plástica que contenía una gasa para atrapar
los residuos vegetales más grandes. 100 ul de este extracto vegetal se
utilizaron por cada pozo de la placa de ELISA y por duplicado.
c. Anticuepos antipotyvirus: se utilizaron anticuerpos monoclonales antipotyvirus
(Kit Agdia 27200) en dilución (l: 100) según la descripción propuesta por el
protocolo.
d. Método de detección: para la detección de los potyvirus transmitidos por áfidos

se utilizó la técnica de ELISA- DAS Indirect propuesta por el protocolo de Agdia.
Brevemente, se adicionaron 100 ul del extracto vegetal a los pozos de la placa de
ELISA, por duplicado para cada muestra, utilizando un control positivo (kit), uno
negativo y un blanco. El extracto vegetal se dejó durante 1 hora a temperatura
ambiente o a 4°C durante la noche. Después de 3 lavados con PBS- Tween durante
5 minutos, se adicionó el anticuerpo antipotyvirus en una dilución de 1:100 con
el buffer de anticuerpo ECl (kit). Se dejó durante 2 horas a temperatura ambiente
y se realizaron 3 lavados con PBS- Tween durante 5 minutos. Seguidamente se
adicionó el anticuerpo antimouse marcado con la fosfatasa alcalina utilizando en
dilución 1:100 en buffer ECI (kit). Se dejó durante 1 hora y se realizaron los 3
lavados con PBS-Tween como en los pasos anteriores. Posteriormente se adicionó
1 ug/ml de substrato (p-nitro fenil fosfato), se cubrió con papel de aluminio y se
dejó durante la noche a 4°C. Las lecturas de densidad óptica se realizaron en un
lector de ELISA con un fLItrode 405 nm. Arbitrariamente se tomó como muestra
potyvirus positiva aquella con densidad óptica 2 veces mayor que la densidad
óptica del control negativo.
Resultados del diagnóstico viral en ñame
Algunos síntomas observados en las plantas de campo de la colección de la

Universidad de Córdoba se presentan a continuación. Se observa la presencia de
bandeamiento y clorosis transversal (figura 6), diferentes grados de moteado severo
y de clorosis (figuras 7 y 8). En las plantas más jóvenes se observaron síntomas de
amarillamiento o moteado vertical hasta la clorosis generalizada, y en las plantas
adultas, síntomas de moteado o amarillamiento transversal y de venas secundarias.
El cultivo de ñame con plantas adultas normales se muestra en la figura 9. Una
planta de la zona de Cereté con síntomas muy conspicuos de virosis y que forma
parte de un cultivo mixto con maíz contaminado con virus se muestra en la figura
(10).
En el 80% de las muestras de campo analizadas las densidades ópticas (DO)

oscilaron entre 0,2 y 2,5 o más. El control negativo presentó una DO de 0,06 y el
control positivo del kit presentó una DO de 2,3. Algunas muestras estaban a límite
de 2 veces la DO del control negativo, por lo que se prefirió mantenerlas como
interrogadas. Se tuvo mejor definición de la DO cuando se utilizó la dilución del
extracto vegetal 1:10 aunque algunas muestras presentaron DO altas en la dilución
1:100.
Todas las malezas analizadas fueron positivas y algunas de ellas presentaron DO

superiores (mayores de 2.5) que las presentadas por el control positivo (DO = 2,3).
En las muestras in vitro se determinó que los microcultivos obtenidos a partir de
Dioscorea alata variedad Canilla y de algunos individuos de Discorea alata
variedad Diamante estaban contaminados con rangos de DO entre 0,2 y 0,6. El
resto de microcultivos presentaron DO negativas (menores de 0,1).
Discusión
La implementación y validación de la técnica de ELISA-DAS indirecta para la

detección de potyvirus transmitidos por áfidos, contempla el uso de un anticuerpo
monoclonal. Con éste se diagnostica la presencia de potyvirus en plantas madres
mantenidas en una colección de campo (80%), como también en malezas (100%)
asociadas al cultivo de ñame y en un 15% de los microcultivos in vitra.
Figura 6. Síntoma de bandeo transversal. Cultivo de ñame Dioscorea alata.

(Universidad de Córdoba. Muestras positivas para ELISA).
ALGUNOS VIRUS VEGETALES y DEL ÑAME 91
Figuras 7 Y8. Síntoma de moteado con diferentes grados de clorosis. Cultivo de ñame
Dioscorea alata. Universidad de Córdoba. Plantas positivas para ELISA.
92 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMlLLAS POR BIarECNOLOOÍA
Figura 9. Cultivo de ñame Dioscorea a/ala de 9 meses de desarrollo.

(Colección Universidad de Córdoba).
Figura 10. Síntoma de moteado en cultivo mixto de ñame y maíz. Localidad Cereté,
Córdoba. Hojas alargadas y encrespadas, con diferentes grados de clorosis.
El conjunto de resultados reconfirman la presencia de potyvirus transmitidos por

áfidos en las plantaciones de ñame del Caribe colombiano, que había sido
previamente detectada en el trabajo de M. 1. Torres, y la validez de la técnica
serológica de ELISA para el diagnóstico de virus vegetales. Sin embargo, algunas
muestras tomadas como negativas podrían ser positivas al aplicar otras técnicas
más sensibles como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En el presente estudio, se detectó por primera vez -a nuestro conocer -, la presencia

de potyvirus transmitidos por áfidos en malezas asociadas a los cultivos de ñame.
Este hallazgo presupone un foco de infección adicional para el cultivo del ñame y
para los otros cultivos mixtos que pueden ser infectados por este tipo de potyvirus.
Es decir, es posible que el áfido vector natural de los potyvirus se pueda alimentar
de plantas de ñame previamente contaminadas, o a partir de otros cultivos asociados
al ñame y a partir de las malezas. Los resultados positivos de las malezas demuestran
que éstas son reservorios virales y, por tanto, existe la alta probabilidad de que se
mantenga un flujo viral entre los cultivos de ñame, las malezas asociadas y un
mismo vector natural. La consideración anterior podría ampliarse para otros cultivos
económicamente importantes de la región caribeña que se siembran de forma mixta
con el ñame, como son el melón, el algodón y el maíz. Sin embargo, faltaría
todavía confirmar si los potyvirus de malezas son capaces de infectar al ñame.
Además, sería necesario confirmar si se trata de YMV o de otro potyvirus.
De otra parte, en este estudio se detectó infección con potyvirus en plántulas

propagadas in viero a partir de yemas procedentes de los laboratorios de cultivo de
tejidos de la Universidad Nacional y de la Universidad de Córdoba. Se determinó
que todos los clones analizados de Dioscorea alata variedad Canilla de origen in
vitro mostraron DO positivas (D = entre 0,2 y 0,6) comparados con el control
negativo (DO = 0,06). Sin embargo, algunos de los clones de Dioscorea alata
variedad Diamante mostraron infección. Los clones son tomados de diferentes
yemas localizadas a lo largo de una misma planta madre. El hecho de mostrar
resultados dispares entre algunos de estos clones, implicaría que la distribución
viral en la planta madre es desigual y, por ejemplo, las yemas basales podrían tener
más virus que las más apicales. Estos hallazgos plantean la necesidad de realizar
seguimientos más frecuentes de los microcultivos y el uso de termoterapia para las
plantas madres.
En general, se obtuvieron densidades ópticas (DO) más concluyentes cuando se

utilizó la dilución del extracto vegetal 1:10 comparado con una dilución 1:100,
propuesta por el kit de Agdia utilizado. Solamente en 3 casos los extractos de
plantas de campo mostraron una DO más alta con la dilución 1:100, posiblemente
por una mejor disponibilidad de los epítopes de la cápside viral en extractos más
diluidos para estas muestras. Sin embargo, no se realizaron análisis estadísticos
para evaluar la significancia de estos resultados.
Las plantas de campo analizadas y las malezas, presentaron diferentes

sintomatologías y grados de ellas tanto entre plantas como dentro de la misma.
En el presente trabajo no se pudo establecer una correlación directa entre un
título viral determinado (DO) y una sintomatología específica. Se requiere un
muestreo más amplio para poder hacer este tipo de correlaciones. Sin embargo,
algunas evidencias nos permiten presentar algunas hipótesis.
a Posiblemente las plantas adultas que mostraron SÚltomasde moteado más suaves
podrían haber sido infectadas más tardíamente en su desarrollo, y de esta manera,
la intensidad de los SÚltomas llegaría a un nivel de manifestación más leve.
b. Las plantas jóvenes que expresan una sintomatología de moteado y clorosis

más intensa podrían estar infectadas desde tubérculo o a muy temprana edad, y
por tanto, la virulencia y la expresión de los síntomas sería más intensa y
deletérea, independientemente del aislado o tipo viral.
c. No se puede descartar que las plantas sean infectadas por variantes de un mismo
tipo de potyvirus, las cuales tendrían diferencias de expresión de síntomas
dependiendo del tipo y de la edad del huésped y de la edad del mismo en el
momento de la infección, Está documentado en la literatura que en una misma
planta puede encontrarse hojas con diferentes síntomas y aun se pueden encontrar
hojas sin síntomas. Los trabajos realizados en otros países (Thouvenel and
Fauquet, 1979; Reckhaus and Nienhaus, 1981; Goudou-Urbino el al., 1996;
Boeglin el al., 1993) apoyarían esta posibilidad.
d. No se puede descartar que las plantas estén infectadas por dos o más tipos
virales diferentes (YMV, YMMV y/o el GBVV), dentro del mismo grupo de
potyvirus que sean transmitidos por áfidos o, de otra parte, que los síntomas
expresen la interacción entre distintos grupos virales.
Faltaría implementar otras metodologías biológicas y moleculares y la inoculación

de plantas indicadoras y de ñame. A partir de la secuencia completa de nucleótidos
del YMV de algunos aislados de la Costa de Marfil (Aleman el al., 1996), ha sido
posible diseñar primers para amplificar secuencias del genoma y establecer sondas
específicas para la detección de variantes virales. La metodología de PCR es
diagnóstica y se ha informado que es más sensible que la prueba de ELISA para la
detección de concentraciones bajas de virus. Esta aplicación sería de especial
interés para la detección viral de plántulas de ñame propagadas in vitro y las
plantas madres. Además, con los productos de PCR y el secuenciamiento de
nucleótidos se pueden establecer relaciones evolutivas con otros grupos virales o
estimar distancias ftligenéticas dentro del mismo grupo viral, como ha sido
informado para otros virus (Pappu el al., 1993; Guzmán-Barney, el al., 1994) y
para algunos aislados de ñame colombianos (Torres, 1997).
Conclusión
Los resultados obtenidos en este estudio están basados en un grupo preliminar

correspondiente a 170 muestras; sin embargo, se pudo establecer que los cultivos de
ñame de la región del Caribe colombiano están contaminados con potyvirus
transmitidos por áfidos, al igual que las malezas asociadas a estos cultivos, además
de algunos microcultivos obtenidos por yemas y plantas madre. Se observaron diversos
síntomas, leves y severos, los cuales han sido informados como producto de la
infección con potyvirus. La mezcla de síntomas entre plantas y dentro de una misma
planta apoya la idea de que los síntomas son producto de mezclas de diferentes tipos
virales o variantes de un mismo tipo viral, donde intervienen también las
características particulares del huésped. Las malezas mostraron títulos virales altos
mayores de 2,5 y, por tanto, son reservorios virales. Es importante el apoyo de técnicas
moleculares más sensibles en la detección viral. Valdría la pena estimar la incidencia
viral en algunas parcelas de las tres regiones de Córdoba, Sucre y Bolívar con el
objeto de establecer si el problema viral es significativo, similar y/ o diferente en
cada una de estas regiones, y si tiene un efecto importante en la reducción de la
productividad del tubérculo de ñame para la economía campesina.
Sugerencias para las medidas de control de la infestación viral
La propagación vegetativa a partir de tubérculos de ñame ("semilla") contaminados

aumenta el índice de dispersión de la virosis y la reducción de productividad del
cultivo. La infección viral puede tener un efecto menos deletéreo y notorio para el
agricultor comparado con la antracnosis producida por el hongo (Colletotrichum
sp.) que devasta en pocos meses el cultivo de ñame. Sin embargo, la antracnosis se
puede controlar con fungicidas pero no existe hasta el momento un medio eficaz
de control de los virus. La infección viral reincidente tiene como consecuencia a
mediano y largo plazo, un descenso paulatino en la calidad y producción del
tubérculo. Los efectos deletéreos se pueden incrementar a medida que aumenta en
el tiempo la dispersión, la mutación y recombinación de diferentes cepas virales.
Es importante implementar técnicas que permitan la detección más sensible y

efectiva de los patógenos, además de la posibilidad de contar con plantas de ñame
resistentes a virosis. La obtención de plantas híbridas o transgénicas, que tengan
mayor resistencia o tolerancia al ataque viral serían un reto importante. Finalmente,
se requieren estudios biológicos, serológicos y moleculares más extensos que
lleven a una mayor comprensión del problema viral del ñame.
De allí la importancia para el agricultor de contar con semillas libre de virus y

sanas en general. Es necesario detectar con prontitud la presencia de virus en los
cultivos para eliminar las plantas y los tubérculos contaminados, para evitar de
esta manera la diseminación de la enfermedad al siguiente cultivo y a los cultivos
circundantes. Un buen mantenimiento del cultivo, acabando con las malezas,
abonando adecuadamente, detectando la presencia de pulgones y, en general,
tecnificando las condiciones del cultivo, permitirán obtener mejores rendimientos
para el campesino de la región y para la agricultura nacional.
Las autoras agradecen a Giovani Bermúdez y a Carlos Andrés Castro, estudiantes

del Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional
de Colombia, quienes colaboraron con la técnica de ELISA para la detección de
potyvirus del ñame.
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ACLIMATACIÓN DE PLANTAS IN VITRO
DE ÑAME ESPINO, JAPÓNICO y
CHOCOANO
EN LA COSTA CARIBE
Andrés Aguas A.
Galo Gamero V.
Jorge Romero F.
Amaury Espitia
Corpoica Turipaná, Regional Córdoba
INTRODUCCIÓN
Durante los meses de febrero a marzo de 1999 en la Regional 2 de
Corpoica, en el Centro de Investigación Turipaná, se realizó un
experimento exploratorio que consistió en aclimatar plantas del medio
ambiente artificial in vitro al medio ambiente natural, en la primera
fase de casa malla, con el propósito de ajustar la metodología para
adaptar vitroplantas de ñame. Se evaluaron seis tratamientos, que
consisten en tres materiales de ñame en dos ambientes diferentes que
se definieron así:
Material 1, ñame espino (Dioscorea rotundata), material 2, ñame

chocoano (Santhosoma sagittifolium) y material 3, ñame japónico
(Dioscorea japonico). Ambiente 1, casa malla con algunas
modificaciones: techo de sarán del 40% de luz y plástico transparente
seguido de sarán del 60%. Las plantas individuales se sembraron en
vasos desechables destapados, montadas en mesas de propagación de
un metro de alto, encerradas en un cubículo de icopor de media pulgada
de espesor. Ambiente 2, similar al ambiente 1, con la diferencia de que
se utilizaron vasos tapados y sin cubículo de icopor. El diseño utilizado
para el experimento fue el de bloques al azar, con cinco repeticiones
por tratamiento y la unidad experimental; cada tratamiento estuvo
representado por una planta. Como resultado se encontró que el
incremento foliar de los clones espino, chocoano y japónico fue mayor
en el ambiente 2. En cuanto al incremento longitudinal del clon espino
fue mayor en el ambiente 1 que en el ambiente 2. Los ñames chocoano
y japónico tuvieron mayor incremento longitudinal en el ambiente 2.
La mortalidad en el ambiente 1 fue del 60% para el clon japónico y
para el espino fue del 20% en el ambiente 2. El clon chocoano no
presentó porcentaje de mortalidad en ninguno de los ambientes.
104 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMlLLAS POR BIOIECNOLOGÍA
La aclimatación de plántulas procedentes de ambientes artificiales in vitro es uno

de los componentes cruciales dentro del proceso de adaptación de materiales a
nuevos ambientes, y es uno de los requisitos indispensables que debe cumplir
cualquier especie para su acomodo a un sitio definitivo en el campo.
Uno de los obstáculos para aclimatar diferentes especies de ñame, tales como:
Dioscorea atata, Dioscorea rotundata, Dioscorea japonico y Santhosoma
sagittifotium, provenientes dé sistemas in vitro, es el desconocimiento de
metodologías ajustadas a las condiciones tropicales, ya que no se tienen referencias
de trabajos realizados en el país, lo cual repercute, desde el punto de vista técnico
y económico, en una nula o baja eficiencia en el número de plántulas a producir.
Este proceso debe tener la mayor eficiencia en la fase de invernadero (casa malla),
como en la fase de vivero, para poder reducir los niveles de mortalidad y aumentar
el endurecimiento de las plántulas, en forma tal que no reduzcan su crecimiento y
desarrollo, permitiendo así llevar plantas sanas y vigorosas al campo.
El ensayo exploratorio tuvo como objetivo cuantificar en condiciones de la

Costa Caribe colombiana, los factores abióticos (luz, temperatura y humedad
relativa) y su efecto sobre el crecimiento y adaptación de vitroplantas de ñame
en fase de invernadero (casa malla), con el propósito de ajustar la metodología a
utilizar en posteriores trabajos con ñame.
Variables y condiciones de adaptación

El experimento se realizó en la Regional 2 de Corpoica, en el Centro de Investigación
Turipaná, y tuvo una duración de dos meses (febrero a marzo de 1999).
La metodología utilizada se ajustó a las metodologías y sugerencias reportadas

por Laignelet y colaboradores (1997); Usui Kanji y colaboradores (1996); Mantell
y colaboradores (1993); Perea y colaboradores (1998) y Hurtado (1994).
Se evaluaron tratamientos utilizando tres variedades de ñame sometidas a dos

ambientes diferentes definidos así:
• Material 1, ñame espino (Dioscorea rotundata).

• Material 2, ñame chocoano (Sanlhosoma sagillifotium).
• Material 3, ñame japónico (Dioscoreajaponico).
• Ambiente 1, casa malla con algunas modificaciones, tales como techo de sarán
que filtraba 40% de luz y plástico transparente calibre No. 12, ubicado 50 cm
por debajo del sarán y luego seguido de otro sarán del 60% de luz a una altura
del piso de 2 metros, dentro de la casa malla; las plantas individuales estaban en
vasos desechables destapados, montadas en mesas de propagación de un metro
de alto y encerradas en un cubículo, hecho con láminas de icopor, de media
pulgada de grueso, de 2 metros de ancho por l metro de alto por 1 metro de
largo.
• Ambiente 2, parecido al ambiente 1, con la diferencia de que las plantas
estaban en vasos de icopor que tenían como tapa hermética otro vaso y sin
cubículo de icopor (véase fotografía 1).
El diseño utilizado para el experimento fue el de bloques al azar, con cinco

repeticiones por tratamiento. La unidad experimental, para cada tratamiento,
estuvo representada por una planta.
ACLIMAJ'ACI6N DE PLANTAS IN VrrRO 105
Las plántuJas utilizadas en el experimento permanecieron entre 4 a 6 meses en

tubos de vidrio, a cuyo término se trasplantaron. Para pasar las plantas al sustrato
(suelo), primero se removieron las trazas de medio adherido a las raíces, con agua
destilada y esterilizada. Para el trasplante se utilizaron vasos de icopor de 6 onzas
con orificios en el fondo. Los vasos contenían una mezcla de tierra con arena
estéril, en relación 2: l. Para mantener regulada la temperatura y humedad relativa,
en todos los tratamientos, se aplicaron riegos de 9:00 a.m. a 4:00 p.m. a diferentes
frecuencias dependiendo de la,humedad relativa, así: en todos los tratamientos se
mantuvo una humedad relativa del 90% en las dos primeras semanas, y en la
tercera y cuarta semanas se mantuvo en 80%, descendiendo a 70% para las semanas
quinta y sexta. De otra parte, en cada uno de los tratamientos se iban descubriendo
paulatinamente las plantas, al retirar las láminas de icopor (véase fotografía 1). En
el ambiente 2, los vasos tapados se perforaron con cinco orificios al igual que las
tapas o vasos superiores.
Como parámetros abióticos se tomaron la temperatura (OC),la humedad relativa (%)

y la intensidad lumínica (Lux). Para determinar el crecimiento y desarrollo de las
plantas, se tomaron como parámetros bióticos el crecimiento lo~gitudinal, número
de hojas emitidas, número de hojas muertas y la mortalidad de las plantas (véase
fotografía 2). Estos parámetros se correlacionaron con los factor~s abióticos según
lo propuesto por Salisbury y colaboradores (1994) y por Tudela y colaboradores
(1993).
En los dos ambientes cada hora se hicieron mediciones de la intensidad lumúlica, la

humedad relativa y la temperatura promedio; utilizando higrotermógrafo y luxómetro
(véase fotografía 1).Las unidades de calor (VC) se determinaron mediante la fórmula:
VC = (Tmáx + Tmín)/2 - Tb
donde: Tmín corresponde a las temperaturas mínimas, Tmáx corresponde a las

temperaturas máximas, registradas ambas con termómetro de mínimas y
máximas, y Tb corresponde a la temperatura mínima para el crecimiento
fisiológico de las plantas de ñame.
Las mediciones del crecimiento y del desarrollo de las plantas como variables de
respuesta se hicieron emanalmente.
Para la nutrición de las plantas se utilizó la metodología reportada por Laignelet

y colaboradore (1997) en la primera semana de la siembra. Con una bomba de
espalda se realizaron dos aplicaciones de una solución de Wuxal® o Nutrifoliar®
completo (2 mil 1de agua) con el último riego de la tarde. A partir de la segunda
semana se aplicaron fertilizantes líquidos dos veces por semana, empleando la
siguiente fónnula en 10 litros de agua:
Nitrato de calcio 32 g
Agrimins® 5g
Sulfato de magnesio 15 g
Kelatex de hierro 9g
Nitrato de amonio 92 mi
Ácido fosfórico 20 mi
Nitrato de potasio 136 g
La dilución se preparó al momento de fertilizar, empleando la cantidad necesaria

de la anterior solución en proporción 1:10 de agua.
106 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BICITECNOLOGÍA
Para el manejo sanitario de las plantas se utilizaron los fungicidas Benomyla en

rotación con oxicloruro de cobre y en dosis de 1 a 2 gIl de agua, cada diez días
después del último riego de la tarde (Lainelet el al., 1997).
Respuestas de las variedades de ñame a las

condiciones de aclimatación
Se analizan tres clones de ñame (espino, chocoano y japónico), en dos ambientes.
Para el ambiente 1, las condiciones climáticas promedio que se presentaron fueron:
unidades de calor 500

Lux 1402 (acumulado)
Humedad relativa 86%
Temperatura 26.8°C.
Para el ambiente 2, las condiciones climáticas promedio que se presentaron fueron:
unidades de calor 568

Lux 2202 (acumulado)
Humedad relativa 76,15%
Temperatura 27°C
Los resultados del experimento se resumen para cada una de las variables de
respuesta en las tablas 1 y 2. Al comparar el incremento foliar de los clones en los
ambientes 1 y 2, la tendencia indica que en el ambiente 2, los clones ñame espino
y ñame chocoano presentan un mayor incremento foliar y de longitud del tallo que
el ñame japónico. En el ambiente 1 hubo la misma tendencia aunque el incremento
fue menor (véase tabla 1).
La respuesta del ñame espino en cuanto a incremento longitudinal de las plantas,

presentó mejores resultados en el ambiente 1 comparado con el ambiente 2, ya que
evidenció un incremento promedio de 3.5 cm durante el tiempo de
experimentación. La variedad chocoano y el ñame japónico presentaron mayor
incremento en las variables respuesta en el ambiente 2 (véase tabla 1).
En general, el clon de ñame espino pierde el mayor número de hojas en los dos
ambientes, si se compara con los otros materiales evaluados; pero así mismo, este
material es el que tiene genéticamente mayor velocidad de emisión foliar en los
dos ambientes. El clon de ñame japónico es el que presenta menor número de hojas
muertas y, adicionalmente, es el que menor emisión de hojas presenta (véase tabla
2).
El mayor porcentaje de mortalidad de plantas se presentó en la variedad japónico

(60%) en el ambiente 1, seguido por el ñame espino (20%) en el ambiente 2; la
variedad chocoano no presentó mortalidad en ninguno de los d0s ambientes.
La tabla 3 muestra que en general no hubo diferencias en el incremento foliar entre

los clones de ñame espino y chocoano, pero sí hubo diferencia entre estos y el
japónico (0.4 hojas). Para el ñame espino se observó que es el que tiene el mayor
incremento en longitud de las plantas (3.09 cm) en los dos ambientes, seguido por
el clon ñame chocoano y, por último, el japónico.
ACLIMATACIÓN DE PLANfAS IN vrmo 107
Fotografía l. Etapa de adaptación de plántulas de ñame de in vilro a ex vitro.
Fotografía 2. PlántuJas de ñame en invernadero, listas para trasplantar a campo.

Tabla 1. Promedio de incremento foliar y longitud del tallo

de tres clones de ñame en dos ambientes
CLON DE AMBIENTE I CREMENTO INCREMENTO LONGITUD

ÑAME FOLIAR DE PLANTA (CM)
1. Casa malla + cubículo .•. ~asos destapados 2.0 3.50

Espino 3.4
2. Casa mana .•. vasos lapados 2.68
1. Casa malla .•.cubículo .•. vasos destapados 2.0 1.18
Chocoano
2. Casa malla .•. vasos tapados 3.6 2.16
l. Casa malla + cubículo .•. vasos destapados 0.0 0.52
Japónico
2. Casa malla .•. vasos tapados 0.8 0.80
Tabla 2. Promedio de número de hojas muertas y

porcentaje de mortalidad de plantas de tres clones de ñame
en dos ambientes
CLON DE AMBIENTE NO. DE HOJAS MORTALIDAD

ÑAME MUERTAS %
Espino 1. Casa malla .•.cubículo .•. vasos destapados 3.0 O
2. Casa malla .•. vasos lapados 4.4 20
Chocoano 1. Casa malla .•.cubículo .•. vasos destapados 0.8 O
2. Casa malla .•. vasos tapados 0.4 O
Japónico 1. Casa malla .•.cubículo .•. vasos destapados 1.0 60

2. Casa malla .•. vasos tapados 0.2 O
Tabla 3. Promedio total de incremento foliar y longitud del

tallo (cm) de tre clones de ñame a través de dos ambientes
CLO DE ÑAME I CREMENTO FOLIAR INCREMENTO LONGITUD DE

PLANTA (CM)
Espino 2.7 3.09
Chocoano 2.8 1.67
Japónico 0.4 0.66
Al comparar el comportamiento en los dos ambientes experimentados, el ñame espino

presentó el mayor promedio total de hojas muertas, debido posiblemente a que
genéticamente tiene la mayor rata de emisión de hojas en cualquier ambiente. Los clones
chocoano y japónico tienen el menor número de hojas muertas (0.6), pero también
presentaron menor emisión de hojas en los ambientes.
ACLIMXfACIÓN DE PLAmAS IN VrrRO 109
La mayor mortalidad de plantas (30%) entre los dos ambientes, la presentó el

clon japónico, posiblemente porque no se adapta bien a las condiciones del
trópico. El ñame espino presenta un índice bajo de mortalidad mientras que el
chocoano no presentó mortalidad de plantas (véase tabla 4).
Tabla 4. Promedio total de número de hojas muertas y

porcentaje de mortalidad de plantas de tres clones de
ñame a través de dos ambientes.
CLONDENAME No. HOJAS MUERTAS MORTALIDAD(%)
Espino 3.7 10.0

I Chocoano 0.6 0.0
Japónico 0.6 30.0
En la tabla 5 se observa que hay mayor efecto para el incremento foliar (2.6 hojas)
en los tres clones sometidos al ambiente 2 comparado con el ambiente l. No así
para el incremento longitudinal de la planta, donde no hay una diferencia marcada
de los ambientes.
Tabla 5. Promedio total de incremento foliar y

longitud del tallo (cm) de dos ambientes en tres clones
de ñame. C. 1. Turipaná, 1999
AMBIENTE INCREMENTO INCREMENTO LONGITUD DE

FOLIAR PLANTA (CM)
l. Casa malla+CubCculo+vasos destapados 1.33 1.73
2. Casa malla+vasos tapados 2.60 1.88
De la tabla 6 se desprende como los ambientes 1 y 2 no mostraron diferencias en el

número de hojas muertas (1.6) para los tres clones, pero sí su influencia en la mortalidad
de plantas. El menor porcentaje de mortalidad (6.6%) se presentó en el ambiente 2.
Tabla 6. Promedio total de número de hojas muertas y

porcentaje de mortalidad de plantas de dos ambientes
en tres clones de ñame.
AMBIENTE No. HOJAS MUERTAS MORTALIDAD (%)
1. Casa malla + cubículo + vasos destapados 1.6 20
2. Casa malla + vasos lapados 1.65 6.66

Condiciones de aclimatación recomendadas

Como resultado de este trabajo, el ambiente 2 (casa malla + vasos tapados), mostró
mayor eficiencia para el incremento foliar, longitudinal y bajo porcentaje de
mortalidad. El clon japónico tuvo poco crecimiento y desarrollo en los dos
ambientes, y mayor porcentaje de mortalidad en el ambiente l. El clon chocoano
presenta un mejor comportamiento en los dos ambientes trab~ados, si se compara
con los clones espino y japónico. El ñame espino tuvo mayor incremento foliar,
mayor número de hojas muertas en el ambiente 2, y mayor incremento longitudinal
en el ambiente l.
Estos resultados se obtuvieron empleando en la experimentación poblaciones no

homogéneas de plántulas en edad, número de hojas y raíces, condiciones que se
espera que prevalezcan cuando se lleven materiales de ñame a adaptación en casa
malla. Es deseable y pertinente que se estudien ambientes con mayores diferencias a
los aquí evaluados, resaltando que la metodología y las variables contempladas son
apropiadas para generar resultados igualmente válidos. Igualmente, es importante
destacar que estos resultados sólo son válidos para las condiciones ambientales de la
región en la que se realizaron los experimentos. Para regiones con climas diferentes,
se puede emplear una metodología similar para generar la información requerida en
la propagación de plantas de ñame provenientes de condiciones in vitro (véase
fotografía 2).
Las condiciones encontradas con este trabajo se emplearán en el programa de

producción de semillas de ñame que se adelanta con el apoyo del gobierno de
Holanda. Sin embargo, durante estas actividades se continuará generando
información sobre la adaptación de plántulas de ñame a condiciones de casa malla y
vivero. Estas apreciaciones son igualmente válidas para establecer condiciones
bióticas y abióticas, incluyendo en éstas aspectos de nutrición y de prácticas culturales
(véase fotografía 3).
ACLIMATACIÓN DE PLANTAS IN VITRO 111
Fotografía 3. Etapa de trasplante a campo de plántulas de ñame obtenidas in vilro.

112 ÑAME: PRODUCCIÓN DE SEMILLAS POR BIOTECNOLOGíA
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viCro en el cultivo de ñame (Dioscorea alma L.)". Universidad Nacional de
Colombia, Santafé de Bogotá, mayo 11 al 22, 1998.
Este libro se terminó de imprimir
en el mes de junio de 2000
Universidad acional de Colombia
EDITORIAL UNIBIBLOS
Teléfonos: 3681437 - 3681443
Telefax: 3684240
Santafé de Bogotá, D.C.
__ C_o_rRoica Universidad de Córdoba

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Editores: Mónica Guzmán Barney, Ph. D.

Universidad Nacional de Colombia

Primera edición: junio de 2000

Preparación editorial e impresión:

Ministry ofForeign Affairs, Directorate General,

Centro de Estudios Ganaderos y Agrícolas, CEGA

Universidad Nacional de Colombia

Corporación Colombiana de Investigación

Prácticas agronómicas para el

Utilización de los sistemas in vitro

Caracterización y diagnóstico del género

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