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INGENIERÍA DE TEJIDOS EN
VÁLVULAS CARDÍACAS
Investigación Bibliográfica
Carrera: Bioingeniería -U.N.E.R -Fac. de Ingeniería - Oro Verde - Paraná-Entre Ríos - Argentina - Febrero 2014
Nicolet, Jonathan; Solari, Esteban - Ingeniería de tejidos en válvulas cardíacas - 2014 Pág. 2
A. ÍNDICE
A. ÍNDICE...................................................................................................2
C. ACTIVIDADES.......................................................................................5
D. RESUMEN.............................................................................................9
D. ABSTRACT..........................................................................................11
E. INTRODUCCIÓN..................................................................................12
F. CAPÍTULOS.........................................................................................13
Capítulo 1: VÁLVULAS CARDÍACAS Y PRÓTESIS...................................................13
1.1. Patologías de las válvulas cardíacas................................................................................13
1.2. Condiciones determinantes para el reemplazo de válvulas cardíacas..............................13
1.3. Tipos de prótesis valvulares cardíacas........................................................................14
1.3.1. Prótesis mecánicas........................................................................................................14
1.3.2. Prótesis biológicas......................................................................................................... 16
1.3.3. Prótesis desarrolladas por ingeniería de tejidos (TE).....................................................17
1.4. Problemas frecuentes de las prótesis valvulares..............................................................18
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G. CONCLUSIONES................................................................................97
H. BIBLIOGRAFÍA...................................................................................98
H.1. Bibliografía de autor......................................................................................................98
H.2. Bibliografía de instituciones........................................................................................115
I. GLOSARIO..........................................................................................117
1.1. Glosario alfabetizado en Inglés....................................................................................117
1.2. Glosario alfabetizado en castellano............................................................................121
J. CLAVES DE BÚSQUEDA..................................................................124
K. ANEXOS............................................................................................125
K.1. Títulos y resúmenes.....................................................................................................125
K.2. Publicaciones científicas................................................................................................137
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B.1.2) Aplicar los conocimientos generales aprendidos durante el cursado de las asignaturas
Comportamiento Físico de Biomateriales y Biomateriales y Biocompatibilidad a una
investigación bibliográfica sobre el tema: “Ingeniería de tejidos en válvulas cardíacas”.
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C. ACTIVIDADES
2012-10-11
Biblioteca de la FI-UNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: tissue engineering of human heart valves, tissue engineering
valves
Cantidad de archivos obtenidos: 32.700, 17.200
Resultados obtenidos:
Mol, Anita: Functional tissue engineering of human heart valve leaflets. The Netherlands,
Eindhoven, Technische Universiteit Eindhoven, 2005. Disponible en:
http://alexandria.tue.nl/extra2/200510793.pdf
Mol, Anita: Tissue Engineering of Human Heart Valve Leaflets: A Novel Bioreactor for a Strain-
Based Conditioning Approach. The Netherlands, Eindhoven, Technische Universiteit
Eindhoven, 2005. Disponible en: http://www.mate.tue.nl/mate/pdfs/5648.pdf
Rieder, Erwin et al.: Decellularized Porcine and Human Valve Scaffolds Differ Importantly in
Residual Potential to Attract Monocytic Cells. Circulation, 2005;111:2712-2714.
Simionescu, Dan: Scaffolds and Stem Cells for Patient-Tailored Aortic Heart Valve Tissue
Engineering. QScience Proceedings: Vol. 2012, Heart Valve Biology and Tissue Engineering,
76.
Lanza, Robert: Principles of tissue engineering. 3era edición, Elsevier, 2011. Disponible en:
http://www.sciencedirect.com/science/book/9780123706157
2012-10-14
Biblioteca de la FI-UNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: heart valve pathologies, válvulas cardiacas protésicas
Cantidad de archivos obtenidos: 17.200, 1.230
Resultados obtenidos:
Michael, George; “Les valves cardiaques et les pathologies valvulaires“. Edward’s Lifesciences
SA, 2010. Disponible en:
http://multivu.prnewswire.com/mnr/prne/edwardslifesciences/44227/docs/44227-
understandingheartvalves-French.pdf
Hinton, Robert: Heart Valve Structure and Function in Development and Disease. Ann. Rev.
Physiol. 2011. 73:29–46. Disponible en:
http://www.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev-physiol-012110-142145
Steinhoff, Gustav et al.: Tissue Engineering of Pulmonary Heart Valves on Allogenic Acellular
Matrix Conduits. 2000. Disponible en: http://circ.ahajournals.org/content/102/suppl_3/III-
50.full
2012-10-25
Domicilio particular de Jonathan Nicolet
Búsqueda en internet
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Clave de búsqueda utilizada: collagen heart valve scaffold, PLGA heart valve scaffold
Cantidad de archivos obtenidos: 5.180, 1.230
Resultados obtenidos:
Chen, Qi et al.: Collagen-Based Scaffolds for Potential Application of Heart Valve Tissue
Engineering. J Tissue Sci Eng, 2012, S:11. Disponible en: http://www.omicsonline.org/2157-
7552/2157-7552-S11-003.pdf
Shangping, Wang et al.: Protein secondary structure and solvent accessibility of proteins in
decellularized heart valve scaffolds. Biomedical Spectroscopy and Imaging 1 (2012) 79–87.
Disponible en: http://iospress.metapress.com/content/562rl6728v249v5n/fulltext.pdf
Holy Chantal et al.: Optimizing the sterilization of PLGA scaffolds for use in tissue engineering.
Biomaterials (2001), Vol. 22, Issue: 1, Publisher: Elsevier Ltd, Pages: 25-31. Disponible en:
http://www.mendeley.com/catalog/optimizing-sterilization-plga-scaffolds-tissue-engineering/
Tedder, Mary et al.: Assembly and Testing of Stem Cell-Seeded Layered Collagen Constructs
for Heart Valve Tissue Engineering. Tissue Engineering Part A. January 2011, 17(1-2): 25-36.
doi:10.1089/ten.tea.2010.0138. ABSTRACT.
Wang, Shangping et al.: Freeze-Dried Heart Valve Scaffolds. Tissue Engineering Part C:
Methods. July 2012, 18(7): 517-525. doi:10.1089/ten.tec.2011.0398. ABSTRACT.
2012-10-25
Domicilio particular de Jonathan Nicolet
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: TE heart valves future
Cantidad de archivos obtenidos: 11.500
Resultados obtenidos:
Mol, Anita et al.: Review Article: Tissue Engineering of Semilunar Heart Valves: Current Status
and Future Developments. Tissue Engineering of Semilunar Heart Valves: Current Status and
Future Developments, Switzerland, 2006. Disponible en:
http://www.mate.tue.nl/mate/pdfs/3978.pdf
Kidane, A. et al.: Current developments and future prospects for heart valve replacement
therapy. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied BiomaterialsVolume 88B,
Issue 1, 2008. ABSTRACT.
2013-04-02
Biblioteca FIUNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: hipoxia + engineered heart valves
Cantidad de archivos obtenidos: 10.600
Resultado obtenido:
Balguid, Angelique; Mol, Anita et al., 2008, Hypoxia Induces Near-Native Mechanical
Properties in Engineered Heart Valve Tissue. Circulation, 2009, vol. 119, pp. 290-297.
Disponible en: circ.ahajournals.org/content/119/2/290.short
Clave de búsqueda utilizada: circulating endothelial progenitor cells
Cantidad de archives obtenidos: 22.300
Resultado obtenido:
Asahara, Takayuki et al., 1999, Bone Marrow Origin of Endothelial Progenitor Cells
Responsible for Postnatal Vasculogenesis in Physiological and Pathological
Neovascularization, Circulation Research, 1999, no. 85, pp 221-228
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Deb, Arjun et al., 2005, Bone Marrow-Derived Myofibroblasts are Present in Adult Human
Heart Valves, J Heart Valve Dis, 2005, Vol. 14, pp 674-678. Disponible en:
http://www.unc.edu/~adeb/DebLab/Publications_files/J%20Heart%20Valve%20Dis
%202005%20Deb.pdf
2013-04-04
Domicilio particular de Esteban Solari
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: strains + tissue properties + TE
Cantidad de archivos obtenidos: 17.200
Resultado obtenido:
Boerboom, R.; Rubbens, M.; Driessen, N.; Bouten, C.; Baaijens, F., 2008, Effect of strain
magnitude of the tissue properties of engineered cardiovascular constructs. Ann. Biomed.
Eng., 2008, vol. 36, pp. 244-253.
Disponible en: http://link.springer.com/article/10.1007/s10439-007-9413-8
2013-04-10
Biblioteca FIUNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: decellularized scaffolds + heart valves
Cantidad de archivos obtenidos: 2950
Resultado obtenido:
Dijkman, Petra E. et al., 2012, Decellularized homologous tissue-engineered heart valves as
off-the-shelf alternatives to xeno- and homografts, Biomaterials, 2012, no. 33, pp 4545-4554.
Disponible en: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0142961212002876
Erdbrügger, Wilhelm et al., 2006, Decellularized Xenogenic Heart Valves Reveal Remodeling
and Growth Potential in Vivo, Tissue Engineering, 2006, Vol 12, no 8, pp 2059-2068.
Disponible en: http://online.liebertpub.com/doi/abs/10.1089/ten.tea.2011.0046
2013-04-11
Biblioteca FIUNER
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: pulsatile bioreactor
Cantidad de archivos obtenidos: 4630
Hoerstrup et al., 2000, New pulsatile bioreactor for in vitro formation of tissue engineered
heart valves, Tissue Engineering, 2000, Vol. 6, no. 1, pp. 75-59. Disponible en:
online.liebertpub.com.sci-hub.org/doi/pdf/10.1089/107632700320919
Dumont et al., 2002, Design of a new pulsatile bioreactor for tissue engineered aortic heart
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http://46.38.63.192/mail/lg.php?doi=10.1046/j.1525-
1594.2002.06931_3.x&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnMS8xMC4xMDQ2L2ouM
TUyNS0xNTk0LjIwMDIuMDY5MzFfMy54LnBkZg%3D%3D
Hildebrand et al., 2004, Design and hydrodinamic evaluation of a novel pulsatile bioreactor
for biologically active heart valves, Ann. Of Biomedical Engineering, 2004, vol. 32, no. 8, pp.
1039-1049. Disponible en: http://46.38.63.192/mail/lg.php?
doi=10.1114/B:ABME.0000036640.11387.4b&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnMy
8xMC4xMTE0L0IlMjUzQUFCTUUuMDAwMDAzNjY0MC4xMTM4Ny40Yi5wZGY%3D
2013-04-15
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Nicolet, Jonathan; Solari, Esteban - Ingeniería de tejidos en válvulas cardíacas - 2014 Pág. 8
Rieder et al., 2005, Tissue engineering of heart valves: Decellularized porcine and human
valve scaffolds differ importantly in residual potential to attract monocytic cells, Circulation,
2005, no. 111, pp. 2792-2797. Disponible en: http://circ.ahajournals.org.sci-
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Disponible en: http://46.38.63.192/mail/lg.php?doi=10.1007/s10047-006-0360-
1&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnMi8xMC4xMDA3L3MxMDA0Ny0wMDYtMDM
2MC0xLnBkZg%3D%3D
Erdbrügger et al., 2006, Decellularized xenogenic heart valves reveal remodeling and growth
potential in vivo, Tissue Engineering, 2006, vol. 12, no. 8, pp. 2059-2067. Disponible en:
http://46.38.63.192/mail/lg.php?
doi=10.1089/ten.2006.12.2059&url=aHR0cDovL2xpYmdlbi5vcmcvc2NpbWFnNS8xMC4xMDg
5L3Rlbi4yMDA2LjEyLjIwNTkucGRm
2013-06-05
Domicilio particular de Jonathan Nicolet
Búsqueda en internet
Clave de búsqueda utilizada: strains + tissue engineering + heart valves
Cantidad de archivos obtenidos: 20500
Mol et al., 2003, The relevance of large strains in functional tissue engineering of heart valves,
Thorac. Cardiov. Surgery, 2003, vol 51, pp. 78-83. Disponible en: http://131.155.54.17.sci-
hub.org/mate/pdfs/2816.pdf
Mol et al., 2005, Tissue engineering of human heart valve leaflets: a novel bioreactor for a
strain-based conditioning approach, Ann. Biomed. Eng., 2005, vol 33, no 12, pp 1778-1788.
Disponible en: http://link.springer.com.sci-hub.org/article/10.1007/s10439-005-8025-4
Carrera: Bioingeniería - U.N.E.R - Facultad de Ingeniería - Oro Verde - Paraná - Entre Ríos - Argentina - Feb. 2014
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D. RESUMEN
Las patologías valvulares son las causas más frecuentes de disfunción cardíaca. En el mundo
se realizan cerca de 250.000 intervenciones valvulares anuales, 3.500 de ellas en Argentina.
La etiología del reemplazo valvular comprende principalmente las estenosis e insuficiencias
de válvulas aórticas y las fallas agudas de cualquier válvula cardíaca. Las condiciones del
reemplazo dependen de la edad, la válvula afectada y la gravedad de la lesión. Existen tres
tipos de prótesis valvulares: las mecánicas, las biológicas y las desarrolladas por ingeniería de
tejidos (TE). En la actualidad las prótesis mecánicas de disco flotante son las más
frecuentemente indicadas, incluso más que el trasplante valvular. Sin embargo requieren
tratamientos anticoagulantes de por vida y en los mejores casos presentan una sobrevida de
20 años. El desarrollo de prótesis por TE se basa en tres pilares: soporte celular (scaffold),
células funcionales y factores de crecimiento.
Los scaffolds son estructuras encargadas de fijar las células necesarias para cumplir las
funciones de mantenimiento de la válvula. Pueden ser de 2 tipos: reabsorbibles o no
reabsorbibles. Algunas técnicas para fabricación de scaffolds son el lixiviado, liofilización,
separación de fases, espumado gaseoso, entrecruzamiento de fibras y electrospinning. Para
mejorar las propiedades mecánicas se usa el crosslinking y el photografting. Pueden
esterilizarse por plasma de argón remoto, óxido de etileno, radiación gamma o etanol al 70%.
Los scaffolds se fabrican con sustancias poliméricas. Inicialmente se usaban polímeros no
biodegradables. Actualmente se prefieren los biodegradables que son reemplazados por tejido
autólogo. Estos pueden ser naturales (como el colágeno, el quitosano o copolímeros
colágeno-elastina) o sintéticos (como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico y sus copolímeros,
la policaprolactona y los polihidroxialcanoatos).
Las válvulas cardíacas se componen de células endoteliales (VECs), células intersticiales
(VICs) y matriz extracelular (VECM). Las VECs se encuentran en contacto con la sangre y
evitan la formación de trombos. Las VICs sintetizan la VECM y son fundamentales para el
mantenimiento de la válvula. Las válvulas se desarrollan por diferenciación de células
endoteliales en mesenquimales mediada por factores de crecimiento. Las células valvulares
provienen del endotelio, el endocardio y células sanguíneas circulantes. Las células para
válvulas ingenieradas pueden ser obtenidas del cultivo de células madre o de células
endoteliales de vasos sanguíneos. Estas son sembradas en los scaffolds por técnicas in vitro
o por recelularización in vivo.
Se utilizan factores de crecimiento para acelerar el desarrollo de las válvulas ingenieradas.
Los más importantes son los factores fibroblásticos (FGF), los factores transformadores (TGF)
y los de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Las moléculas señalizadoras permiten el
control de la proliferación y adhesión celular. Desencadenan mecanismos de señalización que
activan cascadas de reacciones citoplasmáticas, modificando la expresión génica y el
citoesqueleto. Los sustratos de señalización son sustancias sobre las que actúan enzimas o
proteínas receptoras, y pueden ser GAGs, proteínas de la VECM, anticuerpos, citoquinas,
aptameros y polímeros biológicamente activos. Las propiedades mecánicas son mejoradas
hasta en un 50% a través de la aplicación cíclica de estímulos físicos (como deformaciones,
flexiones, flujos y tensiones) y el control de variables químicas (como la concentración de O2 y
de ozono).
La fabricación de scaffolds descelularizados a partir de válvulas de cerdo incluye 3 pasos: la
selección y extracción de la válvula, la decelularización y la optimización de propiedades. Los
scaffolds sintéticos más modernos se fabrican por superposición de capas poliméricas,
imitando las propiedades de las 3 capas válvulares naturales. Las válvulas sin scaffold sólido
utilizan biopapeles y otorgan propiedades biológicas, pero pobres propiedades mecánicas. La
fabricación in situ aprovecha la respuesta inflamatoria temprana post-implantación y permite
disponer de scaffolds a demanda. El conjunto de factores de crecimiento y métodos de
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D. ABSTRACT
Valvular pathologies are the most frequent causes of heart diseases. Annually around 250.000
valvular interventions are performed worldwide, 3.500 of them in Argentina.
Heart valve replaces are given mainly due to aortic valve stenosis and insufficiencies or acute
failure of any heart valve. Heart valve replacement conditions depends on patient’s age, which
valve was affected and the level of damage. There are three kinds of heart valve prostheses:
mechanical grafts, biological grafts and tissue-engineered (TE) heart valves. Currently, tilting-
disc mechanical prostheses are the most frequently indicated, even more often than valvular
transplant. Nevertheless, they require life-long anticoagulant treatments and a 20-year survival
is achieved in the best-case scenario. TE grafts are based on three pillars: scaffolds, cells and
growth factors.
Scaffolds are structures which attach the cells needed for valve maintenance. There are two
kinds of scaffolds: biodegradable and non-biodegradable scaffolds. Scaffold manufacturing
processes include leaching, liophilisation, phase separation, gas foaming, fiber crosslinking
and electrospinning. Mechanical enhacement is achieved by crosslinking and photografting
techniques. Sterilization can be performed by remote argon plasma, ethylene oxide, gamma
radiation or 70% ethanol. Scaffolds are made of polymers. In the beggining non-biodegradable
polymers were proposed. Currently, biodegradable polymers that will be replaced by
autologous tissue are prefered. These can be natural polymers, such as collagen, chitosan or
collagen-elastin copolymers, or synthetic, such as polylactic acid, polyglycolic acid and their
copolymers, polycaprolactone and polyhydroxyalkanoates.
Heart valves are composed of valvular endothelial cells (VECs), valvular interstitial cells (VICs)
and extracellular matrix (VECM). VECs are in contact with the bloodstream and avoid
thrombogenesis. VICs synthesize VECM and are fundamental for heart valve maintenance.
Heart valves are developed by differentiation of endothelial into mesenchymal cells due to
growth factors. Valvular cells comes from endothelium, endocardium and blood circulating
cells. TE heart valve cells can be obtained from stem cells or blood vessel endothelial cells
cultures. They are seeded into scaffolds by in vitro techniques or by in vivo recellularization.
Growth factors are used to accelerate the development of TE heart valves. The most important
are fibroblastic growth factor (FGF), transforming growth factor (TGF) and vascular endothelial
growth factor (VEGF). Signalling molecules allow cellular proliferation and celular attachment
control. They promote signalling mechanisms which consist of cytoplasmic chain reactions that
affect gene expression and cytoskeleton structure. Signalling substrates are the substances
upon which enzymes and membrane receptors act. They can be GAGs, VECM proteins,
antibodies, cytokines, aptamers and biologically active pollymers. Mechanical properties are
enhaced up to 50% through the application of cyclic stimuli (such as strains, flexure, flow and
stresses) and the control of chemical variables (such as O2 and ozone).
Manufacturing of decellularized scaffolds from porcine valves implies 3 steps: selection and
extraction of the valve, decellularization and optimization of the valve’s properties. Modern
synthetic scaffolds are made of attached polymeric layers which mimic the 3 layer structure of
natural valves. Scaffoldless valves use biopapers which give biological properties, but bad
mechanical properties. In situ manufacturing takes advantage of early inflammatory responses
after implantation and allows on demand scaffolds. Growth factors and implant optimization
techniques can be applied in bioreactors. TE heart valves are far from clinical use, but in situ
manufacturing, one-step interventions, feedback controled bioreactors and modern computer
simulations promise good results.
There are not TE heart valves clinically available yet, but great advances have been achieved.
To understand them, a bibliographical research is needed. Knowing the history behind heart
valves and the main current research lines is quintessential to focus our efforts on the most
promising alternatives.
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E. INTRODUCCIÓN
Las patologías valvulares son una de las causas más frecuentes de disfunción cardíaca. Las
válvulas dañadas pueden mantener su funcionalidad durante un tiempo gracias a diversos
tratamientos pero a pesar de la tendencia actual de repararlas, en la mayoría de los pacientes
es necesario sustituirlas. Esto puede realizarse usando válvulas mecánicas o biológicas.
Las prótesis valvulares mecánicas tienen una gran durabilidad debido al uso de aleaciones
metálicas biocompatibles. Sin embargo, pacientes con estas prótesis pueden presentar
problemas de trombosis, embolias, endocarditis, disfunción protésica y a menudo
complicaciones por la anticoagulación a la que deben someterse. Esto justifica las
investigaciones que se desarrollan en busca de prótesis conformadas con tejido vivo.
La ingeniería de tejidos (TE – Tissue engineering) ofrece una alternativa novedosa al producir
tejido vivo compatible con el receptor. Estudios sobre tejidos musculares ingenierados
muestran que se pueden lograr propiedades biológicas y mecánicas adecuadas mediante
tratamientos pre-implantación. Estos resultados han incentivado el desarrollo de la ingeniería
de tejidos en diversos campos, como la ingeniería de válvulas cardíacas.
Sin embargo, la implantación de válvulas cardíacas fabricadas mediante descelularización de
válvulas de cerdo y posterior siembra de células autólogas puede desencadenar reacciones
inmunológicas, seguidas en la mayoría de los casos de muerte o necesidad del reemplazo de
la válvula. Las válvulas ingenieradas fabricadas sin scaffold son totalmente compatibles con el
tejido vivo, pero aún no logran las propiedades mecánicas necesarias. Los estudios actuales
se enfocan en los métodos de optimización mecánicos y químicos mediante biorreactores, el
uso de factores de crecimiento adecuados y la creación de válvulas in situ.
En esta investigación bibliográfica nos proponemos revisar la evolución de esta aplicación
tecnológica, sus posibles alcances y perspectivas a futuro.
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F. CAPÍTULOS
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Ante estenosis aórtica se prescribe reemplazo valvular con las siguientes condiciones:
Pacientes clase I: pacientes con estenosis aórtica sintomática severa, pacientes con estenosis
aórtica que serán sometidos a revascularización miocárdica y pacientes con estenosis aórtica
severa por someterse a cirugía de otras válvulas cardíacas o de aorta;
Pacientes clase IIa: pacientes con estenosis aórtica moderada que se someterá a
revascularización miocárdica o cirugía cardíaca, pacientes asintomáticos con estenosis aórtica
severa y disfunción sistólica ventricular izquierda y pacientes con respuesta anormal
(hipotensión) al ejercicio;
Pacientes clase IIb: taquicardia ventricular marcada y excesiva hipertrofia ventricular izquierda
(>= 15 mm) y área valvular <0,6 cm2
Pacientes clase III: reemplazo valvular no recomendado. (Hernández-Carrillo et al., 2006)
(SAC, Estenósis aórtica, 2007)
Ante insuficiencia aórtica se indica reemplazo valvular cuando:
Pacientes clase I: pacientes sintomáticos con insuficiencia crónica aórtica severa, pacientes
con insuficiencia aórtica crónica severa asintomáticos con disfunción del ventrículo izquierdo y
pacientes con insuficiencia aórtica crónica severa que serán sometidos a cirugía cardíaca.
Pacientes clase IIa y b: pacientes asintomáticos con regurgitación auricular severa y severa
dilatación del ventrículo izquierdo.
No se recomienda reemplazo para pacientes de clase III. (SAC, Insuficiencia aórtica, 2007)
La selección de la prótesis para reemplazo valvular indicado difiere según la edad: uso de
prótesis mecánica para menores de 70 años sin contraindicación para anticoagulantes; uso de
prótesis biológica para pacientes mayores de 70 años o menores con contraindicación para
anticoagulantes; uso de autoinjerto de válvula pulmonar en pacientes menores de 40 años;
uso de homoinjerto de aorta superior y válvula aórtica de un donante de tejido cuando haya
endocarditis activa o no haya posibilidad de alguno de los procedimientos anteriores (Bonow
et al., 2006)
Carrera: Bioingeniería - U.N.E.R - Facultad de Ingeniería - Oro Verde - Paraná - Entre Ríos - Argentina - Feb. 2014
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obsoletas, desde su creación hasta las años noventa fueron usadas largamente y se
sucedieron una serie de modificaciones. La primera prótesis Starr-Edwards, implantada en un
humano en 1960, comprendía una jaula de fibras de Lucite (PMMA) cerradas en cono, a la
que se le insertaba una bola de goma de silicona (polimetilsiloxano vulcanizado) moldeada por
compresión, para luego cerrarla por soldadura por solvente de un anillo de Lucite, con acetona
como solvente (Matthews, 1998)
Uno de los cambios fundamentales sobre esta primera prótesis surgió con el objetivo de
mejorar la resistencia a la corrosión, que delimitaba enormemente la durabilidad. Para esto, se
reemplazó el PMMA por acero inoxidable de bajo carbono. Posteriormente se usaron también
diferentes tipos de estelita (CoCrMo), entre los cuales podemos nombrar la estelita 21. Se
mejoró la forma del anillo para aumentar la fijación al flanco, y para preservar el tejido lindante
se agregó una esponja de goma de silicona porosa al cuerpo del anillo de costura
(proveyendo una mayor flexibilidad) y se reemplazó la forma cónica de la caja por una de
ángulos más suaves, semiesférica. La reducción del sonido de golpeteo se logró al cambiar la
cobertura siliconada de una goma de nylon por un cuerpo completamente de silicona. Sin
embargo, al día de hoy no ha podido evitarse el golpeteo completamente. La evolución de las
válvulas Starr-Edwards puede apreciarse en la figura 1. Otros cambios en base al mismo
principio han sido sugeridos por diferentes fabricantes, con resultados muy similares
(Matthews, 1998) (Lund et al., 1999)
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Figura 2: Perfiles de velocidades de las prótesis mecánicas. Puede verse como la prótesis de
disco supera a la de bola enjaulada en velocidad de flujo y en distribución de esa velocidad,
así como también en ausencia de reflujo central. Entre las 2 prótesis de disco, la de doble
disco (C) tiene un perfil más parejo, con mejor hemodinámica (modificado de: Yoganathan,
op. Cit.)
Sin embargo, también los materiales usados cambiaron. En un principio el disco fue
construido con Derlin (polioximetileno) estabilizado para evitar degradación. Este presentaba
características deseables como un bajo coeficiente de fricción, alta dureza y estabilidad
dimensional. Actualmente se prefiere el uso de anillos de grafito y tungsteno cubiertos por una
capa de carbono pirolítico, la cual evita la formación de coágulos en su superficie reduciendo
el peligro de trombosis. El anillo y los ejes están fabricados con aleaciones de titanio
reforzado, que les provee una gran durabilidad. El anillo de costura está compuesto de un
tejido de Teflon (PTFE) (Yoganathan, 2000) (Gosálbez Jordá et al., 2003)
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capacidad de crecimiento y desarrollo tisular, lo que los convierte en los candidatos principales
para transplante infantil y una buena alternativa en otros casos (Anastasiadis, 2004)
Entre los autoinjertos llama la atención un procedimiento de reemplazo aórtico por una válvula
pulmonar sana. Al mismo tiempo debe reemplazarse también la válvula pulmonar extraída. Se
reducen convenientemente los problemas si como reemplazo se utiliza otra válvula pulmonar,
en este caso un aloinjerto (de un donante de la misma especie, genotípicamente diferente).
De este modo se suple adecuadamente la necesidad de una válvula cardíaca, que si bien no
trabaja con la eficiencia de la válvula original asegura la mínima tasa de re-reemplazo valvular
a largo plazo y la mínima tasa de tromboembolismo asociado, respecto al resto de las prótesis
biológicas. Por otro lado, además del autoinjerto pulmonar, sólo los aloinjertos aórticos poseen
la cualidad de no presentar gradiente hemodinámico en el cierre, evitando el reflujo y el
trabajo forzado. Como contracara, la técnica es difícil, lo que lleva a una tasa relativamente
mayor de fallas quirúrgicas y un elevado riesgo. Este tipo de cirugías es conocido como el
procedimiento de Ross (Hopkins, 2005) (Westaby, 1995)
Ante la poca diversidad de procedimientos posibles con autoinjertos, una variante son los
homoinjertos. Estos son transplantes de válvulas cadavéricas de un donante de la misma
especie, las cuales mantienen sus propiedades mediante criopreservación. El problema
principal de estas válvulas es su baja disponibilidad. Por otro lado, existen algunos problemas
de rechazo de tejido, si este no es previamente tratado (Téllez de Peralta, 2008) (Hopkins,
2005)
Los xenoinjertos presentan una mayor disponibilidad. Estos son prótesis obtenidas de tejido
animal de otra especie. Son montados en soportes con cubierta de tela, en general hechos de
estelita, titanio o algún biopolímero, con cobertura superficial de teflón o polipropileno. Es
deseable una cierta flexibilidad, de manera de absorber parte de la tensión dinámica
circulatoria y evitar el desgaste de las válvulas. En general se usan válvulas de aorta porcina o
de pericardio bovino, aunque también se están probando valvas y miocardio ovino. Para evitar
su deterioro prematuro y corta longevidad pueden realizarse pretratamientos de detoxificación
como los anticalcificantes, antimineralizantes o antidegenerativos. Además, se las
descelulariza para evitar reacciones inmunogénicas. Esto produce ciertos problemas, como
son la dificultad del tejido para recolonizar una matriz con detergentes u otros productos
químicos (como el glutaraldehído, que además es tóxico), lo que limita la durabilidad de estos
injertos (Lichtenberg et al., 2007) (Zhao et al., 2003)
En cuanto a los injertos sin soporte, no sólo no poseen una estructura de base sino que
tampoco usan anillos de costura. Son prótesis de tamaño mayor que las con soporte de su
mismo estilo, y presentan a su vez mejores características hemodinámicas a corto plazo
debido a que no obstruyen el conducto aórtico. Sin embargo, a largo plazo presentan efectos
similares a las que poseen soporte, y están siendo superadas por las prótesis con soporte
implantadas supraanularmente (que con dicha disposición evitan la disminución del canal
aórtico) (Dominik et al., 2010) (Bloomfield, 2002)
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grandes ventajas que presentan estos injertos: morfología funcionalmente adecuada por su
similitud con la válvula reemplazada, hemodinamia mecánica y fisiológica igual a la requerida
(lo que reduce el pre acondicionamiento del scaffold, acortando el tiempo de espera para la
implantación), y la disponibilidad de moléculas señalizadoras naturales para la adhesión y
proliferación del tejido valvular autólogo (Mol, 2009).
Varios estudios han logrado una adecuada repoblación de homoinjertos y xenoinjertos en
animales. Tal es el caso de la repoblación de válvulas alogénicas ovinas y xenogénicas
porcinas en ovejas. Si bien las válvulas alogénicas se calcificaron luego de 12 semanas, las
válvulas xenogénicas sobrevivieron las 24 semanas desde la implantación sin calcificación
aparente (al microscopio óptico), pero con pequeñas microcalcificaciones halladas por
microscopía electrónica en las zonas de baja repoblación celular. Un análisis cuantitativo
celular determinó una repoblación valvular de cúmulos de células endoteliales luego de 12
semanas en las válvulas alogénicas, con intersticios vagamente poblados con algunos
fibroblastos y miocitos. En cambio, las válvulas xenogénicas mostraron una cubierta endotelial
uniforme a las 24 semanas, con intersticios poblados de fibroblastos y miocitos similar a la
población ovina nativa, con síntesis activa de ECM (indicada por cantidades de colágeno,
GAGs y elastina similares a los naturales) (Takagi et al., 2006)
La elección de injertos xenogénicos u homogénicos depende de una serie de ventajas y
desventajas. En general se usan xenoinjertos debido a que los donantes de válvulas
homogénicas son pocos, ya que se requieren válvulas funcionales. Existen problemas éticos
en la obtención de estas válvulas, lo que reduce la oferta, y no se ha probado aún repoblar
válvulas humanas y realizar post-tratamientos a válvulas explantadas, los cuales son
actualmente imprescindibles. En cuanto a los xenoinjertos, una desventaja menor es la
posibilidad de zoonosis por transmisión de virus (Walles et al, 2003).
Los homoinjertos, por otro lado, poseen mejores propiedades que los xenoinjertos: menor
trombogenicidad, riesgo de infección e inmunogenicidad. Sin embargo, los homoinjertos
criopreservados aumentan el riesgo de rechazo inmunológico crónico y deterioración
estructural (Domenech, 2008).
Nuevas técnicas de descelularización, como SynerGraft, proveen la perspectiva de
recelularización autóloga con mejora de la durabilidad y reducida inmunogenicidad. Estudios
de homoinjertos de válvula pulmonar descelularizada por el método SynerGraft mostraron
infiltración de la capa neoíntima sólo con granulocitos neutrófilos y macrófagos CD68-
positivos, pero sin células valvulares específicas a 5 semanas de la implantación. En ese
tiempo, la válvula implantada falló sin revelar signos de deterioro ni enfermedad, pero si
inflamación (Sayk et al., 2005). Incluso en un homoinjerto de válvula aórtica SynerGraft
explantada a 2 años de la implantación se encontró proliferación superficial de células
endoteliales y miofibroblastos, aunque no una colonización valvular completa. Actualmente no
existen homoinjertos viables a largo plazo, con excepción de injertos autólogos de válvula
pulmonar, pero se espera que se logren avances (Miller et al., 2006).
En el proceso de descelularización es muy importante remover todo el componente celular sin
dañar la válvula ni alterar las propiedades de la matriz. Las características intrínsecas del
scaffold son decisivas para su mayor durabilidad, y estas dependen del método de
descelularización empleado (Tudorache et al., 2007).
Una opción poco estudiada de xenoinjerto para válvulas cardíacas es el uso de pericardio
bovino descelularizado (APB) como scaffold con buenas propiedades mecánicas y posibilidad
de colonización autóloga. Su ECM nativa incluye colágeno insoluble, elastina y GAGs. Estos
últimos sirven de reservorio de factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) y promueven la
angiogénesis y regeneración tisular (Lai et al., 2006). En el proceso de descelularización,
estos injertos pierden ECM restringiendo la adhesión celular y complicando la siembra celular
y la proliferación de matriz neogenerada. Esto se debe a que al usarse métodos agresivos de
descelularización se pierden GAGs, colágeno y fibronectina. La adhesión celular al colágeno y
la fibronectina de la ECM es mediada por las integrinas, proteínas de la membrana celular.
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Éstas tienen como ligando a las secuencias aminoacídicas RGD (arginina – lisina –
asparagina), presentes en el colágeno y la fibrina. Para mejorar la adhesión celular se
propuso conjugar covalentemente los APB con péptidos RGD, con resultados óptimos (Dong
et al., 2009). Finalmente, es conveniente mencionar que, a menos que los xenoantígenos
sean enmascarados por fijación química o removidos completamente por solubilización y
difusión, los xenoinjertos conllevan una reacción inmunológica (Iwai 2007).
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De este modo se obtuvieron hidrogeles tan estables como los scaffolds no porosos (Autissier
et al., 2010).
En cualquiera de los procedimientos anteriores se puede controlar la morfología y tamaño de
los poros modificando la composición (ver figura), la solución, la temperatura y el vacío al que
se someten. Mayor cantidad de solvente logrará estructuras más débiles pero más porosas.
Temperaturas inmediatamente inferiores que la de fusión del solvente lograrán una separación
por nucleación y crecimiento, formando poros esféricos y poco conectados, mientras que
temperaturas más bajas lograrán poros filamentosos o cilíndricos muy bien interconectados.
Vacíos más bajos (0,1 mbar) lograrán más rápida sublimación, obteniendo poros más
pequeños e interconectados. Cualquiera de los métodos puede ser sometido a templado para
lograr ampliación de los dominios porosos. Pueden lograrse porosidades mayores al 90%, con
tamaño de poros pequeños (de hasta 1-10 um de diámetro) o grandes (de 100 um, poco
homogéneos y difíciles de obtener) (Patel, Bonde y Srinivasan, 2010)
Figura 5: Modificación del tamaño de poro con la composición del material (por separación de
fases). Medio: colágeno (100%) con poros de 100 um de diámetro. Izquierda:
colágeno/elastina con poros de 140-180 um (volúmen de colágeno-elastina: arriba 50%-
%50%; abajo 20%-80%). Derecha: colágeno/C4S con poros de 80-50 um (volúmen de
colágeno-C4S: arriba 90%-%10%; abajo 50%-50%) (modificado de: Chen et al., 2012)
Espumado gaseoso: técnica de porificación que evade completamente el uso de solventes
orgánicos citotóxicos. Utiliza la nucleación y crecimiento de burbujas de gas dispersadas en
una solución polimérica viscosa, las cuales pueden ser creadas por agentes químicos
espumantes. Fluidos supercríticos (por ejemplo, CO2 a presión, poco inflamable, no tóxico y
punto crítico bajo) pueden ser eficientes en la formación de polímeros saturados de gas por su
buena transferencia de masa, tensión superficial nula y densidad ajustable por presión y
temperatura. La porificación se da en 2 etapas: 1. Creación de una fase polimérica saturada
de gas, y 2. Nucleación, crecimiento de poros y coalescencia (despresurización). El CO2 a
alta presión aumenta su solubilidad en el material, que al despresurizarse disminuye
(supersaturación de CO2) formándose núcleos de moléculas del gas. Estos crecen hasta que
el polímero vitrifica (Ji et al., 2012)
Se pueden modificar los parámetros de fabricación para lograr los scaffolds más adecuados
en cuanto a propiedades mecánicas y tamaño de poros para una correcta nucleación celular y
proliferación, pero los controles no son precisos y los poros tienen una gran dispersión de
tamaños. Entre los parámetros modificables están la temperatura del proceso, grado de
saturación, presión hidrostática, energía interfacial y propiedades viscoelástica de la mezcla
gas/polímero. Las desventajas de este método son la mala interconexión de los poros y la
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imposibilidad de usar materiales termolábiles, que son afectados por el calentamiento durante
el moldeado a compresión (Stella et al., 2010).
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calentado para producir soldadura dura o sinterización. Al sacar del horno, se comprimen y se
enfrían las fibras y se esterilizan (Rodrigues et al., 2012).
Con esta técnica se logran tejidos con propiedades de adhesión y crecimiento celular
mejoradas respecto de otros scaffolds porosos, además de mejorar las propiedades
mecánicas por la unión entre las fibras y la matriz (ver figura). Una desventaja mayor es el uso
de solventes orgánicos, los cuales dificultan o impiden el crecimiento celular si no son
completamente removidos, para lo cual se requieren largos tiempos de lavado y secado al
vacío. Además existe calentamiento a altas temperaturas, lo cual es perjudicial para los
polímeros y biomoléculas (factores de crecimiento, etc) intervinientes, y es difícil controlar las
propiedades de los poros (Ku et al., 2011).
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provee propiedades mecánicas anisotrópicas similares a las que se ven en las válvulas
humanas naturales (Masoumi et al., 2013)
Por otro lado, la microfabricación láser permite lograr resultados similares con ayuda
del CAD, máscaras resistentes al láser (en general hechas de alúmina) y un láser que
maquina directamente el scaffold polimérico (Masoumi et al., 2012). Puede usarse
para lograr estructuras 3D si se combina con procesos de sinterización. Para eso se
requieren polvos de polímeros que serán sometidos a lásers (de CO2, en general) con
movimientos micrométricos controlados por computadora según un proyecto de trabajo
diseñado con software de CAD. Estos se encargarán de derretir los polvos poliméricos
(sinterización) y formar geometrías complejas capa por capa, sin usar sustancias
tóxicas ni estructuras de soporte (Lohfeld et al., 2010)
- Estereolitografía (Fotolitografía): proceso aditivo de fabricación de scaffolds capa
por capa que se guía por diseños CAD (que pueden incluso ser tomados de scans de
resonancia magnética o tomografía computada). Se basa en la solidificación de una
resina líquida por fotopolimerización usando un láser controlado por computadora. Una
vez solidificada la primera capa, se baja una plataforma permitiendo llenar una
segunda capa con resina líquida, y se vuelve a someter al tratamiento láser a una
nueva capa. Este proceso se repite hasta lograr el sólido 3D deseado. En general se
requieren procesos de post-curado para completar la conversión de grupos reactivos
(en general por luz UV estroboscópica) (Melchels, Feijen y Grijpma, 2010).
Electrospinning: el electrospinning es una técnica muy rápida de producción electrostática de
largas fibras tridimensionales con diámetros desde algunos nanómetros hasta micrómetros y
longitudes de hasta 1 km. Una de las propiedades principales del uso de estas fibras en
estructuras es la gran relación de área de contacto por unidad de masa, además de la alta
porosidad, bajo peso específico y bajo costo de material (Chronakis, 2010).
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Figura 8: Ilustración esquemática del proceso de formación del chorro (jet). A) El campo
eléctrico induce cargas de superficie en la solución polimérica. B) Se elonga la gota
suspendida. C) Se deforma la gota hasta formar un cono de Taylor debido a la repulsión de
cargas del mismos signo en superficies aledañas. Se crea un chorro fino (Baji et al., 2010)
Puede usarse una gran diversidad de polímeros con esta técnica. Proteínas frecuentemente
utilizadas son el colágeno, la gelatina, caseína, acetato de celulosa, proteína de seda, quitina
y fibrinógeno. Sin embargo, se ha demostrado en los últimos años desnaturalización de estos
polímeros naturales, en especial de colágeno en gelatina, lo cual es un gran problema a
considerar (Zeugolis et al., 2008). Polímeros sintéticos usados son los poliésteres hidrofóbicos
biodegradables como PGA, PLA y PCL. También se usa en poliuretano (PU) y copolímeros
PLGA y PLLA-PCL para scaffolds en ingeniería de tejidos. Otros biopolímeros, como el
quitosano y el ácido hialurónico presentan también un gran uso por electrospinning (Bhardwaj
y Kundu, 2010).
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Figura 9: Análisis con microscopio electrónico (x3000) de láminas de PTFE luego de ser
sometidas a goteo de plasma sanguíneo de alta concentración plaquetaria: a) No esterilizado,
b) c) y d) Esterilizado con plasma de argón a 100 W (óptimo) durante 2 minutos a 20 cm 3/s de
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Es una práctica común el uso de polímeros naturales como el colágeno como proveedores de
soporte y propiedades mecánicas específicas, combinados con polímeros sintéticos para
control de las tasas de absorción y conformado de sitios de adhesión celular (a través de
poros o mallas tejidas). Por ejemplo, fueron desarrollados scaffolds de colágeno como soporte
con PGA, PCL y PLLA mallados, con buena formación de tejido gracias a la biodegradación
de los polímeros sintéticos, y buenas propiedades biomecánicas provistas por el colágeno
(Torikai et al., 2008). Los scaffolds de colágeno con elastina mejoran el tamaño de poros y
proveen mayor flexibilidad, pero con peores propiedades de adhesión y proliferación celular.
En cambio, el agregado de condroitin-4-sulfato (C4S) disminuye los poros pero aumenta la
invasión y proliferación celular (Chen et al., 2012).
Elastina y ELP: la elastina es una proteína de la ECM encontrada predominantemente en
tejido conectivo de arterias, piel, pulmones y ligamentos, tejidos a los cuales les provee una
gran elasticidad. La tropoelastina, el precursor soluble de la elastina, está compuesta de
dominios entrecruzados alternativos hidrofóbicos e hidrofílicos. Los residuos de lisina (Lys) en
toda la extensión de la cadena de tropoelastina permiten su entrecruzamiento a través de
enzimas, creando fibrillas de elastina insoluble. Los dominios hidrofóbicos de tropoelastina
son solubles en ciertas condiciones de temperatura, pH, luz y disparadores redox, por lo que
entran en la clasificación de polímeros inteligentes (que responden ante estímulos) (MacEwan
y Chilkoti, 2009).
La estabilidad de la elastina, su resistencia a la tracción, su resiliencia y su elasticidad están
relacionadas directamente con la densidad y características de sus entrecruzamientos, los
cuales proveen la funcionalidad y estructura de la ECM, en especial en arterias. El
entrecruzamiento se produce por desaminación oxidativa espontánea de los residuos de Lys
de la tropoelastina mediada por lisil-oxidasa. Esta enzima entrecruza residuos de alisina y de
lisina para formar desmosina (DES) e isodesmosina (IDE), enlaces que resisten la elastólisis,
solubilización y proveen las propiedades biomecánicas de la proteína. La degradación de la
elastina puede producir y complicar placas de ateroma y aneurismas, así como también
envejecer válvulas cardíacas (Umeda, Aikawa y Libby, 2011)
Se demostró que la elastina es un polímero importante en la ECM de las válvulas cardíacas.
Es parte fundamental de la lámina ventricular (LV) de la estructura trilaminar de las válvulas.
Por otro lado, la evidencia demuestra que la degradación de la red de elastina tiene un rol
fundamental en la estenosis aórtica por calcificación, una de las principales causas de falla
valvular en la vejez y en los injertos valvulares biológicos y sintéticos, y la principal causa de
reemplazo valvular en el mundo. Las válvulas patológicas explantadas mostraron una severa
desorganización y fragmentación de la red de elastina, con fibrosis intersticial, depósitos de
calcio y acumulación de lípidos en la ECM (Perrota et al., 2011). Además se demostró que la
elastina reduce la proliferación de células musculares lisas y que sirve como sitio de
nucleación de la calcificación. Para evitar esto pueden usarse GAGs y factor de crecimiento
fibroblástico básico (bFGF) (Filová et al., 2009).
Se desarrolló un injerto trilaminar de válvula aórtica, imitando a las válvulas naturales. Las
válvulas naturales tienen una composición proteica de 40 a 50% de elastina y 25 a 30% de
colágeno. Para la ECM no proteica se utilizó policaprolactona (PCL), con elastina y colágeno
tipo I. Se depositaron por electrospinning, secuencialmente para generar una capa interna
(íntima), una intermedia (media) y una externa (adventicia), cada una con una mezcla
polimérica específica. Los resultados demuestran que dicho injerto imita adecuadamente las
propiedades anisotrópicas de las válvulas cardíacas (McClure et al., 2010).
La elastina no se usa como único componente del scaffold, sino que se busca reforzarla con
fibras colagénicas o usarla como aditivo para scaffolds de otros polímeros. Tal es el caso del
scaffold bilaminar de colágeno-elastina propuesto por Qi Chen et al.. Se observó que este
modelo proporcionó un módulo elástico y un módulo de flexión anisotrópicos similares a los
naturales, cuyo comportamiento ante tensiones es similar al mostrado en las válvulas
humanas (Chen et al., 2013).
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La elastina se obtiene principalmente del ligamento nucal de bovinos y otros mamíferos, por lo
que es poco abundante y de difícil producción masiva.
Los ELP (elastin-like polipeptides) son polímeros cuyas secuencias aminoacídicas
(repeticiones de VPAVG) se encuentran naturalmente en la elastina, en sus dominios
hidrofóbicos. Los ELP responden a la temperatura alterando su funcionalidad y solubilidad, y
se caracterizan por su transición de fase inversa (varias moléculas se asocian
hidrofóbicamente al aumentar la temperatura). Los SELP (silk-elastin-like polipeptides) son
polímeros derivados de los ELP, con secuencias de AA de seda (GAGAGS). No sólo
responden a la temperatura, sino también al pH y la concentración iónica. Las características
biomecánicas de los ELP y los SELP y sus interacciones con los tejidos son similares a las de
la elastina, pero pueden ser mejoradas modificando las secuencias de AA y la longitud de la
cadena. La producción de ELP y SELP puede realizarse a medida por ingeniería genética de
bacterias o células eucariotas heterólogas, controlando con precisión sus AA y peso molecular
y permitiendo una producción masiva (la Escherichia coli es una gran candidata en ese
sentido) (Collins et al., 2013)
Los ELP son biocompatibles, biodegradables, no inmunogénicos y sus propiedades pueden
hacerse a medida, imitando o no a las de la elastina. Pueden ser procesadas como geles,
films, espumas y fibras. Pueden además contener secuencias RGD (arg-lys-asp), REDV (arg-
glu-asp-val) o EILDV (glu-ile-leu-asp-val), secuencias reconocidas por las integrinas celulares
como propias de su ECM y que promueven la adhesión celular (Danhier et al., 2012). Los ELP
ya han sido usados como materiales para scaffolds de injertos vasculares (Nettles et al., 2010)
Quitina y quitosano: la quitina (poli-β-1-4-N-acetil-D-glucosamina) (ver figura) es un
biopolímero natural (polisacárido lineal) encontrado en el exoesqueleto de moluscos y
crustáceos. Es el polímero más producido en el mundo después de la celulosa. Es
biocompatible, biodegradable y puede ligarse a superficies cargadas negativamente, como las
membranas mucosas, por lo que puede ser usado como transportador de principios activos a
través de las superficies epiteliales. El quitosano es el derivado desacetilado de la quitina, por
condiciones alcalinas (NaOH) o hidrólisis por la enzima quitina-desacetilasa (Jayakumar et al.,
2010).
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gelatina-poliuretano desarrolladas por Wong et al. (Wong et al., 2010). Sin embargo, se ha
intentado también reforzar el quitosano con fibras de quitosano, las cuales fueron exitosas en
proveer propiedades mecánicas mejoradas al scaffold valvular (Albanna et al., 2012).
Se usa también al quitosano como refuerzo de válvulas de colágeno (Li et al., 2006) y de
PLLA (Li et al., 2009), demostrando una gran mejoría de las propiedades mecánicas en
ambos casos. También se demostró una mejora adherencia, proliferación y diferenciación
celular, reduciendo la tendencia a la mineralización de los respectivos scaffolds. Los recientes
estudios de Wang et al. demostraron que una matriz de nanofibras de PLLA reforzada con
fibras de chitosano permite un mayor control y predicción de las propiedades mecánicas
finales del injerto (Wang et al., 2009).
Celulosa y celulosa bacteriana (BC): la celulosa es un biopolímero (homopolisacárido de β-
glucosa) producido por las plantas para sus paredes celulares. Es el polímero más abundante
en la tierra, y se forma por enlace β-1,4-O-glucosídico. Sus propiedades mecánicas la hacen
uno de los polímeros más resistentes, y si bien es biodegradable, su degradación se produce
por hidrólisis, la cual es muy poco probable por su estructura compacta. La celulosa
bacteriana es una nanofibra de celulosa producida por bacterias (gluconacetobacter,
acanthamoeba, achromobacter, zoogloea), que sólo se diferencia de la celulosa vegetal en la
longitud de sus fibras. La red de nanofibras es muy similar a las redes poliméricas que
conforman la ECM, por lo que es potencialmente muy útil en el campo de la ingeniería de
tejidos. La BC es más fácil de sintetizar y separar para uso médico, ya que no posee lignina,
hemicelulosa ni otras moléculas que deben ser separadas para uso médico del material.
Ambos tienen gran resistencia y son fácilmente conformables (Petersen y Gatenholm, 2011)
Varios materiales compuestos (composites) de celulosa se desarrollaron como posibles
scaffolds para válvulas cardíacas. Un ejemplo de esto es el hidrogel de PVA-BC (alcohol
polivinilico y celulosa bacteriana) que imita el comportamiento mecánico no lineal y
anisotrópico de las válvulas porcinas. Para esto se usaron nanofibras de celulosa como
refuerzo fibroso, para evitar el problema de la falla por ruptura y calcificación valvular debida a
los esfuerzos dinámicos del torrente sanguíneo (Mohammadi, 2010).
Una alternativa a la celulosa es la carboximetil celulosa (CMC), polímero aniónico muy usado
en la industria del papel como refuerzo mecánico. Esta puede agregarse a matrices de
diversos materiales para formar composites más resistentes (Fatehi et al., 2010).
b) Polímeros sintéticos:
Los polímeros sintéticos son muy útiles en el campo biomédico debido a que sus propiedades
(porosidad, tasa de reabsorción, propiedades biomecánicas, módulo elástico) pueden ser
controladas y diseñadas para aplicaciones específicas. En general son más baratos de
obtener que los polímeros biológicos, ya que pueden ser producidos en grandes cantidades y
pueden almacenarse por largo tiempo sin degradarse. Muchos de estos polímeros disponibles
comercialmente tienen propiedades mecánicas y fisicoquímicas similares a las de los tejidos
biológicos. Los más usados en TE son los copolímeros de PLA (ya sea PLLA y PDLLA), PGA
y PLGA. El PHA pertenece a la clase de poliésteres microbianos, y se ha comenzado a usar
extensamente (Dhandayuthapani et al., 2011)
PLA: el ácido poliláctico es un biopolímero termoplástico, amorfo o semicristalino, producido
por polimerización estérica de monómeros de ácido láctico. El ácido láctico es un producto
final del metabolismo de la glucosa. El PLA es biodegradable y su tasa de degradación (más
lenta que la del PGA por ser una versión metilada del PGA, y por lo tanto menos hidrofílica) y
propiedades mecánicas pueden variarse controlando su peso molecular. La producción de
ácido láctico requiere de uno de 2 procesos: 1. La apertura del anillo de lactida (dímero cíclico
de ácido láctico deshidratado), o 2. Condensación deshidratante azeotrópica del ácido láctico
por solventes. Nuevos procesos productivos de PLA incluyen la ingeniería genética bacteriana
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(por ejemplo, en Escherichia Coli) para la producción masiva y de bajo costo de PLA (Jung et
al., 2010)
Figura 12: Síntesis de PLA: 1) Síntesis de ácido láctico como derivado de la hidrólisis de la
glucosa (ciclo de Krebs) y posterior fermentación anaeróbica. 2) Polimerización del ácido
láctico por esterificación en PLA.
Entre las ventajas del PLA se encuentra su fácil diseño y fabricación. Existen diversas
técnicas de manufacturas que pueden utilizarse para conformar PLA, como el tejido, colado
por solvente y leaching salino, espumado gaseoso, método de secado por congelación,
separación de fases, electrospinning, estereolitografía y el spinning húmedo de microfibras.
Además el PLA permite la liberación escalonada y continua de factores de crecimiento para
diseñar estrategias de fabricación de scaffolds funcionales. El PLLA (ácido poli-L-láctico,
conocido como Dacron) tiene buena fuerza tensil, y puede encontrarse como fibras no
degradables, polímero amorfo inyectable o estructuras biodegradables. El PLDLA tiene mayor
facilidad para modular las propiedades, pero sólo se usa como implante bioabsorbible
(Dhandayuthapani et al., 2011)
Se implantó en humanos con corazón monoventricular un scaffold de vena cavopulmonar de
una esponja biodegradable de copolímero de PLLA con poli-epsilon-caprolactona (P(LA/CL))
esterilizado con óxido de etileno (ETO), previo sembrado con células autólogas
mononucleares de médula espinal (MN BMC) obtenidas de la cresta ilíaca y la cabeza del
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fémur heparinizados del paciente. No se notó aneurisma, dilatación o ruptura del implante
luego de un promedio de 6 años de implantado, pero sí un debilitamiento significativo. Se
logró endotelización más rápida que en los scaffolds sin siembra autóloga, y se demostró que
las células endoteliales pertenecían al grupo de MN BMC diferenciadas (Hibino et al., 2010)
PGA: Polímero biodegradable y termoplástico, formado por uniones poliéster. Puede ser
fabricado por reacción de condensación de ácido glicólico o por apertura de anillos. Posee
una alta tasa de degradación (puede ser totalmente reabsorbido en semanas), por lo que se
usa para regeneración de tejidos biológicos (suturas, parches, injertos vasculares), y sus
buenas propiedades mecánicas le permiten usarse en fijación de tejidos. Puede producirse
mediante electrospinning, y por derretimiento y soplado para la formación de cubiertas y
relleno de moldes. Es un polímero barato y comercialmente se encuentra una gran
disponibilidad, en especial en forma de hojas de fibras no-malladas, pero los procesos de
fabricación no permiten geometrías complicadas (Dhandayuthapani et al., 2011).
Se propuso la creación de scaffolds para válvulas tricúspides fabricados con PGA no mallado
cubierto con P4HB, incorporados a stents radialmente autoexpandibles de nitinol (aleación de
níquel-titanio con memoria de forma). Se los cultivó con células MN BMC (células
mononucleares derivadas de la médula ósea) de chimpancés, y se los implantó con
procedimientos mínimamente invasivos. Hasta 4 semanas post-implantación, la funcionalidad
valvular se mantuvo adecuada, con remodelación celular sustancial y crecimiento interno de
tejido, incluso con endotelización. De todos modos se detectaron cultivos de muchos tipos de
leucocitos (granulocitos, monocitos y principalmente linfocitos), demostrando cierta toxicidad e
inflamación (Weber et al., 2011). También se propuso un scaffold vascular elástico de PGA
mallado y células musculares lisas, con resultados óptimos (Wang et al., 2010)
PLGA: el ácido poli-L-láctico-co-glicólico (ver figura) es un biopolímero biocompatible y
biodegradable, de muy fácil procesado y maquinabilidad, con gran fuerza mecánica. Puede
ser utilizado en la liberación controlada de drogas, como material de suturas o como material
para scaffolds resistentes. Es hidrofílico, de estructura cristalina y con morfología controlable,
propiedades que pueden modificarse cambiando la relación de los monómeros en la
preparación del copolímero. Permite su conformado por colado y leaching salino, leaching de
partículas congeladas, espumado gaseoso, todos métodos que permiten un estricto control
del tamaño y proporción de poros. Además pueden fabricarse microesferas por evaporación
de solvente o secado por congelación. Permite la creación de scaffolds inyectables como
cerámicas, muy biomiméticos, además del electrospinning, spinning húmedo y procesos de
liberación progresiva de factores de crecimiento (Zhan et al., 2013).
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Figura 13: Polimerización de los monómeros de ácido láctico y ácido glicólico en PLA, PGA y
PLGA (Baldwin y Saltzman, 1998)
PHA (Polihidroxialcanoato): nuevo polímero (poliéster) almacenable, obtenido de cultivo
bacteriano. Es sintetizado naturalmente por varios tipos de bacteria, y es un polímero
renovable con potencialidad de reemplazar algunos plásticos derivados del petróleo. Tiene la
ventaja de ser completamente biodegradable, al igual que el PLA. Una fuente de producción
de este polímero son los aceites vegetales, los cuales permitirían fabricarlo a gran escala ya
que gracias a la compleja mezcla de triglicéridos obtienen una mayor cantidad de PHA que
otros substratos, como la glucosa. Para evitar el uso de aceites comestibles para la
generación de PHA, se propone el uso de productos intermedios de la producción de aceite
de palma, un aceite que es producido en grandes cantidades (Sudesh et al., 2010).
Sodian et al. Propusieron en 1999 un scaffold de válvula tricúspide de PGA no tejido y PHA, el
cual es encargado de proveerle al scaffold una flexibilidad que el PGA no podía darle. Ambos
son poliésteres biodegradables y flexibles, pero el PHA es un termoplástico de baja
temperatura de fusión y muy buena flexibilidad. El PHA puede ablandarse y el PGA
comprimirse para lograr una lámina como pared vascular con cierto grosor y dureza, dejando
internamente al PGA y en la pared externa al PHA, con una disposición simil sándwich para
las valvas (PGA-PHA-PGA). Se sembraron dichos scaffolds con células vasculares ovinas
adultas y se optimizaron sus propiedades en un biorreactor. Luego de realizarse diferentes
pruebas se demostró una buena adhesión celular, con propiedades elásticas muy superiores a
las anteriores, permitiendo a las valvas abrirse y cerrarse con facilidad (Sodian et al., 1999)
PCL: la policaprolactona es un polímero sintético cuya principal característica es su muy baja
tasa de degradación (con u período de semidegradación medido en años). Por esto debe
usarse en TE combinada con otros polímeros para regular su degradación. La PCL es en ese
sentido de mu fácil miscibilidad, además de poseer muy buenas propiedades mecánicas y de
soporte. Además, permite varias técnicas de conformado, entre ellas el electrospinning, el
tejido y la estereolitografía. El electrospinning permite la formación de tricapas características
de las válvulas cardíacas. Se demostró que scaffolds así fabricados de PCL permitieron la
proliferación de fibroblastos en 3 meses en pruebas subcutáneas (Talacua et al., 2012).
Es interesante su potencialidad para estrategias in situ por su excelente estabilidad in vivo al
combinarse con colágeno por electrospinning. Estudios demostraron que luego de 1 mes de
implantado, las propiedades mecánicas del injerto vascular permanecieron viables, muy
similares a las propiedades vasculares normales (Tillman et al., 2009). También posee una
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gran facilidad para conformar las propiedades mecánicas del PCL según la necesidad a través
del agregado de materiales supramoleculares de relleno (Wise et al., 2006).
Injertos vasculares tubulares de PCL fabricados por electrospinning demostraron incluso
mejores propiedades de curación en ratas respecto a injertos de PTFE, el polímero
actualmente de elección para injertos vasculares por la necesidad de una baja
trombogenicidad. Sin embargo, los injertos de PCL pueden producir metaplasia condroide,
con lo cual se remarca la necesidad de adecuadas moléculas señalizadoras para guiar la
diferenciación del tejido hacia variedades de tejido conjuntivo no condrales (Pektok et al.,
2008).
Como desventaja de este material, estudios mostraron que la PCL (al igual que el PLA) no
tiene la capacidad de imitar las propiedades mecánicas de las válvulas cardíacas (no
linealidad, anisotropía, flexibilidad) y su deformabilidad ante esfuerzos en la dirección radial, a
diferencia de polímeros como la gelatina (colágeno desnaturalizado) y el poliuretano (Stradins
et al., 2012).
PHA: los poli-β-hidroxialcanoatos son una serie de poliésteres sintetizados por algunos
géneros bacterianos como material de reserva de energía ante la carencia de ciertos
nutrientes en el medio (como O2, P, N2, S o Mg) o el exceso de carbono. Son los polímeros
con mayores perspectivas como reemplazantes de los plásticos de origen petroquímico ya
que son renovables (provienen de sustancias agrícolas) y degradables en CO2 y H2O en
condiciones aerobias o en metano en condiciones anaerobias. Las bacterias que generan
mayores concentraciones (aptas para escala industrial) son la ralstonia eutropha (ex
alcaligenes eutrophus), la alcaligenes latus, pseudomonas oleovorans y la escherichia coli
recombinante, entre otras (Barbosa et al., 2005)
Los PHA más utilizados son el P3HB y P4HB (poli-N-hidroxibutirato), producidos en grandes
cantidades por la bacteria ralstonia eutropha con insumos sencillos como glucosa, fructosa y
residuos de la industria oleica, o por la vía fermentativa del bacillus megaterium. Son
homopolímeros altamente cristalinos, lo que los hace frágiles a temperatura ambiente, pero
permite un muy fácil diseño y conformación con propiedades mecánicas comparables a la de
los plásticos derivados del petróleo. Pueden usarse técnicas de conformado como tejido,
electrospinning y estereolitografía (Bello et al., 2008).
Mallas no tejidas de PGA con cubierta de P4HB fueron usados extensamente en la creación
de scaffolds vasculares y de válvulas cardíacas, con resultados prometedores. Fueron los
primeros implantes de triple capa implantados exitosamente en ovejas, gracias a la flexibilidad
del P4HB que permite el plegamiento de las valvas y su resistencia al flujo por alargamiento
de las fibras. El PGA es completamente absorbido en 4 semanas in vivo mientras que el P4HB
en 8 semanas, constituyendo en conjunto un material de rápida reabsorción. Esto y la pérdida
de las propiedades mecánicas por deformaciones permanentes (causando regurgitación) los
hace aún no aptos para su uso (Klouda et al., 2008)
Estudios comparativos demostraron que es más plausible el uso de scaffolds de PCL que los
tradicionales de PGA/P4HB, ya que sus propiedades mecánicas son más estables con el
tiempo y no comprometen la composición del tejido (Brugmans, Driessen-Mol et al., 2012).
Por otro lado, válvulas de PGA/P4HB fueron sembradas con células madre derivadas de tejido
adiposos (ADSC), resultando en un scaffold más duradero con propiedades mecánicas
estables gracias a la población y diferenciación celular endotelial, con creación de ECG con
GAGs y colágeno (Frese et al., 2012).
PGS: el poliglicerol-sebacato es un biopolímero (poliéster) biodegradable sintetizado por
policondensación de una mezcla de glicerol y ácido sebácico en relación 1:1 a 120°C en
ambiente de nitrógeno. El proceso de síntesis permite su fabricación a escala industrial. Sus
propiedades mecánicas pueden ser modeladas controlando el tiempo y temperatura de
curado, los reactantes y la concentración de acrilatos. Su naturaleza flexible lo hace útil para
la síntesis de tejidos blandos, entre ellos la creación de scaffolds valvulares, en especial para
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Figura 14: Estructura trilaminar de válvulas cardíacas maduras. A) Válvula aórtica o pulmonar
(1 de sus 3 valvas), con sus capas fibrosa (F), esponjosa (S) y ventricular (V). B) Válvula
auriculoventricular (AV) con sus capas atrial (A), esponjosa (S) y fibrosa (F). En ambos casos,
las valvas están sostenidas por chordae tendineae (CT) a los músculos papilares. Las flechas
indican la dirección del flujo sanguíneo (Combs y Yutzey, 2009)
Como ejemplo, la válvula mitral normal presenta deformaciones heterogéneas y con gran
anisotropía: la región central muestra deformaciones homogéneas, mientras que en los
bordes se ven deformaciones poco consistentes. La superficie valvular se deforma de modo
heterogéneo por existir regiones con diversa composición de ECM, además de una gran
concentración de tensiones alrededor de las inserciones de las chordae tendineae
(Krishnamurthy et al., 2009).
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Figura 15: Redes de qVICs cultivadas in vitro. Puede verse cómo por diversos estímulos en la
obtención (mecánicos, químicos) y en el cultivo (biológicos) pierden su adecuada expresión de
células elongadas. En A forman redes interdigitadas, en B pierden su morfología por falta de
estímulos (contactos célula-célula, célula-matriz, etc) hasta llegar al estado C, en el que se
comportan como tejido altamente proliferativo, mayormente aVICs (Liu, Joag y Gotlieb, 2007)
Los miofibroblastos (o VICs activados) son las células encargadas de la producción de
ECM. Se originan de la mecanotransducción de qVICs ante fuerzas mecánicas alteradas en la
válvula adulta (a través de la red de filamentos de actina y miosina, conectado a las
integrinas) (ver figura), o de VECs durante la valvulogénesis (proceso denominado transición
endotelial-mesenquimal, EMT). Se distribuyen en toda la válvula, pero se encuentran
principalmente en la capa ventricular, junto con algunas células musculares lisas provenientes
del miotelio arterial (Iop et al., 2009).
Figura 16: Fibroblasto y sus marcadores de diferenciación celular. Diversas integrinas son
expresadas en las adhesiones gap supermaduras, conectadas a la red de filamentos de actina
(ASMA, alpha-smooth muscle actin) del citoesqueleto. Tensiones mecánicas de la red de
colágeno de la ECM son transducidas a través de las integrinas y promueven la
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Figura 17: Los 5 fenotipos de VICs existentes y sus funciones (Liu, Joang y Gotlieb, 2007)
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Figura 18: Sección longitudinal de una valva de válvula mitral por tinción Tricolor de Mason
(x100). Pueden verse las láminas ventricular (V), fibrosa (F) y atrial (A), y la flecha apuntando
a una delgada capa de miocardio, en general en válvulas masculinas. Esta técnica tiñe de
azul las fibras de colágeno, de rojo las fibras musculares y los núcleos celulares de violeta
(Gatonga et al., 2009).
Existen diferencias marcadas en la composición de la ECM de las distintas válvulas. La
válvula aórtica (AV), por ejemplo, soporta presiones diastólicas de aproximadamente 90
mmHg, mientras que la pulmonar (PV) sólo debe soportar presiones del orden de los 15
mmHg. Esto lleva a que la ECM secretada sea distinta, debido a que la secreción es regulada
por estímulos mecánicos y factores de crecimiento. Por otro lado, la disposición de la ECM por
adaptaciones estructurales será distinta para soportar las cargas distintas (Liu y Gotlieb,
2008).
Esto se ve en el hecho que hay un menor contenido de colágeno en la PV, responsable de
una mejor respuesta hemodinámica (menor rigidez) (Joyce et al., 2009). En reposo, las fibras
de colágeno I de la AV están desalineadas, mientras que en la PV son relativamente regulares
o alineadas. Esto permite a la AV soportar mayores tensiones, aumentando la deformación
posible por alineamiento de fibras (aún más marcado que las de la PV) (Carruthers et al.,
2011). Esto demuestra una mayor habilidad de respuesta ante tensiones de la AV. Además, a
la presión de pico respectiva de cada válvula se demostraron iguales deformaciones de la
fibrosa, indicando una adaptación óptima de cada válvula a su entorno (Carruthers et al.,
2012). Cabe destacar que se logró un mayor alineamiento total de la fibras de la PV a igual
presión (90mmHg) aplicada, pero proporcionalmente el alineamiento es mayor en la AV (Joyce
et al., 2009).
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Figura 19: Muestra histológica de válvulas aórtica (AV, o semilunar) y pulmonar (PV) por
tinción Pentacrómica de Movat. Este método tiñe las fibras de colágeno de amarillo,
proteoglicanos y GAGs de azul, fibras elásticas de negro. Pueden verse las fibras de colágeno
I no alineadas en la fibrosa de la AV (amarillo), así como la prevalencia de GAGs en la
spongiosa (azul) y las fibras de elastina (negro) alineadas en la ventricular (Carruthers et al.,
2011)
La elastina es una proteína de gran importancia en las válvulas cardíacas debido a que les
provee su flexibilidad (imprescindible para la constante apertura y cierre cíclicos de las valvas)
y su elasticidad para reducir las tensiones que soporta y evitar su endurecimiento. Es
sintetizada por células elastogénicas (como fibras musculares lisas y fibroblastos) en forma de
monómeros de tropoelastina soluble, no glicosilada y muy hidrofóbica, con alta repetición de
motivos VPGG, VPGVG, APGVG, etc, los cuales le permiten grandes deformaciones
(Fernandez-Colino et al., 2011). Después de modificaciones postraslacionales se produce el
crosslinking y la organización polimérica en redes de elastina (ver figura), encargadas de
soportar las tensiones a bajas deformaciones (a altas deformaciones, entra en juego el
colágeno) (Patel et al., 2006)
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Figura 21: Formación de las fibras elásticas. A la izquierda, (1) coacervación de tropoelastina
(hidrofóbica) al ser secretada a la ECM, y (2) ensamblaje de FBLN4 con proLOX. (3) Posterior
deposición de proLOX ensamblado en la proelastina, escisión del proLOX (LOX maduro) con
(4) crosslinking de tropoelastina por LOX maduro. A la derecha, ausencia de FBLN4 no
permite la adecuada deposición de FBLN4 en la proelastina. El LOX maduro une la
tropoelastina aleatoriamente y en menor proporción que la lograda con FBLN4, determinando
la formación de elastina desorganizada (modificado de: Horiguchi et al., 2009)
El 5to componente proteico es la MFAP4 (microfibrillar associated protein) o MAGP36
(microfibril-associated glycoprotein), proteínas que permiten un crosslinking ordenado del
tropocolágeno (ver figura). El ensamblaje a través de la MFAP4 de las microfibrillas de
fibrilina-1 permite la formación de largas fibras de elastina orientadas, evitando la formación
de pequeñas fibras esparcidas por toda la ECM sin orden aparente. Sin este paso
fundamental no podrían formarse fibras elásticas sino una matriz amorfa, con propiedades
elásticas pobres (Kasamatsu et al., 2011).
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Figura 22: Importancia de la MFAP4 en el desarrollo fibrilar de las fibras elásticas; a) síntesis
de fibras elásticas en presencia de MFAP4; b) crosslinking de tropoelastina en ausencia de
MFAP4 (nótese la desorganización producida por fibras no alineadas) (Kasamatsu et al.,
2011)
La interacción de las fibras con receptores celulares se produce a través del extremo C-
terminal de la tropoelastina. La elastina es un regulador autócrino de sus células secretoras,
evitando patologías fibrocelulares. Las señales de la elastina no son mediadas por integrina,
sino por proteínas de unión celulares con la elastonectina y el receptor de proteína G
(proteínas de unión a nucleótidos de guanosina, que hidrolizan GTP en GDP y fosforilan
sustratos), induciendo organización fibrosa de los filamentos de actina por tensión, inhibiendo
la proliferación de fibras musculares y regulando su migración, y favoreciendo la adhesión de
células endoteliales (Patel et al., 2006). Las enfermedades que afectan la elastina (genéticas,
injuria o vejez) puede derivar en estenosis, hiperproliferación de células musculares lisas,
incremento del grosor valvular o vascular y fibrosis (Urban et al., 2001). La desorganización de
las fibras de elastina puede incluso producir aneurismas (Horiguchi et al., 2009).
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Figura 23: Diferentes niveles del control de EMT por el factor VEGF (valvular endotelial GF)
en los cojines endoteliales. I. Una baja expresión de VEGF permite la EMT endocardial. II.
Altos niveles de VEGF suprimen la formación de cojines fuera de la zona de formación. III. Los
niveles de VEGF inducen la expresión de señales que inician la formación septal valvular
(modificado de Wagner y Siddiqui, 2007)
Las células mesenquimales son altamente proliferativas, y están embebidas en una ECM
pobremente organizada. Esto no impide que los cojines funcionen bien como válvulas
unidireccionales para el flujo sanguíneo. Se crea además una capa superficial valvular, la
primordia, que dará lugar a las valvas por afinamiento y elongación seguida de una
separación (para las válvulas tricúspides) o una fusión (para las bicúspides). Además, se
produce una remodelación de la ECM, que se separa en 3 capas: la atrial (para la válvula AV)
o ventricular (para la aórtica), rica en elastina; la fibrosa, rica en colágeno fibrilar; la esponjosa,
rica en proteoglicanos. La proliferación celular se detiene al conformarse la estructura
trilaminar, y casi no hay futura proliferación de VICs en las válvulas adultas. Esto sugiere que
los factores de crecimiento son imprescindibles en TE (Gittenberger-de Groot et al., 2013).
Las células valvulares provienen de diversas fuentes. Las células endoteliales que rodean las
valvas forman una capa continua con el endocardio. En el tracto de salida, las células
precursoras del endocardio y el miocardio provienen del campo cardíaco secundario. Las
células mesenquimales de las válvulas son derivadas de células endoteliales (como fue
demostrado por los ratones transgénicos del linaje Tie2-Cre y Rosa26R) por EMT. Las VIC
adultas provienen en su mayoría o incluso completamente de estas mismas células
endoteliales, aunque hay evidencia de que algunas podrían provenir de células derivadas del
epicardio en etapas embrionarias (Combs y Yutzey, 2009).
El desencadenamiento del desarrollo valvular está regulado por moléculas seañalizadoras y
factores de crecimiento. La proteína morfogénica del hueso 2 (BMP2) enviada desde el
miocardio al endocardio es requerida para la inducción inicial de la EMT. La señalización Wnt
(promotor de la capa fibrosa rica en colágeno) y el TGF-β también son importantes durante la
EMT y la proliferación de células mesenquimales en los cojines endocardiales. La
señalización notch (que puede promover el crecimiento, muerte, activación o diferenciación de
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células en contacto con la célula productora) regula la represión del gen endotelial, lo cual la
hace necesaria también para la EMT (ver figura). Las células mesenquimales de los cojines
endocardiales expresan los factores de transcripción Twist1 y Msx, características de las
células mesenquimales, que promueven la expresión de genes de producción de ECM
primitiva. El FGF4 activa la proteína escleraxis y los tenocitos, células que mejoran las
propiedades mecánicas. La estratificación trilaminar es probablemente regulada por los
esfuerzo cíclicos del flujo sanguíneo (Hinton y Yutzey, 2010).
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mientras que la capa de PLLA mantiene su resistencia pasados 6 meses, por degradarse más
lentamente. (Torikai, 2008)
Este tejido trilaminar mostró una alta durabilidad in vivo en injertos vasculares de hasta 12
meses en animales. Las pruebas se llevaron a cabo en cerdos de Crown (animales de 12 a 20
Kg). Los animales se separaron en 5 grupos al azar, que se sacrificaron pasados distintos
períodos desde la implantación. Se comprobó que el grosor de las paredes de tejido
neoformado no aumenta de una manera directamente proporcional al tiempo de implantación
(Torikai, 2008).
Se comprobó también que para el caso de creación de válvulas in situ la combinación
PGA/PLLA posee mayor afinidad con las células que el ePTFE usado también en este tipo de
técnicas. Todos los implantes desarrollaron endotelización completa, hecho nunca observado
en los implantes de ePTFE, más allá del tiempo de implantación. Los estudios mostraron la
integridad de la endotelización de la pared luminal de las válvulas, y que el endotelio
neoformado poseía membrana basal. Esto fundamenta la ausencia de trombos formados
sobre la superficie luminal del implante en el tiempo de implantación al que fueron sometidos.
Además, en las capas subendoteliales se observó una gran población de SMCs, gracias a las
cuales el tejido neogenerado demostraró una respuesta fisiológica normal (Reacción
vasomotora) a 2 meses de la implantación (Torikai, 2008).
En estudios sobre perros, la respuesta a este mismo tipo de implante también fue
satisfactoria, mostrando que luego de la completa regeneración del tejido neoformado, el
contenido de colágeno en la ECM era equivalente al presente en el tejido vascular nativo. Sin
embargo, las fibras elásticas fueron menos abundantes, y la capa elástica fue más angosta
que la de la aorta normal, pero con el paso del tiempo se comprobó que las fibras elásticas
siguieron desarrollándose (Yokota, 2008).
Se ha demostrado la existencia de un progenitor común para las células endoteliales y las
hematopoyéticas, y que este progenitor se diferencia en células endoteliales en el cultivo in
vitro frente a la presencia de factor de crecimiento fibroblástico, factor de crecimiento 1 y
factor de crecimiento vascular endotelial. Para la demostración de este hecho in vivo, se
implantaron válvulas pre sembradas con células derivadas de médula ósea de humanos en
perros. Se obtuvo que las células endoteliales desarrolladas en la superficie luminal del
implante sólo correspondieron al ADN del donante, concluyendo que las células progenitoras
CD34+ presentes en la médula ósea pueden circular en la circulación periférica y colonizar
superficies endoteliales de prótesis vasculares. (Shi et al., 1998) Además en estudios sobre
vasculogénesis se mostró que las EPCs son importantes en la neovascularización, proceso
que no depende solamente de la angiogénesis a partir de vasos preexistentes. (Asahara,
1999)
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al scaffold son multipotentes y que, dado un entorno óptimo, pueden diferenciarse en tipos
celulares específicos, necesarios para la regeneración tisular funcional (Lee, 2008).
El proceso de revitalización de las válvulas repobladas in situ depende completamente de la
respuesta del organismo ante una lesión, la cual guía la reparación tisular, y surge de manera
espontánea. La repoblación involucra la presencia en la circulación de células progenitoras
vasculares, las cuales se depositan en la superficie luminal del implante, y células del estroma
que migran desde la capa periadventicia del tejido de granulación o a través del sitio de
anastomosis. Consecuentemente, el reclutamiento de fibroblastos y su actividad sintética
promueve la remodelación de la ECM; la proliferación de EPCs guía la neogeneracion
endotelial sobre el implante (Iwai, 2007).
Figura 27: Esquema que muestra los enfoques in vitro e in vivo de la ingeniería de tejidos.
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Figura 28: Vía regulatoria desencadenada por factores de crecimiento. 1. Secreción por la
célula productora. 2. Interacción con la ECM. 3. Interacción con proteínas receptoras de la
membrana (en este caso, integrinas). 4. Mecanismo de regulación interna (mediadores
celulares citoplasmáticos, expresión genética nuclear) (Lee, Silva y Mooney, 2010)
Los factores de crecimiento de posible uso en ingeniería de válvulas cardíacas son (Lee, Silva
y Mooney, 2010):
Angiopoyetinas (Ang)
- Ang-1: ayuda en la maduración y estabilidad de los vasos sanguíneos, el corazón y el
tejido muscular.
- Ang-2: desestabiliza, produce regresión y disocia las células del tejido endotelial
aledaño.
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2011). Además, la TGFβ (al igual que las tensiones mecánicas) induce la activación de
las VICs adultas con incremento de su actividad sintética de ECM (Schoen, 2008)
(Hulin et al., 2012). Los efectos regulatorios de la TGFβ1 circulatoria evitan la
inflamación, la calcificación y la degeneración valvular (Attaran et al., 2010).
- Proteína morfogénica del hueso (BMP): factores secretados por fibroblastos que se
fijan a macromoléculas de la ECM, como la fibronectina y las fibrilinas. La BMP2 es
expresada en el miocardio auriculoventricular (AV) durante la maduración de los
cojines endoteliales, promoviendo la EMT y maduración de la válvula AV. En la
valvulogénesis aórtica participan las BMP4, 5, 6 y 7. Los niveles de BMP2 en la válvula
humana adulta no son detectables en válvulas sanas, pero sí en válvulas enfermas. La
BMP4, en cambio, si es expresada en células valvulares adultas sanas para su
maduración y mantenimiento (Conway et al., 2011).
Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF): Este factor es el más citado en los
trabajos de investigación y actúa sobre los vasos sanguíneos, fomentando el crecimiento
endotelial. Inhibe la invasión celular de los tejidos, pero aumenta la migración celular, hecho
que se condice con su actuación tardía en la formación de los cojines endoteliales que
conformarán las válvulas cardíacas primitivas. De este modo, al no actuar e un principio
permite la invasión celular del tejido, y su actuación posterior fomenta la motilidad celular de
los miofibroblastos para la remodelación de la ECM según las tensiones aplicadas (Chiu et al.,
2010)
La composición de la ECM es crucial para la mediación de la respuesta de factores de
crecimiento, ya que esta puede regular la presentación de los factores mediante la unión de
los factores a la ECM. En algunos factores de crecimiento existen dominios de unión con la
heparina, que hacen fundamental la composición adecuada de la matriz en la señalización.
Esta unión con heparina representa reacciones más lentas que los factores sin dominios de
unión con heparina, los cuales presentan una más rápida difusión. Además, la ECM regula el
anclaje y motilidad de las células, adaptando el tejido a su estructura. Por ejemplo las
integrinas, proteínas de membrana con dominios de unión con ECM, regulan activamente la
angiogénesis y señalización de tejido endotelial (Place, Evans y Stevens, 2009).
La concentración local de factores puede regular respuestas célula-célula, como las uniones
mediadas por cadherinas que son aumentadas para suprimir la proliferación celular sólo
cuando un determinado factor disminuye su concentración por debajo de un umbral. Además,
la angiogénesis mediada por VEGF es controlada por señalización notch, que suprime los
picos de concentración de VEGF. La inhibición local de los notch por DAPT (un inhibidor de
señalización notch) promueve la angiogénesis por crecimiento endotelial gracias a una mayor
captación de VEGF (Chen et al., 2011).
Si se desea lograr angiogénesis o endotelización (ver figura), la 1era etapa requiere de
factores Ang-2 (retrotrae la estructura de vasos preexistentes), FGF (ayuda en la migración,
proliferación y supervivencia de nuevas células endoteliales) y VEGF (fomenta el crecimiento
endotelial) para formar neovascularización inmadura. En una 2da etapa se utiliza Ang-1 y
PDGF-BB (factor de crecimiento BB derivado de plaquetas) ayudan a madurar y estabilizar los
vasos sanguíneos, permitiéndoles un crecimiento adecuado. Esto se puede realizar con
estrategias secuenciales de liberación de factores, mejores que la liberación de factores
únicos. La secuencia puede estar gobernada tanto por tasas de degradación variables como
por diferente unión de los factores con los polímeros degradables (Place, Evans y Stevens;
2009).
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Figura 30: Algunas estrategias RGD. A) Secuencia RGD original. B) RGD antagonista cíclico.
C) Péptido cíclico c(RGDfK). D) ACDCRGDCFCG. E) y F) 2 moléculas peptidomiméticas
(Danhier, Le Breton y Préat, 2012)
Otro péptido recientemente descubierto es el YCWS-QYLCY, que puede inmovilizarse a
hidrogeles y aumentar la supervivencia celular.
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Figura 31: Mecanismo de SWITCH binario de las GPCR. La proteína-G está inactiva cuando
es unida a GDP (modo “off”). GPCR intercambia el GDP de la proteína-G por GTP ante
estímulos, lo cual la activa (modo “on”). Activa puede activar distintas kinasas, cada una de las
cuales implica un mecanismo diferente (Berridge, 2012)
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Wnt pathway: regula la pluripotencialidad de las células madre y otras células poco
diferenciadas, a la vez que tiene un importante rol en el desarrollo celular y de los órganos.
Representa uno de los mecanismos por el cual actúan diversos factores de crecimiento, como
FGF, TGF-β y BMP. El ligando Wnt es una glicoproteína secretada parácrina (por otra célula
cercana) o autócrinamente (por la misma célula), que se une a receptores frizzled (Cai et al.,
2013).
En la ausencia de Wnt (estado “off”), las β-cateninas (E-cadherinas integrales de adaptación
célula-célula y co-reguladoras transcripcionales) son fosforiladas y degradadas, reduciendo la
capacidad de respuesta de la célula. Ante la presencia de Wnt (estado “on”) se producen 3
respuestas (ver figura): 1. Respuesta canónica: las β-cateninas son liberadas (acumulación
citoplasmática) y traslocadas al núcleo, fomentando la diferenciación, proliferación o migración
celular y disminuyendo la adhesión; 2. Respuesta no canónica: regula el citoesqueleto por
polimerización de actina y profilina durante la migración, mitosis o diferenciación celular; 3.
Respuesta no canónica reguladora de calcio: regula la liberación de calcio del retículo
endoplasmático (RE) (Berridge, 2012).
Figura 32: Respuestas celulares a la presentación del ligando Wnt. Izquierda: Respuesta
canónica, con acumulación de β-catenina citoplasmática y translocación hacia el núcleo para
control de los genes Wnt. Medio: Respuesta no canónica (RNC) por polaridad celular, con
activación de proteínas unidas a GTP (Rho y Rac) que, a través de quinasas, remodelan el
esqueleto de actina y producen contracción de actina/miosina. Derecha: RNC de regulación
de calcio, liberando o reteniendo Ca2+ del REL (Berridge, 2012)
La regulación Wnt es muy importante en las etapas de formación de las válvulas cardíacas,
durante la transformación EMT. En el mesénquima de cojines endocardiales de válvulas de
ratón y gallina se encontró expresión de múltiples genes del mecanismo Wnt (Wnt2, LEF1,
Fzd2) consistentes con la EMT (Alfieri et al., 2010). Además se estudió la pérdida de β-
cateninas en células valvulares embrionales de ratón y se descubrió que no ocurre EMT en
ausencia de Wnt (Liebner et al., 2004). La presencia en células valvulares mesenquimales de
Wnt2 es consistente con la proliferación celular durante la etapa de EMT. Wnt2 es además
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requerido para la diferenciación celular del linaje cardíaco en células madre embrionarias
(Wang et al., 2007).
Además se pudo relacionar la calcificación patológica de válvulas cardíacas adultas con el
aumento de la expresión de mecanismos canónicos de señalización Wnt, lo cual puede estar
relacionado con la función que cumple Wnt en el desarrollo del linaje osteoblástico, además
de su función de regulador de calcio. Sin embargo, para la osteogénesis por Wnt se requiere
además un medio osteogénico, por lo que probablemente existan otros factores que afecten
conjuntamente a la calcificación de las válvulas (Caira et al., 2006).
Señalización Notch: Regula la diferenciación celular y la homeostasis en células adultas. La
regulación es yuxtácrina y unidireccional entre 2 células en contacto. Una unión de proteínas
de membrana de una célula emisora y una célula receptora produce la escisión del dominio
extracelular de la receptora, desencadenando una cascada por liberación intracelular del
dominio citoplasmático de la proteína, el cual transduce en el núcleo el mensaje (ver figura)
(Andersson, Sandberg y Lendahl, 2011).
Figura 33: Modelo de señalización Notch (Canónica y No canónica). Pueden verse: a) unión
ligando(célula emisora)-Notch(célula receptora); b) endocitosis de ligando-dominio Notch
extracelular (NECD); c) endocitosis de NICD; d) traslocación de NICD al núcleo; e) NICD
remueve moléculas represoras y permite expresión del gen (modificado de: Ables et al., 2011)
La señalización Notch es un camino crucial en la diferenciación celular durante el desarrollo
del corazón, y particularmente en el desarrollo valvular y la transformación endotelial-
mesenquimal (EMT). La EMT se produce sin infiltración de la primordia en células endoteliales
y endocardiales via Notch (transmitido yuxtacelularmente). Notch activa Snail1,2, una proteína
que produce la expresión de genes mesenquimales (α-actina, fibronectina, N-cadherina,
vimetina) y la inhibición de genes endoteliales (como los marcadores E-cadherina y α/β-
catenina). El agregado de factor BMP2 induce la migración y total invasión del tejido valvular
con EMT (ver figura), sugiriendo que la señalización Notch desencadena la EMT y una
posterior señalización BMP2 completa el proceso (Luna-Zurita et al., 2010).
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Figura 35: Señalización Hh. A) Producción de ligandos (Shh, Ihh o Dhh) con agregado de
colesterol para polimerización (formación de complejos de señales) y palmitato (para
señalización de alto nivel), y empacado en partículas asociadas a lípidos. B. Unión de Hh a
Ptch permite a Smo liberar proteínas Gli, que activan genes blanco. C. Célula sin unión a Hh,
cuya Ptch inhibe la acción de Smo. Las proteínas Gli se fosforilan y se convierten en
represoras de genes blanco (Wilson y Chuang, 2010)
En mamíferos los cilios primarios son los reguladores del mecanismo Hh a través de un
proceso dinámico de transporte interflagelar (IFT). Las células de mamíferos expresan
proteínas Ptch, Smo y Gli (1, 2 y 3) sólo en las puntas de los cilios primarios. El proceso Hh,
entonces, implica el transporte dinámico de los receptores de membrana Ptch y las GPCR
Smo (ver figura). Sin las señales Hh en la ECM, las Ptch reprimen no sólo la acción de las
Smo, sino también su transporte anterógrado (hacia la punta) por el cilio. Al unirse el ligando a
Ptch, esta proteína deja el cilio por el mecanismo retrógrado (hacia la base del cilio) de
transporte IFT, mediado por la proteína citoplasmática dineína. La Smo entonces es
transportada hacia la punta del cilio por IFT anterógrado, mediado por kinesina a través del
axonema ciliar. Allí cumple su rol de liberar Gli, la cual es transportada hacia la célula a través
del cilio. La respuesta a los estímulos Hh de las células ciliadas incluye el aumento de las
prolongaciones citoplasmáticas y la motilidad celular (Kardon y Vale, 2009).
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Figura 36: Mecanismo Hh en mamíferos (ratón) a través del cilio primario. C) Ptch1 activa por
ausencia de factores Hh en el medio, inhibe la acción de Smo. D) Al unirse a Hh, Ptch1 se
inactiva y es arrastrada fuera del cilio (dineína). Esto permite a Smo ser traslocada hacia el
cilio (kinesinas en el axonema ciliar) para activar la señalización (Wilson y Chuang, 2010)
Las proteínas Gli humanas 3: Gli1, Gli2 y Gli3. Gli 2 y Gli3 son factores de transcripción
bifuncionales regulados por procesamiento proteolítico, de modo que en su longitud completa
actúan con un extremo C-terminal activador transcripcional y truncados actúan con un
extremo N-terminal represor genético. Ambos son esenciales para la embriogénesis, como lo
demuestran estudios en ratones. Gli1, en cambio, sólo actúa en su longitud completa con su
extremo activador C-terminal, y no puede ser regulado. Por otro lado, es prescindible en el
desarrollo embrional y sólo actúa como lazo de realimentación positiva, potenciando los
efectos de la señalización (Hui y Angers, 2011).
Los blancos genéticos son variados, e incluyen reguladores de la diferenciación y renovación
de células madre, y de la proliferación, determinación y muerte celular (Canettieri et al., 2010)
Señalización TGF-β: la superfamilia TGFβ incluye a las TGFβs y las BMPs (bone
morphogenic proteins). Las TGFβs 1, 2 y 3 controlan un amplio espectro de procesos
celulares, desde EMT, crecimiento celular, apoptosis, diferenciación, síntesis de ECM y
remodelación de tejidos, todo de un modo altamente dependiente del contexto (Sporn et al.,
2006). Genes muy implicados en la actividad de los miembros de la familia TGFβ son el de la
periostina, (Postn), el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) y el inhibidor de
activadores de plaquetas (PAI1), cruciales en el desarrollo del hueso, tejidos blandos y en la
remodelación tisular (Snider et al., 2009).
La señalización se basa en la oligomerización (mediada por presentación de ligandos) de
kinasas de serina/treonina unidas a receptores, que fosforilan las moléculas de señalización
citoplasmática SMAD (SMAD2 y SMAD3 para los caminos TGF-β/activina; SMAD1, 5 y 8 para
el camino de BMP). Los SMADs carboxilados se unen al co-mediador SMAD4
(heterodimerización), que les permite la translocación al núcleo y la regulación genética (ver
figura) (Wu, Hill et al., 2009).
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implique una matriz ósea con densidad mineral significativamente alterada (Xiong et al.,
2009). Respecto a los procesos de osificación, se encontró que BMP2 también puede actuar
como ligando de TGFβR3 (Townsend et al.2011). Esta interacción entre la vía de señalización
TGFβ2 y BMP2 tiene un rol importante en procesos de calcificación valvular aórtica (Hakuno
et al., 2009) (Miyazono, Kamiya y Morikawa, 2010).
Señalización Hippo: controla el crecimiento y proliferación celular, siendo crítico en la
inhibición de la modificación del tamaño del órgano y del desarrollo de procesos carcigénicos.
La señalización es principalmente mecánica (filamentos de actina) o mediada por uniones
intercelulares adherentes y zonula occludens (yuxtacelular), además de por daños del ADN.
La densidad celular del tejido aumenta la formación de uniones, estimulando este mecanismo.
El camino final depende de la actividad de 2 coactivadores transcripcionales, el YAP y el TAZ,
que inducen antiapoptosis y proliferación celular, entre otros procesos compartidos con
distintos mecanismos de señalización (FGF, TGF). La fosforilación de YAP y TAZ promueve su
degradación o la activación de genes pro-apoptóticos (Cell Signalling Technology, 2010).
La estimulación parácrina a través de la zonula adherens determina la fosforilación de YAP y
su inmobilización. La zonula occludens actúa por varios caminos: 1. El complejo proteico
Crumbs une a los coactivadores YAP y TAZ a complejos SMAD (transductores de la
señalización TGF-β), inhibiendo su actividad nuclear; 2. Ante alta densidad celular suprime la
actividad nuclear por vía de la quinasa MST1/2, que fosforila a la kinasa LATS1/2 (activación)
para que esta fosforile a YAP y TAZ (ver figura); 3. Ante baja densidad celular, en cambio, la
zonula occludens fomenta la traslocación de YAP y TAZ al núcleo para permitir su expresión
genética (Halder y Johnson, 2011).
La proteína CD44, expresada en la vecindad de las zonula occludens, es un receptor
transmembrana de ácido hialurónico (componente fundamental de la ECM de tejidos blandos,
como las válvulas cardíacas) que puede responder incluso a osteopontina y colágeno
(también encontrados normalmente en el tejido valvular). El camino de CD44 es similar al ya
expresado. MST 1 y 2 (MST1/2) son 2 quinasas que fosforilan kinasas LATs (Large Tumor
Supresor) 1 y 2, proteínas encargadas de inhibir la actividad tumoral (Berridge, 2012).
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Figura 40: Celularización en scaffolds: A) PLC sembrado sin fibrina. B) PLC con fibrina
smebrado. En B) puede verse la organización densa de células en las regiones con fibrina
(Alfonso et al., 2013)
La fibrina usada en TE muestra gran capacidad para el crecimiento celular homogéneo,
producción de colágeno, alta eficiencia de sembrado y buena distribución celular. Además, los
tejidos expuestos a scaffolds de fibrina demuestran muy buena remodelación in vivo (Syedain
et al., 2008). Por otro lado, las tensiones dinámicas aplicadas a los scaffolds como
pretratamiento para mejorar sus propiedades mecánicas producen depleción de GAGs del
scaffold. La fibrina parece sin embargo aumentar la retención de GAGs en el scaffold ante
tensiones dinámicas. Esto es bueno ya que los GAGs en la capa esponjosa disminuye las
tensiones por flexión producidas dinámicamente en las valvas (ver figura) (Alfonso et al.,
2013).
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Figura 41: Retención de GAGs por la estructura de fibrinas. Arriba: Sin fibrinas, puede verse
la casi total depleción de GAGs (azules) del scaffold luego de una semana de tensiones
dinámicas. Abajo: La estructura de fibrina (rojo) retiene lo GAGs (azules) luego de una
semana de aplicación de las tensiones dinámicas (Alfonso et al., 2013)
Vitaminas: Sustancias orgánicas, de origen vegetal o animal, que se encuentran en los
alimentos en pequeñas cantidades y son imprescindibles para el desarrollo y crecimiento de
los animales, puesto que estos son incapaces de sintetizarlas y deben obtenerlas a través de
la alimentación. Las vitaminas se dividen en dos grandes grupos: las liposolubles, como las
vitaminas A, D, E y K y las hidrosolubles, como la C y los compuestos del complejo B. Son
encargadas de actuar como cofactores de diversas reacciones enzimáticas, muy importantes
durante la generación y remodelado de redes poliméricas de la ECM (Diccionario
Enciclopédico Vox 1, 2009).
El uso de ácido retinóico (RA, metabolito de la vitamina A) y ácido ascórbico (AA, metabolito
de la vitamina C) demostró ser de gran ayuda en la proliferación de redes proteicas de la ECM
y en la adecuación de las propiedades mecánicas. Se trataron injertos vasculares (de
colágeno I fibrilar) sembrados con células musculares lisas (SMC) de aorta humana con 0,3
mM de AA y 0,1 mM de RA. Se demostraron propiedades biomecánicas mejoradas con el
tiempo de cultivo (aumento de resistencia, disminución de dureza). También mejoró la
creación de ECM, hecho demostrado en el aumento de ARNm de colágeno y elastina el las
SMC en 15 y 30 días de cultivo (Ogle y Mooradian, 2002).
La adición de vitamina D mejora las propiedades mecánicas de los scaffolds, pero induce la
diferenciación de células madre mesenquimales (MSC) humanas en condroblastos u
osteoblastos, modificando su secreción y perjudicando a la ECM (Formosa et al., 2010).
Sucede algo similar en células del estroma medular (Ravindran, 2012)
Productos de degradación de scaffold: los scaffolds biodegradables liberan monómeros
durante su degradación. Estos se acumulan cerca de los injertos y son reabsorbidos por los
tejidos, induciendo diversas reacciones. Fragmentos de ácido hialurónico (HA) en forma
oligomérica agregados a scaffolds podrían inducir la estimulación de citokinas y quemokinas.
La expresión y secreción de este tipo de moléculas es inducida de un modo dependiente del
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tiempo al liberarse anticuerpos TLR2 y TLR4, los cuales son estimulados por oligómeros de
HA (Shimada et al., 2008).
Más aun, la diferencia de tamaño de poros y morfología del scaffold también influye en la
expresión genética de las células, en especial debido a las alteraciones en el contacto célula-
material y célula-célula. Del mismo modo esto ocurre con los productos de degradación, que
modifican los contactos de adhesión con la ECM (Hee et al., 2005)
Citoquinas y quemoquinas: las citoquinas son una superfamilia muy amplia de proteínas, las
cuales son liberadas por determinadas células y producen el desplazamiento o marcan el
camino para el desplazamiento de otras células, por medio de los caminos de señalización
que mueven el citoesqueleto de actinas (GPCR, integrinas y kinasas de tyrosina receptoras
-RTKs-). Las quemoquinas son un tipo de citoquinas encargadas del movimiento de leucocitos
y las respuestas inflamatorias (SABiosciences, 2012).
Las citoquinas pueden ser fomentadas por el agregado de GAGs a los scaffolds. Esto sucede
por la unión natural de los GAGs a algunas proteínas quemoatrayentes. RANTES y las
proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP-1α y MIP-1β) aumentan las propiedades
adhesivas de las células a las que atraen. De este modo se pueden generar scaffolds con
propiedades de atracción celular (Schall y Bacon, 1994).
El ácido hialurónico de alto (HMW-HA) y bajo (LMW-HA) peso molecular existen naturalmente
en la ECM de varios tejidos, y promueven la agregación de citoquinas. La interacción con
determinadas células con LMW-HA estimula la unión con receptores de membrana
relacionados con el citoesqueleto de actina y la AFAP (proteína asociada con los filamentos de
actina). Así se estimula la motilidad celular, al tiempo que se desencadenan procesos
regulados por ciertos genes blanco (mediante factores de transcripción). De este modo se
señaliza la producción de citoquinas y quemoquinas pro inflamatorias, las cuales pueden
usarse para fomentar la rápida angiogénesis y endotelización, así como también los procesos
de remodelación vascular y valvular (Bourguignon et al., 2011).
Más importante aún es el uso de quemoquinas para atraer células madre a través de la
inflamación. Las células madre mesenquimales (MSC) y las hematopoyéticas (HSC) pueden
producir efectos beneficiosos alterando las respuestas inflamatorias para evitar la fibrosis y
mejorar la curación. La incorporación de quemoquinas, en este caso SDF-1α (stromal derived
factor), por inyección a un scaffold de PLGA fue implementada y evaluada en ratones. En 2
semanas la respuesta de las células madre autólogas fue mejorada 3 veces en cuanto a la
población celular (ver figura) y la interfase célula-matriz. Además, se redujo la respuesta
inflamatoria celular y el aumento de la angiogénesis, reduciendo el tejido fibrótico (Thevenot et
al. 2010)
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Figura 42: Aumento de la población de MSC por agregado de citokina SDF-1α a scaffolds de
PLGA. En rojo se marcan las células CD45-, mientras que en verde las SSEA-4, 2 tipos de
MSC. En azul se tiñeron los núcleos celulares. A. Scaffold de PLGA sin citokinas. B. Scaffold
con citokinas. Se nota a simple vista la celularidad aumentada en B (modificado de: Thevenot
et al., 2010)
Anticuerpos CD34 y aptameros de alta afinidad: Los anticuerpos son moléculas de
membrana o secretadas que se adhieren selectivamente a antígenos, proteínas reconocibles
por el sistema inmune que señalizan e identifican diversas células (Janeway et al., 2001). Los
aptameros son ácidos nucleicos (ADN y ARN) monocatenarios que permiten señalizar
respuestas genéticas específicas y plegarse en estructuras 3D uniéndose con gran afinidad a
moléculas determinadas (proteínas en general, enzimas, receptores de membrana,
anticuerpos, etc). A través de estrategias de ingeniería superficial (como cubiertas peptídicas
de scaffolds) ayudan en el reclutamiento activo y la diferenciación celular valvular, en conjunto
con el uso de factores de crecimiento específicos (Jayasena, 1999).
La inmovilización de células por anticuerpos fue probada por Rotmans et al., que usó
anticuerpos anti-CD34 para la atracción de células progenitoras endoteliales circulantes
(EPCs). Estudios in vivo demostraron que scaffolds con cubiertas de anticuerpos produjeron
una endotelización más rápida, aunque produjeron hiperplasia de la membrana íntima en
injertos arteriovenosos de PTFE expandido en cerdos (Rotmans et al., 2005). Otra molécula
que puede atraer células con gran especificidad es la P-selectina. Injertos vasculares fueron
implantados en la arteria femoral de ratas como shunts cubiertos con dicha proteína y se
obtuvo una captura satisfactoria de células mononucleares CD34+ (Wojciechowsky et al.,
2008).
Aptameros fueron inmovilizados en cubiertas de polietilenglicol (PEG) star (scaffolds de PTFE
y PDMS cubiertos con PEG). Star PEG es un PEG con forma de estrella de 6 brazos, que de
este modo logra adherirse con facilidad y formar cubiertas sobre superficies irregulares. Luego
de la polimerización, star PEG tiene grupos funcionales libres que pueden usarse para unir
moléculas de adhesión celular (Schleicher et al., 2009). Las ventajas de los aptameros como
moléculas de adhesión son su pequeño tamaño, su gran afinidad y especificidad, su no
toxicidad y su no inmunogenicidad. Un estudio demostró la posibilidad de unir aptámeros de
células CD31-positivas porcinas, obteniéndose una gran captación y retención celular
(Hoffmann et al., 2008).
Fibulina: Las fibulinas son una familia de 7 glicoproteínas secretadas hacia la ECM
(Horiguchi, 2009). Contienen dominios de unión a calcio similares a los del factor de
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Figura 44: Adhesión celular de HUVECs a injertos. Arriba: PS-RGD. Abajo: PS sin tratamiento
de superficie. Washed/stained muestra la adhesión luego de lavado de los cultivos e
inmunotinción (Meyers et al., 2009)
Los cultivos celulares en colágeno promueven la apoptosis celular aumentada con el paso del
tiempo. Esto está ligado a la falta de uniones de integrinas de unión RGD (αv-β3 y α5-β1) a
ligandos presentadores de RGD, demostrado por la mayor supervivencia de células con
menor expresión de dichas proteínas (Stupack et al., 2001). Esto se debe a que sin las
suficientes uniones RGD se sintetizan ciertos factores como los de necrosis tumoral (TNFs)
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por diferentes vías de señalización (GPCR, Scr, TLR, FGF). Los IFBM unidos a RGD inhiben
por vía de las integrinas a los TNFs, promoviendo la supervivencia celular (Meyers et al.,
2009).
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Figura 45: Sistema desarrollado por Isenberg et al para la aplicación de estiramientos cíclicos.
Figura 46: Esquema del sistema desarrollado por Isenberg et al para la aplicación de
estiramientos cíclicos.
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Diversas estrategias de estiramiento de las válvulas han sido implementadas. Las más
importantes son citadas a continuación.
- Deformación estática y dinámica: La aplicación de deformaciones favorece la producción
de elastina en el tejido neoformado. Los datos relevados experimentalmente ofrecen evidencia
sobre que la aplicación de deformaciones cíclicas resulta en actividades de remodelación
tisular mediada por células, apuntando a reestructurar los componentes de la ECM. Se
estudió particularmente la expresión de los genes que codifican colágeno tipo I y elastina,
obteniéndose resultados prometedores; sin embargo, la aplicación de las deformaciones
durante períodos prolongados genera consecuencias adversas sobre la integridad estructural
del tejido (Seliktar 2003).
- Deformación dinámica continua de larga duración: En este caso, los implantes son
sometidos a 2 magnitudes de tensión diferentes, mostrando diferencias respecto a los
controles sin aplicación de tensiones en sus propiedades bioquímicas, mecánicas y en
organización de la microestructura. Los resultados sugieren que la producción de colágeno
con un número mayor de entrecruzamientos está relacionada a la aplicación de
deformaciones prolongadas en el tiempo. Sin embargo, el uso de grandes tensiones tiene un
efecto negativo en las propiedades mecánicas del tejido. Las tensiones dinámicas inducen
una alineación de las células y el colágeno diferente en relación a la profundidad del tejido
(Boerboom 2008).
- Deformación dinámica intermitente: Se cultivaron fibroblastos humanos de vena safena en
medio de cultivo DMEM con Glutamax y gentamicina, para su posterior siembra en scaffolds
de PGA+P4HB. Se sembraron con la ayuda de gel de fibrina como transportador celular, a
una densidad de 2 millones de células por cm2. Luego de 1 semana de cultivo en condiciones
de deformación continua, los implantes se separaron en 2 grupos, uno para control y otro para
la aplicación de deformaciones intermitentes uniaxiales del 4%, a frecuencia de 1Hz, con
aplicación durante 3 horas alternada con descanso de 3 horas. Se retiraron para su posterior
estudio implantes de ambos grupos luego de 2, 3 y 4 semanas de cultivo bajo las condiciones
antes mencionadas. Las muestras fueron analizadas en la organización y morfología tisular,
producción de colágeno, densidad de entrecruzamientos y propiedades mecánicas. Aunque
las deformaciones cíclicas presentes en tejidos nativos alcanzan de 8% a 12%, previamente
se demostró que su aplicación no mejora los tejidos neoformados sino que reduce sus
propiedades (Boerboom, 2008).
En la aplicación de deformaciones intermitentes se produjo un aumento de formación de ECM
comparado con la aplicación de deformaciones continuas, lo cual se traduce en una mejor
producción de colágeno, en las muestras de 2 y 3 semanas de cultivo. Sin embargo esta
producción se estabilizó en las muestras sometidas a tensión intermitente, mientras que creció
de forma sostenida en las muestras sometidas a tensión continua. El nivel de
entrecruzamientos logrado es similar al de los tejidos nativos, y no se estabilizó sino que
continuó aumentando, pero las propiedades mecánicas, lo mismo que el colágeno, se
estabilizaron luego de cierto período, sin mejorar en el tiempo y alcanzando niveles menores a
los del tejido nativo. Se proponen métodos bioquímicos para promover la síntesis de
colágeno, y se recalca la importancia de estudiar la relación entre la expresión génica y el
condicionamiento mecánico (Rubbens et al., 2009).
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Figura 47: Se observan los tejidos formados con deformaciones continuas (A-C) y con
deformaciones intermitentes (D-F), después de 2 (A y D), 3 (B y E) y 4 semanas (C y F) de
cultivo. El colágeno se observa en azul, las células en rojo, núcleos en negro, los restos del
scaffold en celeste. Se aprecia la mejora del tejido formado con deformaciones intermitentes.
b) Flujo: Se trabajó con 11 válvulas pulmonares ovinas descelularizadas, sembradas con
células ovinas con una densidad de 1.2x10(7) células por válvula. El cultivo se inició con un
flujo de 0.1 l/min en 8 biorreactores. En 4 de ellos el flujo inicial fue lento, y se incrementó en 1
l/min 2 veces por día, hasta alcanzar un flujo máximo de 0.5 l/min y con una frecuencia de
pulsos de 20 pulsos/min. En los otros 4 biorreactores el flujo se aumentó a una tasa de 0.7
l/min/día, alcanzando 2l/min con una frecuencia de pulsos de 50 por minuto. La presión media
del sistema se mantuvo a 25 +/- 5 mmHg. Se encontró que el endotelio, que inicialmente
estaba formado como una monocapa discontinua, logró una continuidad en todo el implante
(paredes y cúspides), inducida por la circulación pulsátil moderada. El flujo alto llevó a una
pérdida parcial de las células en la superficie luminal, generando grandes defectos en esta y
una completa pérdida de las células sobre las cúspides. La actividad metabólica del tejido
neoformado fue significativamente mayor luego del cultivo expuesto a flujo moderado,
mientras que las cúspides no lograron mantener ningún proceso metabólico en los cultivos
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expuestos a grandes flujos. Se concluye que los flujos moderados pulsátiles con incrementos
pequeños estimulan la proliferación celular, mientras que los flujos mayores provocan daños
en el tejido en formación. Esto podría explicar las fallas de válvulas ingenieradas luego de la
implantación in vivo, al estar de repente sujetas a los flujos fisiológicos (Lichtenberg, 2006).
c) Alineamiento comisural de fibras: Este método busca resolver el problema común de la
falta de propiedades mecánicas en los implantes valvulares creados mediante TE, alineando
las fibrillas colágenas en la válvula de forma similar a como están alineadas en las válvulas
nativas, de tal forma que este alineamiento logre propiedades mecánicas similares a las
nativas. Esto es posible mediante una compactación que llevan a cabo las mismas células del
tejido, la cual se efectúa de forma anisotrópica y limitada mecánicamente, lo cual genera una
tensión anisotrópica sobre la red colágena, induciendo la alineación de las fibras. Trabajos
previos mostraron una forma de predicción de la dirección del alineamiento de fibras en
respuesta a tensiones anisotrópicas. Con esto, se mejoran las propiedades mecánicas de
forma anisotrópica, que es lo más adecuado considerando la fisiología de las válvulas
cardíacas (Neidert, 2006).
d) Tensión isométrica continua: los miofibroblastos tienen una actividad importante en la
reconstrucción tisular en las heridas que desarrollan fibrosis. La fuerza desarrollada por estas
células está condicionada por citoquinas, por componentes de la ECM y por las tensiones
mecánicas aplicadas al tejido. La comprensión de este fenómeno ayudaría a lograr mejoras
en las propiedades mecánicas de los tejidos desarrollados mediante TE. (Hinz 2003). Los
tejidos formados con fibroblastos y ECM alineados presentaron mejor resistencia mecánica
respecto de los tejidos con alineación aleatoria, evaluada mediante la tensión de ruptura y el
módulo de elasticidad. El tejido vascular formado sobre la matriz prealineada mejoró la
capacidad contráctil de las células musculares lisas comparada con aquellas que crecieron en
matrices sin alineación previa. Estos resultados muestran que la fuerza generada por las
células durante la organización tisular es importante sobre la alineación del mismo, y por esto
influye sobre la funcionalidad posterior del mismo (propiedades mecánicas y vasocontráctiles)
(Grenier, 2005).
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GAGs. El EDTA (así como el EGTA) provee unión de iones metálicos, separando las
células de la ECM (Crapo et al., 2011)
La descelularización de válvulas de cerdo por este método produce pérdida de la
estructura de 3 capas valvular, con mantenimiento de algunos cuerpos celulares
contraídas, con núcleos picnóticos (cromatina hipercondensada) y pérdida de contacto
con la matriz extracelular. La sustracción total de las células no es posible ni siquiera
con sucesivos lavados, y si la exposición a tripsina se extiende por demasiado tiempo
se pierde completamente la estructura de la válvula (Grauss et al., 2010)
- Método Triton: método enzimático que consiste en sumergir los injertos en PBS
(buffer salino de fosfato) sin iones Ca2+ ni Mg2+, en solución con ter-octilfenil-
polioxietileno (Triton X-100) y EDTA al 0,02% en peso, con ADNasas y ARNasas,
revolviendo continuamente. Desestabiliza las uniones ADN-proteínas, las uniones
lípido-lípido y lípido-proteína, destruyendo las paredes celulares y su unión con ECM,
pero con ligeros efectos negativos sobre la ultraestructura de la ECM. Como resultado
se obtiene una completa pérdida de la celularidad, con mantenimiento integral de la
estructura trilaminar valvular y funcionalidad de la valvula (Grauss et al., 2010).
- Detergentes no enzimáticos: detergentes que, por sus propiedades anfibólicas, son
usados para remover el estrato celular y, en muy baja medida, parte de la ECM
valvular. Comprenden compuestos como el deoxicolato de sodio (SDC) o el
dodecilsulfato de sodio (SDS). Ambos son compuestos tensoactivos iónicos no
enzimáticos poco agresivos, que proveen remoción celular mucho más eficiente que
los métodos más antiguos (tripsina/EDTA) manteniendo la integridad de la ECM con
mayor efectividad que el método Triton. Sin embargo, se notó una pérdida de las
propiedades biomecánicas valvulares por cambios microestructurales, aun con
preservación a grandes rasgos de la estructura fibrosa (Rieder et al., 2003).
Usando SDS se logró repoblación por células autólogas en perros, con alta resistencia
a la calcificación. Luego de 1 mes se logró la reendotelización espontánea, y al 2do
mes las células ya habían infiltrado algunas capas debajo de la intima, con buena
recelularización de la valva y la adventicia. Al 6to mes se logró una ECM superficial
similar a la natural, con fibras de actina alineadas con las fibras musculares lisas (Iwai
et al., 2007).
Los resultados a mediano plazo usando SDS demuestran integridad estructural
estable, baja tasa de calcificación y hemodinámica adecuada. Sin embargo, luego de 3
años la repoblación autóloga valvular es limitada, lo cual da una idea de la causa de la
relativamente corta vida media de dichas válvulas. Si se lograra solucionar este
problema, los aloinjertos aórticos descelularizados parecen una alternativa
prometedora (Da Costa et al., 2010).
El uso de SDC logró mejores propiedades mecánicas que el SDS. La integridad de la
ECM fue más efectiva, con una remoción celular total. Sin embargo, tanto SDC como
SDS y los demás métodos desarrollados hasta la actualidad afectan la respuesta
inmunológica humana e incrementan la trombogenicidad del injerto (Zhou et al., 2010).
- SynerGraft: método alternativo de descelularización que usa la autolisis celular y la
digestión por nucleasas para minimizar la antigenicidad. Consiste en la lísis celular por
solución hipotónica, digestión de material genético por nucleasas (ADNasa I y ARNasa
A) y lavado por solución buffer salina (BSS, isotónica). Con este método se logró
mantener la estructura de colágeno y elastina íntegramente, incluso luego de la
criopreservación, con remoción celular total (Gerson et al., 2012).
Sin embargo, si bien el uso de aloinjertos descelularizados por SynerGraft en humanos
adultos logró resultados iniciales prometedores, los xenoinjertos con válvulas porcinas
generaron respuestas inmunogénicas severas y falla temprana del injerto en niños
(Simon et al., 2003). Se demostró además que los xenoinjertos aún revisten un alto
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glutaraldehído) citotóxicos que afectan la estabilidad del scaffold a largo plazo. El NDGA es un
producto natural bioactivo que ha sido provado con éxito en scaffolds para TE reconstructiva
de tendones. Se demostró una resistencia mecánica mejorada respecto de los scaffolds sin
entrecruzamientos, y una menor citotoxicidad que los scaffolds tratados con GA en cerdos.
Debe tenerse especial cuidado en utilizar las proporciones adecuadas, debido que a altas
concentraciones el NDGA es relativamente citotóxico (Lü et al., 2010).
Una de las ventajas del entrecruzamiento del colágeno es que permite, hasta cierto punto, la
mejora de la resistencia a la calcificación de los scaffolds. Se entrecruzaron fibras de injertos
descelularizados de válvulas aórticas de cerdo por medio de procianidinas, y se observó la
morfología, la densidad de entrecruzamientos y la resstencia a la tensión. Posteriormente se
implantaron 3 tipos de muestras subcutáneas en ratas: injertos decelularizados sin
entrecruzamientos extra, con procianidina y con glutaraldehído (GA). Se observó una
resistencia a la tensión aumentada en las muestras con entrecruzamientos, mayor en las
tratadas con procianidina que las tratadas con GA. En las matrices con procianidina no se
detectó calcificación luego de 2 meses (Liu et al., 2009).
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Figura 48: Microfotografías de la estructura bicapa generada con colágeno y elastina, para 2
proporciones diferentes. Se aprecia que ambas capas están bien interconectadas y poseen
microestructura similar (Qi Chen, 2013).
Los estudios demostraron que el agregado de elastina aumenta el tamaño de los poros (ver
figura), mientras que el C4S lo disminuye. Las mejores propiedades mecánicas se obtuvieron
usando las mayores proporciones de colágeno. El agregado de elastina disminuyó la
migración de células derivadas de cardioesferas (CDCs, células madre presentes en tejido
cardíaco), produciendo una colonización sólo superficial. En los casos de scaffolds de
colágeno y colágeno-C4S, la migración celular fue profunda a través de los poros
interconectados. Los scaffolds con C4S mostraron el mejor comportamiento en cuanto a
adhesión celular. Esto puede explicarse teniendo en cuenta que las células se unen
naturalmente al colágeno mediante las integrinas de la membrana plasmática, y que la unión
celular es facilitada por los GAGs. Específicamente, el C4S mejora la actividad metabólica
celular y provee adhesión de células y factores de crecimiento. Un próximo estudio debería
intentas conseguir scaffolds trilaminares que se asemejen a las válvulas reales, con una capa
colagénica, una de colágeno-elastina y una tercera de colágeno-C4S (Qi Chen et al., 2012).
Se demostró que estas estructuras bicapa lograron una buena interfase, y que las diferencias
en la composición de ambas introdujo un comportamiento anisotrópico, asemejándose a la
naturaleza del tejido valvular nativo, y un cierto nivel de controlabilidad en cuanto a la
distribución celular en el scaffold. Se lograron implantes mecánica y biológicamente
calificados para su uso como válvulas cardíacas ingenieradas. Se prevé, respecto de estos
resultados, avanzar en la creación de scaffolds tricapa, asemejándose aún más a la estructura
natural del tejido valvular (Qi Chen et al., 2013).
Injerto trilaminar:
Las estrategias in situ no permiten el uso de polímeros de rápida reabsorción, ya que implican
una rápida degradación de las propiedades mecánicas con pérdida de la funcionalidad de la
válvula, arriesgando la vida del paciente. Pueden usarse entónces scaffolds tricapa, con
diferentes grados de absorción por capa. Una propuesta utilizó un lado luminal de PGA +
colágeno microesponjoso, una capa central de policaprolactona y el exterior de ácido poli-L-
láctico tejido. Todos estos materiales son biocompatibles y biodegradables. Se espera que la
estructura porosa del PGA y la esponja colágena tengan un rol crucial en promover la
recelularización in situ del implante. La capa tejida externa tiene como fin reforzar el implante,
y la capa intermedia de policaprolactona une ambas capas (Torikai, 2008).
Se mostró que este tipo de válvula no generó trombosis ni aneurisma en ningún momento aún
sin suministro de drogas anticoagulantes. Los análisis histológicos y bioquímicos mostraron
excelente regeneración tisular in situ, con una monocapa endotelial, células musculares lisas,
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colágeno y elastina. Se comprobó una alta durabilidad, 12 meses sin signos de problemas en
animales. Uno de los problemas fue la persistencia de fibras de PLLA, necesarias en su
momento para resistencia mecánica, pero que deberían haber desaparecido, luego de la
generación de matriz extracelular propia del tejido neogenerado (Yokota, 2008).
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Dada la generación de ECM en la superficie basal de la capa celular, esta ultima puede
adherirse al tejido hospedador directamente, prescindiendo del uso de adhesivos o suturas.
Respecto al uso de scaffolds biodegradables o de scaffolds solubles, el método scaffoldless
también es ventajoso. Los scaffolds biodegradables ocasionan reacciones inflamatorias y
formación de tejido fibroso en su proceso de degradación, además de que por su naturaleza
altamente porosa, las células sembradas no tienen posibilidad de formar conexiones entre sí,
al quedar distanciadas físicamente. El uso de scaffolds en forma de geles (mezcla de
colágeno y células) ha demostrado mejorar el tejido cardíaco, pero igualmente las células no
logran conexiones físicas entre ellas. La técnica scaffoldless permite la formación de
volúmenes de tejido con células interconectadas y ECM basal, minimizando la respuesta
inflamatoria al no utilizar ninguna sustancia para soporte físico más que la misma ECM
generada por las células (ver figura) (Masuda, 2008).
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Figura 51: TE in situ de implantes vasculares (proceso muy similar al buscado en los
implantes valvulares). En A puede verse la invasión del implante por monocitos, atraídos por la
citoquina MCP1. En B continúa la infiltración celular, esta vez por parte de SMCs y ECs
atraídas por diversas citoquinas secretadas por los monocitos. Estos también secretan factor
VEGF, que estimula el crecimiento endotelial vascular. En C puede verse el tejido vivo
neoformado, con reabsorción total del scaffold (modificado de: Roh et al., 2010)
Es scaffold implantable requerido debe ser no trombogénico, no inmunogénico, bioabsorbible,
funcionalmente viable y capáz de población o repoblación por células huésped autólogas. El
reclutamiento celular debe ser controlado para que el tejido se desarrolle sin pérdida de
propiedades mecánicas y mejorando paulatinamente la funcionalidad. De este modo se
requieren scaffolds que recluten selectivamente células circulantes progenitoras, fomenten su
diferenciación y función adecuada y controlen la formación de tejido. Para esto se requieren
materiales “inteligentes” con señales y factores biológicos y buenas propiedades
biomecánicas (van Loon et al., 2013).
Una propuesta para permitir la señalización natural de los procesos de reabsorción y
desarrollo in situ es el control de la respuesta inflamatoria temprana que sobreviene al colocar
el implante, la cual puede guiar la futura formación de tejido. Esto se desprende de lo sugerido
al implantar scaffolds vasculares sembrados con BMCs humanas no inmunogénicas en
ratones, lo cual produjo la desaparición de estas células en cuestión de días. En su lugar, el
scaffold fue invadido por monocitos de ratón y posteriormente con células musculares lisas
(SMC) y células endoteliales (EC). Esto se debió en parte a la respuesta natural inflamatoria,
pero principalmente a la secrecíon de factores quemotácticos por parte de los BMC humanos
sembrados, atrayentes de monocitos, lo que sugiere que se pueden transformar scaffolds en
tejido vivo funcional a través del uso y modificación de los procesos inflamatorios de
remodelado tisular (Roh et al., 2010).
La injuria incurrida durante la implantación desencadena la respuesta inflamatoria
independientemente del material utilizado, ya que se produce por daño celular y disrupción
tisular. Esta respuesta puede aprovecharse si es adecuadamente modulada en su amplitud y
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la deformación volumétrica de la válvula, obteniendose valores realistas. Por otro lado, para
evitar ensayos destructivos se propusieron análisis numéricos inversos, de carácter
experimental, que permiten cuantificar dichas propiedades de forma no invasiva y no
destructiva. Los resultados obtenidos de los ensayos reales sobre 6 válvulas se contrastaron
con los calculados, validándose el método propuesto. Además, este algoritmo diseñado
permite el trabajo en tiempo real, y puede ser utilizado para monitorear y controlar la evolución
de las propiedades mecánicas durante el cultivo del implante (Kortsmit ert al., 2009)
c) Sólo estiramiento: En lugar de aplciarse flujos a través de las válvulas, el
acondicionamiento se produce mediante estiramiento. Como ventaja principal se encuentra la
facilidad para su control. La diferencia entre el comportamiento ante estímulos de estiramiento
dinámicos y estáticos del implante sólo es visible en una mayor producción de GAGs en el
caso dinámico. Para ambos casos se logró tejido más homogéneo con abundancia de
colágeno respecto de los controles. Como desventaja se logró menor número de células que
en los controles, lo que da a entender que no fomenta la proliferación celular sino sólo la
síntesis de ECM (Mol, 2006).
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G. CONCLUSIONES
Mediante este trabajo pudimos observar la enorme cantidad de información disponible sobre
el tema elegido, que sin embargo se encuentra muy dispersa. La realización de una
investigación bibliográfica termina siendo imprescindible para introducirnos en el tema y
obtener un enfoque general del estado del arte dentro del campo de la ingeniería tisular
aplicada a válvulas cardíacas. En este sentido, sólo después de haber revisado una gran
cantidad de bibliografía logramos compenetrarnos con la terminología y los conceptos usados
más ampliamente, para luego poder relacionarlos y volcarlos en un informe general.
Además, pudimos relacionar conceptos básicos de la asignatura con distintas aplicaciones
reales. En la lectura de papers y trabajos sobre el tema encontramos valiosa la visión general
que nos había aportado el estudio de las diferentes propiedades de los materiales y sus
utilidades.
Pensamos que, por un lado, los conceptos adquiridos pueden ser útiles como punto de partida
para una futura investigación en profundidad. Por otro lado, el método de investigación
aplicado resultará útil en nuestro futuro profesional, cuando necesitemos informarnos sobre
cualquier tema científico sobre el cual debamos trabajar. Asimismo, la metodología grupal
aporta un enfoque importante ya que los trabajos científicos en general requieren de la
participación de varios profesionales.
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Zhou, Shumin et al., 2010b, Nogo-B mediates HeLa cell adhession and motility through
binding of fibulin-5. Biochemical and Biophysical Research Communication, 2010, vol. 398, pp.
247-253.
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I. GLOSARIO
1.1. Glosario alfabetizado en Inglés
amphibolic: anfibólico: proceso que involucra reacciones catabólicas y anabólicas.
antigenicity: antigenicidad: particularidad del antígeno que hace que éste sea reconocido por
un determinado anticuerpo.
aptamers: aptámeros: Los aptámeros son oligonucleótidos de cadena sencilla con tamaños
entre 70 y 100 nucleótidos capaces de reconocer de forma específica y con alta afinidad a
varios tipos de moléculas diana mediante un plegamiento tridimensional de su cadena.
atherosclerotic plaques: placas de ateroma: Las placas de ateroma o ateromas son lesiones
focales que se inician en la capa íntima de una arteria.
autocrine: autócrino: se aplica a un tipo de secreción química que afecta a la misma célula
que secretó la sustancia, como una hormona, por ejemplo.
autolisis: autolisis: proceso biológico por el cual una célula se autodestruye, ya sea porque no
es más necesaria o porque está dañada y debe prevenirse un daño mayor.
azeotropic: azeotrópico: mezcla líquida de dos o más compuestos químicos que hierven a
temperatura constante y que se comportan como si estuviesen formadas por un solo
componente.
bioactive: bioactivo: Relativo o perteneciente a una sustancia que tiene un efecto en el tejido
vivo o causa una reacción en él.
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chemotaxis: quimiotaxis: fenómeno en el cual las bacterias y otras células de organismos uni
o multicelulares dirigen sus movimientos de acuerdo con la concentración de ciertas
sustancias químicas en su medio ambiente.
endocrine: endócrino: propiedad de las glándulas también llamadas ‘de secreción interna’, que
vierten sus secreciones directamente a la sangre, o relacionado con ellas.
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fusiform: fusiforme: en forma de huso (antiguo instrumento utilizado para hilar); con forma
alargada, elipsoide, y con las extremidades más estrechas que el centro.
immiscible: inmiscible: sustancias que en ninguna proporción pueden formar una fase
homogénea.
machinable: maquinable: se aplica a los materiales que soportan los procesos de maquinado,
tales como fresado, torneado, limado, etc.
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proteolytic: proteolítico: Dícese de una sustancia que disuelve las materias albuminoides o
proteicas.
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Genotípico: genotypic.
Glicosilada: glycosylated.
Hemodinámica: hemodynamic.
Hemostasia: hemostasis.
Hidrofilico: hydrophilic.
Hidrofobico: hydrophobic.
Hipertrofia: hypertrophy.
Hipotónica: hypotonic.
Inmiscible: immiscible.
Isquemia: ischemia.
Lixiviación: leaching .
Maquinable: machinable.
Metaplasia: metaplasia.
Metaplasia condroide: chondroid metaplasia.
Mitogénesis: mitogenesis.
Nanofibras: nanofibers.
Neovascularización: neovascularization.
Nucleación: Nucleation.
Osteogénicos: osteogenic.
Patologia: pathology.
Placas de ateroma: atherosclerotic plaques.
Prolapso valvular: valve prolapse.
Proteolíticas: proteolytic.
Quiescentes: quiescent.
Quimiotaxis: chemotaxis.
Regurgitación: regurgitation.
Sinterización: sintering.
Taquicardia: tachycardia.
Tensoactivo: surfactant.
Termoplástico: thermoplastic.
Tromboembolismo: thromboembolism.
Trombosis: thrombosis.
Tumorogénesis: tumorigenesis.
Valvuloplastia: valvuloplasty.
Yuxtácrina: juxtacrine.
Zoonosis: zoonoses.
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J. CLAVES DE BÚSQUEDA
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K. ANEXOS
K.1. Títulos y resúmenes
Alfieri, Christina; 2010, Wnt signaling in heart valve development and osteogenic gene
induction. Developmental Biology, 2010, vol. 338, pp. 127-135.
Abstract:
Wnt signaling mediated by β-catenin has been implicated in early endocardial cushion
development, but its roles in later stages of heart valve maturation and homeostasis have not
been identified. Multiple Wnt ligands and pathway genes are differentially expressed during
heart valve development. At E12.5, Wnt2 is expressed in cushion mesenchyme, whereas Wnt4
and Wnt9b are predominant in overlying endothelial cells. At E17.5, both Wnt3a and Wnt7b are
expressed in the remodeling atrioventricular (AV) and semilunar valves. In addition, the
TOPGAL Wnt reporter transgene is active throughout the developing AV and semilunar valves
at E16.5, with more localized expression in the stratified valve leaflets after birth. In chicken
embryo aortic valves, genes characteristic of osteogenic cell lineages including periostin,
osteonectin, and Id2 are expressed specifically in the collagen-rich fibrosa layer at E14.
Treatment of E14 aortic valve interstitial cells (VICs) in culture with osteogenic media results in
increased expression of multiple genes associated with bone formation. Treatment of VIC with
Wnt3a leads to nuclear localization of β-catenin and induction of periostin and matrix gla
protein but does not induce genes associated with later stages of osteogenesis. Together,
these studies provide evidence for Wnt signaling as a regulator of endocardial cushion
maturation as well as valve leaflet stratification, homeostasis, and pathogenesis.
Ankeny, R.F.; Ankeny, C.J.; Nerem, R.M.; Jo, H., 2012, Maturing EPCs into endothelial cells:
may the force be with the EPCs: focus on "Fluid shear stress induces differentiation of
circulating phenotype endothelial progenitor cells". Am J Physiol Cell Physiol, 2012, vol 303,
no. 6, pp. C589-C591.
Abstract:
Endothelial progenitor cells (EPCs) are a unique cell type found circulating in the peripheral
blood with the capacity to become mature endothelial cells. EPCs can be released from many
sources including the bone marrow, adipose tissue, the vessel wall, as well as potentially the
spleen, liver, and intestine (4). Currently, there are two main methods of isolating EPCs: 1)
separation during in vitro cell culture by morphological properties/differences, such as time of
outgrowth, or 2) cell sorting with specific markers (9). More specifically, cell sorting relies on
key markers, such as CD133, CD34, vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor 2
(VEGF-R2), or a combination of these markers to isolate and purify an EPC population (12).
There still remains debate with respect to the optimal isolation and culturing procedures;
however, there is a consensus regarding the therapeutic potential of EPCs as a cell source for
regenerative medicine, including for both replacement and endogenous repair.
Asahara, Takayuki et al., 1999, Bone Marrow Origin of Endothelial Progenitor Cells
Responsible for Postnatal Vasculogenesis in Physiological and Pathological
Neovascularization, Circulation Research, 1999, no. 85, pp 221-228
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Abstract:
Circulating endothelial progenitor cells (EPCs) have been isolated in peripheral blood of adult
species. To determine the origin and role of EPCs contributing to postnatal vasculogenesis,
transgenic mice constitutively expressing b-galactosidase under the transcriptional regulation
of an endothelial cell–specific promoter (Flk-1/LZ or
Tie-2/LZ) were used as transplant donors. Localization of EPCs, indicated by flk-1 or tie-2/lacZ
fusion transcripts, were identified in corpus luteal and endometrial neovasculature after
inductive ovulation. Mouse syngeneic colon cancer cells (MCA38) were implanted
subcutaneously into Flk-1/LZ/BMT (bone marrow transplantation) and Tie-2/LZ/BMT mice;
tumor samples harvested at 1 week disclosed abundant flk-1/lacZ and tie-2/lacZ fusion
transcripts, and sections stained with X-gal demonstrated that the neovasculature of the
developing tumor frequently comprised Flk-1– or Tie-2–expressing EPCs. Cutaneous wounds
examined at 4 days and 7 days after skin removal by punch biopsy disclosed EPCs
incorporated into foci of neovascularization at high frequency. One week after the onset of
hindlimb ischemia, lacZ-positive EPCs were identified incorporated into capillaries among
skeletal myocytes. After permanent ligation of the left anterior descending coronary artery,
histological samples from sites of myocardial infarction demonstrated incorporation of EPCs
into foci of neovascularization at the border of the infarct. These findings indicate that postnatal
neovascularization does not rely exclusively on sprouting from preexisting blood vessels
(angiogenesis); instead, EPCs circulate from bone marrow to incorporate into and thus
contribute to postnatal physiological and pathological neovascularization, which is consistent
with postnatal vasculogenesis.
Attaran, Saina et al., 2010, Identification of low circulatory transforming growth factor beta-1
in patients with degenerative heart valve disease. Interactive Cardiovascular and Thoracic
Surgery, 2010, vol. 11, pp.791-793.
Abstract:
Transforming growth factor β-1 (TGF-β1) is an immunosuppressive cytokine. It exerts
cardioprotection during acute myocardial ischaemia, promoting healing of the injured
myocytes. Lower plasma concentrations of TGF-β1 have been identified in patients with
coronary artery disease (CAD) compared to those with normal coronary arteries. We
measured plasma TGF-β1 concentrations in patients with CAD compared to those with
degenerative heart valves (DHVs) and normal coronary arteries. The mean concentration of
TGF-β1 in patients with valvular heart disease was significantly lower (18.67 μg/l) than the
mean in the coronary artery bypass graft (CABG) group (26.46 μg/l). There was no correlation
between the patient characteristics and preoperative concentration of TGF-β1. It is possible
that the lower plasma concentration of TGF-β1 in patients with valvular heart disease and the
lack of its regulatory effect results in the increased inflammation and calcification seen in
DHVs.
Azhar, M. et al., 2011, Transforming growth factor Beta2 is required for valve remodeling
during heart development. Dev. Dyn., 2010, vol. 10.
Abstract:
Although the function of transforming growth factor beta2 (TGFβ2) in epithelial mesenchymal
transition (EMT) is well studied, its role in valve remodeling remains to be fully explored. Here,
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Bastian, F. et al., 2008, IgG deposition and activation of the classical complement pathway
involved in the activation of human granulocytes by decellularized porcine heart valve tissue.
Biomaterials, 2008, vol. 29, pp. 1824-1832.
Abstract:
Decellularization treatment of heart valves has been thought to eliminate tissue
immunogenicity. Early failure of tissue-engineered xenogeneic heart valves was seen in
children and has been a major drawback in this promising field of research. This study was
designed to characterize the effects of acellular porcine heart valve tissue on immune
activation in vitro. Incubation of decellularized porcine tissue with human plasma led to
adsorption of IgG, activation of the classical complement pathway and adhesion of activated
polymorphonuclear leukocytes (PMN). This inflammatory response was strongly inhibited by
proteins extracted from native porcine tissue which might indicate that inhibitors of PMN
activation present in the extracellular matrix (ECM) are lost during the decellularization
process.
Boerboom, R.; Rubbens, M.; Driessen, N.; Bouten, C.; Baaijens, F., 2008, Effect of strain
magnitude of the tissue properties of engineered cardiovascular constructs. Ann. Biomed.
Eng., 2008, vol. 36, pp. 244-253.
Abstract:
Mechanical loading is a powerful regulator of tissue properties in engineered cardiovascular
tissues. To ultimately regulate the biochemical processes, it is essential to quantify the effect of
mechanical loading on the properties of engineered cardiovascular constructs. In this study the
Flexercell FX-4000T (Flexcell Int. Corp., USA) straining system was modified to simultaneously
apply various strain magnitudes to individual samples during one experiment. In addition,
porous polyglycolic acid (PGA) scaffolds, coated with poly-4-hydroxybutyrate (P4HB), were
partially embedded in a silicone layer to allow long-term uniaxial cyclic mechanical straining of
cardiovascular engineered constructs. The constructs were subjected to two different strain
magnitudes and showed differences in biochemical properties, mechanical properties and
organization of the microstructure compared to the unstrained constructs. The results suggest
that when the tissues are exposed to prolonged mechanical stimulation, the production of
collagen with a higher fraction of crosslinks is induced. However, straining with a large strain
magnitude resulted in a negative effect on the mechanical properties of the tissue. In addition,
dynamic straining induced a different alignment of cells and collagen in the superficial layers
compared to the deeper layers of the construct. The presented model system can be used to
systematically optimize culture protocols for engineered cardiovascular tissues.
Bourguignon, Lilly et al., 2011, Interaction of Low Molecular Weight Hyaluronan with CD44
and Toll-Like Receptors Promotes the Actin Filament-Associated Protein 110-Actin Binding
and MyD88-NFjB Signaling Leading to Proinflammatory Cytokine/Chemokine Production and
Breast Tumor Invasion. Cytoeskeleton, 2011, vol. 68, pp. 671-693.
Abstract:
Both high and low molecular weight hyaluronan (HMW-HA vs. LMW-HA) exist in various
tissues and cells. In this study, we investigated LMW-HA-mediated CD44 interaction with Toll-
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like receptors (TLRs), the actin filament-associated protein (AFAP-110), and a myeloid
differentiation factor (MyD88) in breast tumor cells (MDA-MB-231 cells). Our data indicate that
LMW-HA (but not HMW-HA) preferentially stimulates a physical association between CD44
and TLRs followed by a concomitant recruitment of AFAP-110 and MyD88 into receptor-
containing complexes in breast tumor cells. LMW-HA-activated AFAP-110 then binds to
filamentous actin (F-actin) resulting in MyD88/nuclear factor-κB (NF-κB) nuclear translocation,
NF-κB-specific transcription, and target gene [interleukine 1β and interleukine-8 (IL-1β and IL-
8)] expression. These signaling events lead to proinflammatory cytokine/chemokine production
in the breast tumor cells. AFAP-110-F-actin (activated by LMW-HA) also promotes tumor cell
invasion. Downregulation of AFAP-110 or MyD88 by transfecting breast tumor cells with AFAP-
110 siRNA or MyD88 siRNA, respectively not only blocks the ability of LMW-HA to stimulate
AFAP-110-actin function, but also impairs MyD88-NF-κB nuclear translocation and NF-κB
transcriptional activation. Consequently, both IL-1β/IL-8 production and tumor cell invasion are
impaired. Taken together, these findings suggest that LMW-HA plays an important role in
CD44-TLR-associated AFAP-110-actin interaction and MyD88-NF-κB signaling required for
tumor cell behaviors, which may contribute to the progression of breast cancer.
Bouten, C. et al., 2011, Substrates for cardiovascular tissue engineering. Advanced Drug
Delivery Reviews, 2011, vol. 63, pp. 221-241.
Abstract:
Cardiovascular tissue engineering aims to find solutions for the suboptimal regeneration of
heart valves, arteries and myocardium by creating ‘living’ tissue replacements outside (in vitro)
or inside (in situ) the human body. A combination of cells, biomaterials and environmental cues
of tissue development is employed to obtain tissues with targeted structure and functional
properties that can survive and develop within the harsh hemodynamic environment of the
cardiovascular system. This paper reviews the up-to-date status of cardiovascular tissue
engineering with special emphasis on the development and use of biomaterial substrates. Key
requirements and properties of these substrates, as well as methods and readout parameters
to test their efficacy in the human body, are described in detail and discussed in the light of
current trends toward designing biologically inspired microenviroments for in situ tissue
engineering purposes.
Carruthers, Christopher et al., 2011, Gene expression and collagen fiber micromechanical
interactions of semilunar heart valve interstitial cell. Cellular and Molecular Bioingeneering,
2012, vol. 5, no. 3, pp. 254-265.
Abstract:
The semilunar (aortic and pulmonary) heart valves function under dramatically different
hemodynamic environments, and have been shown to exhibit differences in mechanical
properties, extracellular matrix (ECM) structure, and valve interstitial cell (VIC) biosynthetic
activity. However, the relationship between VIC function and the unique micromechanical
environment in each semilunar heart valve remains unclear. In the present study, we
quantitatively compared porcine semilunar mRNA expression of primary ECM constituents,
and layer- and valve-specific VIC–collagen mechanical interactions under increasing
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transvalvular pressure (TVP). Results indicated that the aortic valve (AV) had a higher fibrillar
collagen mRNA expression level compared to the pulmonary valve (PV). We further noted that
VICs exhibited larger deformations with increasing TVP in the collagen rich fibrosa layer, with
substantially smaller changes in the spongiosa and ventricularis layers. While the VIC–
collagen micromechanical coupling varied considerably between the semilunar valves, we
observed that the VIC deformations in the fibrosa layer were similar at each valve’s respective
peak TVP. This result suggests that each semilunar heart valve’s collagen fiber microstructure
is organized to induce a consistent VIC deformation under its respective diastolic TVP.
Collectively, our results are consistent with higher collagen biosynthetic demands for the AV
compared to the PV, and that the valvular collagen microenvironment may play a significant
role in regulating VIC function.
Chen, Qi et al., 2012, Collagen-based scaffolds for potential application of heart valve tissue
engineering. J. Tissue Sci. Eng., vol. S11:003, pp. 1-6.
Abstract:
Collagen and elastin are two major components of the extracellular matrix of heart valves. This
work examines bi-layer scaffolds made of collagen and elastin for potential use in the tissue
engineering of heart valves, by investigating the effects of the layered structure on the
mechanical and biological properties. The scaffolds showed anisotropic bending moduli
depending on the loading directions (lower when with curvature than against curvature), which
mimicked the characteristic behaviour of the native heart valves. The interaction of
cardiosphere-drived cells with the scaffolds was characterized by scanning electron
microscopy and multiphoton microscopy, and an asymmetrical cell distribution was observed.
The bi-layer scaffolds have represented a forwarding step to the tri-layer scaffolds that more
closely resemble the native heart valves.
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of the polymeric chains and some defects in the inorganic component were observed.
Moreover, the radiation sensitivity of the composites proved almost the same under the two
different atmospheres.
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concepts in the field of cardiovascular tissue engineering that will eliminate the need for in vitro
construction of autologous heart valves.
Freed, Lisa E. et al., 2009, Advanced Material Strategies for Tissue Engineering Scaffolds,
Advanced Materials, 2009, no 21, pp 3410-3418
Abstract:
Tissue engineering seeks to restore the function of diseased or damaged tissues through the
use of cells and biomaterial scaffolds. It is now apparent that the next generation of functional
tissue replacements will require advanced material strategies to achieve many of the important
requirements for long-term success. Here, we provide representative examples of engineered
skeletal and myocardial tissue constructs in which scaffolds were explicitly designed to match
native tissue mechanical properties as well as to promote cell alignment. We discuss recent
progress in microfluidic devices that can potentially serve as tissue engineering scaffolds,
since mass transport via microvascular-like structures will be essential in the development of
tissue engineered constructs on the length scale of native tissues. Given the rapid evolution of
the field of tissue engineering, it is important to consider the use of advanced materials in light
of the emerging role of genetics, growth factors, bioreactors, and other technologies.
Frese, Laura et al., 2012, Adipose fat derived tissue-engineered heart valves. QScience
Proceedings, 2012, Session 8 – New approaches to tissue engineering.
Abstract:
A major challenge in tissue engineering of heart valves is the in vitro creation of mature tissue
structures compliant with the native valve function. Concerning the remodeling capacity of the
extracellular matrix (ECM), various cell types have been investigated, including prenatal cells,
umbilical cord and vascular derived cells. The pluripotency and availability of human
mesenchymal stem cells has made them highly attractive for tissue engineering purposes.
However, for clinical use, adult bone marrow derived mesenchymal stem cells (MSC) are
suboptimal due to the highly invasive donation procedure, and the decline in MSC number and
differentiation potential with increasing age of the patient. Adipose derived stem cells (ADSC)
represent an interesting alternative of mesodermal origin. The easy and repeatable access to
subcutaneous adipose tissue and the simple isolation procedures provide a clear advantage.
Here, we investigate the suitability of ADSC as a novel cell source for tissue engineered heart
valves (TEHV). Tissue Engineered (TE) heart valve leaflets (n=6) were produced, based on
PGA/P4HB scaffolds seeded with human ADSC isolated from fat tissue excisions from plastic
surgery. To stimulate tissue formation and induce matrix alignment, the TE leaflets were
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cultivated in dynamic strain bioreactors for 4 weeks. We subsequently reseeded the cultivated
valves with ADSC derived endothelial cells. Differentiation into endothelial-like cells was
induced by cultivation of ADSC in the presence of vascular endothelial growth factor. To
determine the ECM composition of the TE leaflets, biochemical analyses for
glycosaminoglycans (GAG), hydroxyproline (HYP) and DNA were performed. To further
evaluate the microstructural features, tissue samples of TE leaflets were analyzed by stainings
as well as by scanning electron microscopy. The mechanical properties of the ADSC derived
TE leaflets were analyzed using a biaxial tensile tester. TE leaflets based on ADSC showed a
homogenous vital cell distribution throughout the whole leaflet structure and the formation of a
confluent endothelial lining. Furthermore, a mechanically stable matrix with GAG and collagen
was demonstrated. These results indicate that ADSC represent an interesting alternative
autologous mesenchymal human cell source with clinical relevance due to their easy
accessibility and excellent proliferation and tissue formation capacities.
Gerson, Cindy et al., 2012, Structural integrity of collagen and elastin in SynerGraft
decellularized-cryopreserved human heart valves. Cryobiology, 2012, vol. 64, pp. 33-42.
Abstract:
SynerGraft® (SG) decellularized–cryopreserved cardiac valve allografts have been developed
to provide a valve replacement option that has reduced antigenicity, retained structural
integrity, and the ability to be stored long-term until needed for implantation. However, it is
critical to ensure that both the SG processing and cryopreservation of these allografts do not
detrimentally affect the extracellular matrix architecture within the tissue. This study evaluates
the effects of SG decellularization and subsequent cryopreservation on the extracellular matrix
integrity of allograft heart valves. Human aortic and pulmonary valves were trisected, with one-
third of each either left fresh (no further processing after dissection), decellularized, or
decellularized and cryopreserved. Two-photon laser scanning confocal microscopy was used
to visualize collagen and elastin in leaflets and conduits. The optimized percent laser
transmission (OPLT) required for full dynamic range imaging of each site was determined, and
changes in OPLT were used to infer changes in collagen and elastin signal intensity. Collagen
fiber crimp period and collagen and elastin fiber diameter were measured in leaflet tissue.
Statistically significant differences in OPLT and the dimensional characteristics of collagen and
elastin in study groups were determined through single factor ANOVA. The majority of donor-
aggregated average OPLT observations showed no statistically significant differences among
all groups, indicating no difference in collagen or elastin signal strength. Morphometric analysis
of collagen and elastin fibers revealed no significant alterations in treated leaflet tissues
relative to fresh tissues. Collagen and elastin structural integrity within allograft heart valves
are maintained through SynerGraft® decellularization and subsequent cryopreservation.
Gómez-Guillén, M.C. et al., 2011, Functional and bioactive properties of collagen and gelatin
from alternative sources: a review. Food Hydrocolloids, 2011, vol. 25, pp. 1813-1827.
Abstract:
The rising interest in the valorisation of industrial by-products is one of the main reasons why
exploring different species and optimizing the extracting conditions of collagen and gelatin has
attracted the attention of researchers in the last decade. The most abundant sources of gelatin
are pig skin, bovine hide and, pork and cattle bones, however, the industrial use of collagen or
gelatin obtained from non-mammalian species is growing in importance. The classical food,
photographic, cosmetic and pharmaceutical application of gelatin is based mainly on its gel-
forming properties. Recently, and especially in the food industry, an increasing number of new
applications have been found for gelatin in products such as emulsifiers, foaming agents,
colloid stabilizers, biodegradable film-forming materials and micro-encapsulating agents, in line
with the growing trend to replace synthetic agents with more natural ones. In the last decade, a
large number of studies have dealt with the enzymatic hydrolysis of collagen or gelatin for the
production of bioactive peptides. Besides exploring diverse types of bioactivities, of an
antimicrobial, antioxidant or antihypertensive nature, studies have also focused on the effect of
oral intake in both animal and human models, revealing the excellent absorption and
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Isenberg, Brett et al., 1993, Long-Term Cyclic Distention Enhances the Mechanical
Properties of Collagen-Based Media-Equivalents, Annals of Biomedical Engineering, 2003, Vol
31, pp 937-949
Abstract:
In this study, we sought to identify the key parameters involved in long-term cyclic distension
(CD) as they pertain to the development of collagen-based media-equivalents (MEs). By using
only highly compacted, cross-linked constructs, we avoided the complicating issues of
irrecoverable creep and transient alignment, and isolated the effects of cyclic mechanical
loading on ME development. Our system allowed us to study this development over a wide
range of parameters including strain amplitude, pulse frequency, pulse shape, and culture
time. We found that in most cases involving cyclic distension, MEs were both stronger and
stiffer than constructs that were grown under static conditions. The mechanical properties were
not significantly different from static controls after two weeks of CD, however, five weeks of CD
was sufficient to note significant increases in both stiffness and strength. The strain, stretch
time, and relaxation time were all important variables in determining ME mechanical
properties. While we were unable to detect a significant net change in the amount of total
collagen, we observed significant deposition of insoluble elastin in our CDMEs, something that
has never been previously reported using adult smooth muscle cells. Finally, these changes in
ME development did not depend on the age of the MEs prior to the initiation of CD.
Kadner A, Hoerstrup SP, Zund G, et al., 2002, A new source for cardiovascular tissue
engineering: human bone marrow stromal cells. Eur J Cardiothorac Surg, 2002; vol. 21, pp.
1055-60.
Abstract:
Objective: Vascular-derived cells represent an established cell source for tissue engineering of
cardiovascular constructs. Previously, cell isolation was performed by harvesting of vascular
structures prior to scaffold seeding. Marrow stromal cells (MSC) demonstrate the ability to
differentiate into multiple mesenchymal cell lineages and would offer an alternative cell source
for tissue engineering involving a less invasive harvesting technique. We studied the feasibility
of using MSC as an alternative cell source for cardiovascular tissue engineering. Methods:
Human MSC were isolated from bone marrow and expanded in culture. Subsequently MSC
were seeded on bioabsorbable polymers and grown in vitro. Cultivated cells and seeded
polymers were studied for cell characterization and tissue formation including extracellular
matrix production. Applied methods comprised flow cytometry, histology,
immunohistochemistry, transmission (TEM) and scanning electron microscopy (SEM), and
biochemical assays. Results: Isolated MSC demonstrated fibroblast-like morphology.
Phenotype analysis revealed positive signals for alpha-smooth muscle actin and vimentin.
Histology and SEM of seeded polymers showed layered tissue formation. TEM demonstrated
formation of extracellular matrix with deposition of collagen fibrils. Matrix protein analysis
showed production of collagen I and III. In comparison to vascular-derived cell constructs
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Lichtenberg, A. et al., 2007, Biological scaffolds for heart valve tissue engineering. Methods
in Molecular Medicine, 2007, Vol. 140, pp. 309-317.
Abstract:
Tissue engineering might bear promising solutions for overcoming the limitations of biological
and mechanical heart valve substitutes. The concept of heart valve tissue engineering bases
on decellularized biological matrices, as removal of cellular components might reduce
immunological reactions, which are thought to be responsible for accelerated valvular graft
deterioration and their subsequent repopulation with autologous cells, which leads to tissue
integrity and continuous remodeling. Here, we report a method for efficient removal of cells
from ovine heart valve tissue (including cusp, wall, and myocardial cuff) by detergents for the
generation of biological valvular scaffolds.
Masuda, Shinako et al., 2008, Cell sheet engineering for heart tissue repair, Advanced Drug
Delivery Reviews, 2008, no 60, pp 277-285
Abstract:
Recently, myocardial tissue engineering has emerged as one of the most promising therapies
for patients suffering from severe heart failure. Nevertheless, conventional methods in tissue
engineering involving the seeding of cells into biodegradable scaffolds have intrinsic
shortcomings, such as inflammatory reactions and fibrous tissue formation caused by scaffold
degradation. On the other hand, we have developed cell sheet engineering as scaffoldless
tissue engineering, and applied it for myocardial tissue engineering. Using temperature-
responsive culture surfaces, cells can be harvested as intact sheets and cell-dense thick
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tissues are constructed by layering these cell sheets. Myocardial cell sheets non-invasively
harvested from temperature-responsive culture surfaces are successfully layered, resulting in
electrically communicative 3-dimensional (3-D) cardiac constructs. Transplantation of cell
sheets onto damaged hearts improved heart function in several animal models. In this review,
we summarize the development of myocardial tissue engineering using cell sheets harvested
from temperature-responsive culture surfaces and discuss about future views.
Mol, Anita et al., 2009, Tissue engineering of heart valves: advances and current challenges.
Expert Rev. Med. Devices, 2009, vol. 6, no. 3, pp. 259-275.
Abstract:
It is estimated that the number of patients requiring heart valve replacement will triple over the
next five decades. None of the current replacement valves can fully restore native valve
function because they lack growth and remodeling capabilities. Heart valve tissue engineering
is a promising technology to overcome these limitations. Various approaches are being
employed, either aimed at development of the valve substitute in vitro or at the use of the
regenerative potential of the body (in situ) for the tissue culture phase. This review provides an
overview of the progress within both the in vitro and in situ tissue engineering approaches for
trileaflet heart valve tissue engineering. Current challenges with these approaches are
discussed, focusing in particular on the use of synthetic scaffold materials.
Rotmans, J.; Heyligers, J.; Verhagen, H.; 2005, In vivo cell seeding with anti-CD34
antibodies succesfully accelerates endothelialization but stimulates intimal hiperplasia in
porcine arteriovenous expanded polytetrafluorethylene grafts. Circulation, vol. 112, no. 1, pp.
12-18.
Abstract:
Background— The patency of AV expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) grafts for
hemodialysis is impaired by intimal hyperplasia (IH) at the venous outflow tract. The absence
of a functional endothelial monolayer on the prosthetic grafts is an important stimulus for IH. In
the present study, we evaluated the feasibility of capturing endothelial progenitor cells in vivo
using anti-CD34 antibodies on ePTFE grafts to inhibit IH in porcine AV ePTFE grafts.
Methods and Results— In 11 pigs, anti-CD34–coated ePTFE grafts were implanted between
the carotid artery and internal jugular vein. Bare ePTFE grafts were implanted at the
contralateral side. After 3 (n=2) or 28 (n=9) days, the pigs were terminated, and the AV grafts
were excised for histological analysis and SEM. At 3 and 28 days after implantation, 95% and
85% of the coated graft surface was covered by endothelial cells. In contrast, no cell coverage
was observed in the bare graft at 3 days, whereas at 28 days, bare grafts were partly covered
with endothelial cells (32%; P=0.04). Twenty-eight days after implantation, IH at the venous
anastomosis was strongly increased in anti-CD34–coated grafts (5.96±1.9 mm2) compared
with bare grafts (1.70±0.4 mm2; P=0.03). This increase in IH coincided with enhanced cellular
proliferation at the venous anastomosis.
Conclusions— Autoseeding with anti-CD34 antibodies results in rapid endothelialization within
72 hours. Despite persistent endothelial graft coverage, IH at the outflow tract is increased
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profoundly at 4 weeks after implantation. Further modifications are required to stimulate the
protective effects of trapped endothelial cells.
Syedain, Zeeshan; Tranquillo, Robert, 2009, Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-
engineered heart valves. Biomaterials, 2009, vol. 30, pp. 4078-4084.
Abstract:
A tissue-engineered heart valve (TEHV) represents the ultimate valve replacement, especially
for juvenile patients given its growth potential. To date, most TEHV bioreactors have been
developed based on pulsed flow of culture medium through the valve lumen to induce strain in
the leaflets. Using a strategy for controlled cyclic stretching of tubular constructs reported
previously, we developed a controlled cyclic stretch bioreactor for TEHVs that leads to
improved tensile and compositional properties. The TEHV is mounted inside a latex tube,
which is then cyclically pressurized with culture medium. The root and leaflets stretch
commensurately with the latex, the stretching being dictated by the stiffer latex and thus
controllable. Medium is also perfused through the lumen at a slow rate in a flow loop to provide
nutrient delivery. Fibrin-based TEHVs prepared with human dermal fibroblasts were subjected
to three weeks of cyclic stretching with incrementally increasing strain amplitude. The TEHV
possessed the tensile stiffness and stiffness anisotropy of leaflets from sheep pulmonary
valves and could withstand cyclic pulmonary pressures with similar distension as for a sheep
pulmonary artery.
Thevenot, Paul et al., 2010, The effect of incorporation of SDF-1alfa into PLGA scaffolds on
stem cell recruitment and the inflammatory response. Biomaterials, 2010, vol. 31, no. 14, pp.
3997-4008.
Abstract:
Despite significant advances in the understanding of tissue responses to biomaterials, most
implants are still plagued by inflammatory responses which can lead to fibrotic encapsulation.
This is of dire consequence in tissue engineering, where seeded cells and bioactive
components are separated from the native tissue, limiting the regenerative potential of the
design. Additionally, these interactions prevent desired tissue integration and angiogenesis,
preventing functionality of the design. Recent evidence supports that mesenchymal stem cells
(MSC) and hematopoietic stem cells (HSC) can have beneficial effects which alter the
inflammatory responses and improve healing. The purpose of this study was to examine
whether stem cells could be targeted to the site of biomaterial implantation and whether
increasing local stem cell responses could improve the tissue response to PLGA scaffold
implants. Through incorporation of SDF-1α through factor adsorption and mini-osmotic pump
delivery, the host-derived stem cell response can be improved resulting in 3X increase in stem
cell populations at the interface for up to 2 weeks. These interactions were found to
significantly alter the acute mast cell responses, reducing the number of mast cells and
degranulated mast cells near the scaffold implants. This led to subsequent downstream
reduction in the inflammatory cell responses, and through altered mast cell activation and stem
cell participation, increased angiogenesis and decreased fibrotic responses to the scaffold
implants. These results support that enhanced recruitment of autologous stem cells can
improve the tissue responses to biomaterial implants through modifying/bypassing
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inflammatory cell responses and jumpstarting stem cell participation in healing at the implant
interface.
Torikai, Kei et al., 2008, A self-renewing, tissue-engineered vascular graft for arterial
reconstruction. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, 2008, vol. 136, no. 1, pp.
37-45.
Abstract:
Various tissue-engineered vascular grafts have been studied to overcome the clinical
disadvantages of conventional prostheses. Previous tissue-engineered vascular grafts have
generally required preoperative cellular manipulation or use of bioreactors to improve
performance, and their mechanical properties have been insufficient. We focused on the
concept of in situ cellularization and developed a tissue-engineered vascular graft for arterial
reconstruction that would facilitate renewal of autologous tissue without any pretreatment.
The graft comprised an interior of knitted polyglycolic acid compounded with collagen to supply
a scaffold for tissue growth and an exterior of woven poly-l-lactic acid for reinforcement. All
components were biocompatible and biodegradable, with excellent cellular affinity. The grafts,
measuring 10 mm in internal diameter and 30 mm in length, were implanted into porcine
aortas, and their utility was evaluated to 12 months after grafting.
All explants were patent throughout the observation period, with no sign of thrombus formation
or aneurysmal change. Presence in the neomedia of endothelialization with proper integrity
and parallel accumulation of functioning smooth muscle cells, which responded to vasoreactive
agents, was confirmed in an early phase after implantation. Sufficient collagen synthesis and
lack of elastin were quantitatively demonstrated. Dynamic assessment and long-term results of
the in vivo study indicated adequate durability of the implants.
Conclusion:
The graft showed morphologic evidence of good in situ cellularization, satisfactory durability to
withstand arterial pressure for 12 postoperative months, and the potential to acquire
physiologic vasomotor responsiveness. These results suggest that our tissue-engineered
vascular graft shows promise as an arterial conduit prosthesis.
Zhou, Shumin et al., 2010b, Nogo-B mediates HeLa cell adhession and motility through
binding of fibulin-5. Biochemical and Biophysical Research Communication, 2010, vol. 398, pp.
247-253.
Abstract:
Nogo-B is a known regulator of neural functions and plays an important role in cell adhesion
and migration. To our knowledge, the molecular mechanism behind its regulation of cell motility
is still unknown. Here, we identified Fibulin-5, a secreted extracellular matrix protein, as a
binding partner of Nogo-B. Using HeLa cells as a model, we found that Nogo-B and Fibulin-5
co-localize in the cytoplasm and plasma membrane. Furthermore, in HeLa cells that
overexpress Nogo-B, cell migration and invasion was promoted by the elevated secretion of
Fibulin-5. Thus, identification of the Nogo-B binding protein Fibulin-5 may contribute to uncover
the pathway in which Nogo-B regulates tumor cell movement.
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