Biología molecular

Para Alumnos de
Bioquímica y Biología Molecular de la ETSIA

Ignacio Frías Viera

2006
Sección I. Función y estructura de ácidos Nucleicos

Lección 1.- La estructura de la información en los seres vivos.

Bioquímica del DNA y RNA. Estructura primaria, secundaria y
terciaria del DNA y RNA. Modelos y estabilidad estructural del DNA.

Lección 2. Estructura cuaternaria de ácidos nucleicos. DNA

nuclear: cromosomas y cromatina. DNA cloroplástico, DNA
mitocondrial. Tipos de RNA.

Lección 3. Metabolismo de los ácidos nucleicos.

Síntesis y degradación de ácidos nucleicos. Rutas bioquímicas de
síntesis y degradación de nucleótidos.

Lección 4 Organización del genoma.

Genomas de Plantas. Estructura génica nuclear. Genoma de
bacterias y virus que interaccionan con plantas.

Sección II. Dinámica génica

Lección 5. Replicación del DNA.

Propiedades de las DNA polimerasas. Características dinámicas.
Telómeros. Mecanismos de fidelidad y reparación.

Lección 6. Transcripción del DNA: del DNA al RNA.

Dinámica de la transcripción eucariota. Tipos de RNA.
Procesamiento del mRNA.

Lección 7. Traducción del RNA.

RNA precursor del polipéptido. El código genético. Síntesis de
proteínas. Productos génicos finales. Modificaciones
postraduccionales.

Lección 8. Integración molecular del metabolismo.

Niveles de control en la expresión génica. Control epigenético.
Sección III. Herramientas en Biología molecular de Plantas

Lección 9. Manipulación y análisis de los Ácidos Nucleicos.

El Laboratorio Molecular. Técnicas de manipulación. Aislamiento de
DNA y RNA. Enzimas de restricción. Electroforesis. Transferencia.
Sondas e hibridación

Lección 10. Clonación del genoma.

Plásmidos y virus. Clonando genes en vectores. Librerías génicas.
Expresión “in vitro” de un gen. Secuenciación de DNA. PCR. RT-
PCR. DNA microarray.

Lección 11. Inserción de genes clonados en plantas.

Planta modificada genéticamente por inserción. Plantas modificadas
por otros métodos. Metodología para obtención de plantas GM.
Genes de interés para su uso como trans-genes. Métodos de
transformación. Aspectos destacables de los experimentos de
transformación. Importancia económica.

Lección 12. Temas especiales de Biología molecular de

Plantas.

Consideraciones especiales en el uso de especies transgénicas.

Plantas GM y la situación Canaria. Biodiversidad en variedades y
cultivos agronómicos preservados en Canarias: millo, tomate, papa.
Consideraciones especiales de algunas plantas usadas como
modelo de biología molecular. Arabidopsis y Millo. Evolución del
genoma de las plantas.
Bibliografía.

Referencias general de Libros básicos. Referencias general de

libros de biología molecular plantas. Paginas Web y link a Internet.
Lección 1.- La estructura de la información en los
seres vivos. Bioquímica del DNA y RNA. Estructura
primaria, secundaria y terciaria del DNA y RNA.
Modelos y estabilidad estructural del DNA.

La estructura de la información en los seres vivos.

La información en los seres vivos esta codificada

de forma universal en un tipo de molécula orgánica
ácida, cuya estructura básica es la de hetero-polímeros
lineales de los ácidos desoxirribonucleico (DNA) y
ribonucleico (RNA).

Se reconoce a los investigadores: Oswald T. Avery

(1877-1955), Maclyn McCarty (1911-) and Colin
MacLeod (1909-1972), el haber identificado por primera
vez, en el DNA, el carácter de codificación de la
información genética a partir de su demostración de
1944 del experimento de transformación, que en 1928
realizó Frederick Griffith (1877 or 1881 - 1941), sobre
la transformación del neumococo rugoso en liso, para lo
cual emplearon solo el DNA aislado. A pesar de ser
propuestos para el premio Nobel nunca se les concedió.
En una publicación de 1944 escribieron sobre la
naturaleza del principio transformante:

" Deoxyribonucleic acid (DNA) plays a central role in

determining specific characteristics in the course of
reproduction. If experimental results could be confirmed,
then nucleic acids must be regarded as possessing
biological specificity the chemical basis of which is as yet
undetermined."
The Journal of Experimental Medicine 79:137–156,1944.

El Dogma central de la Biología molecular

(Figura 1) define la dinámica de la información de la
siguiente forma: El flujo de información va desde el DNA
(en la que se almacena y conserva), hasta el RNA (en
que se transmite) y las Proteínas (la forma quimicamente
activa de la información).

Figura 1.1. Dogma Central Clásico

Todos los seres vivos poseen un sistema de
información que codifica los aspectos moleculares,
estructurales y de comportamiento químico. El embrión
situado en la semilla de una planta, por ejemplo, posee
la información que precisa para todos los aspectos
predeterminados de su existencia, desde el crecimiento
hasta su metabolismo, incluso hasta el momento de su
senescencia. Este bagaje informativo codificado en los
ácidos nucleicos se localiza, en las plantas, en los
núcleos celulares y en menor medida en mitocondrias y
cloroplastos (Figura 1.2). Mientras que en procariotas
aparece en forma libre en el citoplasmas en varias
formas diferentes.
Figura 1.2. Citología de una célula de planta vascular, ampliado una 5000
veces.

Excepciones al Dogma: podemos encontrar varios

tipos de excepciones a este proceso general, por un lado
tenemoss el caso de Organismos como los retrovirus,
los cuales poseen su información almacenada en forma
de RNA y no de DNA. por otro lado, la forma en que se
expresan los genes también esta controlada por factores
epigenéticos como las metilaciones en regiones
promotoras y codificantes de los genes (ver más
adelante), lo que en algunos casos inducen cambios
permanentes en la expresión del genoma que han sido
inducidos por el ambiente. Y por último existen algunas
procesos de sintesis de polipéptidos no dependientes de
mRNA, todos ellos son excepciones al proceso general
del flujo de la información genética.
Bioquímica del DNA y RNA.

Composición química de los ácidos nucleicos:

Los elementos químicos: H, O, C, N y P componen

la estructura de todas las formas de ácidos nucleicos,
elementos que son de las formas químicas más
abundantes en la corteza terrestre, y se distribuyen en
tres tipos moleculares básicos moleculares que se
indican a continuación:

Azúcares pentosa. 2 tipos: Ribosa y desoxi-

Ribosa
Fosfato inorgánico: PO4H2
Bases nitrogenadas. 2 tipos: Púricas y
pirimidínicas

Estas moléculas están unidas covalentemente entre si

para dar lugar a unas moléculas más complejas,
denominadas nucleótidos, los cuales representan la
unidad estructural y funcional de los ácidos nucleicos,
son estas unidades los monómeros con los que
construyen las largas cadenas del DNA y el RNA.

Los nucleótidos, por tanto, están compuestos por

una base nitrogenada, un azúcar y un grupo fosfato. Los
nucleótidos se diferencian en el azúcar, que distingue a
los dos grandes grupos: la desoxi-ribosa en el caso del
DNA (ácido desoxi-ribonucleico) o la ribosa en el caso
del RNA (ácido ribonucleico).

Dentro de cada grupo la distinción es en el tipo de

base que lo forman, así en los nucleótidos que forman el
DNA pueden encontrarse las siguientes bases: Adenina
(A), Timina (T), Guanina (G) y Citosina (C). La Adenina y
la Guanina son ambas Purinas y la Timina y la Citosina
son Pirimidinas. En cambio en los nucleótidos que
forman parte del RNA las bases que se encuentran son:
Uracilo (U), Adenina, Guanina y Citosina, donde el
Uracilo es una pirimidina (ver Figura 1.3).
Figura 1.3. Bases nitrogenadas, derivadas de purina o pirimidina, en el
DNA

La conformación espacial de los nucleótidos está

caracterizada por una estructura semi-rígida adoptando
lo que podemos considerar estructuras planares unidas
por enlaces sencillos, la conformación espacial absoluta
esta bastante restringida por las limitaciones estéricas
que imponen los voluminosos grupos en ocasiones
fuertemente polares (ver la secuencia de imágenes de
las Figuras 1.4:

Figura 1.4. Conformación espacial de un Nucleótido aislado de purina. El

esquema muestra la estructura en cajas del nucleótido.
Estructura primaria del DNA y RNA.

Tanto en el DNA como en el RNA, los nucleótidos

están enlazados mediante enlaces fosfo-di-éster entre
el grupo fosfato del C5’ y el grupo (-OH) del C3’,
formando cadenas lineales extremadamente grandes.
Son, por tanto: polímeros lineales de poli esteres, con
extremos ácidos. Las cadenas de DNA y RNA están
polarizadas con un extremo 5’ correspondiente al
fosfato libre unidos al Carbono 4 y un extremo 3’ con un
grupo hidroxilo libre que se encuentra unido a lCarbono
3. (Figura 1.5,6).

Fig. 1.5. Designation of chain direction and main chain atoms of i th unit in a
polynucleotide chain

Figura 1.6. Cadena de nucleótidos

La libertad de giro de los componentes de los
nucleótidos dentro de la estructura de DNA o RNA es
aún más restringida y se representa en la Figura 1.6.

Figura 1.6. Rotación y conformación espacial

Dado que los nucleótidos pueden tener diferentes bases,

resulta claro que el polímero posee una secuencia de
bases específicas, la cual en su forma de representación
más simple, se indica por letras que representan a las
bases solamente (se asume el tipo de azúcar que es
específico para el DNA o RNA). En el siguiente ejemplo
dos secuencias, de DNA y RNA, se muestran mediante
esta simplificación:

5´-AAGCTTC…
Una secuencia de DNA (dado que tiene T)

5´-AAGCUUC…
Una secuencia de RNA (dado que tiene U)

Estructura secundaria y terciaria del DNA y RNA.

 Las propiedades del DNA derivan en parte del
conjunto de enlaces de que consta la molécula. Hasta
ahora, solo hemos descrito las estructuras unidas
mediante enlaces covalentes, sin embargo otro tipo de
enlaces -no covalentes- están presentes en los ácidos
nucleicos. Las diferencias energéticas de unión entre los
diferentes tipos de enlaces en el DNA permiten el doble
carácter funcional de la molécula, por un lado la
estabilidad estructural de los enlaces covalentes y por
otro lado la flexibilidad de interacción dependiente de los
enlaces no covalentes y de las interacciones que estos
originan. en la siguiente tabla se sumarizan las energías
de estos enlaces:

Energía de enlace
Enlaces covalentes
(kJ/mol)
Enlaces sencillos
H-H 436
C-H 411
C-O 369
C-N 294
C-S 260
Enlaces dobles
C=C 616
C=O 704
O=O 402
Enlaces triples
C C 805
N N 955
Interacciones no
Energía
covalentes
Puentes de hidrógeno 4.2 - 8.4
Interacciones hidrofóbicas 4.2 - 8.4
Atracciones de Van der
4.2 - 8.4
Waals
Tabla 1. Energías de enlace entre átomos en el DNA.

Describiremos brevemente este tipo de interacciones:

Las interacciones denominadas puente de hidrógeno y
las denominadas interacciones hidrofóbicas,
permiten a la estructura del RNA adoptar diferentes
conformaciones estables en el medio acuoso y son
responsables de la estructura secundaria y de las
propiedades funcionales de la molécula. En el caso del
DNA estas interacciones dan lugar a un nivel más de
complejidad al permitir la formación de la doble hélice
anti-paralela primeramente propuesta por J. Watson y F.
Crick, en 1953.

De la interacción de todas estas fuerzas se obtiene una

estructura muy estable para el caso del DNA que es la
forma predicha que adopta esta molécula en los seres
vivos. Vamos ahora describiendo por parte estas
interacciones. Empezamos viendo los enlaces de puente
de hidrógeno entre nucleótidos:

Las bases nitrogenadas en la doble hélice del DNA se

encuentran enfrentadas y enlazadas por puentes de
hidrógeno, que se establecen entre los grupos
hidroxilos y las aminas I, II, y III de las bases
enfrentadas (Figura 1.7-10).

Figura 1.7. Par GC sún W&C.

Figura 1.8. Par AU sún W&C.

Figura 1.9.Conformación tridimensional: (a) Vista aislada del par G-C (b)
Representación de los pares A-T y G-C en la estructura del DNA.

En las moléculas de DNA la existencia de puentes

de Hidrógeno condiciona la estructura de la molécula,
estando esta formada por dos hebras anti-paralelas
cuyas secuencias de bases nitrogenadas se encuentran
formando secuencias complementarias.

En esta conformación particular se observa como las

bases nitrogenadas interaccionan en el interior de la
molécula y los fosfatos cargados se sitúan en el exterior
de ella, tal y como se aprecia en la Figura 1.7-8.
Dos aspectos en este punto son importantes: por un
lado, las bases no son co-planares totalmente existiendo
un pequeño giro definido como forma de propulsor. Por
otro lado existe un balanceo entre un par de bases con
respecto a sus vecinas. Por último el DNA puede
plegarse suavemente lo que permite adoptar formas en
el espacio, para arrollarse, por ejemplo, a otras proteínas
que reconocen las formas básicas de surcos mayor y
menor y pequeño, además de otras conformaciones
espaciales secundarias (Figura 1.12).

Por último, otras interacciones, también no

covalentes, pero aún más débiles que las de puente de
Hidrógeno, son las denominadas de tipo hidrofóbico o
van-der-Waals (dipolo inducido - dipolo inducido), las
cuales estabilizan las bases resonantes mediante
apilamiento.

Se concluye que la forma nativa (natural) del DNA es la

compuesta por dos polímeros es decir: un duplex, esta
estructura es particularmente estable gracias a las
numerosas interacciones o enlaces débiles del tipo
puente de hidrógeno descrito más arriba, junto a las
fuerzas débiles de interacción entre bases resonantes y
que en conjunto conforman la estructura tridimensional
del DNA. A pesar de repetirnos, indicamos que los
enlaces que se establecen son muy específicos de tal
forma que la Adenina y Timina forman una unión con
dos enlaces y la Guanina y Citosina forma otra unión con
tres enlaces, obsérvese que esta asociación
corresponde siempre a una purina junto a una pirimidina.

De esta complementariedad de bases se deriva una

importante propiedad: sea cual sea la secuencia de
bases de un polímero de DNA su hebra complementaria
debe poseer la secuencia complementaria ya que solo
así se encontrará una Timina frente a cada Adenina, o
una Guanina frente a cada Citosina y viceversa, en otras
palabra las dos hebras del DNA poseen secuencias
complementarias.

Todas las formas biológicas del DNA se caracterizan por

respetar estas características, y para ello precisan no
solo de que la secuencia de bases en ambas hebras sea
homogénea y complementaria, es decir una alta
proporción de bases debe estar en la forma correcta,
sino que, además, la concentración de agua y sales sea
la adecuada y se cumplan algunas otras restricciones.
Nunca hay que olvidar que la estructura tridimensional
del DNA que observamos depende de los parámetros
físicos del entorno.
Modelos estructurales del DNA:

El DNA duplex puede adoptar diferentes

estructuras. En condiciones fisiológicas encontramos la
denominada estructura B, B-DNA, concebido
inicialmente por los investigadores J. Watson, F. Crick,
R. Franklin y M. Wilkins, y publicado en Nature en 1953
( WATSON JD, CRICK FH. Molecular structure of nucleic
acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. Nature.
1953 Apr 25;171(4356):737–738), en este caso la
macromolécula está completamente hidratada y es la
forma predominante en la célula, es una estructura en
forma de hélice dextrógira, dado que los nucleótidos
han de girar ligeramente unos respecto de los otros para
establecer los puentes de hidrógeno con los de la
cadena adyacente, En esta conformación los nucleótidos
de purina se enfrentan a los de guanina, la Adenina
aparece enfrentada a la Timina y la Guanina lo hace con
la citosina explicando de esta forma las observaciones
de E. Chargaff de 1950-1951 (CHARGAFF E,
MAGASANIK B, VISCHER E, GREEN C, DONIGER R,
ELSON D. Nucleotide composition of pentose nucleic
acids from yeast and mammalian tissues. J Biol Chem.
1950 Sep;186(1):51–67). En el modelo ideal de B-DNA,
hay 10,4 nucleótidos por vuelta, correspondientes a una
altura de 33,2 Ángstrom (Å) y 20 Å de diámetro y
presenta dos surcos o depresiones: uno menor y otro
mayor, que lo estrechan repetidamente a lo ancho y que
se corresponden con los enlaces entre el azúcar y el
fosfato de cada nucleótido. La conformación fina y la
cadencia de estas depresiones son importantes puntos
de interacción con proteínas que se unen y regulan la
función del DNA.

El modelo de B-DNA propuesto por Watson & Crick,

parece el más habitual en la forma normal de las células.
A partir de la estructura del B-DNA se deducen
directamente las propiedades de transcripción y copia de
la información genética, lo que ya fué apuntado por los
autores en su trabajo original.

Otras conformaciones espaciales diferentes son la

conformación A-DNA (detectadas en fibras de DNA
deshidratadas). En una doble hélice dextrógira más
apilada y más gruesa al disponerse los nucleótidos en
un ángulo mas inclinado hacia el eje de la fibra, esta
conformación presenta 11 nucleótidos por vuelta y 24,6
Å de altura. Es frecuente en híbridos de DNA RNA o
cadenas dobles de RNA. La conformación denominada
Z-DNA, corresponde a una conformación levógira
posible cuando aparece un gran número de piridinas y
purinas alternadas (poli CG o poli AT) suidas y
alternadas en la secuencia, aparece igualmente cuando
se añaden compuestos químicos que interaccionan con
la estructura de la molécula como el agente intercalante
5
metyl-C. También aparece en condiciones de alta
fuerza iónica. Posee una conformación en zig-zag y no
parece relevante fisiológicamente, entre sus
características está el que posee 12 nucleótidos por
vuelta y 45 Å de alto.
Un resumen cuantitativo de propiedades de las formas
A, B, C y Z DNA se muestra en la Tabla 1. 2.
 Bases/
Forma Dirección Diámetro de la hélice
giro de 360o

A Derecha 11.0 23 Å
B Derecha 10.0 19 Å

C Derecha 9.3 19 Å
Z Izquierda 12.0 18 Å

Tabla 1.2. Propiedades de las formas A,B,C y Z-DNA

La molécula del DNA, especialmente la forma B-DNA, en

condiciones fisiológicas, presenta unos característicos
surcos denominados surco mayor y surco menor que
son debidos al diferente tamaño de las bases
nitrogenadas en la secuencia, y que posee importante
significado bioquímico al ser el punto de anclaje de
diferentes proteínas que identifican la forma específica
de estos surcos. De esta forma, por ejemplo, la
desoxiribonucleasa I reconoce el surco menor del DNA
e interacciona inespecíficamente con los fosfatos de la
secuencia. Otras enzimas, como por ejemplo la enzima
de restricción Eco RI, lo hacen sobre el surco mayor y
son dependientes de la forma y tipo de bases que lo
conforman, siendo por tanto capaces de identificar
secuencias específicas.

La estructura última del DNA forma lo que

denominamos genoma y corresponde a un conjunto de
una o varias de estas hebras de DNA duplex formando
agregados de una forma más o menos laxa. En
ocasiones los genomas de algunos organismos como las
bacterias y cloroplastos y mitocondrias (todos ellos con
el mismo origen evolutivo) las hebras de DNA están
unidas por los extremos, formando un circulo sin
extremos -P y -OH libres.
 En cuanto al RNA, al presentar este, un -OH en la
posición C2´ y al presentar Uracilo en vez de timina, se
imposibilita la adopción de conformación en B-DNA
(debido a la fuerte repulsión estérica y eléctrica sobre la
forma tan empaquetada del B-DNA, que el -OH adicional
del azúcar y el volumen del Uracilo muestran); esto, sin
embargo, no afecta a otras interacciones intracadena
entre sus bases nitrogenadas, lo que le permite adoptar
regiones con estructuras del tipo A-DNA.

Estabilidad estructural del DNA:

Físicamente, el DNA está unido por dos tipos de

enlaces, uno covalente, implicado en la estructura de la
molécula, y otro tipo de enlaces débiles (puentes de
hidrógeno, interacciones de van der Waals, e
interacciones en el entorno acuoso) implicados, estos
últimos, en la conformación espacial y en el
mantenimiento de la doble hélice del DNA. Resulta
evidente que al aumentar la temperatura en medio
acuoso, se rompan estos enlaces débiles y
consiguientemente se separen ambas cadenas
adoptando una conformación libre. Este fenómeno,
denominado desnaturalización, puede ser detectado
espectrofotometricamente (las bases, una vez rotos los
enlaces que estabilizan su estructura resonante,
cambian sus propiedades electrónicas, entre ellas la
propiedad de absorber luz de ciertas longitudes de onda
(260nm), en la misma forma que algunas sustancias
cambian de color al pasar de un estado hidratado a uno
seco). Por tanto y como se observa en la gráfica de la
Figura 1.14, la doble hélice absorbe menos luz que la
forma libre o desnaturalizada, cuya absorción se
aproxima a la de los nucleótidos libres. Este fenómeno
de desnaturalización térmica del DNA, es similar al
encontrado en las proteínas, sin embargo, y al contrario
que en estas, es un proceso reversible, es decir las
hebras complementarias de DNA pueden volver a unirse
restableciendo sus enlaces originales al disminuir la
temperatura. Este fenómeno se denomina
renaturalización y es más eficaz y rápido cuando los
fragmentos de DNA son pequeños, del orden de pocas
decenas de nucleótidos (Figura 1.14).

Figura 1.14. Diagrama de desnaturalización-renaturalización del DNA en

solución.

Lo destacable de este fenómeno, es el hecho de

que en el proceso de renaturalización se obtiene la
misma estructura de doble hélice que teníamos, es decir
las hebras siguen siendo las complementarias, en otras
palabras, en una mezcla de formas desnaturalizadas, la
renaturalización se produce siempre uniendo las hebras
complementarias. Por tanto, la renaturalización reconoce
las hebras que se complementan. Este experimento que
simula la apertura de la doble hélice es similar al que se
produce en los núcleos celulares y es la base de la
tecnología de los ácidos nucleicos como veremos más
adelante

Como ya hemos indicado, el RNA, al contrario que el

DNA, es un solo polímero de nucleótidos -formados de
ribosa y conteniendo Uracilo en vez de timina- que al
presentar potenciales enlaces de puentes de hidrógeno,
muestra secciones con estructura secundaria como el
DNA, aunque en este caso, con parte de su propia
cadena. Basados en la forma tridimensional del RNA y
en su función biológica se pueden encontrar diferentes
tipos de RNA:

RNA mensajeros (mRNA)

RNA de transferencia (tRNA)
RNA ribosómicos (rRNA)

Una interesante propiedad de los RNA (y también de las

hebras sencillas de DNA) es que pueden formar duplex
RNA-DNA, lo que es la base de la transcripción del DNA
y tiene importantes repercusiones para manipular el
genoma experimentalmente. Por otro lado, es de
destacar, tanto en el DNA como en el RNA, el que su
forma molecular depende de la secuencia de nucleótidos
que poseen, de esta forma aparecen diferentes tipos de
t-RNA, sún cual sea su secuencia lineal, formándose
formas complejas tridimensionales. En el caso del DNA,
el equivalente a la forma tridimensional del RNA aparece
representado a lo largo de la propia secuencia de surcos
mayor u menor, dando lugar a formas espaciales sobre
las que diferentes proteínas (frecuentemente con formas
complementarias a estas irregularidades) interaccionan
específicamente.
Ejercicios y problemas: lección 1.

Ejercicio 1.1.
a) represente la estructura química completa
correspondiente a las siguientes secuencias de DNA:

3’-AUG

5’-AUG

b) realice la misma representación pero con el la forma

estructural correspondiente al RNA:

Notas al ejercicio:
Compruebe la similitud estructural de la molécula con respecto la
cadena azúcar-fosfato
Reconozca las diferencias entre DNA-RNA
Observe la capacidad de las bases nitrogenadas para establecer
enlaces de puente de hidrógeno.

Ejercicio 1.2.
Represente la secuencia de la hebra complementaria a
la siguiente:

Notas al ejercicio:
Identifique los enlaces: covalente, puente de Hidrógeno y van der
Waals implicados.
Visualice la imagen tridimensional correspondiente.
Ejercicio 1.3: Cuantificación de DNA y RNA

Calcule la cantidad en ugr. de DNA de doble cadena

que tiene una solución conteniendo un plásmido pUC19
diluido a 5 ul/ 1000 ul en agua. Los valores de
absorbancia a 260nm = 0.789; y a 280 nm = 0.4475.
Determine la pureza del DNA
Respuesta:
(xµg/ml) / (0.789) = (50µg / ml) / (1.0 OD) x= 19.74 µg/ml
multiplicando por (1000 µl / 5 µl) = 3948µg dsDNA/ ml
La relación A260 /A280 del dsDNA es 0.789 / 0.447 = 1.76

Tutorial específico al ejercicio:

Los ácidos nucleicos absorben eficientemente luz ultravioleta

debido a la presencia de bases aromáticas nitrogenadas a lo largo
de las cadenas de DNA. La absorción de UV de DNA es una
característica de la molécula, que es usada eficientemente para
determinar su concentración. Cada una de las bases tiene su
propio y único espectro de absorción y por lo tanto contribuye de
manera diferente a la propiedad total de absorción de UV de una
molécula de DNA. Para muchas aplicaciones, el porcentaje de
contribución de cada una de las bases al espectro de absorción
de UV de una molécula de DNA de doble cadena de alto peso
molecular (dsDNA) puede ser ignorado. Sin embargo, esas
contribuciones son más significativas cuando se trata de
oligonucleótidos y deben ser consideradas si se requiere
determinar correctamente la concentración

Concentración en µg/ml de dsDNA de Alto Peso Molecular.

Para determinar la concentración de dsDNA de Alto Peso
Molecular, plásmidos o productos de PCR, se realizan mediciones
a 260 y 280 nm. Concentraciones tan bajas como 2.5µg/ml
pueden ser detectadas. A pH neutro, una solución de DNA a 1
mg/ml tiene una absorción máxima a 260nm de 20 cuando se lee
en una celda de 1cm. (este valor es para moléculas de dsDNA
con un contenido G+C de 50%. Sin embargo para muchas
aplicaciones en Biología molecular el contenido de G+C no es
necesario considerarlo a menos que sea muy extremo). En
principio una solución de dsDNA con una concentración de 50 µg
/ml debe tener una A260 igual a1.0.

1 (A260) unidad de dsDNA=50 µg /ml

Las proteínas tienen un máximo de absorción a A280
(principalmente por residuos de triptófano) las lecturas a esta
longitud pueden mostrar si existe algún contaminante proteico. El
cálculo de la relación A260 /A280 es una manera común para
expresar la pureza del DNA. Dependiendo de la composición
nucleica, un valor de 1.65 a 1.9 indican una muestra pura.
Debido a otros contaminantes una muestra con una relación
alta de A260 /A280 puede no necesariamente producir buenos datos
de secuencia. A veces también, una muestra con una baja
relación A260 /A280 puede secuenciarse bien.

Ejercicio 1.4: Cuantificación de DNA y RNA

¿Que volumen del Núcleo de una planta de Pino,

ocupan sus 100 cromosomas en anafase si cada
cromátida de estos ocupa 70 nm de ancho por 600 nm
de largo? suponga que son un cilindro completo y que la
sección del núcleo es completamente esférico y tiene un
diámetro de 1 metro?

Tutorial específico al ejercicio:

1 metro = 10 nm
Volumen de un l cilindro Recto :

•
•
•
•
•
•

Un cilindro recto, de base circular, es un cuerpo formado por dos

caras circulares paralelas, como base, cuyos centros pertenecen
a un smento de recta perpendicular a ambos círculos, y por una
superficie que las rodea por su borde, como muestra la figura
adjunta.
El volumen de un cilindro recto de base circular de radio r y altura
h se obtiene multiplicando el área de la circunferencia basal por la
altura h.
Sabemos que el área de un círculo de radio r es:
Acírculo = p · r2
El volumen del cilindro cuya base es el círculo descrito
anteriormente se obtiene multiplicando el área de dicho círculo por
la altura del cilindro, es decir:
Vcilindro = Acírculo · h o sea:

volumen de una esfera:

El volumen de una esfera de radio r se obtiene a través de la

fórmula:

Ejercicio 1.5: Calculo de moles de DNA

A Partir de un núcleo de una célula de Pino conteniendo

DNA que ocupan la mitad del núcleo (esférico de 1
metro de diámetro) Y que un cromosoma que ocupa un
tamaño de 140 nm x 1200 nm, Calcule:
1.- ¿Que masa en gr. contiene de DNA?
2.- ¿Cuantos cromosomas contiene?
3.- ¿Cuantos moles contienen los nucleótidos de A-T de
dicho núcleo?, teniendo en cuenta que en pino la
proporción AT/GC es = 1

Tutorial específico al ejercicio:

Volumen de una esfera:

El volumen de una esfera de radio r (Un núcleo ideal) se obtiene a
través de la fórmula:
Calcule primero el volumen ocupado por el DNA y asuma que su
densidad es 1.
Luego Calcule el ocupado por los cromosomas y el número de
estos, teniendo en cuenta:
El volumen de un cilindro (un cromosoma ideal)

es

A partir de este valor, determine los moles teniendo en cuenta

que:
El peso molecular medio aproximado que proponemos es:
dAMP= 400
dCMP = 250
dGMP= 400
dTMP=250
por tanto, El pm medio de un par de nucleótidos AT (pb) es de=
650 aprox.
Luego:
1 pmol de dsDNA (AT) de 1 kb es de : 0,66 x 1 gr/ 2 = 0,33 gr
de este valor puede deducir el que se pregunta mediante una
regla de tres.
1 pmol (T)----------------------------> 0,33 gr
x <------------------- Volumen en gr del DNA

Ejercicio 1.6: Calculo de la TM. Esta práctica-

ejercicio recurre a software online.

Determine el valor de TM para los siguientes oligos:

5´-TGCTTTGGTTTGGGTGATTGC

5´-TTTGCTTTTQCTGTCCTCTGC

Respuesta:

Calculo de Tm

Aquí teclea tu secuencia

 TGCTTTGGTTTGGGTGATTGC

21 41
Longitud : Tm = °C
48
Peso Molecular
%(C+G) : 6546
: g/mol

Nota: Este calculo de Tm se basa en una concentración

de 0.050M de Sal (Catión Monovalente), y utiliza la
ecuación:
Tm = 81.5 - (16.6 * log[Na]) + 0.41 * %(C+G) -
675/longitud

Tutorial:

La Temperatura de Fusión, Tm, de un oligonucleótido es un valor

de crítica importancia. Su determinación más confiable y exacta
es empírica [1a], sin embargo, es bastante tediosa [1b].
Muchas fórmulas útiles y prácticas se han desarrollado para
calcular la Tm para experimentos de PCR, Southern, Northern, y
para hibridizaciones in situ
Los principales factores que afectan este valor son:
concentración de sales, concentración de ADN, presencia de
agentes desnaturalizantes (DMSO o formamida), secuencia,
longitud y condiciones de hibridación.
La ecuación más simple para calcular la Tm está dada por la
Regla de Wallace[2]:
(1) Tm = 2(A+T) + 4(G+C)

En donde A, G, C, y T corresponden al número de cada nucleótido

presentes. Esta ecuación se desarrolló para oligos '
cortos'de 14 a
20 bases que hibridarían con sus correspondientes
complementarios unidos a una membrana con una concentración
de NaCl 0.9M
Por ejemplo, la Tm para la secuencia TGCTCA es: 2(1+2) +
4(1+2) = 18 °C.
La naturaleza de la cadena complementaria inmovilizada
provee un decremento neto en la Tm observada cuando tanto la
sonda como el complementario están libres en solución. Esta
variación es de 7 a 8 °C
 Otra ecuación familiar[3] para ADN que también es válida para
oligos mayores de 50 nucleótidos en pH' s de 5 a 9 es:
(2) Tm = 81.5 + 16.6 log M + 41(XG+XC) - 500/L - 0.62F

En donde M es la concentración molar de cationes

monovalentes, XG y XC son las fracciones molares de G y C en el
oligo, L es la longitud de la cadena mas corta en el '
duplex', y F es
la concentración molar de formamida
Esta última ecuación es la más conveniente por incluir ajustes
para dos de los agentes mas comunes que afectan las
temperaturas de hibridización : concentración de sales (a pesar de
no estar definida cuando M=0) y concentración de formamida
Así, para la secuencia anterior y con M = 0.9, and F = 0 :
Tm = 81.5 + 16.6(log(0.9)) + 41(.17+.33) - 500/6 - 0.62(0) = 17.9
°C.
Lección 2. Estructura cuaternaria de ácidos
nucleicos. DNA Nuclear: Cromosomas y cromatina.
DNA cloroplástico y mitocondrial. Tipos de RNA.
_____________________________________________

Estructura cuaternaria del DNA

La estructura III del DNA se asocia a los Súper

enrollamientos, tanto a la derecha torsión + como a la
izquierda torsión -. El grupo de enzimas más importante
encargadas de este proceso son las Topoisomerasas
que empaquetan el DNA en estas formas torsionales
(por ejemplo en E coli, el DNA se encuentra súper
enrollado a la izquierda, unas 20 000 vueltas
adicionales), o bien, restablecen la forma original de
DNA súper enrollado (por ejemplo en el momento de la
duplicación del DNA como se verá mas adelante). En
adición a esto, el DNA adopta estructuras en conjunto
con proteínas en procesos complejos donde participan
muchas de estas y cuyas formas estructurales se
definen en el siguiente apartado. Por tanto, la forma
tridimensional natural del DNA consiste en estructuras
súper enrolladas unidas a complejos de proteínas
específicas, formando por tanto estructuras espaciales
complejas denominadas, de forma genérica,
nucleoproteínas.

DNA Nuclear: Cromosomas y cromatina.

El material genético de eucariotas, como lo son las

plantas superiores, se encuentra distribuido en
cromosomas compuestos por una única larga molécula
de DNA (Figura 2.1). La estructura básica de estos
cromosomas es la misma desde el hombre hasta el millo
y consiste en un estrecho arrollamiento entre el DNA y
unas proteínas básicas denominadas histonas que
conforman una estructura tridimensional que puede
visualizarse mediante la microscopía electrónica. Esta
forma ordenada de empaquetar el DNA es importante ya
que hebras de DNA de hasta 2m de longitud pueden
empaquetarse eficazmente en los 10µm (10x10-6 m) de
diámetro de un núcleo vegetal.

Figura 2.1. Niveles de empaquetamiento de los cromosomas

Se denomina cromatina a la asociación entre el

DNA y las histonas formando un continuo formado por
complejos DNA-proteína unidos por smentos lineales de
DNA, a modo de cuentas en un collar, y a su vez
compactados sobre si mismos en secuencias de orden
superior. La forma más empaquetada corresponde con
lo que conocemos como cromosomas, los cuales en la
célula viva pueden encontrarse en los procesos de
división y visualizarse mediante microscopía óptica. En
células activas fisiológicas la cromatina aparece menos
estructurada y muestra cambios conformacionales y de
empaquetamiento relacionados con la actividad génica
del DNA.

La función biológica de la cromatina es compleja y

no está totalmente desvelada. La cromatina posee un
evidente papel estructural además de un papel en la
regulación de la expresión de los genes que contiene
mediando en la identificación de zonas de
reconocimiento por parte de proteínas con diversa
función en la expresión del DNA. Por otro lado, los
cromosomas se comportan como unidades estructurales
durante la meiosis y por tanto poseen un importante
papel evolutivo. Sin embargo hay que recordar siempre
que en sentido estricto la información genética está
codificada, como sabemos, por la secuencia de
nucleótidos del DNA, las formas de empaquetamiento
del DNA como la cromatina y los cromosomas, a la que
nos estamos refiriendo solo poseen función estructural y
no genética.
Como se observa en la Figura 2.1. La cromatina se
empaqueta en formas globulares características, de 30
nm ancho, que al agregarse entre sí originan fibras de
hasta 700 nm ancho. Estas fibras se corresponden con
la forma desenredada de los Cromosomas vistos en la
metafase del ciclo celular (2 x700= 1400 nm ancho)

Nucleosomas:

Las proteínas de carácter básico (Histonas ricas en

Lys) junto con el DNA forman complejos o unidades
discretas denominadas Nucleosomas. La base
estructural de la cromatina. Estas proteínas forman parte
del alrededor de la mitad de la masa de la cromatina.
Hay 5 clases principales de histonas: H1, H2A, H2B, H3
y H4, todas ellas contienen una gran cantidad de
residuos cargados positivamente (Arg y Lys).
Histonas y DNA se empaquetan en complejos discretos,
estos complejos están formados por asociaciones de
proteínas de 10 nm ancho y aproximadamente 150-200
pares de bases (pb), formando octámeros con la
siguiente composición: H1 (H2A, H2B, H3, H4) x 2. La
Tabla 2.1 muestra algunos datos bioquímicos de las
histonas.

Histona Número residuos Masa (kD) %Arg %Lys

UEP*

(x10-6 años)

H1 215 23.0 1 29
8
H2A 129 14.0 9 11
60
H2B 125 13.8 6 16
60
H3 135 15.3 13 10
330
H4 102 11.3 14 11
600

*Unidad de periodo evolutivo: es el tiempo en el que la secuencia de

aminoácidos de una proteína cambia en 1% después de que dos especies
divergen. Por tanto están conservadas evolutivamente (su función es tan crítica
que no soportan cambios).

Tabla 2.1. Propiedades de las Histonas.

Las histonas sufren modificaciones

postraduccionales como metilaciones, acetilaciones y
fosforilaciones en residuos específicos de Arg, His, Lys,
Ser y Thr. La mayoría de estas modificaciones revierten
al alterarse la carga de la proteína, lo que ocurre, por
ejemplo, al unirse al ADN. En otros casos, las
modificaciones están controladas por otras proteínas
reguladoras. Las modificaciones de las histonas son
diferentes dependiendo del tejido o el estado del ciclo
celular en que se encuentra la célula. Por ejemplo, el
10% de la H2A tiene unido en el grupo ε de la Lys119 en
el carboxilo terminal a la proteína ubiquitina. En
general, esta señal en el citoplasma se traduce en la
degradación de la proteína.

Los Nucleosomas forman una estructura ordenada

sobre el DNA tal y como se muestra en la Figura 2.3. y
forman los gromerulos descritos en la Figura 2.1. Estas
estructuras que arropan al DNA son modificadas a fin de
hacer accesible partes de la secuencia (en un proceso
dependiente del momento fisiológico, de la célula, etc.) a
las proteínas implicadas en la síntesis y translación de la
información genética. (El nucleosoma sin la Histona H1,
es la forma propuesta como unidad de regulación de la
transcripción)

Figura 2.3. Modelo de de un nucleosoma (A. P. WOLFFE & J. J. HAYES –

publicado en. Chromatin disruption and modification. - Nucleic Acid
Research, 27, 711-720,1999) y modificado por el autor.

Orgánulos:
Los orgánulos de las células eucariotas han
evolucionado a partir de primitivas formas de
colaboración entre células primitivas, por tanto
complejas formas de interacción entre los genomas de
las células huésped y sus hospedadores han dado lugar
a un equilibrio en el que unos genes han permanecido
confinados en el genoma del orgánulo y otros en el
nuclear, lo que vemos actualmente es el resultado de
varios procesos de este tipo donde generalmente los
orgánulos han minimizado su genoma a expensas del
nuclear. De forma general los genomas organulares son
circulares es decir, que sus extremos 3´-5´ están unidos
entre si y están presentes en varias copias.

DNA Mitocondrial:

Este genoma es circular y además posee muchas

copias del genoma en cada mitocondria. Es de tamaño
muy variable dependiendo de la especie, y se ha
formado por sucesivos procesos de recombinación y
duplicación.

DNA Cloroplástico:

Al igual que el mitocondrial es un DNA Circular, al

contrario que aquél es muy homogéneo entre especies,
presenta pocas copias.

Estructuras del RNA.

Todas las formas del RNA pueden adoptar

conformaciones espaciales al igual que el DNA, aunque
solo en regiones discretas.
La capacidad de formar puentes de H de las bases
nitrogenadas es la propiedad que permite la formación
de estructura secundaria en el RNA y por tanto depende
la orientación y distancia a la que se encuentran estos
grupos.

RNA mensajero (mRNA): Su función, al ser portador

del mensaje, requiere una disposición abierta. Adopta
algunas conformaciones espaciales pero es la forma
menos estructurada, casi siempre en forma lineal sin
forma II.
RNA Ribosómico (rRNA): Forma estructuras
estabilizadas por enlaces intracadena y también con
proteínas formando los ribosomas. Su estructura y
función se corresponde con la síntesis de proteínas en el
citoplasma o celular. Por tanto a la estructura secundaria
que pueda formar hay que sumarle su capacidad para
adoptar estructura III con proteínas del complejo
ribosoma.

RNA Transferente (tRNA): Forma estructuras

secundarias definidas en dominios (ver Figura 2.4), uno
de ellos es específico para la unión a aminoácidos; otro
de ellos es específico para la unión a un triplete de
bases nitrogenadas. Aparte de estos dominios, posee
zonas de interacción con ribosomas y mRNA. Su papel
estructural se relaciona con su función, al igual que los
casos anteriores, estando relacionado con el citoplasma
celular u organular y sirviendo de transportador de
aminoácidos al ribosoma.

Figura 2.4. Estructura secundaria del t-RNA, donde las zonas identificadas
se corresponden con las siguientes: Unión a áa (Aceptor); Unión al
mRNA (anticodon loop).
Ejercicios y problemas: lección 2.

Ejercicio 2.1: Ddesnaturalización del DNA

En un experimento de desnaturalización de DNA de

doble cadena, se encuentran las siguientes moléculas
de DNA de una sola hebra que han sido
desnaturalizadas a 75ºC:

5´-AAATTTGTGAACCTTT-3´
5´-GGGTTTACCCTGGAG-3´
3´-ATGCATCGTAGCTAT-5´
3´-AAAGCTATACGGCAA-5´
3´-ATGCATGCATGAACATGCATGCATGCATGC-5´
________________________________________
________________________________________
________________________________________
______________________________________
________________________________________

a scriba en los espacios las secuencias

complementarias que también se encuentran
desnaturalizadas

b) Cuales son las secuencias que aparecerán unidas

tras disminuir la temperatura y producirse la
renaturalización.

c) Cuales de estas secuencias aparecerá renaturalizada

en primer lugar y cual la última.

d) Si añadimos las siguientes secuencias marcadas

radiactivamente (sondas):

5´-GCATGAAC-3´
3´-GCATGAAC-5´
a: Cual de las sondas se unirá al DNA.
b:, Que hebra de DNA se marcará.
Ejercicio 2.2: Desnaturalización del DNA

¿Cual de estas afirmaciones NO es cierta acerca de la

hibridación del DNA?

A-Depende de paridad entre pares de bases

B-Un polisacárido puede hibridar con una hebra de DNA
C-Una hebra de DNA puede hibridar con otra hebra de
DNA
D-Una hebra de RNA puede hibridar con una hebra de
DNA
E-La doble hebra de DNA se desnaturaliza a alta
temperatura

Respuesta:
B
Tutorial específico al ejercicio:

Desnaturalización del DNA

Tanto el DNA como el RNA pueden formar híbridos en solución
con moléculas de RNA y DNA que tienen complementariedad en
sus bases. La doble hélice puede desnaturalizarse con calor. Si
las hebras simples obtenidas, se enfrían suavemente las hebras
complementarias pueden volver a reunirse y formar el DNA doble
de nuevo, lo que se muestra en los siguientes diagramas:
Apareamiento entre DNA y RNA
La relación de apareamiento es como sabemos de A con T y G
con C
Una molécula de RNA puede formar también un par RNA -DNA
duplex con un DNA con el que muestre complementariedad de
bases. La forma más común de esto ocurre en la hebra
complementaria que es molde para la síntesis de RNA, tal y como
se ilustra en la figura:
Lección 3. Metabolismo de los ácidos Nucleicos.
Síntesis y degradación de ácidos nucleicos. Rutas
bioquímicas de síntesis y degradación de
nucleótidos.
_____________________________________________
_______

Síntesis y degradación de ácidos nucleicos.

La economía de los seres vivos se manifiesta en

múltiples aspectos de la biología celular, no es por tanto
de extrañar que tanto la síntesis como las funciones de
los nucleótidos cumplan este requisito, es más, resulta
innumerable el numero de funciones diferentes que tanto
nucleótidos, como compuestos similares que podemos
denominar nucleótidos modificados, cumplen en el
metabolismo, la regulación, el transporte de energía o la
señalización, aparte de su función fundamental como
sillares de los genes y del genoma in extenso.
Dejaremos por tanto para un buen texto de bioquímica la
descripción de las funciones de estos compuestos
metabólicos y nos centraremos en aquellos aspectos
relacionados con los componentes de la arquitectura
génica.

En la mayoría de las células, es posible la creación

de nucleótidos a partir de las rutas de síntesis del
metabolismo intermediario. Estas rutas se denominan
Rutas de novo y son universales (con excepciones como
siempre en biología) a todos los organismos. Sin
embargo, cuantitativamente, estas rutas no pueden
suplir los requerimientos estructurales del metabolismo
de ácidos nucleicos, normalmente vigoroso y extremo en
la división celular y en otros procesos celulares donde
son necesarios grandes aportes de estos compuestos.
Para satisfacer los requerimientos de precursores,
existen, de forma alternativa a las rutas de síntesis, las
denominadas rutas de salvamento, donde se
recuperan los compuestos de purina y pirimidina de
productos de degradación. Las rutas de salvamento,
frecuentes en animales, son cuantitativamente
despreciables cuando nos referimos a las plantas
autótrofas en condiciones óptimas de crecimiento.

Síntesis de novo de nucleótidos:

Las rutas de biosíntesis de nucleótidos en las

planta proceden por rutas que son universales, en los
aspectos generales, tanto a plantas como a animales.
Los anillos de purina y de pirimidina son un paso clave
en la síntesis de nucleótidos. El primero se forma a partir
del azúcar ribosa, formándose enlaces adicionales que
completan la estructura de la purina. El anillo de
pirimidina se organiza a partir de una molécula
denominada orotato, el cual se une a ribosa-fosfato y
origina el primer nucleótido de pirimidina precursor de
los demás.
En ambas vías, purinas y pirimidinas, los precursores de
los nucleótidos son de dos tipos aminoácidos
frecuentemente Glicina (para las purinas) y Aspartato
(para las pirimidinas) a los cuales se le unen, o se
incorporan azucares, predominantemente el PRPP
(fosforribosil-pirofosfato) derivado de la ribosa-5-fosfato.
La participación del ATP es fundamental a este nivel a
fin de aportar la energía necesaria para los procesos de
síntesis.

Síntesis de Purinas:

La síntesis de purina se genera a partir de un

compuesto inestable formado por la fusión entre el
PRPP y el grupo amino de la glutamina, posteriormente
se añade parte de la molécula de glicina, se incorpora
grupos amina, aspartato y fumarato con lo que se
obtiene el precursor IMP (Inosina monofosfato). Toda
esta ruta de al menos diez enzimas funciona en forma
de complejo multienzimático por lo que además de ser
una ruta metabólica, también es un macro-complejo
enzimático generador de IMP. La síntesis del AMP
deriva del anterior tras la incorporación de un grupo
amina procedente del aspartato, en un proceso que
requiere energía del GTP. La regulación de la ruta se
ejerce por retro-inhibición: la primera enzima de la ruta,
la glutamina-prpp amidotransferasa es inhibida por
IMP, AMP y GMP productos finales de la ruta. Puntos de
regulación más finos controlan los niveles de los
diferentes intermediarios.
Los nucleótidos monofosfato se transforman en
nucleótidos trifosfatos por acción de diferentes enzimas,
entre ellas la adenilato quinasa (ATP + AMP ----> 2
ADP) y que rinde ADP y la fosforilación oxidativa que
regenera dos ATP. Por otro lado las nucleótido
monofosfato quinasas, enzimas citosólicas generan
dinucleosidosfosfato a partir de sus correspondientes
monofosfatos mas ATP. La Figura 3.1 muestra las rutas
metabólicas generales de la síntesis de pirimidinas.

Figura 3.1. Esquema General de la síntesis de pirimidinas en el

metabolismo
Síntesis de Pirimidinas:

La síntesis de pirimidina se origina en el

aspartato, primeramente sintetizando el anillo de seis
átomos de la base y luego incorporando la ribosa-5-
fosfato, la síntesis del anillo da como intermediario al
oroato, producto final de otra cadena multienzimática.
Posteriormente, el oroato incorpora PRPP conformando
la estructura azúcar-anillo típica de pirimidinas como el
UMP. Este precursor sufre la adición de dos moléculas
de ATP para dar UTP y la incorporación de amonio
gestiona la síntesis de CTP. La síntesis está regulada
por retroinhibición, el producto final CTP inhibe a la
primera enzima de la ruta la aspartato-carbamoilasa.
Los desoxirribonucleótidos se forman a partir de
los ribonucleótidos en una reacción directa de reducción
del hidrógeno en posición 2 del sundo carbono en una
importante reacción catalizada por la ribonucleótido
reductasa. Esta enzima es prototípica y modelo para los
mecanismo de catálisis en que están implicados
radicales libres, productos frecuentes en el potente
metabolismo oxidativo de las plantas y sobre los que se
dudaba acerca de su participación en reacciones
enzimáticas. Además la enzima esta delicadamente
regulada de tal forma que su especifidad y la velocidad
de síntesis esta regula por los productos finales, los
desoxirribonucleótidos, de forma que se garantiza un
aporte equilibrado de precursores para la síntesis de
DNA. La Figura 3.2 muestra el metabolismo general de
purinas.
Figura 3.2. Esquema General de la síntesis de purinas en el metabolismo

Degradación de Purinas y Pirimidinas:

En plantas, los nucleótidos originados en la

degradación de DNA y RNA son prácticamente
recuperados mediante las vías de salvamento que lo
reincorporan a moléculas de ácidos nucleicos en
formación. La Adenosina fosforribosiltransferasa,
transforma, por ejemplo, la adenina libre al
correspondiente nucleótido AMP empleando PRPP
como sustrato. En plantas se establecen además vías
alternativas tanto de acumulación como de
transformación que actúan sobre los productos de
degradación de ácidos nucleicos. Por último las plantas
poseen mecanismos propios de acumulación de los
denominados productos finales, en regiones exteriores al
sistema celular. Muchos de estos depósitos contienen
elementos biológicos importantes para la industria y la
medicina.
Lección 4. Organización del Genoma.
Genomas de Plantas. Estructura génica nuclear.
Genoma de bacterias y virus que interaccionan con
plantas.

Organización del Genoma.

EL genoma de todos los seres vivos está

contenido en la estructura primaria de los ácidos
nucleicos. Podríamos definirlo como la información
codificada que puede extraerse de la secuencia de
nucleótidos que posee un organismo de una especie
determinada. Este conjunto se secuencias responsables
de la expresión de un RNA se definen como genes y
representan solo una parte de la estructura total del DNA
de una especie.

Existe una correlación aproximada entre la complejidad

de un organismo y el número de estas secuencias
organizadas. Por otro lado los organismos altamente
especializados como los virus han minimizado la relación
número de genes respecto de dotación génica total
hasta un mínimo y en ocasiones se observan
solapamientos en las secuencias de DNA y otros
procesos de optimización de la información. Es difícil
adaptar la noción de tamaño a la escala molecular del
DNA, a ese nivel, los procesos macroscópicos no
siempre se manifiestan en la forma que conocemos para
las relaciones entre materia y energía.

Relación entre complejidad del genoma y

complejidad evolutiva:

De forma general podemos asumir que los

organismos más complejos poseen genomas mayores,
ya que requieren un número mayor de genes para
codificar su funcionamiento. Los virus muy pequeños
como el del mosaico del tabaco poseen genomas
pequeños codificando para la dotación completa de
genes y por tanto proteínas y enzimas que necesitan
para su ciclo vital. Un virus pequeño puede poseer
aproximadamente 3 x 106 Dalton (5 x 103 pares de bases
o 5 kbp ), pudiendo llegar a los 108 Dalton; mientras,
una bacteria como E. coli posee 2,5 x 109 Dalton y una
longitud de 1 milímetro.

El genoma de levaduras una eucariota unicelular,

posee 17 cromosomas, cada uno de ellos está
compuesto por una larga molécula de DNA. Por último,
frecuentemente, los cromosomas de plantas superiores
varían desde plantas con pequeños genomas como la
pequeña mostaza (Arabidopsis sp.) con un tamaño de
108 Dalton (aprox. 10 veces el de la levadura) hasta
plantas con valores enormes del orden de 1011(como es
el caso de algunos lirios) distribuidos en múltiples
cromosomas que poseen varias copias del mismo gen.
El hombre, con una dotación de 4 x 109 Dalton, ocupa
una posición intermedia en esta escala (ver Figura 4.2 y
Tabla 4.1) con unos aprox. 100 000 productos génicos
generados de unos 30 000 genes básicos que tras la
secuenciación general completa, están siendo ubicados
en la secuencia de los cromosomas completa en el
programa multinacional denominado proyecto genoma
humano. De especial relevancia para nosotros es el
denominado proyecto arabidopsis que, con medios
más modestos ha secuenciado el genoma de esta
planta.
 Figura 4.2. Relación entre tamaño del genoma y especies

Homo sapiens (humano) 46

Mus musculus (ratón casa) 40
Zea mays(millo) 20
Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) 8
Xenopus laevis (rana de Sudáfrica) 36
Caenorhabditis elegans (gusano microscópico) 12
Saccharomyces cerevisiae (levadura del pan) 32
Canis familiaris (perro doméstico) 78
Arabidopsis thaliana (mostaza salvaje) 10
Muntiacus reevesi (cérvido rumiante) 23
Muntiacus muntjac (pariente europeo) 6
Myrmecia pilosula (ante) 2
Parascaris equorum var. univalens (gusano parásito) 2
Cambarus clarkii (pez ) 200
Equisetum arvense (helecho) 216

Tabla 4.1. Número diploide de algunos organismos comúnmente

estudiados (ejemplos extremos)
ESTRUCTURA GENICA NUCLEAR

Los grandes genomas eucariotas, como los de las

plantas superiores, poseen un tamaño no directamente
relacionado con la necesidad de un numero determinado
de genes (Tabla 4.1), la secuenciación exhaustiva de
largas regiones del genoma de una especie como
Arabidopsis thaliana ha puesto de manifiesto la
existencia importantes regiones que no codifican
directamente para proteínas. Por tanto, y de acuerdo a
esto, se puede dividir el genoma en regiones génicas y
regiones no-génicas.

Regiones Génicas:

Una importante fracción de las secuencias de DNA

de los genomas de plantas corresponde a regiones que
codifican para proteínas, también denominadas:
regiones génicas.

Los Genes son unidades funcionales discretas del

DNA, sin solución de continuidad con el resto de la
secuencia del DNA. La definición de gen es por tanto
funcional, no estructural, y se asimila a la información
requerida para la síntesis de un polipéptido (un mRNA)
o de un RNA no mensajero. Esto implica que las
secuencias de los genes no tienen porque encontrarse
de forma contigua u homogéneamente direccionada,
como veremos que ocurre en las plantas.

Es preciso indicar que la maquinaria encargada de

copiar la información genética para la síntesis de un
polipéptido dado necesita de información adicional a la
propiamente codificante, lo que incluye a regiones de
reconocimiento, regulación y control, frecuentes en
muchos genes de plantas y que aparecen como grandes
regiones de secuencias no codificantes entre o
adyacente a las secuencias propiamente codificantes. La
integridad de estas regiones es imprescindible para el
correcto procesamiento de los Genes. La modificación
química de las bases nitrogenadas de estas regiones,
como por ejemplo la metilación, son factores que
participan en el control y regulación de la expresión de
tal forma que algunos de estos cambios se correlaciona
con patologías que incluyen el cáncer y otros procesos
en los que participa la expresión génica.
Composición de las secuencias génicas.

Una importante característica de los genes de

Organismos Eucariota como son las plantas superiores
es la fragmentación de las regiones codificantes, de
forma que, distribuidas alternativamente a lo largo del
Gen, se detectan secuencias codificantes: denominadas
regiones exónicas y secuencias no codificantes o
regiones intrónicas (Figura 4.3), estas últimas
denominadas así en contraposición a las regiones que si
codifican.
Los términos de Exón e Intrón fueron primeramente
descritos por Sharp & Roberts en 1977, los Intrones, en
contraposición a los Exones, son regiones situadas
dentro de los límites de un gen (ver secuencias de inicio
y fin de un gen) y cuya secuencia no es traducida a
proteínas. Se asume que la secuencia lineal que está
entre el primer Exón y el último inclusive corresponde al
dominio del gen.

En el proceso de translación las secuencias

exónicas se conectan secuencialmente lo que junto a
otras modificaciones dará lugar a la forma madura del
mRNA tal y como se verá más adelante. En plantas, un
porcentaje variable de la secuencia de los genes se
corresponde con intrones- en ocasiones mayor que los
exones- y con función estructural además de ser
topológicamente importante para la estructura, la
evolución y el procesamiento de los genes.

A diferencia de las Plantas superiores, donde

muchos de sus genes contienen esta composición en
intrones y exones, los otros genomas de plantas
(cloroplásticos y mitocondriales), y los de organismos
prokariotas que interaccionan con ellas, carecen de
regiones intrónicas.

Figura 4.3. Estructura del gen eucariota: Exones e intrones.

2.- Familias génicas y secuencias de DNA repetitivo.

Un importante factor que contribuye al tamaño de

los genomas, especialmente de plantas, es la repetición
de secuencias, que incluyen tanto a secuencias de DNA
no codificantes como a genes enteros. Estas múltiples
copias de un gen se denominan Familias Génicas, y
forman largas secuencias de DNA que pueden
expresarse simultáneamente cuando los requerimientos
de RNA o proteínas que lo codifican son activados
(rRNA, o mRNA de histonas). Sin embargo, es más
frecuente que diferentes genes constituyentes de una
familia génica se expresen en diferentes tejidos de forma
específica e incluso que muchas de estas secuencias
sean silentes, es decir no traducidas. La localización de
estas familias génicas suele estar distribuidas
secuencialmente en el genoma pero frecuentemente
aparecen incluso en cromosomas diferentes.

No hay duda de que un buen bagaje genético,

capaz de adaptarse a diferentes condiciones
ambientales, consiste en la presencia de múltiples
copias de un gen, los cuales, pueden estar sometido a
mutación y selección, y puede residir aquí parte del
motivo de la existencia de muchas familias génicas, en
algunos casos, como son los de algunos genes de la
familia de la y globinas, estos genes están
inactivados por mutaciones y constituyen genes
relícticos que no aportan contribuciones génicas
funcionales al fenotipo.

En adición a las Familias Génicas, el genoma

eucariota y especialmente el genoma de plantas, posee
una gran cantidad de secuencias repetidas, que al
contrario de las familias génicas no se encuentran
formando parte de genes, estas secuencias son no
codificantes, aparecen en cientos de miles de copias por
todo el genoma, flanqueadas por genes o familias
génicas, que en el caso de plantas superiores alcanza
en ocasiones el 50% del DNA total.

Tres tipos de secuencias de este tipo, han sido

catalogadas:
Secuencias Simples, también llamadas DNA Satélite
porque migran en centrifugación isopícnica como bandas
satélites de la banda principal del DNA, contienen miles
de secuencias cortas (5 a 200 nucleótidos) colocadas en
tandem, se ha descrito un papel para estas secuencias
en la estructura de la cromatina y el cromosoma.

Clasificación de los genes en los genomas.

En función del tipo y de su abundancia se pueden

clasificar los genes y otros componentes del genoma en
los siguientes grupos:

1.- Genes Solitarios.

Codifican para polipéptidos no muy abundantes, agrupa
también a varios genes próximos pero no muy
abundantes. En una planta se pueden encontrar
aproximadamente de 100 000 a 1 millón de genes.
2.- Familias Génicas.
Se caracterizan por el gran numero de copias que
aparecen en el genoma, frecuentemente próximas
(parecido a los Operones
Procariotas), aunque también dispersos por todo el
genoma. Codifican para proteínas muy abundantes, por
ejemplo: Proteínas de Respuesta sistémica (Heat shock
etc.), Proteínas de reserva (Patatina), y otras
(Inhibidores de proteasas en tubérculo).
Especialmente son familias génicas las codificantes para
Histonas, RNA de transferencia( tRNA), y RNA
ribosómico (rRNA).
Existen distintas familias génicas con secuencias algo
diferentes en
Los distintos tejidos (por ejemplo: raíz respecto flor). Su
origen evolutivo esta en genes solitarios que se duplican
y mutan dando lugar a familias emparentadas tanto por
la secuencia como por la función.

3.- Secuencias de DNA repetitivo:

Secuencias de DNA no codificante y no Exónicos.
Aparecen con una frecuencia de miles de copias por
genoma. Detectado por primera vez por Ray- Britten al
observar regiones importantes del genoma que se
renaturalizaban muy rápidamente. Se clasifican a su vez
en:

3.1.- Secuencias Simples o DNA Satélite denominado

así porque migran en centrifugación isopícnica como
bandas satélites de la banda principal del DNA,
contienen miles de cortas secuencias (5 a 200
nucleótidos) colocadas en tandem miles de veces.
Presentan un significado estructural.

3.2.- Elementos móviles del DNA (moderadamente

repetitivo) Son regiones del genoma con la peculiaridad
de que su posición en el genoma en variable y pueden
desplazarse por el genoma insertándose en diferentes
localizaciones. Se han identificado diferentes tipos:
3.2.1.- Transposones Virales. Regiones móviles con un
origen identificable como viral (insertado en el genoma).
El descubrimiento de las secuencia transponibles o
Transposones correspondió a Barbara McClintock
(1902-1992) a partir de su trabajo sobre el Millo, ver la
Figura 4.4.

Figura 4.4. Parte de la presentación de Barbara McClintock en su

alocución al recibir el premio Nobel en 1983. Publicado en los anales del
Premio y autorizado para uso público.

3.2.2.-Retrotransposones de RNA. Están flanqueados

por regiones repetidas LTR que facilitan la integración.
Responsables en parte de reagrupamientos en la
expresión génica y posiblemente en la herencia
horizontal.

3.2.3.- Transposones no Virales. Regiones móviles

cuyo origen no esta identificado y muy abundante.
Representan otra población importante de secuencias
que no se disponen en tandem sino distribuidas por todo
el genoma, su función no ha sido esclarecida a pesar de
que algunas de ellas, como las secuencias Alu, se
trascriben a RNA de función desconocida. Pueden
clasificarse a su vez en:
3.2.3.1- SINE DNA : Short Interspeed elements (300-600
pb) millones de veces en un genoma. No se distribuyen
de forma correlativa.
3.2.3.2.- LINE DNA: Long interspeed elements
(>1000pb) con la estructura mostrada en la Figura 4.5.

Figura 4.5. Estructura de los LINE DNA

Organización básica de las secuencias LINE.

En la Figura 4.5 se observan regiones que son

universales a los LINE, entre ellas son las secuencias
ORF1 y ORF2, las cuales son regiones con marco de
lectura abierta. El producto proteico de ORF1 se
denomina p40, con función desconocida. La región
ORF2 también codifica para una proteína, una enzima
denominada trascriptasa inversa que se corresponde
con una enzima típica de un retrovirus. Las regiones en
rojo en la Figura 4.4 son secuencias directas repetidas,
comunes a todos los elementos móviles y necesarias
para su transposición e integración.

GENOMA DE BACTERIAS Y VIRUS QUE

INTERACCIONAN CON PLANTAS.

En ocasiones, en organismos inferiores la mayoría

del genoma se dispone como estructuras circulares sin
extremos libres, así ocurre con la mayoría de los
cromosomas bacterianos y algunos virus (Figura 4.6).
Algunos de estos virus portan RNA como material
genético y llevan un ciclo de vida específico (Figura 4.7).
Igualmente muchas bacterias presentan genes incluidos
en estructuras circulares de DNA situadas fuera del
cromosoma, es decir formando unidades independientes
con importantes propiedades biológicas, incluyendo la
capacidad de compartir sexualmente genes mediante
estos plásmidos.

Figura 4.6. Imagen ultramicroscópica del virus del tabaco.

Los genomas bacterianos son menos complejos

que los de los eucariotas. Las características generales
de estos organismos son que están localizados en el
citoplasma (carecen de núcleos) y no muestran una
organización en intrones y exones, los grupos de genes
que codifican para las enzimas de una ruta metabólica
se distribuyen en tandem dando origen a la organización
génica denominada operones. Otra importante
característica de las bacterias reside en la capacidad de
portar plásmidos, que como hemos indicado, son
secuencias de DNA auto replicantes e independientes
que codifican algunos genes relacionados con la
adquisición e intercambio de genes entre distintas
bacterias, en ocasiones entre especies diferentes. Los
plásmidos se trasmiten entre organismos mediante
procesos específicos que dan lugar a una forma de
reproducción especial propia de bacterias.

Muchas bacterias afectan a las plantas superiores

introduciéndose en sus células e infectándolas, algunas
de estas bacterias pueden además, introducir parte del
genoma contenido en sus plásmidos en el genoma
celular integrando algunos genes y modificando la
expresión de la célula en su propio interés, es el caso de
la formación de agallas mediadas por la bacteria
Agrobacterium. En estos casos se establece una
coexistencia de tipo simbiótica entre dos especies con
modificación del patrimonio genético somático de una de
ellas.
Ejercicio 4.1: Magnitudes relativas de los genomas:

a) Indique los valores aproximados de número de bases

que poseen los siguientes organismos:
Un virus
El hombre
Una planta de mostaza
Un lirio

b) ¿Si la media de peso de un nucleótido fuera de unos

550 gramos por mol, cual seria el peso molecular de
esos genomas?. Calcule el número de células
aproximadas de estas especies. ¿Cual sería el peso
total del DNA? (recuerde que necesita saber el número
de avogadro)
Respuesta parcial:
Un virus 5000 pb
El hombre 3 x 109pb
Una planta de mostaza 1,6 x 106pb
Un lirio 1,1 x 1012pb

Tutorial específico al ejercicio (primera parte):

Número de Avogadro
Es el número de átomos o moléculas (sún el caso) que hay en un
mol de cualquier elemento o compuesto. Su valor es de
6.023×1023 moléculas/mol. Se suele usar el símbolo NA para
representarlo.
NA = 6.023·1023 moléculas/mol

Mol
Unidad básica del Sistema Internacional de Unidades que mide la
cantidad de sustancia, y que se representa con el símbolo mol. Es
la cantidad de sustancia de un sistema que contiene la misma
cantidad de objetos elementales que átomos hay en 0.012
kilogramos de carbono 12. Debe especificarse a qué tipo de
objetos se refiere (átomos, moléculas, etc.). Dada una molécula
de una sustancia determinada cuya masa molecular expresado en
unidades de masa sea m, la masa de un mol de dicha sustancia
es m pero expresada en gramos. Esta propiedad junto con el
hecho de que cada nucleón pese aproximadamente una uma
hace del mol una forma muy conveniente de contar moléculas (o
átomos).
Masa molar:
Masa expresada en gramos de un mol de una determinada
sustancia. Dada una molécula de una sustancia determinada cuya
masa molecular expresado en umas sea m, la masa de un mol de
dicha sustancia es m pero expresada en gramos.
La masa molar se calcula usando la tabla periódica de los
elementos. En el caso de la molecula de agua, contiene 2 átomos
de hidrógeno con una masa atómica de 1.008 uma y uno de
oxígeno con una masa atómica de 16.0 uma (redondeada). Al
sumar estas dos masas, se obtiene una masa molecular de 18
gramos (redondeada). Por tanto la masa de un mol de agua es de
18 gramos. Su masa molar o peso molecular es 18 g/mol. 5 moles
de moléculas tendran una masa de: 5 mol × (18g/mol) = 90 g
Podríamos decir que 6.02×1023 moléculas de agua tienen una
masa de 18 g.

Tutorial específico al ejercicio (sunda parte):

¿Si la media de peso de un nucleótido fuera de unos 600 gramos

por mol, cual seria el peso molecular de esos genomas?

Un virus 5000 pb x 600= 3 x 106 Dalton

El hombre 3 x 109pb x 600 = 1,8 x 1012 Dalton
Una planta de mostaza 1,6 x 106pb x 600= 9,6 x 107 Dalton
Un lirio 1,1 x 1012pb x 600 = 6,6 x 1014 Dalton

Calcule el número de células aproximadas de estas especies.

¿Cual sería el peso total del DNA? (recuerde que necesita saber
el número de avogadro)
Un virus 1 célula x 3 x 106 = 3 x 106 Dalton
El hombre 3 x 1012 x 1,8 x 1012Dalton = 5,4 x 1024 Dalton
Una planta de mostaza 1 x 106 x 9,6 x 107= 9,6 x 1013 Dalton
Un lirio 1 x 109 x 6,6 x 1014 =6,6 x 10 23 Dalton

Este peso molecular sería los gramos de un mol, es decir de un

número de avogadro de moléculas, asumimos que solo hay una
enorme molécula de DNA y el resultado será:

Respuesta parcial:
Para el caso del virus:
gr= 3 x 106 / NA = 3 x 106 / 6.02×1023 = 4,98 x 10-18 gr
para el hombre:
gr= 5,4 x 1024/ 6.02×1023 = 4,98 x 10-18 gr = 8,98 gr
y para un lirio:
gr= 6,6 x 1023/6.02×1023 = 1,1 gr
Lección 5. Replicación del DNA. Propiedades de las
DNA polimerasas. Características dinámicas.
Telómeros. Mecanismos de fidelidad y reparación.
_____________________________________________

La Información contenida en el DNA tiene dos

funciones universales, una de ellas es la de contener la
información que usara la célula en su ciclo de vida pero
al mismos tiempo esa información debe copiarse para
permitir la multiplicación y la permanencia en el tiempo.
El proceso de replicación es la forma de llevar a cabo
esto último, y el concepto más simple significa duplicarse
de forma exacta produciendo una copia independiente.
Por tanto, la replicación implica la síntesis de dos hebras
de doble DNA iguales a partir de una parental. En todos
los eucariotas la copia de las moléculas de DNA
condiciona el metabolismo de las células, de forma que
se desarrolla un ciclo (ver Figura 5.1) que comprende
desde el estado en que el núcleo esta compuesto por
una copia de su genoma hasta aquel en que el núcleo se
divide en dos poblaciones genómicas idénticas

Figura 5.1. Ciclo celular vegetal eucariota: (S) fase síntesis de DNA, (G1,
G0) fase previa a mitosis (M), (G2) fase posterior a mitosis.
Características generales de la replicación eucariota:

1.- El proceso esta catalizado (al igual que todo el

metabolismo del DNA) por enzimas específicas
localizadas en el Núcleo (caso del genoma nuclear).
La catálisis de la síntesis emplea la propia energía
contenida en los propios precursores nucleótidos trí-
fosfatos.
2.- La dirección de la replicaciones 5´-3´ (Figura 5.2a)

3.- La replicación es semi-conservativa. En un brillante

experimento de biología, Matthew Meselson y Franklin
Stahl demostraron que las hebras de DNA no se
fragmentan y mientras una se incorpora a la copia la
otra se incorpora a la hebra parental o molde (Meselson,
M. and Stahl, F.W. (1958) The Replication of DNA in
Escherichia Coli. PNAS 44:671-682., ver Figura 5.2b). El
experimento de Meselson se ha considerado un
paradigma del trabajo bioquímico:

“It’s very rare in biology that anything comes out like that.
It’s all so self-contained. All so internally self-supporting.
Usually, if you are lucky to get a result in biology, you then
spend the next year doing all those plausible controls to
rule out other explanations; but this one was just a self-
contained statement.”
Figura 5.2. (a) Direccionalidad en el DNA (b) Experimento de Meselson &
Stahl.

3. -La Duplicación del DNA se origina en regiones

discretas del cromosoma, formando estructuras de
replicación denominadas: horquillas de replicación.

Donde las enzimas y el DNA forman complejos de

Replicación (Ver Figura 5.3).
Figura 5.3 Representación simplificada de la horquilla de replicación.

Mecanismo de la Replicación.

El inicio de la replicación comienza con la unión de

proteínas a los denominados Orígenes de replicación
que son múltiples secuencias cortas y repetidas del
DNA. A partir de este momento se forman los bucles de
Replicación denominados ARS: (Secuencias de
 Replicación Autónoma). Las proteínas que participan en
este primer paso son de forma genérica y universal:

Helicasas
Topoisomerasas
Proteínas fijadoras de la horquilla
Proteínas reguladora

Una vez formada esta horquilla se forma un complejo de

al menos 20 proteínas, que en las bacterias que son el
modelo donde más se ha estudiado se denomina:
Sistema Replicasa del DNA o Replicón.

El complejo enzimático más importante del

Replicón es el de las DNA polimerasas. Este sub-
complejo de enzimas se encarga de la síntesis de la
nueva hebra de DNA. Su composición y propiedades se
muestran en la siguiente tabla:

PROPIEDADES DE LA DNA POLIMERASA DE EUCARIOTAS

------------------------Enzima--------------------------

Compartimiento
Núcleo Núcleo Mitocondria Núcleo Núcleo
celular
Primasa
Si No No No No
asociada
Replicación Replicación Replicación
Función Reparación Replicación
hebra del DNA hebra
biológica del DNA Adicional
retardada Mitocondria conductora
Número de 4
4 1 2 ?
subunidades isoformas
Peso molecular
subunidad 165-185 40 125 125 210-230
catalítica

El proceso general esta representado en la figura

5.4. Comienza con la formación de las horquillas de
replicación, en este momento se une un complejo
importante de proteínas con función de reconocimiento y
de control sobre el proceso, destaca la unión de la DNA
polimerasa . que tiene actividad primasa, es decir
fabrica smentos cortos de DNA monocatenario que se
unirán al DNA (también monocatenario), a partir de aquí
esta misma enzima polimeriza un corto smento de DNA
(es decir incorpora nucleótidos mediante puentes de
Hidrogeno de W/C a la hebra parenta)l y los une
covalentemente mediante enlaces 5´-3´- . En este
momento, el proceso se detiene y el Factor de
replicación se incorpora en ese sitio, lo que permite a la
DNA polimerasa unirse a su vez y iniciar la
polimerización durante largos smentos del DNA parental.
La síntesis que hemos descrito se corresponde con el
subsiguiente crecimiento de los replicones, cuando dos
de estos replicones adyacentes se tocan, estos se
fusionan entre si, dando por concluido el proceso de
copia de la DNA polimerasa .

Propiedades de la replicación eucariota:

1.- El desplazamiento de la copia es 5´->3´. Todas las

polimerasas lo hacen de esta forma, es decir incorporan
un nuevo nucleótido uniendo el extremo 5´ de este
nucleótido al extremo 3´, de la cadena.

2.- La DNA polimerasa no puede destruir los enlaces

que ha formado, sin embargo la DNA polimerasa
puede romper en dirección 3´-5´, lo que se denomina
actividad correctora de errores y representa un
importante mecanismo de fidelidad del proceso.
3.- Teniendo en cuenta que el replicon tienen dos
extremos, uno de estos va en la dirección 3´-5´, con lo
que se sintetiza de forma continua en la dirección 5´-3´
tal y como hemos indicado. Sin embargo, es de destacar
que la otra hebra va en la dirección 5´-3´, lo que implica
que las enzimas no pueden desplazarse con la
elongación del replicón (véanse la figura anterior). Por
tanto este extremo se duplica a trozos, a medida que se
va abriendo el replicón, por tanto, aquí se forman
fragmentos incompletos de doble cadena polimerizada
denominadas fragmentos de Okazaki, la síntesis de
esta hebra retardada requiere la escisión ulterior de las
cortas secuencias de RNA (denominadas también
primers), suido del proceso de completado de la síntesis
y la unión de todas las secuencias antes de considerarse
concluida.

Características dinámicas de la replicación:

Conozcamos ahora algunos datos cuantitativos

sobre este proceso: En plantas y animales, se supone
que los replicones se distribuyen cada 30-300 K pb. Es
decir, para el genoma humano, existirían unos 30 000
distribuidos a lo largo de los cromosomas. La velocidad
es de aprox. 50 nucleótidos /sundo. Lo que resuelve la
replicación en un tiempo corto (para una secuencia de
108 pb, tendríamos un tiempo de replicación de unos 11
minutos).

La reacción de polimerización es favorable

termodinámicamente solamente por el gran gasto
energético asociado a la ruptura del sundo y tercer
enlace de fosfato en los nucleótidos tri-fosfatos (enlaces
de alta energía: refiérase al capítulo de metabolismo de
un texto de bioquímica) que son la forma activa de los
mononucleótidos que forman parte del DNA (-28 kJ/mol
por nucleótido incorporado). Estas y otras características
del proceso de replicación se especifican en la tabla 5.2:
PROPIEDADES DE LA REPLICACIÓN

Función E. coli Humano

Contenido en DNA (pb/célula) 3.9 x 10 6 10 9

Velocidad de progresión de la horquilla
30 3
( m/min)
Velocidad de replicación (nucleótidos/s.
850 60-90
x horquilla)
Número de orígenes de replicación/
1 10 3 - 104
célula
Horas necesarias para la replicación del
0.67 8
genoma
Horas necesarias para una división
0.33 24
celular completa

Tabla 5.2. Propiedades de la polimeración eucariota y procariota

Telómeros y telomerasas:

Los telómeros son secuencias repetidas que

cierran los cromosomas su secuencia de nucleótidos
consiste, frecuentemente, en unidades del nucleótido T
y G (1-5 repeticiones) en una de las cadenas, y por tanto
repeticiones CA en la cadena complementaria. La
dinámica de la replicación no permite completar la copia
de los extremos de una hebra de DNA, al no poderse
situar un primer más allá del final de la secuencia (no
existe, por definición ninguna secuencia a la que unirse),
por tanto la solución para el proceso de obtener copias
completas de los cromosomas se resuelve mediante las
enzimas denominadas telomerasas, enzimas que
portan su propio primer de RNA y una secuencia de
RNA formado por la repetición CA correspondiente.
Estas enzimas actúan por transcripción inversa de
esta secuencia generando la secuencia de DNA
necesaria para completar el cromosoma.
En los eucariotas pluricelulares, la presencia de las
telomerasas en las células germinales garantizan la
preservación de las largas secuencias teloméricas. La
desaparición de la enzima en las células somáticas
condiciona la longitud de estas secuencias y puede
llegar a impedir la correcta división celular, por tanto,
este proceso controla el tiempo de vida de una célula y
por extensión, del organismo.

Mecanismos de fidelidad y reparación:

La característica biológica más llamativa de la

replicación es la fidelidad que las hebras hijas poseen
con respecto a las parentales. Esto es del orden de 10-9
a 10-10. Lo que representa valores inferiores a 1 error
cada 10 a 100 ciclos de replicación.

La responsable principal de esta eficiencia es la DNA

polimerasa . la cual posee la propiedad de reparar el
último nucleótido añadido, mediante la escisión 3´-5´ del
enlace fosfo-diester. Esta enzima revisa el enlace último
que ha catalizado en un tiempo que va entre uno a
varios milisundos después de la incorporación del
nucleótido.
El error natural de la DNA polimerasa es alrededor de
10-5 y el proceso de escisión 3´-5´ incrementa esta
eficiencia unas 100 veces hasta 10-7. Otros sistemas de
fidelidad en la copia, incrementan la fidelidad hasta los
10-9 indicados.

Estos mecanismos, ralentizan el proceso general

de copia (en comparación con otros procesos de copias
mediadas por enzimas diferentes a la DNA pol (como
por ejemplo virus y bacterias) pero en organismos
superiores evita, entre otros, uno de los procesos de
mutación más destacables como es la tautomería de las
guaninas.

Tautomería de Guanina
 Este es un proceso enteramente espontáneo y
reversible que modifica la estructura química de la
guanina, redistribuyendo los orbítales electrónicos y
afectando a la capacidad de formación de enlaces de
puente de hidrogeno, como consecuencia de ello la
guanina se asemeja a una adenina. El proceso ocurre a
temperatura ambiente con una frecuencia de 10-4 a 10-5.
Esto implica que cualquier proceso de copia se debería
equivocar (y de hecho se equivoca) con esta misma
frecuencia en la colocación de un nucleótido de citosina
cada vez que encuentra una guanina modificada y por
tanto colocando erróneamente timina. Dado que la
reversión de la Tautomería es más rápida que la
velocidad de elongación de la polimerasa , esta puede
detectar el error al revisar en dirección 3´-5´ rompiendo
el enlace y colocando el nucleótido correcto (la
correspondiente citosina).

Otros procesos naturales causantes de error en la

replicación, son:
-7
Base incorrecta: ocurre cada 10 . Siendo también
reparado por el sistema polimerasa.

Apareamientos incorrectos, nik y roturas del DNA.

Dímeros de Timidina, originados por radiación

ionizante, etc.

Cambios espontáneos de Citosina a Uracilo.

De forma alternativa, otros procesos físicos

causante de error o mutación, incluyen:

1.- Adición de grupos: Carcinógenos químicos: son

altamente electrofílicos y pueden ser interceptados o no
por la maquinaria detoxificante celular.

2.- Agentes Intercalantes. Son reparados mediante

escisión y reparación
Todos estos errores pueden ser detectados y sujetos a
corrección mediante diferentes sistemas enzimáticos
que actúan continuamente en la célula, destacamos de
entre ellos:

1.- El sistema de reparación de apareamientos

incorrectos, en el que estos apareamientos, no de
W&C, son detectados y reparados. Destaca la detección
diferencial de la hebra parental mediante la metilación de
esta hebra por el sistema de reparación.

2.- El sistema de reparación SOS, que actúa de forma

inespecífica en casos de destrucción acusada y general
del DNA. Un mecanismo con gran importancia en
diferentes procesos patológicos o situaciones extremas
de las células y que básicamente consiste en la
priorización del mantenimiento de la continuidad de la
cadena de DNA obviando la secuencia.

Como conclusión hay que hacer mención al papel

de la mutación en el origen genético del Cáncer. Un
fenómeno presente en todos los organismos
pluricelulares, tanto de plantas como de animales, y que
debe abordarse en otro lugar de forma extensa.

No todos los procesos de modificación de la

secuencia son dañinos, uno que favorece la evolución y
adaptación de los organismos con reproducción sexual
son los procesos de Recombinación homóloga que se
originan en las meiosis mediante quiasmas regulados
por sistemas específicos de la maquinaria celular, la
familia de proteínas implicadas en la recombinación
homóloga es también importante en el mantenimiento de
la integridad del genoma.
Ejercicio 5.1 Codificación del DNA

La región del DNA en los genes eucariotas que codifica

un polipéptido se denomina:
a) hnRNA
b) Exones
c) Enhancers
d) Secuencias líder
e) tRNA

Respuesta:

Tutorial específico al ejercicio:

Los exones se unen durante la fragmentación y se traducen

sobre los ribosomas a los productos polipeptidicos del gen
Tutorial
La región codificante de muchos genes se interrumpen por
regiones no-codificantes conocidas como Intrones, estos son
secuencias del DNA cuyos ttranscriptos están ausentes en el
mRNA maduro.
Ejercicio 5.1 Horquilla de replicación
¿A que se corresponde la cadena denominada B en el
esquema?
A Cadena molde
B Cadena Conductora
C cadena adelantada
D Fragmento de Okazaki
E Primer RNA

Respuesta:
B (Cadena conductora)
Tutorial específico al ejercicio:

Ejercicio 5.1 Promotores

Los promotores para la síntesis de mRNA eucariota.

a) Son más complejos que los promotores prokariotas

b) pueden requerir unión de múltiples factores de
transcripción para formar complejos de trascripción
c) tienen secuencias de DNA específicas como las TATA
box que son reconocidas por proteínas
d) Son las porciones del DNA al cual las RNA
polimerasas se unen para iniciar la polimerización
e) Todas ellas

Respuesta:

E. Además de estas secuencias, otras denominadas promotores

ayudan a la iniciación de la síntesis de genes específicos

Tutorial específico al ejercicio:

Los complejos de transcripción eucariota tienen muchos más
factores de transcripción. Esas proteínas son necesarias para
reconocer las secuencias de DNA específicas en el promotor
eucariota a el cual las RNA polimerasas se unen para iniciar la
transcripción
El complejo de transcripción se sitúa al comienzo del gen
eucariota. El complejo contiene factores básales como son las
proteínas de unión a la caja TATA. La RNA polimerasa requiere
múltiples factores de transcripción para formar el complejo de
transcripción capaz de unirse a la caja TATA e iniciar la síntesis
de mRNA.
Lección 6. Transcripción del DNA: del DNA al RNA.
Dinámica de la transcripción eucariota. Tipos de
RNA. Procesamiento del mRNA.
_____________________________________________

El proceso de biosíntesis de RNA se denomina

transcripción refiriéndose al hecho de que se trata
realmente de un cambio de molécula química pero no de
código (ver Figura 6.1). Se realiza de forma similar a la
duplicación del DNA y sigue los mismos principios de
paridad en la secuencia de bases aunque los
nucleótidos precursores son ribonucleótidos y el Uracilo
sustituirá a la timina en el proceso.

5´ACATCGA…3´HEBRA DNA CODIFICANTE (+)

3´TGTAGCG…5´HEBRA DNA MOLDE (-)
5´ACAUCGA…3´ RNA (+)
Figura 6.1. Cambio de estructura, mismo código en la transcripción.

De nuevo se forma una horquilla, esta vez denominada

horquilla de transcripción (ver Figura 6.2.a), y en esta
estructura, iniciada y mantenidas por diferentes enzimas
y proteínas reguladoras, se desenvuelve una sección de
la doble hélice para que la enzima polimerasa (ver
Figura 6.2.b) copie el molde para la síntesis de una
hebra de RNA. Una vez se separa esta molécula, la
doble hélice se reconstituye o se utiliza en otro ciclo de
copia.

En los eucariotas la transcripción esta catalizada por la

RNA pol II, la cual requiere el auxilio de un número
importante de proteínas reguladoras que interacionan
con el DNA o entre ellas en localizaciones específicas
como la denominada caja TATA, y en otras, a menudo
muy distantes en la secuencia del punto de inicio del
gen, este complejo de proteínas formará el complejo de
pre-iniciación, principal elemento del proceso.
Conceptos básicos en la transcripción:

Sustitución de Timina por Uracilo, esto implica que la

RNA polimerasa codifica frente a una Adenina de la
hebra molde a un Uracilo.

Requieren nucleótidos tri-fosfatos como sustratos para

la polimerización, y Mg++ y GTP o ATP para iniciar.

La síntesis de RNA es en el Núcleo aunque el destino

de los RNA es el citoplasma donde han de ser
transportados.

Las secuencias de DNA que van a ser copiadas a RNA

corresponden a regiones génicas, por tanto presentan
regiones promotoras muy importantes para dirigir y
controlar la síntesis de RNA y regiones de terminación.

La región que se transcribe, el gen propiamente dicho,

se corresponde solamente a una de las hebras, la
hebra complementaria no suele contener información
transcribible. Sin embargo, la dirección de la síntesis y la
hebra donde están los genes es variable en la cadena
de DNA.

No se requiere primer, pero requiere una secuencia

iniciadora y una terminadora descrita más arriba.
Además un número variable de secuencias previas y
posteriores al gen regulan el proceso mediante la unión
de proteínas reguladoras, activadoras y represoras que
conforman el complejo de pre-iniciación y los factores de
transcripción generales.

La RNA polimerasa no presenta actividad de corrección

de errores que encontrábamos en la DNA polimerasa,
por tanto no existe tampoco actividad exo-nucleasa.

Proteínas implicadas en la transcripción:

RNA polimerasas procariotas:

 Pol I: RNA Ribosómico.
Pol II: mRNA.
Pol III: tRNA, rRNA 5s.

Proteínas reguladoras (Muchas de ellas del tipo

proteínas Zn- finger) señalamos a continuación una lista
de las proteínas implicadas en eucariotas:

TFIID (unido generalmente a la caja TATA)

TBP (también relacionado con la caja TATA)
Factor de Transcription IIA : TFIIA
Factor de Transcription IIB : TFIIB (junto con los tres
anteriores, íntimamente formando un complejo sobre la
caja TATA)

Dinámica de la transcripción:

Tres pasos pueden distinguirse en el proceso de la

transcripción:

1. a - Formación de un complejo del promotor (Figura

6.3.a) formado por proteínas de reconocimiento y
regulación adheridas a la caja TATA, una secuencia de
DNA específica que señala la proximidad de una región
transcribible. Esta región es consenso para gran parte
de los genes de diversos organismos, la cual forma parte
del grupo de secuencias de reconocimiento y control
requerido para la transcripción (Figura 6.3.b):
Figura 6.3. (a)Secuencia consenso, en distintos genes, para la caja TATA
(b) resumen de regiones e reconocimiento y control.

La región denominada TATA box (Ver Figura 6.4) es

secuencia de reconocimiento para el complejo del
promotor descrito más arriba. Como hemos indicado, su
presencia delata la proximidad de un gen. Las regiones
TATA poseen una estructura reconocida por proteínas
de unión específica y su secuencia esta
extremadamente conservada habiendo solo pequeñas
diferencias entre reinos.

1.2.- A continuación y para la síntesis de mRNA, el

complejo de transcripción -que incluye a la RNA pol II-
debe activarse mediante una plétora de elementos de
reconocimiento y regulación sobre la región del promotor
y otras regiones adyacentes y lejanas de control

2.- Elongación:
Este paso se inicia con el progreso de la RNA
polimerasa sobre la cadena de DNA que sirve de molde.
EL proceso procede por adición de trinucleótidos y la
energía del ATP hasta llegar al final de la secuencia
codificada.

3.- Terminación:
Una vez el complejo reconoce la secuencia de
terminación se para la síntesis de RNA y esta es
liberada en el Núcleo, proteínas específicas actúan a
este nivel para procesar este RNA de forma que pueda
abandonar el orgánulo hacia el citoplasma.
Al final de la síntesis, el complejo unido al promotor se
separa del DNA, se separa en sus proteínas
componentes y la doble hélice del DNA se restablece.

Características de la Burbuja de transcripción:

Las burbujas de transcripción se distribuyen sobre

todas las regiones de expresión génica activa, lo cual
depende del estado fisiológico de la planta, del momento
del ciclo y del tejido. Entre los parámetros que hay que
considerar están:

Velocidad de progresión en eucariota es de unas 50

bases /sundo. La fidelidad de la copia es baja: 10-4 -
10-5, debido a que carece de la actividad exonucleasa
que encontramos en las DNA polimerasa eucariota
citada para la replicación del DNA.

Tipos de RNA:

Tres tipos de RNA son sintetizados de forma

universal por las RNA polimerasas eucariota:

1.- RNA mensajero (mRNA)

Este RNA es de tamaño variable, debido a que depende

del tamaño de la proteína que codifica, normalmente
entre 300 y 3000 bases. Puede ser sintetizado de forma
constitutiva, caso de genes constitutivos (proteínas que
la célula necesita de forma constante), o bien pueden
corresponder a genes que codifican para proteínas que
son inducidas por diferentes estímulos que dependerán
de la maquinaria de control y respuesta de la célula.

La correcta distribución de estos mRNA requiere un

mecanismo de etiquetado, lo que les permitirá ser
procesados para varias funciones entre ellas ser
llevados al citoplasma o la determinación de su tiempo
de vida, por tanto, debe haber un procesamiento de
estos mRNA adicional a su síntesis.

Procesamiento del mRNA:

La síntesis del RNA se efectúa en el Núcleo: la

cadena de RNA recién sintetizada se denomina Pre-
RNA o RNA precursor. Hasta que el RNA pueda ser
utilizado por los ribosomas debe sufrir un proceso de
maduración que dé como resultado un RNA Maduro.

Tres aspectos explican la maduración: el

Transporte al Citoplasma, la Reorganización de la
secuencia para que corresponda a la de la proteína que
se debe sintetizar y, por último, el Control del tiempo que
debe permanecer antes de ser degradado, estos
procesos se llevan a cabo en los siguientes pasos:

A: 5´Cap.
Consiste en la adición del nucleótido modificado 7-metíl
Guanosina (CH3-GTP). Este nucleótido conserva sus
tres enlaces fosfato de alta energía potencial y se añade
al extremo 5´del primer nucleótido del RNA recién
sintetizado, su papel es determinar su unión al
Ribosoma.

B: Eliminación de Intrones.
También denominado Autosplicing del RNA, fue
descubierto por Cech en 1989, (Deletion of
nonconserved helices near the 3'end of the rRNA intron
of Tetrahymena thermophila alters self-splicing but not
core catalytic activity. Barfod ET, Cech TR. Genes Dev.
1988 Jun;2(6):652-63.) y es realizado por la actividad
catalítica de un smento de RNA. Su función consiste en
retirar las secuencias que no están en fase de aquellas
que serán traducidas a polipéptido, por tanto este
proceso conecta en línea a los exones, por último estas
secuencias son unidas entre sí para dar lugar a una
secuencia continua.

C: Poliadenilación en el extremo 3´. La poliadenilación

consiste en la adición catalítica en el extremo 3´, de un
número variable de residuos de adenina, formando la
denominada cola de poli-A. Su función es actuar como
un reloj que determina la vida del mRNA y por tanto el
número de moléculas de péptido que codificará, así
como el tiempo en que estas copias estarán presentes.
La degradación del RNA está catalizado por las RNasas,
y las secuencias de control se encuentran codificadas en
el número de residuos de adenina de las colas de Poli-A,
tal y como se ha indicado.

2.- RNA Ribosómico (rRNA):

Este tipo de RNA está codificado por una decena

de genes con secuencias específicas y bien
conservadas en la evolución, cuyo papel es fundamental
para la construcción del gran complejo de RNA y
proteínas: los ribosomas (ver Figura 6.6), por tanto,
estos RNA no codifican directamente para proteínas y
tampoco son procesados como los mRNA. Su papel es
formar parte estructural de los ribosomas y son
transportados a los lugares citoplásmicos de ensamblaje
por proteínas específicas. Existe una masa equivalente
en el ribosoma distribuida entre rRNA y proteínas, y es
reseñable que esta es la estructura macromolecular más
compleja de la célula. Algunos de estos RNA
sorprendentemente poseen actividad catalítica, esto
hace que se consideren descendientes evolutivos de las
primeras moléculas auto replicantes es decir son las
moléculas vivas precursoras de los seres vivos, este
descubrimiento se le debe a Thomas Cech, premio
Nobel de química por su descubrimiento del RNA
catalítico (Kruger, K., Grabowski, P.J., Zaug, A.J. Sands,
J., Gottschling, D.E., Cech, T.R. (1982) Cell 31,147-157)
y hablaremos de ello, tambien, mas adelante.

3.- RNA de transferencia (tRNA):

Los tRNA, al igual que ocurría con los rRNA, están

conservados. Son de unos 75 nucleótidos de largo y
adoptan una forma espacial, conservada en todos ellos,
gracias a la existencia de zonas de interacción por
enlaces de puentes de hidrógeno formando doble
cadena. Por tanto tienen estructura secundaria (Figura
6.7). Funcionalmente, existen al menos 20 diferentes
tRNA en una célula eucariota, siendo su función la de
transportar los aminoácidos al ribosoma en un proceso
dependiente específicamente de la secuencia del mRNA
que se encuentra anclado a dicha estructura.

Los tRNA contienen una región de tres nucleótidos

denominado anticodon que especifica el aminoácido al
que se unirá. Esta región establece una unión labil
mediante enlaces Watson&Crick, con un triplete de la
secuencia del mRNA. Esta secuencia complementaria
en el mRNA es el codon. Por tanto tenemos la región
anticodon en el tRNA y unida a ella el codon
especificado por el mRNA. Es importante entender que
esta interacción define una nueva forma de estructura
que es la de un tRNA, o varios tRNA, unidos al mRNA y
formando una estructura que localmente es de doble
cadena.
Todo este proceso de reconocimiento es posible
en el entorno del Ribosoma. Por tanto los tRNA
transfieren aminoácidos específicamente a la secuencia
del mRNA en el Ribosoma.

Figura 6.7. Estructura de los tRNA.

Ejercicio 6.1: Conceptos de transcripción

Plantee las siguientes cuestiones:

a) Calcular el tiempo necesario para que se replique en

E. coli el gen de la ribonucleasa (104 aminoácidos) si
una horquilla de replicación se mueve a una velocidad
de 750 bp/sundo.

b) Una hebra de DNA que tiene una composición de

bases A:21%, G:29%, C:35% y T:15% se replica por la
DNA pol. y origina una nueva hebra complementaria.
Suidamente el DNA resultante es utilizado como patrón
por la RNA pol que transcribe la nueva hebra y produce
un RNA que tiene el mismo número de residuos que el
DNA:
Determinar la composición porcentual de bases de la
nueva hebra de DNA
Determinar la composición porcentual de bases del RNA

c) El siguiente DNA se transcribe de derecha a

izquierda:
5'CATTCGCAGGCT 3'banda 1
3'GTAAGCGTCCGA 5'banda 2
¿En que sentido crece el trascrito?
¿Que banda sirve como molde?
¿Cual es la secuencia del mRNA y de la proteína
resultante?
¿Que relación existe entre el mRNA y la banda 2?

Ejercicio 6.2: Conceptos del mRNA eucariota

¿Cual de los siguientes eventos No se corresponde con

la expresión génica?
A. mRNA policistrónicos son muy raros
B. Muchos genes están interrumpidos por secuencias no
codificantes
C. La síntesis de proteínas y RNA esta acoplada en
prokariotas
D. Antes de la traducción el mRNA es extensamente
modificado
E. Pueden ocurrir múltiples copias de genes nucleares y
pseudo genes
Respuesta:

C. La síntesis de RNA ocurre en el Núcleo, pero la

traducción ocurre en el citoplasma. La transcripción y la
Traducción son espacial y temporalmente hechos
aislados

Tutorial específico al ejercicio:

Los hechos distintivos entre procariotas y eucariotas son:

A los Eucariotas son multicelulares. La expresión génica puede
asociarse a tejidos y al desarrollo
B Hay múltiples copias de los genes eucariotas y una gran
cantidad de DNA no esencial
C Los genes eucariotas están mayormente e el núcleo. los mRNA
cruzan esta barrera antes de ser traducidos en el citoplasma
D Muchos genes eucariotas están interrumpidos por regiones no
codificantes de DNA, las cuales son transcritos y descartados en
un proceso conocido como splicing
E El precursor eucariota mRNA es extensamente modificado en el
núcleo antes de ser traducido
F Transcripción y traducción no suceden acoplados en eucariotas
G mRNA policistrónico es raro en Eucariotas

Ejercicio 6.3: Conceptos Sobre la traducción

Que respuesta es correcta para los RNA que están
implicados, respectivamente, en los centros
estructurales y funcionales de la síntesis de proteínas,
la traducción y el transporte de aminoácidos:
A mRNA, tRNA, rRNA
B rRNA, tRNA, mRNA
C tRNA, mRNA, rRNA
D tRNA, rRNA, mRNA
E rRNA, mRNA ,tRNA
Respuesta:
E

Tutorial específico al ejercicio:

Los rRNA sirven como un componente estructural y funcional del

Ribosoma, implicado en la transpeptidización.
Los mRNA se emplean como molde para la síntesis de proteínas.
Los El tRNA trae los aminoácidos correctos al punto de síntesis

Ejercicio 6.1: Procesamiento del mRNA.

a)Porqué se hace más pequeño el pre-mRNA durante su
procesamiento?
b) El trascripto primario de un gen tipo es de 7700
nucleótidos de largo, pero en el RNA maduro su longitud
es de 1872 (gen de la ovo albúmina de gallina). La
causa principal de este hecho radica en:
A. Gorro
B. Rotura del mRNA policistrónico
C. Remoción de la cola de poli A
D Transcripción reversa
Respuesta:
E Splicing. El splicing del pre mRNA quita los intrones
con un total de 5828 nucleótidos
 Tutorial específico al ejercicio:

El gen de la Ovo albúmina

El gen de la ovo albúmina ha sido extensivamente estudiado. Este
gen es conocido por tener 8 exones que codifican al mRNA
maduro de la ovoalbumina. Esos 8 exones están interrumpidos
por 7 intrones los cuales son secuencias no codificantes que se
transcriben en el precursor de la ovo albúmina mRNA. Durante el
Splicing del pre-RNA en el Núcleo, los 7 intrones (76%) del pre-
mRNA, se quitan y los exones se unen entre si para dar lugar a un
mRNA maduro de 1872 nucleótidos de largo.
Lección 7. Traducción del RNA.
RNA precursor del polipéptido. El código genético.
Síntesis de proteínas. Productos génicos finales.
Modificaciones postraduccionales.

Las interacciones de puentes de hidrógeno entre

nucleótidos, permiten el reconocimiento entre cadenas
de DNA y por ejemplo la síntesis del RNA dependiente
de DNA, esto es una forma de traspasar información de
una molécula a otra (DNA a RNA) de una forma eficaz y
precisa. De forma adicional existe otro mecanismo de
transmitir información que implica por un lado al RNA y
por el otro a las proteínas que se localiza a nivel de
traducción de la secuencia de nucleótidos a la secuencia
de aminoácidos. Este sundo sistema se realiza en el
citoplasma, en un entorno específico no organular
denominado Ribosoma y que esta formado por dos
complejos macromoleculares compuestos por proteínas
y rRNA y que se asocia para dar lugar a un ribosoma
funcional, véase la Figura 7.1. La composición en
subunidades proteicas y rRNA es diferente en
procariotas y eucariotas, lo que influye en la velocidad
de su sedimentación, definida en unidades Svedberg
(S), denominada así por su inventor: Theodor
Svedverg, premio Nobel de química en 1926 por su
descubrimiento de la ultracentrifugación y el
comportamiento de los coloides

Basándose en estas unidades, la composición en

procariotas del rRNA es: 23s, 5s, 16s y 52 proteínas
específicas. La correspondiente a los eucariotas es de:
5.8s, 28s, 5s, 18s y 82 proteínas específicas.

Código genético. Codon y anticodon.

El proceso de la traducción implica una conversión

de secuencias desde los nucleótidos a la también lineal,
codificada por los aminoácidos. Este cambio de
estructura portadora de información requiere un código
que relacione ambos sistemas. De forma pragmática se
trata de ínter convertir el de 4 diferentes nucleótidos o
bases, al de los al menos 20 diferentes aminoácidos. Es
esta traducción de código lo que se denomina Código
genético. La relación mínima posible es de 3 bases para
codificar 64 combinaciones de aminoácidos, de acuerdo
a la potencia de 43, y de sobra para precisar los 20
requeridos.

Por tanto existe una distribución funcional del DNA

en secuencias de tres bases que ya denominaremos con
su denominación clásica de Codon, en la forma que ya
adelantamos en la lección anterior. Los aspectos
básicos, a destacar, de los codones son:

1.- Los codones son la unidad funcional de los genes

(al “significar”, para el mecanismo de las células, un
aminoácido).

2.- Cualquier combinación de tres bases genera un

posible codon, y todos ellos tiene significado, bien un
aminoácido o bien una señal del código, estas últimas
aparecen en número de 4 y son necesarias para el
procesamiento de los genes.

3.- La secuencia de codones es continua, es decir, los

nucleótidos del primer codon están contiguos a los
nucleótidos del sundo codon, sin “nucleótidos”ni
espacios vacíos o rellenos de nucleótidos sin significado
que separen estos entre sí.

4.- De forma general, Los codones no se solapan. Por

tanto para cualquier secuencia al azar de DNA, hay tres
posibles combinaciones de secuencias de bases que
darían lugar a distintas secuencias de codones. Solo
una de estas secuencias se corresponde con la
secuencia del mRNA que se traducirá a polipéptido. La
excepción a este apartado es el denominado
Solapamiento de secuencias, frecuente solamente en
algunos genomas de virus y en otros casos especiales,
en que algunos genes poseen una pauta de lectura
alternativa que se construye sobre la misma secuencia
de bases.

5.- Además de los codones, otras secuencias, señaladas

en el apartado 2, y formadas también de tres bases,
tienen significado para el procesamiento, regulación y
control de los genes, siendo clasificadas en señales de
paro e inicio de la traducción.

6.- La existencia de los codones condiciona la existencia

de los anticodones, localizados en el tRNA y del que
ya hemos hablado anteriormente. El significado funcional
de los anticodones se pone de manifiesto al
correlacionar la secuencia de DNA con la de
aminoácidos mediante el código genético.

Codon (mRNA): triplete de tres bases consecutivas en

el RNA (copiado de los codones del gen-DNA) que
codifican para un determinado aminoácido.

Anticodon (tRNA): triplete de tres bases consecutivas

en el tRNA que interacciona específicamente con el
codon del mRNA y con un aminoácido concreto que se
une a este tRNA.

Evidencias del Código genético:

El descubrimiento del Código parte de la

observación de Francis Crick de que una combinación
de 3 unidades o letras del código del RNA puede ser
suficiente para codificar cada uno de los 20
aminoácidos, nace de esta forma el concepto de un
código que traduzca entre ambos tipos de moléculas
(referenciado en Crick F. and Watson J. Genetic
Implications of the Structure of Deoxyribonucleic Acid."
Nature. Volume 171. 1953, pages 964-967).
Posteriormente Severo Ochoa premio Nobel de
fisiología/medicina de 1959, con su purificación de la
RNasa denominada por él: Polinucleótido Kinasa (PNK) (
trabajo publicado en una carta al Journal of the American
Chemical Society y en un artículo: The structure and
properties of synthetic and other polynucleotides.
Introductory remarks. Ochoa S. Ann N Y Acad Sci. 1959
Sep 4;81:690-2) describe un procedimiento para fabricar
secuencias de RNA a partir de nucleótidos libres, lo que
representa una herramienta fundamental para el
desciframiento del código.

En un experimento, ya clásico, Ochoa utilizó el

nucleótido U como único sustrato para la síntesis de un
polinucleótido catalizado la PNK. La enzima sintetizó un
RNA cuya composición era poli-U, a continuación
empleó un extracto de levadura libre de núcleos, que era
capaz de sintetizar una proteína, siguiendo las
condiciones del entonces desconocido código genético y
dando lugar a un polipéptido formado por Phe
exclusivamente. De esta forma se estableció la
concordancia entre la única secuencia de ácido nucleico,
el poli-U y el polipéptido de phe. A partir de este
resultado, y entre los años 1960 y 1967 se completo la
información para establecer el valor del código de
levadura (Figura 7.2).

Propiedades del Código:

Es prácticamente universal, con pocas diferencias

entre los grandes reinos, ver Figura 7.3.

Prímera Sunda posición Tercera

posición posición
U C A G
Phe Ser Tyr Cys U
Phe Ser Tyr Cys C
U Leu Ser Paro Paro A
Leu Ser Paro Trp G
Leu Pro His Arg U
 Leu Pro His Arg U
Leu Pro His Arg C
C Leu Pro Gln Arg A
Leu Pro Gln Arg G
Ile Thr Asn Ser U
Ile Thr Asn Ser C
A Ile Thr Lys Arg A
Met Thr Lys Arg G
Val Ala Asp Gly U
Val Ala Asp Gly C
G Val Ala Glu Gly A
Val Ala Glu Gly G
Figura 7.2. Código genético universal. Se muestran en cursiva los
aminoácidos con diferente codificación entre plantas y mamíferos.

Mitochondria

Codon Código Mamíferos Drosophila Neurospora Levaduras Plantas

genético
estandar:
Nuclear
UGA Stop Trp Trp Trp Trp Stop
AGA, Arg Stop Ser Arg Arg Arg
AGG
AUA Ile Met Met Ile Met Ile
AUU Ile Met Met Met Met Ile
CUU, Leu Leu Leu Leu Thr Leu
CUC,
CUA,
CUG

Figura 7.3. Desviaciones entre los códigos genéticos de diferentes

organismos y el universal, observe las diferencias que afectan a plantas.

Otra característica importante del código es su

carácter redundante, es decir, existen aminoácidos
codificados por varios codones, pero tenga en cuenta
que un codon concreto solo codifica para un aminoácido.
Algunos tripletes o codones representan señales
especiales relacionadas con el principio y el fin de un
mRNA, es decir señales de inicio y Paro, donde tres de
estas señales son de paro, y solo una codifica el inicio.

Papel de los tRNA:

En 1960 se descubrió la existencia de una molécula que

actúa de conectora entre aminoácido y RNA,
correspondiendo a los aminoacíl-tRNAsa (ver la Figura
7.4). Los áa-tRNA son específicos para un aminoácido
concreto, y poseen una secuencia de 3 nucleótidos
complementaria a un codon específico. Esta región del
tRNA se denomina anti-Codon y complementa, como
decimos, al codon del mRNA al cual se une mediante
puentes de hidrógeno. Como ejemplo ponemos el codon
UUU para el que existe un anticodon AAA que lo porta
un tRNA que a su vez está unido al aminoácido Phe

Por tanto, la unión codon-anticodon establece un

enlace entre un aminoácido concreto y una secuencia
específica del mRNA. Además este proceso se
establece en el entorno químico del ribosoma. La
presencia del entorno peptídico y de RNA del ribosoma
es fundamental para este reconocimiento y para la serie
de reacciones catalizadas por diferentes enzimas que
generaran la cadena de aminoácido de los polipéptidos.

Una característica topológica, importante, de los

tRNA es que la interacción entre codon y anticodon no
es perfecta, debido a una distancia de enlace
ligeramente desplazada del ideal, que se traduce en un
balanceo o indefinición mostrado por la primera base
del anticodon (tercera del codon). La consecuencia
práctica de este fenómeno consiste en una, en
ocasiones irrelevante, indefinición del aminoácido a ser
codificado, dependiente de esta tercera base (Figura
7.6).
Figura 7.6. Indefinición de la tercera posición de los anticodon

Identificación de los codones y los genes a partir de

la secuencia:

A partir del código genético sabemos predecir la

secuencia codificada en una secuencia de ácido
nucleico que codifica para proteína. Sin embargo, dado
que las secuencias son continuas y que frecuentemente
se desconoce el punto de inicio de la codificación, nos
encontramos con que en cualquier secuencia de RNA, o
de DNA, existen tres posibles pautas de lectura (es decir
tres formas de asociar en codones una secuencia de
nucleótidos). Como hemos dicho esto es debido a que la
primera base del triplete en una secuencia nos suele ser
desconocida al no poseer marcas de ningún tipo que la
identifique. Veamos un ejemplo de lo dicho:

Para la secuencia:
. . . A A A U G U U A A G G C C C...

hay las siguientes tres posibles pautas de lectura:

. . . A A A-U G U-U A A-G G C-C C...
. . A A U-G U U-A A G-G C C-C...
. A U G-U U A- A G G-C C C...

Las tres podrían ser la correcta, obsérvese que si

aplicamos el código genético a esta secuencia de
codones, obtendremos productos polipeptídicos
completamente diferentes.
Síntesis de proteínas en el Ribosoma:

El complejo de proteína y RNA (rRNA) que

conforma el Ribosoma es el ambiente adecuado para
efectuar las catálisis implicadas es la síntesis de
proteínas, donde la más obvia es la formación del enlace
peptídico entre los aminoácidos. Sin embargo, el
proceso es tremendamente complejo y esto se refleja en
el número de procesos catalíticos que participan en la
síntesis de un polipéptido completo:

70 proteínas ribosómicas diferentes.

20 enzimas para activar los aminoácidos acoplándolos a
tRNA.
12 enzimas auxiliares, factores específicos para cada
paso de la síntesis, enzimas para modificar y procesar la
cadena polipeptídica.
40 tipos de RNA, tanto de transferencia como
ribosómicos.

Fases:
Varias fases conforman la síntesis de proteínas, en un
estadio previo, los aminoácidos se activan en el citosol,
luego todos los siguientes pasos se establecen en el
entorno del ribosoma: Inicio, elongación y terminación:

1.- Activación de aminoácidos:

Esta fase procede en el citosol, y no en interacción con
el ribosoma se establece un enlace covalente entre un
aminoácido y el correspondiente tRNA en un proceso
catalizado por la aminoacil- tRNA sintetasa, a expensas
del ATP, lo cual es específico para un aminoácido
determinado. Cuando hay varios tRNA para un
aminoácido, la iso-enzima es la misma.

2.- Fase de Inicio:

Ocurre en la subunidad menor del ribosoma, uniéndose
a ella el mRNA maduro que va a ser leído. Esto se sigue
de la unión del aminoacil-tRNA iniciador y de la
subunidad ribosómica mayor.
El aminoacil-tRNA iniciador se une al codon AUG del
mRNA que señala el inicio de la síntesis proteica. La
energía del proceso la da el GTP y lo catalizan enzimas
citosólicas (ver Figura 7.7).

Figura 7.7. Factores y Esquema de la Iniciación.

3.- Fase de elongación:

Se inicia la síntesis de polipéptido mediante el

desplazamiento del Ribosoma sobre el mRNA y la
sustitución de los tRNA libres por los siguientes
aminoacil-tRNA en un proceso catalizado y específico
para los codones del mRNA. La energética del proceso
es de dos GTP hidrolizados por aminoácido entrante a la
cadena polipeptídica. En eucariotas la síntesis de
proteína a partir de un mRNA incorpora muchos
ribosomas que secuencial mente leen el mRNA dando
lugar a los poli ribosomas que pueden apreciarse en
microscopia electrónica (Figura 7.7).

Figura 7.8. Factores y Esquema de la elongación.

4.-Fase de terminación:
En esta fase, un codon de terminación en el mRNA
señala el punto en que acaba la cadena de proteína,
liberándose los componentes del ribosoma y el
polipéptido (Figura 7.9).

Figura 7.8. Factores y Esquema de la terminación elongación.

Energética de la síntesis de proteínas:

El proceso de traducción representa el mecanismo

más costoso energéticamente para la célula vegetal,
aproximadamente el 90% del total. La maquinaria de
síntesis de proteínas representa el 35% en peso, lo que
en cifras es aproximadamente como sigue:

50 000 Ribosomas/célula
200 000 Factores proteicos / célula
200 000 tRNA /célula

El proceso de síntesis de proteínas es rápido, así para

una proteína de 100 000 Dalton (1000 aminoácido
aproximadamente), la Velocidad de síntesis es la
siguiente:
En el núcleo: 50 bases/s. Por tanto 15 min. para la
síntesis completa del mRNA.
En el citoplasma: 3,3 aminoácido/s. Por tanto 5 min. en
procesarse la proteína en el Ribosoma.
Por tanto, un mínimo de 25 a 30 min. para el proceso
completo a temperatura óptima.

Resumen de la síntesis de proteínas:

1.- La síntesis comienza por el extremo amino-terminal y

por tanto crecen por incorporación de aminoácido. al
extremo carboxilo libre.

2.- hay un aminoácido. de inicio que es la metionina, el

cual está codificado en el mRNA por el codon AUG. Por
tanto debe haber al menos dos codones para metionina,
uno (el AUG) es específico para el inicio, el otro codifica
la metionina normal que aparece en cualquier cadena.
En cloroplastos y mitocondrias el aminoácido. inicial es
la formil-metionina o f-met.
3.- Factores de reconocimiento anteriores al codon de
inicio en el mRNA señalan la unión a la subunidad
pequeña del Ribosoma y además distingue el codon
AUG como un codon de inicio (en procariotas esta
secuencia específica se denomina secuencia de
Shine&Dalgarno.

4.- Uno de los procesos catalíticos más importante del

proceso la realiza el rRNA 23S y es la denominada
actividad peptidil-transferasa.

5.- El proceso de elongación procede mediante tres

pasos discretos asociados a dos localizaciones
específicas de las subunidades 40 y 60 S del ribosoma
denominados sitios P y A.

Los pasos discretos que suceden en el ribosoma

son los siguientes (véase la Figura 7.11):

1.- Tras la unión del aminoacil-tRNA iniciador al sitio de

inicio P se incorpora un sundo aminoacil-tRNA al sitio A.

2.- Se produce el enlace peptídico entre los aminoácido.

catalizada por la ribozima descrita, quedando un
dipeptidil-tRNA en el sitio A.

3.- Desplazamiento del dipeptidil-tRNA al sitio P,

liberando al primer tRNA e iniciándose otro ciclo de
elongación.

5.- La fidelidad de la traducción se limita a la eficacia de

la interacción entre codon y anticodon, por tanto
indirectamente las aminoacil-tRNA sintetasas tienen la
responsabilidad de la eficiencia en la fidelidad de la
traducción. La velocidad de la copia depende del aporte
e hidrólisis del GTP momento en el que se verifica
químicamente la interacción codon-anticodon.
El polipéptido sintetizado es liberado al citosol y ha de
sufrir un proceso de plegado y modificación antes de ser
empleado tanto en el transporte como en la adquisición
de actividad caso de las enzimas. Este proceso se
denomina Procesamiento post-traduccional y está
intimamente ligado a los orgánulos de procesamiento y
transporte como el Golgi.

6. - El transporte de muchas proteínas de mitocondrias y

cloroplastos se realiza a través del citoplasma, luego el
procesado de estas proteínas es diferente dependiendo
del destino y proceso implicado.
Ejercicio 7.1: Sobre la traducción

Que respuesta es correcta para los RNA que están

implicados, respectivamente, en los centros
estructurales y funcionales de la síntesis de proteínas,
la traducción y el transporte de aminoácidos:

A mRNA, tRNA, rRNA

B rRNA, tRNA, mRNA
C tRNA, mRNA, rRNA
D tRNA, rRNA, mRNA
E rRNA, mRNA ,tRNA

Respuesta:

Tutorial específico al ejercicio:

Los rRNA sirve como un componente estructural y funcional del
Ribosoma, implicado en la transpeptidización.
Los mRNA se emplea como molde para la síntesis de proteínas.
Los El tRNA trae los aminoácidos correctos al punto de síntesis

Ejercicio 7.2: Código genético

Usando met como 1er áa, ¿que proteína codificaría el

siguiente mRNA?

5'-CCUCAUAUGCGCCAUUAUAAGUGACACACA-3'

Respuesta:
C
 Tutorial específico al ejercicio :

! "#$
!
%!& '( ) * + ,
-!

Problema 7.3. Emparejamiento codon-anticodon

Con cual codon-mRNA debería el tRNA del diagrama

unirse para formar la interacción cdo-anticodon?
" %.
/"#$/0.
1 %.
/$#"/0.
2 %.
/2"#/0.
3 %.
/#"2/0.
%.
/#"$/0.
Respuesta:
A. 3´-AUG-5´
La clave consiste en saber que la secuencia debe ser
antiparalela. En otras palabras, para 5´-UAC como aticodon, le
corresponde el 5´-GUA, como codon, que si lo invertimos resulta:
AUG-5´.
 Lección 8. Integración Molecular del metabolismo
Niveles de control en la expresión génica. Control
epigenético.
_____________________________________________

El Dogma central propone, como hemos visto, que

la información contenida en la secuencia de nucleótidos
de los genes se expresa en la secuencia de aminoácidos
de las proteínas, de las cuales, las enzimas controlan y
ejecutan el metabolismo, el crecimiento y la división
celular.
Las enzimas se organizan en rutas metabólicas cuyos
flujos catalíticos se modulan a todos los niveles
mediante otras proteínas con carácter regulador, estas
proteínas están controladas por otros mecanismos
(también catalíticos) organizados en la denominada
cascada, y que en último término se controla de acuerdo
a dos tipos básicos de estímulos:
a.- Patrón rítmico: el cual es producto de la expresión de
un grupo de genes específicos.
b.- Respuesta a estímulos externos, bien mediante
estímulos químico-físicos del entorno o bien debido a la
presencia de factores hormonales, y que representan, en
todos los casos, procesos que afectan a la expresión de
una gran cantidad de genes como los del tipo a
descritos.

Niveles de control en la expresión génica en Plantas.

Los organismos eucariota pluricelulares (plantas y

animales superiores) poseen complejos sistemas de
control y regulación que les permite afrontar la división
celular, la diferenciación y la respuesta al entorno.

1.- Control de la expresión génica individual:

a.- Mecanismos de retroalimentación. En los cuales el

producto génico tiene un efecto sobre su síntesis,
regulando así su expresión.
b.- Procesos de degradación de mRNA y proteínas.
Controlados por enzimas específicas, y que permiten
una construcción continua del metabolismo y por tanto la
plasticidad del organismo.

c.- Procesos epigenéticos. Inducidos por proteínas

modificadas, que afecta al control de la propia expresión
génica primaria, en ocasiones de forma estable,
modificando por tanto el patrón de expresión del genoma
debido a estímulos del entorno.

2.- Control del metabolismo celular:

a.- Un primer nivel origina productos proteicos que

regulan la síntesis de otros grupos de genes
secundarios, los productos de estos mRNA regulan a
otros en un tercer nivel de expresión. Este mecanismo
permite el desencadenamiento de cascadas de procesos
enzimático, originando los procesos del desarrollo
diferenciación y respuesta antes mencionada.

b.- Un complejo y aún no totalmente esclarecido sistema

hormonal que regula la expresión a todos los niveles
citados, impidiendo, activando o regulando
cuantitativamente la síntesis de los diferentes mRNA.

El conjunto de todos estos procesos integrados

configura el metabolismo de una célula viva.

3.- Control e integración de la fisiología de tejidos y

órganos en plantas:

Algunas características de la integración en plantas son

destacables:

a.-Desdiferenciación.
La capacidad de desdiferenciación celular, propio de
muchas plantas en el que una célula diferenciada, bajo
los estímulos adecuados y la presencia o ausencia de
hormonas puede transformarse a un estadio primordial.
Este fenómeno ha permitido el desarrollo de las
tecnologías “in vitro” de células y tejidos vegetales.

b.- Control de la expresión floral en arabidopsis.

El estudio de Arabidopsis thaliana como modelo para la
regulación del desarrollo, con sus cortos tiempos de
generación (8 semanas) y su reducido tamaño del
genoma (150 Mb), ha permitido esclarecer algunos
aspectos de la integración molecular de las plantas. El
caso más destacable es el del desarrollo de las flores de
arabidopsis, que se regula por genes del tipo homeobox
como los descritos en mosca y mamíferos. Estos genes
homeóticos se dividen en tres tipos de genes los cuales
identifican las diferentes partes de la flor. Este
mecanismo de tres genes pertenece a la familia MADS
de factores de transcripción similar a la de animales,
caracterizados por formar homo y heterodímeros
proteicos cuyas combinaciones combinatoriales da lugar
a diferentes productos que controlan la expresión del
siguiente nivel de genes y por tanto afectan al tipo y
características de los órganos florales (véase al respecto
el trabajo de Coen ES y Meyerowitz EM: The war of the
whorls: genetic interactions controlling flower
development. Nature 1991,
353:31-37).

Control epigenético

El control de la expresión epigenética consiste en

procesos de modificación del DNA que no afectan a la
secuencia, y que originan cambios en la expresión
temporal, a largo plazo o irreversibles. Estos
mecanismos proceden mediante modificaciones de
algunas de las bases de los nucleótidos en secuencia
bien codificantes o de control de los genes. Las
metilaciones son una de las formas más habituales de
modificación epigenética y en muchos casos están
influenciados por el entorno en procesos no totalmente
descifrados.
Lección 9. Manipulación y análisis de los Ácidos
Nucleicos.
El Laboratorio Molecular. Técnicas de manipulación.
Aislamiento de DNA y RNA. . Enzimas de restricción.
Electroforesis. Transferencia. Sondas e hibridación.
_____________________________________________

El laboratorio de biología molecular de plantas:

El importante avance en la Biología molecular es

consecuencia de la utilización del método experimental y
su extrapolación a problemas relacionados con los
ácidos nucleicos.

La Biología molecular utiliza la metodología

bioquímica que se emplea en laboratorios y más
recientemente hace uso de la bioinformática y la
inferencia de modelos matemáticos para, por ejemplo,
abordar la secuenciación de genomas enteros o la
estructura tridimensional de proteínas modificadas
genéticamente.

El trabajo actual de gran parte de investigadores

de los ácidos nucleicos que trabajan con plantas de
interés agronómico, emplea un número determinado de
técnicas y métodos que se describen en las secciones
siguientes. Algunas de ellas, como las del aislamiento de
DNA y RNA son iguales a las empleadas hace unos
decenios, y otras, de más reciente implantación, como
es la PCR o la secuenciación automática, han sido
introducidas en los últimos años y han permitido el
análisis de un gran numero de secuencias génicas en
poco tiempo.

Conocer los fundamentos teóricos y prácticos de

esta metodología es una herramienta intelectual muy
poderosa y dotará de grandes recursos profesionales a
los estudiantes que deseen desarrollar sus
conocimientos en el futuro próximo.
Técnicas de manipulación de ácidos nucleicos:

Introducción:

La dilucidación de la estructura y los mecanismos

básicos de funcionamiento del material genético ha
posibilitado el desarrollo de técnicas para su
manipulación. Durante dos décadas un rápido progreso
se ha establecido que ha permitido avances importantes
en este campo, uno de cuyos logros más llamativos es la
capacidad para modificar el patrimonio genético de una
especie de forma que exprese de forma previsible un
fenotipo diferente.

Varias características hacen que las técnicas de

manipulación del DNA y RNA sean tan eficaces:

1.- En primer lugar el Material genético esta compuesto

por solo dos tipos moleculares que en todos los
organismos muestran el mismo comportamiento
químico y físico, independientemente de su secuencia y
del organismo que estudiamos. Este carácter universal,
que implica el origen único del código y de los
mecanismos enzimáticos, es muy útil para compartir los
resultados que generan diferentes investigadores, por
tanto las técnicas de un laboratorio son fácilmente
transferibles y optimizadas con las de otros laboratorios
de Biología molecular acelerando el progreso de la
investigación.
2.- En sundo lugar, y al contrario que la mayoría de las
otras moléculas biológicas, el DNA es extremadamente
estable tanto al calor como al ataque químico, estas
propiedades fisicoquímicas permiten manipularlo
fácilmente y separarlo del resto de compuestos
biológicos, sin embargo en plantas, la existencia de
homo-polímeros es abundante, y su comportamiento
interfiere con el tratamiento del DNA. Además hay que
sumar a esto el carácter químicamente más agresivo de
los compuestos que aparecen en el interior de las
plantas y que afectan a la integridad de los ácidos
nucleicos.
3.- El tercer factor es la capacidad de reproducir con
facilidad algunos procesos biológicos del DNA en el
entorno del laboratorio, procesos que han permitido
desarrollar la tecnología de estas moléculas.

Herramientas:

Se dispone actualmente de un amplio número de

herramientas con las que manipular el DNA, con ellas se
puede aislar, amplificar, secuenciar y modificar
cantidades mínimas de un genoma. Las clasificaremos
brevemente:

Las enzimas catalizan reacciones específicas en

condiciones controladas, las propias técnicas del DNA
han permitido obtener fuentes abundantes de estas
enzimas.
El carácter universal del DNA y de los procesos
genéticos permiten emplear enzimas de cualquier
organismo, para cualquier tipo de catálisis que implique
al DNA o RNA, esto permite además utilizar enzimas
exóticas para realizar procesos determinados. La
utilización de las enzimas de restricción por Boyer, Berg
y Cohen (Stanley N. Cohen, Annie C. Y. Chang, Herbert
W. Boyer, and Robert B. Helling: Construction of
Biologically Functional Bacterial Plasmids In Vitro. Proc
Natl Acad Sci U S A. 1973 November; 70(11): 3240–
3244 ) para multiplicar e identificar pequeños smentos
de DNA fue la base de las técnicas del DNA
recombinante, mostramos en la tabla 9.1 sus funciones
más características:
 Enzimas

Función Enzima Origen

Biológico
Enzimas para degradar el DNA DNAsas y bacteriano
y RNA RNAsas
Enzimas para cortar Restricción DNA bacteriano
fragmentos de DNA
Enzimas para cortar Restricción RNA bacteriano
fragmentos de RNA
Enzimas para unir fragmentos Ligasas bacteriano
de DNA/RNA
Enzimas para duplicar el DNA Polimerasas bacterias
termófilas
Enzimas para copiar RNA en Transcriptasas vírico
DNA
Enzimas para marcar y Metilasas, etc… múltiple
modificar nucleótidos

Otras herramientas y técnicas

Función Herramienta Origen
biológico

Vectores de amplificación y Plásmidos bacteriano

clonación
Virus vírico
Secuenciación Combinación bacteriano
de enzimas y
métodos
Expresión de genes Organismos bacteriano,
vivos células eucariota
Sistemas "in bacteriano
vitro"
Síntesis de secuencias de Combinación bacteriano
DNA (oligos) de enzimas y
métodos

Tabla 9.1. Resumen de los procesos y herramientas empleados en

biología molecular.

Con este conjunto de herramientas y enzimas se pueden

llevar a cabo la mayoría de los procesos que afectan a
los genomas, desde su aislamiento y secuenciación
hasta la generación de organismos manipulados
genéticamente. Describimos en los siguientes capítulos
las técnicas más comunes que recurren a estas
herramientas.
Las enzimas de restricción tipo II son, tal vez, las más
importantes al permitir cortar e identificar secuencias
cortas de DNA, el mecanismo de acción de estas
enzimas ha evolucionado durante un largo período de
tiempo en las bacterias en respuesta a la actividad
vírica, el mecanismo enzimático de actividad es una
reacción de hidrólisis, y se describe esquemáticamente
en la figura 9.1.

Fig. 9.1

Aislamiento de DNA y RNA:

Todo el trabajo con DNA requiere material nucleico

puro, por tanto las técnicas de aislamiento de DNA y
RNA son básicas.

La molécula de DNA es un poli anión, es decir esta

recubierta de cargas negativas debido a los electrones
de valencia del fósforo, esto implica que el DNA se
puede purificar mediante precipitación en un medio con
mucha sal (a pH 8,) y con agentes desnaturalizantes de
proteínas y otras condiciones que facilitan un buen grado
de pureza. Este proceso garantiza un producto integro,
sin roturas, sin proteínas asociadas y sin elementos de
bajo peso molecular como iones o metabolitos unidos a
su estructura, es en este estado en el que el DNA puede
ser manipulado.

El RNA se purifica de forma similar al DNA, aunque

preferentemente empleando el ClLi y teniendo en cuenta
que el carácter unicatenario y la abundancia de enzimas
que lo degradan específicamente obliga a extremar las
precauciones de degradación enzimática en la técnica
de aislamiento. Como ventaja adicional está el que en el
caso del mRNA se puede emplear cromatografía de
afinidad que une las largas colas de poli A del mRNA,
para ello se emplean colas de poli T, unidas a una resina
insoluble como fase sólida.

El mRNA puede ser copiado “in vitro” a DNA

mediante enzimas puras como la Transcriptasa inversa
(una polimerasa especial que es dependiente de un
molde de RNA y se obtienen de retrovirus), de forma que
fabricamos lo que se denomina un DNA clonado o
cDNA, esta molécula es una copia complementaria del
mRNA original Estos cDNA son más estables y pueden
trabajarse como un DNA normal, con la diferencia que
representan la secuencia de un mRNA maduro.

Enzimas de restricción del DNA:

Las enzimas de restricción bacterianas tipo II

como la Eco RI (ver Figura 9.2), Reconocen secuencias
palindrómicas (secuencias equivalentes a ambos lados
de dos ejes imaginarios que las separan por la mitad) de
entre 4 y seis bases, y cortan generando extremos
cohesivos complementarios (en el caso en que el punto
de corte no es por la mitad exacta) es decir que los
extremos cortados pueden de nuevo volver a ligarse
mediante los puentes de hidrógeno que había roto la
enzima. Los cortes que generan extremos iguales son
romos, es decir, no son cohesivos, pero pueden unirse
igualmente con las correspondientes enzimas
específicas, este es el caso de otras enzimas de
restricción tipo II como Sma I.

Por último otras enzimas bacterianas -las

denominadas Ligasas- pueden unir tanto los extremos
romos como los cohesivos dando de nuevo una
secuencia covalente única de dos smentos de DNA.

Figura 9. 2. (a) Representación de bolas de la Eco RI unida a una molécula

de DNA. (b) ídem de estructura secundaria de la Eco RI (rojo-azul) unido al
DNA (amarillo-azul-blanco)

La combinación de estas herramientas actuando

como tijeras y como pegamento específicos de la
secuencia, han permitido su empleo para tratar el DNA
en una forma completamente superior a cualquiera de
las técnicas bioquímicas clásicas. El uso de estas
enzimas permite llegar a algunos objetivos como los que
se describen a continuación:

1.- Se puede cortar un genoma en fragmentos –con un

tamaño relativamente predecible- de DNA, por ejemplo,
combinando varias enzimas se puede fragmentar un
genoma en trozos específicos más pequeños cuyos
extremos son reconocibles al poseer las secuencias
específicas de esas enzimas.

2.- Estos smentos pueden separarse –por su tamaño-

mediante electroforesis en agarosa, identificarse y
aislarse mediante técnicas que explicaremos. Además
pueden volver a unirse a otros DNA de forma específica.

3.- Un DNA, cuya secuencia desconocemos, puede

identificarse por su patrón de fragmentos generados por
varias de estas enzimas, a modo de una huella dactilar.

Técnicas Electroforéticas:

El siguiente paso consiste en separar fragmentos

o poblaciones de DNA, RNA o cDNA y aislarlos
selectivamente. La electroforesis en agarosa de ácidos
nucleicos separa fragmentos de DNA y RNA que se
diferencian en el tamaño Figura 9.3. El principio de la
técnica consiste en que en un campo eléctrico constante
(100 V), los (DNA)- y (RNA)- se desplazan desde el polo
negativo (generador de electrones: ánodo) al positivo
(cátodo), lo que ocurre debido al ser poli-aniones y
transportar los electrones generados (todo ello llevado a
cabo a pH> 8), para distinguir los fragmentos de DNA
por su tamaño, el libre movimiento de estos fragmentos
se dificultan mediante una malla tridimensional de agar
solidificado que frene su avance, el proceso implica que
a mayor tamaño menor movilidad y por tanto menor
desplazamiento en un tiempo determinado (las
condiciones típicas son: 1hora, 2% Agar, 100 V) de esta
forma los DNA menores aparecen más cerca del polo +
y los mayores (impedidos en su migración por el agar)
aparecen a distancias progresivamente mayores del polo
+. La resolución de esta técnica es de varios centenares
de bases por electroforesis.

De forma adicional, recientemente se ha

desarrollado una forma electroforética en acrilamida que
resuelve los fragmento con una resolución de 0,1 base, y
una precisión de 2 bases, desarrollado con la
terminología de ABI-Pris, es de uso rutinario para
analizar fragmentos en la actualidad.

Figura 9.3. Representación esquemática de la separación electroforética

del DNA mediante agarosa.

Transferencia de ácidos nucleicos a membrana:

El DNA y el RNA, tras ser separados en

electroforesis, precisan ser liberados del agar, para de
esta forma ser fijados a un soporte más estable sobre el
que pueden identificarse los fragmentos y manipularlos,
para ello se lleva a cabo la técnica de transferencia a
plástico, el cual tiene carga positiva lo que permite a los
ácidos nucleicos con carga negativa unirse iónicamente.
Este proceso para el DNA se denomina transferencia
Southern véase la Figura 9.3. (Edward Southern, An
improved method for transferring nucleotides from
electrophoresis strips to thin layers of ion-exchange
cellulose. Anal Biochem. 1974 Nov;62(1):317-8.)

El proceso requiere desnaturalizar el DNA

mediante condiciones alcalinas, lo que permite la
linealización del DNA y la exposición de los grupos
fuertemente cargados. En el caso del RNA la técnica se
denomina transferencia Northern e implica una
desnaturalización con formaldehído, más suave que el
álcali, que no destruye al RNA pero lo linealiza y le dota
de suficiente valor de carga iónica como para
interaccionar con el plástico.

Hibridación con sondas marcadas.

La capacidad de una hebra única de DNA para

unirse a una secuencia complementaria, es la clave para
detectar secuencias correspondientes a un DNA en una
mezcla. Para ello hay que poseer la secuencia
complementaria a la que se quiere identificar (por
ejemplo parte de la de un gen determinado que
queremos identificar en una mezcla) cuando esta
secuencia es pequeña, del orden de 30 pb, la
denominamos sonda y en ocasiones se emplean
fragmentos mayores de DNA. Las sondas u
oligonucleótidos, pueden sintetizarse industrialmente en
un sintetizador de oligonucleótidos el cual puede ser
programado para generar una secuencia a una
concentración deseada.

Durante el proceso de síntesis de una sonda -o

bien a posteriori- se le puede incluir una molécula
marcadora, que bien por emitir radioactividad, bien por
emitir luz o bien por interaccionar fuertemente con otra
sunda molécula, denominada marcadora secundaria,
puede delatar la presencia y posición de la sonda y con
ello a la molécula a la que se une. La característica
principal de este tipo de marcaje es que la molécula
añadida no debe alterar las propiedades de unión de la
sonda al DNA.

Una vez que disponemos de esta sonda, se

emplea para unirla a su secuencia complementaria en
un experimento de Southern o Northern. Las hebras
hibridan y tras lavar el exceso de sonda se expone (en el
caso de sondas marcadas con radioactividad o
fluoróforos) a una película fotográfica que identifica la
banda o bandas conteniendo las moléculas de DNA
unidas a la sonda.
Las aplicaciones de esta técnica son muy amplias e
incluyen la identificación de genes, el análisis de
polimorfismos (por ejemplo en la identificación de
individuos) y la clonación.

Figura 9.4 Procedimiento de transferencia de ácidos nucleicos.

Sondas degeneradas:

Dado que no siempre conocemos la secuencia

exacta el gen que queremos detectar mediante sondas,
es necesario un procedimiento alternativo, el cual se
basa en la secuencia de la proteína codificada por ese
gen, que nos permita predecir un grupo posible de
sondas. El procedimiento consiste en utilizar el código
genético para deducir, a partir de la secuencia de
proteína, las secuencias de DNA a las que podría
corresponder el gen que, en el genoma de ese
organismo, codifica a la proteína. La obtención de varias
secuencias es obligada por la degeneración del Código,
lo que obliga a poner todas las posibles combinaciones.
Se debe deducir un fragmento de secuencia con el
menor número posible de secuencias. La Figura 9.5.
Representa la forma de obtener una sonda degenerada
a partir de una secuencia de DNA:

Figura 9.5. Obtención de sondas degeneradas mediante el código

genético.

Tag de secuencia de expresión (EST).

Es una base física de secuencias, formados por

fragmentos parciales de cDNA obtenidos a partir de un
organismo dado. Esas secuencias se traducen a la de
aminoácidos generando una base de datos que
representan las poblaciones de secuencias reales y por
tanto, no degeneradas, pudiéndose usar para diseñar -
con una sola secuencia- secuencias de proteínas
concretas para ese organismo. La ventaja de esta
aproximación es que permite el empleo de sondas con
bajo grado de degeneración, haciendo más eficaz la
detección de secuencias génicas.
Ejercicio 9.1: Hibridación (traduzca)

Which of the following primers would allow copying of the

single stranded DNA sequence?

5' ATGCCTAGGTC?

a 5`ATGCC
b 5`TACGG
c 5`CTGGA
d 5`GACCT
e 5`GGCAT

Respuesta:
d 5'GACCT

Tutorial específico al ejercicio:

The 3' end of the template strand starts the 5' of the newly
synthesized DNA

Primers
The process of DNA replication uses RNA primers. To make a
copy of DNA from a known part of the chromosome, for example
by PCR, short primers of DNA are added to DNA in a test tube and
the appropriate enzymes are included to make a copy of the DNA.
The primers must be complementary to the DNA and obey the
polarity rule.
For the sequence: 5'ATGCCTAGGTC the primer would have to
be 5'GACCT. Extending the 3'T would copy the single stranded
DNA sequence.

Ejercicio 9.2: Relación aminoácido-nucleótido

Un mRNA es de 335 bases de longitud, incluyendo las

secuencias iniciadoras y terminadoras. ¿Cual es la
longitud de la proteína generada?
 A 999
B 630
C 330
D 111
E 110
Respuesta:
C
Tutorial específico al ejercicio:

La síntesis proteica comienza por AUG y codifica Met. El de

terminación (UAA, UAG, UGA) no codifica, luego:
335-2= 333 codones codificantes
334/3 = 111 aminoácidos,

por tanto, 333/3 = 111 aminoácidos.

Ejercicio 9.2: DNA Recombinante (traducir)

One of the most significant discoveries which allowed the

development of recombinant DNA technology was:

A. the discovery of antibiotics used for selecting

transformed bacteria.
B. the identification and isolation of restriction
endonucleases permitting specific DNA cutting.
C. the discovery of DNA and RNA polymerase allowing
workers to synthesize any DNA sequence.
D. the development of the polymerase chain reaction.
E. the Southern technique for separation and
identification of DNA sequences.

Respuesta:
B. The identification and isolation of restriction
endonucleases permitting specific DNA cutting. and yes,
prior to the discovery of these enzymes, there was no
reproducible way to fragment DNA
Ejercicio 9.3: Técnica de Southern (traducir)

The "Southern" technique involves:

A. the detection of RNA fragments on membranes by
specific radioactive antibodies.
B. the detection of DNA fragments on membranes by a
radioactive DNA probe.
C. the detection of proteins on membranes using a
radioactive DNA probe.
D. the detection of proteins on membranes using specific
radioactive antibodies.
E. the detection of DNA fragments on membranes by
specific radioactive antibodies.

Respuesta:
B . The detection of DNA fragments on membranes by a
radioactive DNA probe. Yes, the Southern technique detects
fragments of DNA using a radioactive DNA probe
Lección 10. Clonación del genoma.
Plásmidos y Virus. Clonando genes en vectores.
Librerías génicas. Expresión “in vitro” de un gen.
Secuenciación de DNA. PCR. RT-PCR. DNA-
microarray.
_____________________________________________

Clonación del DNA y cDNA. Plásmidos Bacterianos.

Cuando los fragmentos de DNA se obtienen

mediante corte con enzimas de restricción empleando
las técnicas descritas anteriormente, pueden a
continuación incluirse en otros fragmentos de DNA
(cortado con las mismas enzimas) como son los
plásmidos que auto-replican en bacterias. Estos
constructos artificiales se pueden insertar en sus
huéspedes (las bacterias) y así multiplicar la secuencia
millones de veces, al tiempo que lo hacen sus
huéspedes.

Así, bacterias como E. coli, portando plásmidos

con fragmentos de DNA insertados, pueden crecer en la
superficie de un medio de cultivo solidificado con agar en
una placa de petri. Dado que esta bacteria no se
desplaza, al carecer de flagelo, puede continuar
creciendo y dividiéndose por gemación formando una
masa puntual, diferenciada de las otras bacterias, y
originando el denominado Clon. El término Clon se
aplica a todos los organismos se originan, como en este
caso, por gemación y son copia del primero que se
sembró y por tanto lo mismo, el término, es aplicable a
los plásmidos que portan en su secuencia, la del
fragmento “clonado” (Figura 10.1).

La característica general de los plásmidos

empleados en BM. es que estos son pequeños genomas
independientes auto-replicantes (1 o más copias por
célula) y están formados por 1000 a 100 000 pb. Los
plásmidos, pueden ser cortados por una o varias
enzimas de restricción -dando lugar a una hebra de DNA
con extremos abiertos- y secuencia específica,
secuencias que también pueden ser reconocida por
ligasas específicas. Los plásmidos comerciales son
modificaciones de plásmidos naturales en los que
múltiples puntos de corte están diseñados en la
secuencia, además diversas secuencias garantizan un
comportamiento específico en la bacteria desde la
unicidad del inserto (es decir un solo plásmido por
bacteria) hasta el control de la expresión del inserto a
proteína. Este último caso requiere el uso de
promotores potentes de origen viral, lo que garantiza la
potencia de la traducción de la secuencia a proteína.

Figura 10.1. Corte y empalme mediante enzimas de restricción y ligasas,

de un fragmento de DNA en un plásmido.

Vectores de Expresión.

Algunos plásmidos pueden expresar la proteína

que codifican en el inserto, siempre que estos estén
situados en línea con un promotor, normalmente
inducible por factores que controla el experimentador y
además potentes como hemos dicho. La colocación de
cDNA, que es el término acuñado para estos fragmentos
de DNA, insertados en estos vectores de expresión son
por tanto expresados cuando se induce o activa la
maquinaria de expresión de la bacteria y por tanto muy
útiles para estudiar las propiedades de genes cuyas
productos proteicos sean interesantes. Normalmente la
proteína se excreta al medio donde puede ser
recuperada con buena pureza. El problema principal
radica en la diferencia entre los mecanismos post-
traduccionales de bacterias con respecto a otros
organismos, lo que puede producir proteínas con
diferente estructura terciaria. Entre ellos, la carencia de
glicosidación, y otras modificaciones que afectan a la
reactividad de la proteína que se ha sintetizado “in vitro”.

Diferentes sistemas de expresión con células

eucariota tratan de optimizar estos procesos.

Vectores Víricos.

Los fagos que infectan bacterias tienen las mismas

propiedades que los plásmidos para clonar el DNA:
incorporan fragmentos de DNA, sin afectar a su ciclo
lítico, y se multiplican sobre un césped de bacterias
previamente sembrados a los que lisan formando halos
o calvas llenas de bacterias lisadas (rotura de su pared
celular) y millones de fagos idénticos entre si. Cada uno
de estos fagos posee un genoma que incluye la
secuencia del DNA introducido, véase la Figura 10.2.
Figura 10.2. Mecanismo de clonación mediante fagos, nótese que el
termino E.coli, hace referencia a una población de bacterias.

Estructura de los fagos:

La estructura general de los fagos, como

organismos auto-replicantes necesitados de la
maquinaria celular para su división, consta de los
componentes mínimos necesarios y empaquetados en el
menor volumen posible. Aparte de la cápside o envoltura
proteica y de los apéndices proteicos necesarios para el
proceso de infección, el fago contiene una secuencia de
DNA que codifica para todas esas proteínas (agrupadas
en cabeza y cola) una región lítica y otra región en la
que porta secuencias de DNA que pueden ser
reemplazadas por DNA recombinante, Figura 10.3.

Figura 10.3. Estructura general del genoma de los fagos líticos.

Formas alternativas de Clonar:

Los Cósmidos y los denominados Yeast artificial

chromosomes, Figura 10.5 son vectores para clonar
fragmentos de DNA extremadamente grandes, unos 45
mil pares de bases (45kb) en el caso de los
denominados Cósmidos y hasta dos millones de pares
de bases (2mb) en el caso de cromosomas artificiales
denominados YAC (un fago landa normal solo puede
transportar hasta un máximo de 25 kb). Cuando se
requiere analizar grandes secuencias de DNA, estos
vectores son los adecuados para clonarlos. En todos
los casos descritos hasta ahora, podemos indicar que
podemos obtener gran cantidad de plásmido o DNA
vírico de un solo clon el cual puede purificarse y abrirse
con la misma enzima de restricción empleada en su
fabricación liberando una gran cantidad de copias
idénticas del fragmento original. En cualquier caso, los
hechos destacables son que las bacterias con sus
plásmidos crecen en los clones a modo de una maquina
de conservar y multiplicar DNA y que uno de estos
clones puede multiplicarse en un día millones de veces
para dar una gran cantidad de copias.
Figura 10.5. Vectores Cósmidos expresados en E.coli.

Librerías génicas:

Una de las aplicaciones más importantes del uso

de los vectores es el de la obtención de librerías de
ácidos nucleicos, en realidad una representación física,
en forma de secuencias de DNA de un genoma o parte
de un genoma de un organismo o tejido.
Para obtener estas librerías, un fragmento de DNA
aislado de un organismo (por ejemplo el mRNA de un
tejido) o bien todos los fragmentos del genoma de este
organismo, pueden pegarse (o recombinarse) con
ligasas a plásmidos, (como ya hemos visto, un proceso
denominado técnicas de DNA recombinante) los cuales
se insertarán en bacterias que crecerán separadas,
dando lugar a clones (cada clon portara la misma copia
de DNA) y originando las librerías genómicas (en esta
ejemplo de una representación del conjunto de
fragmentos completos de un genoma).

Cuando las secuencias son la secuencia en forma de

DNA obtenida, por clonación, a partir de un grupo de
mRNA – a su vez proveniente por ejemplo de un tejido o
de un organismo en un momento fisiológico
determinado- lo que obtendremos serán las
denominadas librerías de cDNA, denominación dado al
DNA cuyo origen es recombinante.

De la misma forma que los plásmidos, los virus actúan

como vectores eficientes para la multiplicación de
insertos de DNA o cDNA en huéspedes bacterianos.

Librerías genómicas:

Normalmente se emplean vectores víricos como el

los fagos bacterianos, ya que pueden transportar mayor
longitud de DNA, al menos 20 kb, además de tener una
capacidad de transfección de 100 veces la de un
plásmido bacteriano. Teniendo en cuenta el genoma de
una planta con, por ejemplo, 3 x 1010, se requerirían 1.5
x 105 plásmidos bacterianos o fagos para contener ese
genoma, dado que una placa de petri puede albergar
200 colonias, necesitaríamos 7000 placas para tener
una representación completa de ese genoma. Sin
embargo, en el caso de emplear fagos, no solo se
requeriría menos número de estos, sino que, además la
detección de los clones de fagos puede llevarse a cabo
con hasta 5 x 104 fagos por placa, este conjunto de
ventajas permite representar el genoma descrito con
solo 300 placas.

Librerías de cDNA:

La gran ventaja de estas librerías es que contienen

solo el DNA recombinante obtenido del mRNA trascrito
en un tejido y un momento dado.
Son por tanto más específicos y hay varios tipos de
librerías para cada organismo, dependiendo de múltiples
factores. Son por tanto una instantánea del momento
fisiológico o de expresión de un individuo o de un tejido
concreto (incluso célula) de un organismo.
Por tanto es importante distinguir la librería genómica,
que define, a grandes rasgos, al carácter de especie, de
la librería de cDNA cuyo origen es un grupo de mRNA
particulares, que solo representan un instante de la
expresión génica de un individuo en una célula o
conjunto de estas.

Las librerías de cDNA se obtienen tras extraer el mRNA

del organismo, tejido o células de interés. Para obtener
una representación pura de este material se aprovecha
el que el mRNA maduro (citoplásmico) posee una cola
de poli-A, la cual puede hibridar, en un experimento de
cromatografía de afinidad, con colas de poli-T unidas a
un soporte o resina, esta técnica permite el aislamiento
rápido de los genes y está estandarizada como una de
las técnicas más empleadas en BM (siendo una
modificación del procedimiento publicado por
Cuatrecasas P., Wilchek M. y AnfinsenC. B. 1968.
Selective enzyme purification by affinity chromatography.
Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 61: 636-643). Después de
este paso, la enzima transcriptasa inversa pasa el
mRNA a DNA. Estas moléculas se duplican a doble DNA
mediante la DNA polimerasa originando el cDNA,
denominado así por el hecho de tratarse de un DNA de
origen clonado, y ya se puede emplear para insertarse a
plásmidos bacterianos.
Secuenciación del DNA:

La secuenciación del DNA se basa en la

electroforesis pero con una forma mas sofisticada de gel,
el cual está constituido por una malla polimérica regular
y tridimensional como es la poli-acrilamida, esto permite
separar fragmentos de hasta 500 pb, distinguiéndose
fragmentos que difieren solo en una base. Por tanto,
hasta 300 o 400 fragmentos que se diferencian unos de
otros en solo una base, pueden distinguirse en la
práctica. El empleo de estas electroforesis tan
resolutivas se aplica en conjunto a algunas de las
técnicas descritas más abajo, para secuenciar el DNA:
1.- Método de Sanger 1977:
Basado en el uso de análogos de nucleótidos trifosfatos
(dideoxinucleótidos trifosfatos: ddNTP) los cuales
carecen de extremo 3’ y por tanto son inhibidores de la
síntesis del DNA, al impedir la progresión de la DNA
polimerasa. Véase la Figura 10.6.

Figura 10.6. ddNTP empleados en la secuenciación de Sanger.

La hebra de DNA o cDNA a secuenciar se híbrida con un

cebador y en presencia de los cuatro nucleótidos
trifosfato, en lo que es una mezcla adecuada para
multiplicar “in vitro” el DNA. De esta forma la DNA
polimerasa sintetizará miles copias de la muestra
original.
Para el experimento de secuenciación, cuatro
reacciones se establecen por separado de la forma
descrita más arriba, pero conteniendo cada una de ellas,
aparte de lo anterior, uno de los cuatro ddNTP a una
concentración 10 veces menor que los normales. La
presencia de estos análogos interrumpe, de forma
estadística, el proceso de copia, al carecer estos
análogos del extremo 3’ libre. Por tanto, el resultado de
cada uno de estos ensayos es que se genera una
colección de moléculas incompletas (que incluye
estadísticamente todos y solo los fragmentos que
acaban en un nucleótido complementario al ddNTP que
hemos colocado como análogo.

Las cuatro reacciones se colocan por separado en

electroforesis de poliacrilamida, separándose todos los
fragmentos cuya movilidad relativa representa la
secuencia completa del DNA.

2.- Método de Maxan y Gilbert 1977:

Basado en el marcaje de 4 muestras idénticas en cuatro
tubos con fósforo radioactivo (32P) Figura 10.7. para
posteriormente romper cada una de las cuatro muestras
por los residuos de G C T A la colección completa es
llevada a electroforesis separada y auto radiografiado
para ser analizada.

Figura 10.7. Método de Maxan&Gilbert para la secuenciación del DNA.

Por último, la secuenciación automática procede

basándose en alguno de estos métodos, pero de forma
totalmente independiente del manipulador, mediante
procedimientos que emplean sistemas automáticos
como la propuesta para secuenciar de la casa comercial
Roche denominada: genoma secuencer 20 system y que
realiza sobre 20 millones de bases secuenciadas de una
librería genómica en unas 6 horas.

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):

Las técnicas de amplificación consisten en que a

partir de una secuencia, en ocasiones única, de DNA, se
logren amplificaciones de millones de veces, de manera
que esta secuencia pueda ser empleada para técnicas
que requieren abundancia de muestra como es la
secuenciación, clonaje, etc. Por tanto el empleo de la
PCR, permite sustituir muchos métodos clásicos de
clonar y a diferencia de estos, no utiliza organismos
vivos como las bacterias, siendo extremadamente rápida
y sencilla. La última ventaja es que todas estas técnicas
están mecanizadas y disponibles como kit, lo que
permite su uso a trabajadores poco experimentados.

La reacción en cadena de la polimerasa, es la

técnica básica de la que se desarrollan todas las demás.
Es una técnica desarrollada sobre la base de la
capacidad de algunas DNA polimerasas termo
resistentes para amplificar una secuencia de DNA de
forma continuada, sin destruirse, al acoplarse a ciclos
de desnaturalización a muy alto calor (separación de la
doble cadena) y elongación a alta temperatura (copia de
las hebras). En un proceso dependiente de primers
específicos. Figura 10.8. El proceso requiere los
sustratos y cofactores de la Polimerasa además de los
indicados oligonucleótidos específicos que flanquean la
región a amplificar y que tienen que suministrarse para
iniciar la síntesis.
Figura 10.8. Esquema general de la reacción en cadena mediante
polimerasas termoestables.
Transcripción reversa de la PCR (RT-PCR):

La Transcripción reversa, suida de PCR (RT-

PCR), es una modificación de la PCR en la que se
pretende amplificar pseudo-cuantitativamente
secuencias de mRNA, en vez de DNA bicatenario. Para
ello, un paso previo es la acción de la enzima
transcriptasa inversa que pasa a DNA monocatenario
el mRNA (previamente purificado del pool de RNA total)
suido de la reconstrucción de la doble cadena mediante
otra enzima Polimerasa. A partir de aquí, se procede a
su amplificación mediante la PCR, en ocasiones
utilizando primers específicos (cuando se pretende
encontrar una secuencia concreta) o en otras ocasiones
utilizando primers que amplifican la secuencia completa
de todos los mRNA presentes lo que origina el
equivalente a una librería de cDNA clásica.

DNA Microarray

La técnica de los DNA microarray o Chip-DNA

consiste en una modificación de la técnica de
hibridación, aunque el proceso es en realidad una forma
inversa de esta, dado que la sonda esta fija y no esta
marcada, mientras que la diana esta marcada y en
dilución.

Varias aproximaciones se emplean para hacer

DNA microarray, en una de ellas se procede a amplificar
mediante la PCR, secuencias de un tamaño determinado
a partir de una colección de genes (incluso de la
totalidad de estos en el caso de que se disponga de
todas las secuencias: caso de humanos, arabidopsis,
etc.). A continuación un robot deposita cada clon de
secuencias en puntos consecutivos de una superficie de
cristal dejando fijados estas sondas. El tamaño típico es
de 2 x 2 cm. con unos miles de clones distintos fijados a
la superficie.
 Ahora se utilizan dos conjuntos de cDNA de un
organismo en dos condiciones diferentes (pueden ser
células creciendo en dos condiciones fisiológicas
diferentes, o bien un tejido tumoral y otro sano por
ejemplo), estas poblaciones se amplifican y se marcan
con marcadores fluorescentes de distinto color (por
ejemplo verde y rojo). Al mezclar ambos conjuntos de
cDNA y añadirlos al chip de Microarray se obtiene una
hibridación en cada una de las secuencias fijadas, de
forma que el análisis de la fluorescencia nos indica la
expresión diferencial da cada gen en las condiciones
fisiológicas de partida.

Los DNA Chip o Arrays de DNA son un útil muy

importante en el análisis de la expresión génica y su
utilidad permite analizar procesos entre especies que
escapan del contenido de este manual, véase la Figura
10. 9.

Diseño
Figura 10.9. Fundamento básico de un proceso de microarray-DNA.
Ejercicio 10.1: Secuenciación de DNA, método de
Sanger

Secuenciar el siguiente gel indicando la secuencia de la

hebra complementaria sintetizada y la hebra molde.

Ejercicio 10.2: DNA Recombinante

DNA from a eukaryotic organism is digested with a

restriction endonuclease and the resulting fragments
cloned into a plasmid vector. Bacteria transformed by
these plasmids collectively contain all of the genes of the
organism. This culture of bacteria is refered to as a:

A. restriction map
B. RFLP profile
C. F'factor
D. library
E. lysogenic phage

Respuesta:
D
library. Yes, a library is a culture of bacteria where each
cell has one or a few DNA sequences from another
organism, but the whole culture contains the majority of
the DNA fragments from an organism
Tutorial específico al ejercicio:

4 35"

'

6 , '
' 7
8 '

2 ' 7
'
' 6

Ejercicio 8.1: Secuenciar

A partir de la siguiente secuencia de DNA :

ATTACGACCTATCAGGGACGTATTGGAAAACTAT

responda las siguientes Cuestiones:

a) Secuencia del RNA

b) Escribas los tres posibles marcos de lectura (en
codones)

c) Determine el Marco de lectura abierta y los codones

de inicio y paro.

d) Represente los anticodon de los tRNA que

participaran en la síntesis del polipéptido.

e) Empleando el código genético de plantas identifique la

secuencia de áa del polipéptido.
Lección 11. Inserción de genes clonados en Plantas.
Planta modificada genéticamente por inserción.
Plantas modificadas por otros métodos. Metodología
para obtención de Plantas GM. Genes de interés para
su uso como trans-genes. Métodos de
transformación. Aspectos destacables de los
experimentos de transformación. Importancia
económica
_____________________________________________

Plantas modificadas genéticamente por inserción.

Denominamos planta transgénica a aquella en la

que hemos insertado, de forma estable, una secuencia
de DNA obtenida de otro genoma diferente. Este
procedimiento es un procedimiento alternativo a la
modificación genética obtenida por otros métodos como
es la polinización o la hibridación somática.

Origen de la secuencia insertada:

Normalmente cuando la secuencia corresponde a

un gen -en este caso denominado Trans-gen- este,
puede proceder de otra especie no relacionada con la
receptora, bien sea otra planta, u otra especie incluso
perteneciente a otro reino. La especie modificada se
denominará planta Modificada Genéticamente o planta
GM o de forma alternativa Transgénica. Figura 11.1.
Figura 11.1. Transformación de plantas.
Los motivos para desarrollar plantas transgénicas
son mayoritariamente económicos y también se aducen
razones de tipo ambiental, generalmente asociadas con
mejoras relacionadas con la actividad agrícola. De
cualquier manera, el deseo y la práctica de mejorar las
plantas de interés agrícola ha sido una ocupación
antigua y eficiente (Figura 11.2), mediante las cuales se
han mejorado muchas especies; aunque,
tradicionalmente, esta ocupación se ha llevado a cabo
mediante modificaciones de polinización cruzada entre
especies relacionadas. De la forma a las que nos
referimos con el termino de plantas MG, hemos de
remontarnos a 1983 con la primera planta modificada
genéticamente: una plata de tabaco resistente a
antibióticos a la que le siguieron un numero cada vez
mayor de especies MG.
Figura11.2: Bajorrelieve Asirio de 870 B.C. mostrando la polinización
artificial de palmeras datilíferas

Plantas modificadas por otros métodos.

De forma alternativa a la obtención de plantas

transgénicas, hay que destacar la existencia de métodos
no transgénicos sino basados en la mutación forzada por
diversos métodos de los genes de la propias plantas
diana. Una tabla resumen de las plantas y métodos que
se han obtenido por esta aproximación no transgénica,
se indica en la Tabla 11.1.

Nombre del
Cereal Método empleado
cultivar
arroz Calrose 76 rayos gamma
Above Azida sódica
trigo
Lewis Neutrones
oats Alamo-X Rayos X
Rio Red Neutrones
grapefruit
Star Ruby Neutrones
Tifeagle Rayos gamma
Tifgreen II Rayos gamma
burmuda grass
Tift 94 Rayos gamma
Tifway II Rayos gamma
Ice Cube ethyl methanesulphonate
lettuce
Mini-Green ethyl methanesulphonate
Seafarer Rayos X
common bean
Seaway Rayos X
lilac Prairie Petite Neutrones
TXSA 8202 Rayos gamma
St. Augustine grass
TXSA 8212 Rayos gamma

Tabla 11.1. Plantas y métodos utilizados para transformación.

Plantas florales tratadas mutagenicamente para su

modificación.

Algunas de las siguientes plantas se han mutagenizado

para incrementar su variabilidad:
Astroemeria, Begonia, Crisantemo, Dalia...

Metodología para obtención de Plantas GM.

La metodología para la obtención de secuencias

de DNA clonadas en grandes cantidades se ha descrito
en detalle a lo largo del presente manual. Las
propiedades del DNA, entre ellas su universalidad así
como el desarrollo de las técnicas del DNA
recombinante, facilitan cualquier iniciativa de
modificación genética de plantas (Figura 11.3). El
objetivo más frecuente en los procesos de obtención de
plantas MG son los de insertar un fragmento de DNA
conteniendo información genética de interés, en un
genoma -nuclear u organular - de una planta diana,
frecuentemente correspondientes a variedades de
interés agronómico.

Genes de interés para su uso como trans-genes.

Localizar genes que representen mejoras en

plantas MG es el paso limitante en la investigación en
transgénicas actual. Los conocimientos fisiológicos
sobre el efecto de algunos genes sobre procesos como
tolerancia a factores físicos, composición química o
defensa en las plantas diana limitan la identificación de
candidatos adecuados para la modificación de las
características deseadas en una especie diana. El
empleo de tecnología de ensayo y error se desarrolla
ahora de forma rutinaria con una variedad de genes
candidatos en la investigación industrial.

Consideraciones estructurales sobre los genes.

Se considera gen, tal y como hemos descrito en

partes anteriores de este manual, a la totalidad de la
secuencia que puede influir en la expresión de un
polipéptido determinado, ver Figura 11.3.

Figura 11.3. Representación simplificada de un trans-gen, conteniendo los

componentes necesarios para la integración y expresión

Promotor:

La secuencia promotora adyacente al transgén

suele modificarse para incluir un promotor constitutivo
(aquel que expresa en gran cantidad y de forma continua
la secuencia del gen que le sigue), un ejemplo es el
promotor CaMV35S, del virus en mosaico, se emplea
por su potente efecto promotor bajo cualquier entorno
cromosómico. Las excepciones son cuando interesa
integrar en la secuencia un promotor inducible bajo
condiciones específicas, normalmente relacionadas con
el papel del gen en la Planta MG, ejemplo de este último
tipo de promotor es el promotor del gen Cab que codifica
genes inducidos por luz.

Secuencia génica propiamente:

Las modificaciones en la secuencia permiten una

mejor integración de los trans-genes en los genomas
foráneos, así, es frecuente la utilización de sustituciones
G-C en secuencias A-T de genes bacterianos, estos
cambios se hacen de forma que no se altere
significativamente la secuencia de la proteína codificada,
el incremento en la proporción G-C representa una mejor
aceptación por las plantas diana. Otra serie de cambios
en la secuencia suelen ser también ser frecuentes.
Terminación:

Se desplaza frecuentemente esta señal a fin de

introducir un gen denominado marcador cuya función no
es la de afectar la planta diana, sino simplemente
facilitar la selección de las Plantas MG respecto de
aquellas que no integran trans-genes en un experimento.
Es frecuente que estos genes marcadores sean
requisitos para la supervivencia diferencial de la Planta
MG respecto de la salvaje y facilitar de esta forma su
identificación.

Métodos de transformación.

Varios procesos de transformación se utilizan de

forma rutinaria, entre ellos describimos el de
transformación por Agrobacterium y los recogidos bajo el
acrónimo de biolística, ambos se detallan a continuación:

Métodos basados en Agrobacterium:

Algunas bacterias del género Agrobacterium

(Agrobacterium tumefaciens) entran en simbiosis con
plantas, especialmente de la familia leguminosarum,
mediante un proceso que implica la inserción en el
genoma nuclear, al azar, de un fragmento del DNA
plasmídico de la bacteria (véase la Figura 11.4), este
DNA codifica para una serie de genes que promueven
una transformación somática de la planta, denominada
agalla en corona (véase la imagen). Este proceso ha
sido empleado en la transformación de muchas plantas
comerciales.
Figura 11.4. Agalla en corona de una leguminosa causado por
Agrobacterium tumefaciens.

Agrobacterium tumesfasciens porta un plásmido

denominado plásmido Ti (de transformación) Figura
11.5, el cual posee una región denominada DNA T,
flanqueada por genes Vir, esto genes flanqueantes,
comunes a otros sistemas de inserción, son
responsables de la inserción de esta región en el
genoma nuclear de las células que infecta.

El plásmido Ti puede aislarse, modificarse

mediante manipulación genética -sustituyendo su región
T-DNA para posteriormente volver a insertarla-
obteniendo un plásmido modificado con potencial
transformante (al carecer completamente de los genes
bacterianos siendo sustituidos por una secuencia que
codifica para el/los genes de interés en la
transformación) .

Figura 11.5. Representación del genoma de agobacterium, conteniendo el

plásmido Ti.
Composición de las secuencias que sustituyen a la
región T-DNA en los experimentos de
transformación.

En los experimentos de transformación más

usuales, se incorporan los siguientes genes:

Un gen de interés, que codifica para una proteína

(normalmente una enzima).
Un promotor potente (normalmente constitutivo) y una
región de terminación adecuada.
Un gen marcador, que permite seleccionar las células
que han incorporado este DNA de una forma eficaz, es
decir que lo expresan sin afectar a la viabilidad de la
célula receptora, y que normalmente le confiere
resistencia a un antibiótico vegetal como la ampicilina.

El Plásmido recombinante, se incluye en el vector

bacteriano y posteriormente se infecta la planta,
simulando el método natural, normalmente mediante un
proceso mecánico de abrasión de las hojas. A
continuación se cultivan las células de la planta en un
medio de cultivo con una proporción de auxinas y
citoquininas que promueven la des-diferenciación, lo
que le confiere carácter totí potente a las células, es
decir genera una especie de embrión somático al que se
le puede inducir la diferenciación de nuevo a planta
completa, y se traslada a un entorno de campo.

Métodos biolísticos y whisky:

Alternativamente al método basado en el uso de

un intermediario vivo como Agrobacterium, se ha
establecido uno denominado biolístico (Figura 11.7), en
el que la secuencia de interés, se introduce directamente
en el tejido vegetal, normalmente en aquellos tejidos que
poseen células indiferenciadas, tipo meristemo o
epicotilos, empleando partículas de oro a las que el
trans-gen se encuentra adsorbido, estas partículas son
disparadas con la fuerza necesaria para alcanzar el
núcleo sin romper la integridad estructural de la planta.
Este método permite obviar el vector bacteriano y
usando otros métodos de detección se puede obviar la
introducción de marcadores de transformación, siendo
de uso habitual en la actualidad.

Figura 11.6. Método biolístico de transformación.

De forma alternativa se han desarrollado métodos

que utilizan finas agujas que penetran por fricción el
tejido de las plantas depositando el DNA adherido en los
núcleos, mediante una técnica denominada whisky.

Aspectos destacables de los experimentos de

transformación.

Hay que destacar varios aspectos de la

transformación de plantas, teniendo en cuenta, de forma
general, que la inserción del DNA se produce al azar en
el genoma, por tanto, cada planta transformada es
diferente genéticamente. Además, hay que considerar
que la capacidad de desdiferenciación y posterior
regeneración a planta completa, es la propiedad que
realmente permite el proceso de transformación.
1.- Secuencias codificantes empleadas en la
transformación de plantas agronómicas:

Resistencia a Insectos:
Una de las categorías más usadas, más eficaces y
extendidas, de uso comercial.

Gen implicado: proteínas insecticidas procedentes de

bacterias como Bacillus thuringiensis.

Efecto: La expresión constitutiva de este gen origina

destrucción del las mucosas de larvas de insectos al
activarse proteoliticamente el producto proteico.

Otros genes: inhibidores de amilasas de larvas, lectinas,

quitinasas.

Plantas empleadas: Papa...

Resultado y ventajas agronómicas: las plantas

transformadas resisten el ataque de los estadios
larvarios de un amplio espectro de insectos
fitopatógenos. Se disminuye el uso de pesticidas,
disminuye ligeramente la productividad por planta al
consumirse algunos recursos en la expresión
transformante.

Resistencia a virus y hongos:

Difícil de atajar por métodos alternativos que sean

inocuos para el medio ambiente y la población, el uso de
transgénicos continúa explorando esta alternativa.

Genes implicados: proteínas de la cubierta de los virus

modificada para ser desbloqueante del
empaquetamiento. RNasas, doble RNA dependientes.

Efecto: La expresión constitutiva de estos genes induce

un defecto en la cápside o destruye la secuencia vírica,
anulando la propagación de los viriones a otras plantas.
Otros genes empleados: replicasas virales.

Resultado y ventajas agronómicas: Se obtienen

variedades que crecen sin ser afectadas por los virus.

Plantas: papaya, papa, tomate...

Resistencia inducible a patógenos fúngicos:

EL fuerte efecto nocivo de los patógenos fúngicos se ve

incrementado por su resistencia natural.
Genes implicados: proteínas naturales de las plantas
que responden al ataque de hongos y bacterias.

Mecanismo: el producto génico se expresa

constitutivamente ante la presencia de un elícitor
patógeno. Se provoca una activación metabólica que
interfiere con la infección o la expansión de la infección,
implicando frecuentemente, procesos de muerte celular,
en un proceso denominado como respuesta
hipersensible.

Tolerancia a herbicidas:
Representa un amplio grupo de plantas de uso
extensivo con importantes ventajas medioambientales.

Genes implicados: el producto proteico, normalmente

una enzima alternativa a la diana de un herbicida.

Efecto: modifica una ruta metabólica o actúa como by-

pass en una ruta metabólica afectada por herbicidas
sistémicos, deshabilitando el efecto del herbicida.

Resultado y ventajas agronómicas: Las plantas pueden

ser tratadas durante el crecimiento, sin efectos adversos.
Se disminuye la cantidad de herbicida empleado.
Peligros potenciales en la biodiversidad, en la herencia
horizontal y en la alimentación.
Mejora de las propiedades agronómicas:

Genes implicados: Producto proteico, de reserva o

conteniendo aminoácido. De interés. O bien es una
transformación que destruye un producto génico natural
adverso.

Efecto: Plantas con mejor interés alimentario. Carencia

de inductores de alergia. Propiedades fisiológicas
aumentadas: conservación, textura, aromas etc.

Plantas: heno, avena...

Importancia económica.

El empleo de plantas trangénicas abarca las

principales fuentes agrícolas como son los cereales y los
tubérculos. Por países, USA acumula la mayor extensión
y variedad de producción transgénica. Algunas
entidades estatales actualizan la información sobre este
campo en publicaciones periódicas.

Distribución y Magnitud:

Unas 40 especies de plantas comercializadas son

transgénicas (ver Tabla 11.2), es decir portan en su
genoma, fragmentos de DNA insertados, que le
confieren ventaja frente a una serie de parámetros como
pueden ser tolerancia a insecticidas o resistencia a virus
o patógenos.
 Producción de plantas MG por País (2000)
Área plantada
en el 2000
Pais (millones de Grano implicado
acres)
1 acre=4047m2
soja, algodón ,
USA 74.8
mostaza
Argentina 24.7 soja, millo, algodón

Canadá 7.4 soja, millo, mostaza

China 1.2 algodón

South África 0.5 millo, algodón
Australia 0.4 algodón
México menor algodón
Bulgaria menor millo
Romania menor soja, papa
menor y
España millo
recientemente
Germany menor millo
France menor millo
Uruguay menor soja

Tabla 11.2. Producción y plantas de cultivo transgénicas.

El área dedicada al cultivo de plantas GM aumenta
continuamente (véase la tabla 11.3).

Área dedicada a la producción mundial de Plantas

MG y tipos de trans-genes (Science 286:1663,
1999).
Area planted in 1999
Cereal (millions of acres) 1
2
acre=4047m
soja 53.4
millo 27.4
algodón 9.1
mostaza 8.4
Papa 0.3
Squash 0.3
Papaya 0.3
Modificación
tolerancia a herbicida 69.4
Bt resistencia a
22.0
insectos
Bt + tolerancia a
7.2
herbicida
resistencia a virus 0.3

Tabla 11.3. Área empleada en cultivos de plantas GM.

En cuanto a los genes que se utilizan en las planta

GM, podemos referirnos a los descrito en la Tabla 11.4.
Modificaciones en plantas trans-génicas frecuentes
y previsión
Acción que reporta el
…en los siguientes cereales
siguiente beneficio
Bt crops: Protección frente a corn, cotton, potatoes
insectos, menor uso de Futuras plantas a ser introducido:
pecticidad. Mediante una sunflower, soybean, canola, wheat,
proteína de Bacillus tomatoes
thuringiensis, or Bt.
Herbicide tolerant crops soybean, cotton, corn, canola, rice
Herbicida específico que no Futuras plantas a ser introducido:
daña el cereal. Permite wheat, sugar beet
ajustar tiempos y dosis de los
herbicidas.

Disease-resistant crops sweet potato, casava, rice, corn,

Una especie de vacunación squash, papaya
frente a enfermedades Futuras plantas a ser introducido:
víricas tomatoes, banana
High-performance cooking sunflower, peanuts and soybeans
oils Mejora las propiedades
de los aceites. El acido
oleíco y el esterato son sus
dianas
Healthier cooking oils soybean
menor cantidad de grasas
saturadas
Delayed ripening retrasa el tomatoes
momento de la madurez. Futuras plantas a ser introducido:
Facilita la conservación y el raspberries, strawberries, cherries,
transporte. tomatoes, bananas, pineapples

Increased-solids tomatoes tomatoes

Superiores propiedades
organolépticas
rBST una combinación de la rBST (producción de leche)
hormona somatropina bovina
que regula la síntesis de
leche. Incrementa la
roducción hasta un 15% en
un 30% de las vacas
americanas.

Food enzymes, una forma chymosin (in cheese)

más estable de la chimosina es el primer producto
para hacer queso, biotecnologico de aplicación a la
remplazando esta y la alimentación
rennina que se obtienen del
cuajo.
Nutritionally enhanced Futuras plantas a ser introducido:
foods Nutrientes, vitaminas y Más proteínas en batata y arroz;
otros elementos importantes. Más vitamina A.
Producciendo alimentos más Más antioxidantes.
equilibrados.

Tabla 11.4. Modificación incrementada o modificada en plantas sometidas

a procesos de transformación.

Fuentes de información actualizadas.

Fuente general para las tablas: BIO Member Survey.

Referencias en Internet.

Web relativa a la regulación Americana para la

manipulación de genes y su introducción en obtener
plantas MG:
http://vm.cfsan.fda.gov/~dms/opa-armg.html

Web general sobre técnica y método de Plantas MG:

http://www.agbiotechnet.com/

Web relativo a la modificación de plantas:

http://www.nal.usda.gov/bic/

Curso de información y técnica:

http://www-ceprap.ucdavis.edu/

Página central del gobierno USA sobre organismo

modificados genéticamente:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Ejercicios y problemas: lección 11.

Ejercicio 11.1 Mutantes (traduzca).

A Sanger dideoxy sequence analysis was performed on

a wild+type and the a mutant gene. The sequencing
gels are represented below.

WT MUTANT
G A T C G A T C

From these results

a. determine each sequence in full in the
template strand, 5'3'direction.
b. determine the mutant site and the nature of
the mutational event.
Lección 12. Temas especiales de Biología molecular
Plantas.

Consideraciones especiales en el uso de especies

transgénicas. Plantas GM y la situación Canaria.
Biodiversidad en variedades y cultivos agronómicos
preservados en Canarias: Millo, Tomate, Papa.
Consideraciones especiales de algunas plantas
usadas como modelo de Biología molecular.
Arabidopsis y Millo. Evolución del genoma de las
plantas.
_____________________________________________

Consideraciones especiales: Riesgo para la salud

humana.

Alergia:
No hay evidencia demostrada de que la
alimentación con plantas GM produzcan alergias
diferentes a las de las plantas convencionales, solo hay
descrito alergia para un algodón no comercializado y
para el trigo Starlink®.

Herencia horizontal:
La herencia horizontal de genes incluida la
resistencia a antibióticos puede producirse y ser
causante de resistencias observadas en especies que
poseen este tipo de trans-genes, sobre todo en el caso
de los empleados como genes marcadores.

La vía de transferencia ocurre mediante la

población bacteriana y vírica, residente en el suelo, que
transportaría los trans-genes de una Planta MG a otra
especie, Además se describe la adquisición de
resistencia por parte de la flora bacteriana del estomago
(incluida la absorbida en la comida) lo que incrementaría
la resistencia de estos organismos o los patógenos
asociados en caso de tratamiento médico con el mismo
tipo de antibiótico. Aunque se han descrito interacciones
horizontales entre genomas de especies del suelo, este
proceso es, sin embargo, poco probable para flujos tan
amplios como el que corresponde a especies
transgénicas y otras del entorno, también ocurre la
misma imposibilidad para las ácidas condiciones del
estómago humano.

La última posibilidad es que el producto proteico

del transgen resistente se genere en la planta y sea
ingerido manteniendo sus propiedades en el estómago.
Esta opción ha sido demostrada (Resultado de una
experimentación con Calgene' s FlavrSavr tomato y
Ciba-Geigy' s Bt corn 176).

Resistencia a antibióticos por la flora del suelo:

La población bacteriana del suelo posee su propia

reserva de resistentes. Los genes transgénicos pueden
incorporase a esta población causando una resistencia a
antibióticos generalizada. Sin embargo este proceso solo
se mantiene en condiciones de continua presión
evolutiva y no parece ser un factor propagable. Sin
embargo también hay que mencionar que las relaciones
entre microorganismos y planta son muy complejas y
están aun bajo investigación.

Ingestión y fijación de tansgenes:

Algunos trans-genes son de origen vírico o

bacteriano, al alimentarse de plantas MG, al igual que
otro tipo de alimento la mayor parte del DNA es
fragmentado a nucleótidos y fragmentos de estos. Una
pequeña parte del DNA es absorbido al torrente
circulatorio y otra fracción es excretada. El papel que el
DNA de cualquier tipo adquirido por el torrente
sanguíneo está bajo investigación.

Promotor CaMV:

La adquisición del patrimonio génico humano de

un promotor potente como el promotor del Virus del
Mosaico cauliflor (Figura 12.1) ha sido considerado
como un peligro potencial al ser potentes inductores de
expresión génica y haberse demostrado su peligrosidad
en contacto con nuestro genoma. Sin embargo se
conoce en ratón la capacidad del sistema defensivo
corporal para eliminar fragmentos de DNA circulantes.
Además durante años se ha comido plantas infectadas
con este virus sin aparente efecto sobre el genoma.

Figura 12.1.: Infección causada por el virus del mosaico cauliflor en

mostaza. Fuente: Institute National de la Recherche.Agronomique,
Versailles-Grignon.

Modificaciones en la composición de los nutrientes:

Es importante este apartado para asurar la calidad

de plantas MG comparadas con las originales. Cambios
accidentales en la fisiología de las plantas podrían dar
lugar a especies menos eficaces para nuestra dieta,
incluyendo en esto a las isoflavonas, etc. En general el
estudio del metabolismo secundario en especies
transgénicas debe reexaminarse.

Daños ecológicos:

Algunas especies de mariposa (véase la Figura

12.2) son sensibles a las plantas resistentes a insectos
peligrando la biodiversidad de los campos, este es un
aspecto a considerar cuando se emplean plantas GM
agresivas.
Figura 12.2.: Mariposa Monarca.

Hibridación cruzada de especies de cereal a plantas

silvestres:

La resistencia a herbicida puede traspasarse entre

especies emparentadas mediante polinización cruzada,
esto introduce un elemento a considerar en el estudio de
especies transgénicas. La investigación realizada hasta
el momento indica que estos elementos pueden persistir
mucho tiempo una vez se han establecidos. Un ejemplo
a tener en cuenta es por ejemplo el trigo mexicano con
capacidad para hibridar al contrario que los europeos o
americanos. Algo similar ocurre con la soja china.

Plantas GM y la situación Canaria.

Repercusión de Planta GM en Canarias:

La influencia de la tecnología transgénica en

Canarias (entendiendo como tal, también las zonas
económicas de influencia del archipiélago) se debe
evaluar teniendo en cuenta dos grupos principales:

Grupo 1.- Plantas cultivadas en canarias y que son, o

pueden ser, sustituidas por la misma especie
transgénica
Grupo 2.- Plantas y sus productos, utilizadas
mayoritariamente en la alimentación y con procedencia
en plantaciones transgénicas o elaboradas en entornos
próximos a plantaciones transgénicas.

De entre las plantas cultivadas destacan varias especies

que han sido mejoradas genéticamente de diferente
forma, bien mediante genética clásica (hibridación) o
bien mediante modificación (Plantas MG), destacando,
por su producción las siguientes:

Tomate,

Plátano,

Papa (semilla importada y se postula la posibilidad de

que para variedades locales se hallan llevado a cabo
hibridacion).

Y en cuanto a las sundas, que localizan en mercado e

industria agrícola y ganadera:

Millo bien para siembra o de importación para consumo,

(grano alimenticio, grano procesado)

Papaya

Otros productos vegetales procesados para la

alimentación humana (Soja, Trigo, etc.), y animal
(granos diversos, etc.).

Cultivos agronómicos preservados en Canarias.

Destacamos algunos de los cultivos de mayor

repercusión en la estructura alimentaría canaria:

Millo (Zea Maiz).

El millo es una planta pionera en la tecnología de

plantas CM y es un elemento de la agricultura tradicional
actual. Además sus productos de transformación forman
parte de la dieta en múltiples formas.

Como hemos visto más arriba 4,5 millones de hectáreas

y unos 5,3 billones de euros l año se obtienen en la
unión europea.

España es uno de los cuatro principales

productores y su destino principal es el ganado y la
alimentación directa (aceite, almidón o harina). Los datos
disponibles para la península indican que el uso de
plantas resistentes implica un paso de un 30% al 4% en
perdida de productividad debida a patógenos.
Las propiedades de propagación del millo lo hacen
un cultivo tradicional en Canarias, sin embargo la
producción de variedades modificadas se introduce
lentamente al ser mas eficaces tanto en producción
como en la calidad aparente del producto (véase la
Tabla 12.1.)

Producción de grano de Maíz

Valor
Producción
comercial en
en billones Hectáreas
billones
Kg/año
euros/año
Francia 16,3 1914 2,0
Italia 10,4 1109 1,6
España 4,9 504 0,7
Alemania 3,5 397 0,4
USA 331 30300 19,2
Total 35,1 3924 4,7

Tabla 12.1. Producción mundial del millo.

Dos Millos trangénicos tolerantes a herbicida han

sido comercializados el Roundup Ready (RR) y el
LybertyLink (LL). El primero permite el empleo del
glyphosato, un intermediario metabólico que bloquea la
biosíntesis de aminoácidos aromáticos mediante la
inhibición de la correspondiente enzima. El LL resiste al
glufosinato (un tóxico empleado frecuentemente como
parte de un herbicida) mediante la introducción de un
gen que confiere modificación de este toxico en los
tejidos en que se expresa.

El uso de este tipo de maíz produce los resultados

mostrados en la Tabla 12.2.

Impacto potencial del may tolerante a glufosinato sobre

el uso de herbicidas
País Área Frecuencia Uso total herbicida
(Kg/Ha) (Kg)
Ha actual biot. actual biot. cambio
Francia 1914 1,8 0,9 3445 1723 -1722
Alemania 397 1,74 0,9 691 357 -334
Italia 1109 2,5 0,9 2772 998 -1774
España 504 1,74 0,9 877 454 -423
total 3924 7785 3532 -4258

Tabla 12.2. Aplicaciones del Glufosinato en el millo MG.

La incidencia de las pestes sobre la producción del

maíz local no parece ser prioritario paral a inclusión de
este tipo de especies en la a agricultura. Hay que
destacar sin embargo que el efecto de herbicidas y otras
sustancias químicas empleadas en el tratamiento de la
agricultura en el ecosistema rural canario es una seria
amenaza para la calidad de las aguas al incorporarse o
interaccionar con el agua de infiltración y por tanto afecta
directamente a la salud humana y en el ecosistema.
De forma alternativa hay que considerar la utilización de
millo en las importaciones para fabricar localmente Gofio
y en otros productos ya procesados Conflakes y
derivados, espesantes, componentes etc. en una
variedad de alimentos (igual que en la Península) hay
que indicar que el origen no solo es Nacional sino que
cada vez más frecuentemente su origen es de países
Europeos, mayoritariamente Francia e Italia y
próximamente de los grandes graneros Europeos como
son los nuevos países adheridos del Este de Europa.

Tomate (Lycopersicum ss.).

Figura 12.3. Biología molecular del Tomate como modelo de plantas

transgénicas.

El fruto del tomate es un alimento muy utilizado y

ha sido abundantemente modificado de forma clásica. La
producción del Licopeno relacionado con la vitamina A
ha sido una diana efectiva en la búsqueda de nuevas
variedades, también por modificación genética, al igual
que con el plátano la capacidad para retrasar la madurez
(Flavr-Savr® tomato ha sido obtenido como una
variedad con esta capacidad)

Otro objetivo logrado recientemente son Plantas de

tomate MG capaces de resistir cantidades altas de sal
sin afectar al sabor de los frutos. Todas estas
variedades pueden ser introducidas en el mercado en
fechas relativamente pronto, destacan las variedades
patentadas en Israel y que forman parte de la cartera de
importaciones del gobierno canario.
Más información en el siguiente link:

http://www.ars.usda.gov/is/AR/archive/sep00/tomato090
0.htm

PAPA (solanum tuberosum ss.).

Los cultivos de las diferentes variedades

englobadas bajo el género Solanum tuberosum y
especies afines, han sido muy empleadas para la
modificación de sus tubérculos subterráneos o papas,
debido, en parte, a presentar un tipo de propagación
cerrada - sin polinización- que permiten su uso como
plantas MG con mayor libertad y menos riesgos
aparentes. Uno de los objetivos potenciales es el
incremento en la producción endógena de
glicoalcaloides tóxicos una forma natural de defensa de
la familia solanácea pero que poseen el peligro de su
toxicidad también para el consumidor. La dispersión
polinizada de las variedades ancestrales (Perú) y de las
variedades “puente” entre ancestrales y las adaptadas a
ciclos cortos (Canarias) es un riesgo adicional a estas
variantes modificadas, debido a que pueden propagarse
fuera de los campos de cultivo y propagar genes
resistente a pesticidas en otras variedades.

Las papas como auto-tetraploides han sido

empleados para la selección de variedades desde
tiempos muy remotos (2n = 4x = 48) Las dificultades
inherentes al carácter tetraploide y al alto valor de
heterocigósis han llevado al empleo de eficaces nuevas
variedades mediante la tecnología transgénica. Los
objetivos más aplicados son resistencia a herbicidas, es
de destacar que muchas de estas variedades se han
obtenido mediante el uso de genes aislados de
diferentes variedades de Solanum.

Las papas Autóctonas Canarias se encuentran en

un estado aún no evaluado probablemente
caracterizadas por una mínima diversidad genética
debido a la pequeña población existente, por otro lado
se puede predecir que poseen un importante potencial
para la reproducción sexual y una alta heterocigósis, su
potencial como alimento de referencia contrasta con el
carácter ubiquista de las formas más valiosas. Todos
estos caracteres pueden ser explotados, bien por cruces
híbridos tradicionales, bien por fusión de genética clásica
o bien incluso por su utilización como dianas para
plantas MG.

Por último hay que tener en cuenta la situación

política de Canarias, su ubicación en la Unión Europea
dentro de un protocolo previsible de libre intercambio
agroalimentario requiere tener en consideración las
normativas actuales y las propuestas de actuación de la
Comunidad, que para el campo de la biotecnología de
cultivos transgénicos se expresa en el protocolo de
actuación hasta el 2025 descrito en la siguiente
referencia:

http://www.europabio.org/documents/Plantgenbrochure.p
df

Como una base de datos general se puede suir el

siguiente link (Universidad de Cornell: Información sobre
Papa, Millo, Plátano y otras Plantas MG):

http://cuinfo.cornell.edu/Campus/Infobase/index.phtml?ki
ndex=426

Consideraciones especiales de algunas plantas

usadas como modelo de Biología molecular.
Arabidopsis y Millo.

Se ha podido observar la gran variabilidad en

cuanto al tamaño del genoma existente en el reino
vegetal: 145 millones de pares de bases en Arabidopsis
thaliana, la especie modelo de estudio de las plantas,
con el genoma más pequeño entre los vegetales, y
114000 millones de pares de bases en los mayores
genomas de plantas. No se ha sabido explicar hasta
ahora esta gran variabilidad, se considera resultado del
azar evolutivo, y uno de sus efectos sería una
ralentización de la replicación celular.

Arabidopsis thaliana es una pequeña crucífera

que vive en las montañas, utilizada como modelo de
estudio de la genética de plantas debido al reducido
tamaño de su genoma, a su rápido ciclo de crecimiento y
a la facilidad de realizar cruces y transgénicos. La
secuenciación del genoma de A. thaliana finalizará en el
mes de diciembre del año 2000. Además de averiguar la
secuencia de bases de su DNA, se han identificado
muchos de sus genes y se sabe que están dispuestos
de forma muy compacta (un gen cada 4000 pares de
bases). Se conoce la función del 60% de los
aproximadamente 400 genes de Arabidopsis: 22% son
genes responsables del metabolismo, 10% del
metabolismo secundario (síntesis de aromas u otras
sustancias que aprovechamos a menudo como
medicamentos u otros productos), 15% de la maquinaria
reguladora de la expresión genética, 14% de la defensa
y resistencia a virus, insectos o mamíferos. Al analizar el
genoma de esta planta, hallamos dos importantes
sorpresas: se trata de un genoma muy pequeño, pero
con un gran número de genes: 25000, frente a los 35000
que se estiman ahora para la especie humana o los
14000 de Drosophila.

Se sabe actualmente que un 80% del genoma de

Arabidopsis está duplicado, lo que plantea el problema
de estimar la información genética mínima necesaria
para formar una planta. La sunda sorpresa se descubrió
al comparar el genoma de Arabidopsis con el de otras
especies entre las que figuran bacterias, levaduras,
gusanos o la especie humana. La colección de genes
del metabolismo se parecía en todas las especies y la
colección de genes responsables de regular la expresión
genética se parecía sobre todo, curiosamente, a la del
hombre.
El maíz (Zea mays), una de las cinco especies
base de nuestra alimentación, es otra especie muy
estudiada en genética; fue creada por las primeras
civilizaciones agrícolas de América Central durante el
neolítico, a partir de otra especie, Teosinthe, el maíz
silvestre. Cinco mutaciones separan estas dos especies
que se diferencian en el tamaño del grano, en el número
de ramas, etc. Se ha consuido suir el camino evolutivo
del maíz y el proceso de creación mediante mutaciones
progresivas y selección por parte del hombre con el fin
de mejorar la productividad y calidad de sus cultivos.
Este tipo de evolución dirigida o domesticación ha
ocurrido también con el arroz o el trigo.

Ya en el siglo XX, en los años cincuenta, durante la

llamada revolución verde, Norman E. Borlaug, premio
Nobel de la Paz en 1970, consiguió e identificó
variedades enanas de arroz y de trigo que concentraban
toda la energía en la formación del grano y daban una
enorme productividad. Se originó así un gran crecimiento
de la producción agrícola y con él, de la población
mundial. Recientemente, se han descubierto los
fundamentos moleculares de los hallazgos de Norman E.
Borlaug. Lo que los agricultores mesoamericanos
consuían mediante cruces y selección de variedades
puede realizarse ahora con los conocimientos de
genética. En la actualidad, se modifica el genoma de las
plantas introduciendo genes de otras especies; un
ejemplo es el caso de una variedad de arroz en la que
se ha introducido un gen esencial en la síntesis de
vitamina A (ausente en la planta del arroz), cuya
carencia causa un gran déficit para las poblaciones que
se alimentan de este cereal. Se están mejorando del
mismo modo otros cultivos básicos para la alimentación
humana, lo que ha extendido de forma considerable la
superficie mundial de cultivos transgénicos.

Evolución del genoma de las plantas.

Todos los seres vivos comparten un mismo origen

evolutivo, las afinidades entre las diferentes especies
pueden suirse mediante análisis de los genomas y en
general son coincidentes con los datos obtenidos desde
otras aproximaciones (Figura 12.4). El esquema
aceptado para una visión evolutiva de los genomas
puede representarse mediante árboles evolutivos que
representan las divergencias y cuantifican esta
divergencia mediante las distancias que separan los
diferentes grupos.

Figura 12.4. Árbol evolutivo general de los seres vivos.

El modelo para todas las plantas verdes se

muestra en la Figura 12.5.

Figura 12.5. Árbol evolutivo de las plantas verdes.

De forma general, el análisis genético muestra la

existencia de dos líneas mayores de plantas verdes, la
primera agrupando a las algas verdes microscópicas
correspondiente a los grandes acúmulos de los mares.
La otra línea agrupa a las algas verdes similares a las
terrestres y al resto de las plantas. Todas ellas están
referidas como sub-reino Chlorobionta (Bremer, 1985).
Dentro del sundo grupo, denominado Streptophytes
(Bremer, 1985), encontraremos las briophytas formando
un taxón homogéneo que nos permite clasificar a las
plantas que ocupan nichos terrestres.

Es de destacar el que la identificación de las

Charoficeas como un grupo parafilético ensamblado
con las plantas terrestres ha permitido una reevaluación
de la taxonómica molecular general de las plantas.

Evolución ancestral de las plantas.

Desde 1500 millones de años permanecieron los

organismos fotosintéticos bajo el agua protegidos de la
luz UV. A partir de un nivel suficiente de O2 estos
invadieron las tierras emergidas (Figura 12.6)

Figura 12.6. Evolución de las Plantas en relación con una atmósfera

oxidante.
Lo demuestra la co-evolución de las condiciones
ambientales en paralelo a la aparición de las formas
vegetales y otros organismos generadores y
consumidores de oxigeno.

La aparición de plantas terrestres se inicia en el

Ordovícico (510-439 millones años), un momento
caracterizado por un clima suave y mares poco
profundos. Las plantas probablemente mantenían parte
de su ciclo bajo el agua. Los datos moleculares sugieren
la existencia de todavía una colonización anterior desde
700 millones de años.

Plantas Vasculares.

Hace, aproximadamente, 425 millones de años

aparecieron las plantas con un estilo homo-hídrico, es
decir que mantenían un entorno aislado del exterior. Se
corresponde con el periodo Silúrico, un ejemplo es la
Cooksoni , de solo unos centímetros, que presenta
esporangios en sus extremos. Todas estas plantas
tenían muchos rasgos en común con las algas, como su
capacidad de reserva dentro de los cloroplastos,
paredes celulares de celulosa, pigmentos fotosintéticos
chl-a y chl -b más -caroteno. Además, el paso de la
vida vegetal al suelo, planteó problemas como los que
se indican a continuación, y que requirió la modificación
del metabolismo y una fuerte presión evolutiva para la
diversidad del genoma lo que permitió la adquisición de
nuevos genes, destacando aquellos relacionados con la
adaptación o el control de:

Radiación: Luz UV, Calor, Daño por exposición del

fotosistema.

Desecación: Aire y suministro de agua.

Dispersión embriones: No hay agua para la dispersión

tradicional.
Fertilización: No hay aporte continuo de nutrientes
excepto cuando hay agua circulante.

Exceptuando las algas verdes, cianobacterias (algas

azul-verdosa), líquenes y briófitos, los cuales utilizan
entornos acuosos para crecer permaneciendo
desecados en medios secos, el resto de plantas
terrestres emplean el sistema denominado
homohidroídico par sobrevivir en tierra:

La solución a la existencia en medio seco requirió la

obtención de rutas metabólicas para los siguientes
procesos y estructuras:

Control del contenido de agua (cutícula)

Válvulas para la fotosíntesis (estomas)

Transporte interno de agua (Xilema)

Estructuras espaciales (hojas, tallo, etc.)

Reserva de gas (espacio intercelular)

Diversificación de las plantas terrestres primitivas.

Durante el periodo Devónico (408 - 362 millones

de años), se produjo una fuerte radiación de especies
entre ellas destacan los Líquenes antiguos (similares a
los actuales como Equisetum sp.) y las primeras pro-
gimnospermas intermedias entre ancestros y plantas
actuales. El Archeopteris, un árbol real aparece en el
Devónico tardío junto con las primeras semillas aéreas
de las gimnospermas. La aparición de plantas con raíces
implicó la modificación del suelo y la construcción de
unas condiciones diferentes y adecuadas para el
desarrollo de las plantas.
Semillas.

La presencia de las semillas significó la invasión

rápida de nichos vírgenes, y la resistencia a condiciones
hostiles. Por tanto, tras la aparición de las semillas se
produjo una rápida colonización y diversificación, lo que
se correlaciona con la aparición del Carbonífero (entre
362 y 290 millones de años), el clima se volvió cálido,
pocos cambios estacionales en los trópicos y húmedo. A
partir de este momento se originan los bosques de
dieron lugar a importantes yacimientos fósiles. Las
primeras coníferas aparecen al final de este periodo.

Plantas con flores.

Durante el periodo Jurásico (208 - 145 millones de

años), las Cícadas fueron las plantas terrestres
dominantes, pero durante el Cretácico (145-65 millones
de años) aparecieron las primeras plantas con flores
(Angiospermas) en conjunción con los insectos
polinizadores. Hay 235.000 especies de angiospermas
con una serie de características diferenciadoras: flores,
frutas, metabolismo secundario y ciclo de vida
diferentes, todo ello hace de este conjunto de especies
un grupo monofilético.

En comparación con la angiospermas, la flor

representa una culminación en la complejidad de las
semillas que requieren de un fruto y para ello desarrollan
complejos sistemas de transporte de agua, la presencia
de estomas abiertos durante gran parte del día permiten
mayor eficiencia fotosintética que se emplea en la
fabricación del fruto, flores, aromas etc., todo lo cual
contribuyen a la polinización por animales cuyo resultado
final es una dispersión eficiente de las semillas.
Los dos grupos de las angiospermas son las
Dicotiledóneas (eudi-) y las Monocotiledóneas
(hierbas), estas últimas, evolucionaron en el Eoceno
(56,5-35,4 millones de años) y se asociaron a los
animales rumiantes durante el Oligoceno (35,4-23,2
millones de años). Tras las glaciaciones del Mioceno,
apareció una época desértica en gran parte de los
hábitat. Durante el Plioceno (5,2-1,6 millones de años)
se fragmento aún más el ecosistema global,
coincidiendo con la diversificación de los monos
antropoides.
Bibliografía.
Referencias general de Libros Básicos.
Referencias general de Libros de Biología molecular
Plantas.
Paginas Web y link a Internet.

Referencias generales de libros básicos.

Bioquímica. Lubert STRYER. Editorial Reverté, S.A. en

cualquiera de sus últimas ediciones (IV-VI)

Principios de Bioquímica. Albert L. LEHNINGER; David

L. Nelson; Michael M. Cox. Editorial Omega. Edición III.

Presentaciones basadas en dos libros clásicos de

bioquímica: Lehninger y Stryer en el link:
http://rojo.ibmc.umh.es/asia/

Referencias generales de libros de biología

molecular de plantas.

Libros:
Plant Biotechnology: The Genetic Manipulation of Plants.
Adrian Slater, Nigel W. Scott, Mark R. Fowler. Editorial
Oxford. 2003.

Plants, Genes and Crop Biotechnology. David E.

Sadava. Jones and Bartlett Publishers International.
2003.

Technology Transfer of Plant Biotechnology. Peter M.

Gresshoff. Editorial CRC Press. 1996.

Revistas:
Plant Molecular Biology (Kluwe Editores) on-line.
http://www.kluweronline.com/issn/0167-4412/contents
Páginas Web y link a Internet con contenidos
generales y formativos de molecular biology:
Texto general on line: Molecular Biology Notbook

http://www.rothamsted.bbsrc.ac.uk/notebook/

Videos sobre diferentes aspectos de la biología

molecular de plantas:
Scanning Life Matrix: genes proteins and small
molecules. Howard Hughes Medical Institute.
http://www.biointeractive.org
DNA from the beginning
http://www.dnaftb.org

Centros de referencia para la investigación en

biología molecular:
Organización Europea de Biología molecular (EMBO).
http://www.embo.org
Centro Nacional de Biotecnología.
http://www.cnb.uam.es
Human Genome proyect Information.
http://www.ornl.gov/hgmis.home.html
National Library of Medicine, USA.
http://www.nlm.nih.gov
National Center for Biotechnology Information.
http://www3.ncbi.nlm.nih.gov
Proyecto Genoma Humano.
http://www.nhgri.nih.gov/educationkit/