ChIP

 protocol  
Chromatin  fragmentation  using  the  Covaris  S2  sonicator  
by  Ethan  Ford    (version  12/1/11)  
 
X-­‐link  Cells  
 
1. Grow  six  15  cm  plates  of  HeLa  cells  to  90%  confluency.  
2. Remove  media  and  add  wash  with  10  ml  of  PBS.  
3. Add  10  ml  Fixing  Buffer  with  1%  formaldehyde  (see  note  #1  and  #2).  
4. Incubate  5  min  at  room  temp  on  rocking  platform.  
5. Add  0.5  ml  2.5  M  glycine  to  each  plate  (final  concentration  0.125  M).  
6. Incubate  5  min  at  room  temp  on  rocking  platform.  
7. Pour  off  media  and  rinse  2x  with  PBS.  
8. Harvest  cells  with  10  ml  PBS  using  rubber  policeman  into  a  15  ml  tube.  
9. Rinse  plates  with  an  additional  5  ml  of  PBS  to  get  remaining  cells  and  
transfer  to  the  same  15  ml  tube.  
10. Spin  cells  down  at  3k  rpm  for  5  min.  
Prepare  Chromatin  
11. Remove  supernatant  and  resuspend  cells  in  15  ml  ‘Lysis  Buffer’.  
12. Incubate  10  min  on  ice.  
13. Spin  cells  down  at  4k  rpm  for  5  min.  
14. Remove  supernatant  and  resuspend  cells  in  10  ml  ‘Wash  Buffer’  
15. Spin  cells  down  at  4k  rpm  for  5  min.  
16. Repeat  steps  14  and  15  one  more  time.  
17. Carefully  remove  supernatant  as  to  not  disturb  the  pellet.  
18. Carefully  add  5  ml  ‘Shearing  Buffer’  and  very  gently  turn  tube  sideways  and  
twist  to  wash  all  the  ‘Wash  Buffer’  off  from  the  side  of  the  tube  while  leaving  
the  pellet  completely  intact.  
19. Spin  cells  down  at  4k  rpm  for  5  min.  
20. Repeat  steps  18  and  19  one  more  time.  
21. Resuspend  pellet  in  8  ml  ‘Shearing  Buffer’  
22. Transfer  sample  to  Covaris  TC12x12mm  Tubes  with  AFA  Fiber  being  sure  to  
fill  tubes  completely  (a  little  more  then  1  ml  per  tube  -­‐  see  note  #3).  
23. Sonicate  with  a  Covaris  S2  for  with  the  following  settings:  
Time         12  min  (see  note  #4)  
Duty  Cycle         5%  
Intensity         4  
Cycles  per  Burst       200  
Temperature         4˚C  
Power  mode  Frequency     Sweeping  
Degassing  mode       Continuous  
AFA  Intensifier     No  Intensifier  
Water  Level   8  (water  level  should  be  1  mm  below  
TC12x12  tube  cap)  
 24. Remove  samples  from  TC12  tubes  and  transfer  to  new  15  ml  tube.  
25. Repeat  sonication  with  the  rest  of  the  samples  and  combine.  
26. Add  10%  Triton  X-­‐100  and  5M  NaCl  so  that  the  final  concentration  of  the  
sample  is  1%  Triton  X-­‐100  and  150  mM  NaCl,  i.e.  to  8.70  ml  of  chromatin  add  
1  ml  of  10%  Triton  X-­‐100  and  300  μl  of  5  M  NaCl.  
27. Mix  and  transfer  to  8  microfuge  tubes.    
28. Spin  chromatin  in  microfuge  for  10  min.  
29. Combine  supernatants  in  a  new  15  ml  tube.  
30. Filter  chromatin  through  2  μm  syringe  filter.  
31. Remove  syringe  from  filter,  remove  plunger,  reattach  syringe  and  pass  an  
additional  1  ml  of  ‘IP  Buffer’  through  syringe.  
Immunoprecipitation  

32. Take  100  μl  of  chromatin  and  put  aside  for  input  control.  
33. Use  1  ml  of  chromatin  per  I.P.  (extra  chromatin  can  be  stored  at  -­‐80˚  C).  
34. Add  approximately  0.25-­‐1  μg  affinity  purified  antibody,  1-­‐2  μg  purified  IgG,  
or  1-­‐4  ul  crude  serum.  
35. Incubate  at  4°  C  overnight.  
36. Equilibrate  beads.  Prepare  one  1.5  ml  tube  for  each  for  each  
immunoprecipitatin  with  1  ml  ‘Shearing  Buffer’  and  desired  amount  of  
Protein  G-­‐Dyna  beads  to  each  tube.    Mix  by  inverting  and  spin  at  3k  rpm  in  
microfuge  briefly  to  get  liquid  off  top  of  tube.  Place  in  magnetic  rack  and  
remove  all  liquid.    Note:  Protein-­‐G  beads  are  a  significant  source  of  
background  so  it  is  best  to  use  as  few  as  possible.    The  stated  binding  
capacity  is  200  ng  antibody/μl.      
37. Add  the  chromatin  from  each  I.P.  to  the  appropriate  tube  with  equilibrated  
beads.  
38. Incubate  at  4˚  C  for  1.5  hours  in  tube  rotator.  
39. Spin  briefly  in  microfuge  at  3k  RPM.    Place  in  magnetic  rack  and  remove  
liquid.  
40. Use  filter  tips  for  all  remaining  steps.  
41. Wash  2  times  with  ‘Low  Salt  Wash  Buffer’.  Wash  instructions:    Add  1  ml  
Wash  Buffer,  mix  by  inverting  or  pipeting.    If  mixed  by  inverting,  spin  briefly  
to  get  liquid  off  the  top  of  the  tube.    Place  in  magnetic  rack  and  remove  all  
liquid.    Transfer  beads  to  a  new  tube  every  other  wash.  
42. Wash  2  times  with  ‘High  Salt  Wash  Buffer’  
43. Wash  1  times  with  ‘LiCl  Wash  Buffer’  
44. Wash  1  time  with  1ml  TE  pH  8.1.  
45. To  elute  chromatin  (ChIP’ed  DNA),  add  49  μl  Proteinase  K  Digestion  Buffer  
and  1  μl  Proteinase  K  (20  mg/ml).    –  To  your  Input  DNA  add  2  μl  10%  SDS  
and  1  μl  Proteinase  K  (20  mg/ml).  
46. Incubate  at  50˚C  for  15  min  with  occasional  vortexing.  
47. Place  ChIP’ed  DNA  in  magnetic  rack  for  2  minutes.  
48. Transfer  supernatant  to  new  tube.  
49. To  ChIP’ed  and  Input  DNA  add  3  μl  5M  NaCl  and  0.5  μl  30  mg/ml  RNase  A.  
 50. Reverse  X-­‐linking  by  incubating  4  hours  to  overnight  at  65˚  C  in  hybridization  
oven  to  prevent  condensation  on  top  of  tube.  
51. Add  1.5  μl  20  mg/ml  Proteinase  K.  
52. Incubate  1  hour  at  50˚  C.    Vortex  a  couple  times  during  incubation.  
 
Purify  DNA  with  AMPure  Beads  (See  note  #5)  
 
53. Add  50  μl  of  well-­‐mixed  Ampure  XP  beads  and  60  μl  20  %  PEG8000  1.25  M  
NaCl  
54. Mix  by  pipetting  up  and  down  several  times  (See  Note  9).  
55. Incubate  at  room  temperature  for  15  min.  
56. Place  on  magnetic  rack  for  5  min.  
57. Remove  and  discard  the  supernatant.    When  removing  supernatant  do  so  
very  slowly  with  pipetman  being  careful  not  to  take  any  beads.  
58. Keep  sample  in  magnetic  rack  and  add  900  μl  of  freshly  prepared  80%  
ethanol.  
59. Incubate  for  30  seconds.    Remove  and  discard  ALL  the  supernatant.  
60. Repeat  steps  58  and  59  one  more  time.  
61. Let  the  beads  dry  at  room  temperature  for  2  minutes.  
62. Add  45.5  μl  TE/10  and  pipet  up  and  down  several  times  until  pellet  beads  are  
completely  resuspended.  
63. Incubate  at  room  temperature  for  2  minutes.  
64. Place  in  magnetic  rack  for  5  minutes.  
65. Transfer  44  μl  of  the  supernatant  to  a  0.2  ml  PCR  tube.  
 
 
Post-­‐ChIP  analysis  
 
66. Use  4  μl  of  eluted  DNA  for  with  QuantIT  HS  DNA  Assay  Kit  (Invotrogen)  
67. Run  5  μl  of  input  DNA  on  a  2.2%  agarose  gel.  
68. Use  2.5  μl  DNA  for  qPCR.  
69. Use  10  ng  for  ChIP-­‐seq  library  preparation.  
 
Notes:  
1)  It  is  highly  recommended  to  use  formaldehyde  from  16%  single  use  ampules  or  
freshly  prepared  16%  formaldehyde  from  paraformaldehyde  (see  protocol  for  
preparing  16%  formaldehyde).    
 
2)  It  is  highly  recommended  that  you  try  a  time  course  of  crosslinking.  Different  
proteins  crosslink  at  different  efficiencies  to  the  chromatin.  It  is  also  possible  with  
some  proteins  to  increase  the  efficiency  of  your  ChIP  by  using  a  second  crosslinker  
such  as  DSG,  EGS  or  DMA.  
 
3)    It  is  critical  to  use  these  specific  tubes  from  Covaris  with  the  appropriate  tube  
holder.    It  is  also  critical  that  the  tubes  are  filled  completely.    If  your  sample  does  not  
fill  the  tube  add  extra  Shearing  Buffer  to  the  sample  until  the  tube  is  full.  
  
4)    To  optimize  chromatin  fragmentation,  during  sonication  remove  25  μl  aliquots  of  
chromatin  at  various  time  points.    A  good  start  is  2,  5,  10  and  15  min.    Each  time  
adding  an  additional  25  μl  of  shearing  buffer  to  sample  to  keep  tube  full.    Add  75  μl  
of  H2O  to  chromatin  aliquot  and  proceed  with  reverse  X-­‐linking,  Proteinase  K  
treatment  and  purify  with  Qiagen  MinElute  column  according  to  manufactures  
instructions.    Elute  with  30  μl  elution  buffer  and  run  3  μl  on  a  2.2%  agarose  gel.  
 
It  may  also  be  helpful  to  assess  the  integrity  of  your  epitope  during  the  shearing  
process.    To  do  so,  remove  5  μl  of  your  sample  at  each  time  point.    Add  25  μl  of  H20  
and  2  μl  5M  NaCl.    Incubate  overnight  in  hybridization  oven  or  PCR  machine  at  65˚  C.    
Run  10  μl  on  a  SDS-­‐PAGE  gel  and  Western  Blot  with  an  antibody  to  your  protein.  
 
5)  AMPure  XP  guidelines:  
  a)  Make  sure  that  you  achieve  a  homogenous  solution  of  the  beads  and  PEG  
by  pipetting  up  and  down  a  sufficient  number  of  times.  
  b)  When  removing  the  supernatant  after  the  binding  step,  I  remove  all  but  5  
μl  with  a  P200  pipetman  and  then  go  back  a  carefully  remove  the  last  5  μl  with  a  P20  
pipetman  unless  I  have  a  lot  of  samples  to  process,  then  I  just  remove  it  all  in  one  
step  with  the  P200.  
  c)  When  washing  with  ethanol  the  beads  stick  to  the  wall  of  the  tube  better  
so  you  can  remove  the  supernatant  more  quickly  and  less  carefully.    However,  I  
make  sure  I  remove  all  traces  of  ethanol  by  going  through  each  tube  a  second  time.  
  d)  At  the  elution  step,  when  transferring  the  eluted  DNA  to  a  new  tube  it  is  
important  not  to  accidentally  carryover  any  beads.  I  carefully  look  inside  the  tube  as  
I  am  pipetting  up  the  eluted  DNA  to  make  sure  I  don’t  accidentally  take  up  and  beads.  
Then  I  look  at  the  eluted  DNA  in  the  pipet  tip  see  if  I  can  see  any  beads.  If  there  are,  
simply  pipet  the  breads  back  into  the  tube  you  took  them  from  and  wait  a  few  
minutes  for  the  sample  to  separate  again  in  the  magnetic  rack.  At  this  step  it  is  
important  to  leave  at  lease  1.5  μl  behind  as  it  is  not  possible  to  remove  all  the  liquid  
and  not  take  any  beads.  
 
6)  This  protocol  can  easily  be  scaled  up  or  down.    The  number  of  cells  per  ml  of  
shearing  buffer  should  not  exceed  5x106  according  to  Covaris.  
 
Fixing  Buffer  
50  mM  Hepes-­‐KOH,  pH  7.5  
100  mM  NaCl  
1  mM  EDTA,  pH  8.0  
0.5  mM  EGTA,  pH  8.0  
 
Fixing  Buffer  with  1%  Formaldehyde  
9.375  ml  Fixing  Buffer  
625  μl  16%  formaldehyde  
note:  this  solution  must  be  prepared  fresh  and  used  immediately  
 
 
  
Lysis  Buffer  
50  mM  HEPES  pH  7.9  
140  mM  NaCl  
1  mM  EDTA  
10%  glycerol  
0.5%  NP-­‐40  
0.25%  Triton  X-­‐100  
 
Wash  Buffer  
10  mM  Tris-­‐Cl,  pH  8.1  
200  mM  NaCl  
1  mM  EDTA,  pH  8.0  
0.5  mM  EGTA,  pH  8.0  
 
Shearing  Buffer  
0.1%  SDS  
1  mM  EDTA  
10  mM  Tris,  pH  8.1  
 
IP  Buffer  
0.1%  SDS  
1  mM  EDTA  
10  mM  Tris,  pH  8.1  
1%  Triton  X-­‐100  
150  mM  NaCl  
 
Low  Salt  Wash  Buffer  
0.1%  SDS  
1%  Triton  X-­‐100  
2  mM  EDTA  
20  mM  Hepes-­‐KOH,  pH  7.9  
150  mM  NaCl  
 
High  Salt  Wash  Buffer  
0.1%  SDS  
1%  Trtiton  X-­‐100  
2  mM  EDTA  
20  mM  Hepes-­‐KOH,  pH  7.9  
500  mM  NaCl  
 
LiCl  Wash  Buffer  
100  mM  Tris-­‐HCl,  pH  7.5  
0.5  M  LiCl  
1%  NP-­‐40  
1%  Sodium  Deoxycholate  
 
 
 
 
Proteinase  K  Digestion  Buffer  
20  mM  HEPES,  pH  7.9  
1  mM  EDTA  
0.5%  SDS  
 
TE/10  
10  mM  Tris-­‐HCl,  pH  8.0  
0.1  mM  EDTA  
 
   
  
 
 
Figure  1.    Time  course  of  shearing  time  course  for  HeLa  chromatin.    Six  15  cm  HeLa  
plates  were  grown  to  confluence  and  cross-­‐linked  for  5  min  with  1%  formaldehyde  
according  to  protocol.    The  final  nuclear  pellet  was  resuspended  in  10  ml  of  shearing  
buffer.    1  ml  was  sheared  under  the  perameters  described  above.    25  μl  was  
removed  at  each  time  point  and  processed  as  described  in  Note  3  (above).  
 
  
 
Figure  2.    Western  blot  of  a  chromatin  bound  protein  after  Covaris  shearing  and  
reverse  cross-­‐linking.