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Vacunas orales : Eficiencia de incorporación

en los alimentos y resultados en ISA Y SRS

Sandra Arcos Peña.


Medico Veterinario-Ingeniero Acuícola
Laboratorio Centrovet
32 Años

“Laboratorio Centrovet”. Empresa nacional, que desde


1979 se dedica a la investigación, desarrollo y producción en salud animal.
Número de registros por empresas
productoras de vacunas

Empresa Proveedora Preparación antigénica registradas


Agrovet Ltda. 5
Bayer S.A. 2
Centrovet Ltda. 12
Intervet Chile Ltda. 2
Laboratorios Recalcine S.A. 3
Novartis Chile S.A. 10
Pharmaq AS Chile Ltda. 6
Schering Plough Cía. Ltda. 5
Veterquímica S.A. 2
TOTAL GENERAL 45
Planta de producción de vacunas

-18 profesionales y técnicos.

- Fabricación de acuerdo a
GMP e ISO9001:2008

Capacidad de producción
mes:

-28-30 millones de dosis


vacunas inyectables.
-25 millones de dosis de
vacunas orales.
Vacunas orales registradas (SAG) por
CENTROVET

• Vacuna contra p.salmonis, polvo


liofilizado oral: marzo 2009.
Reg. SAG N° 2027 BP

•Vacuna subunitaria contra ISA, polvo


liofilizado oral : Diciembre 2009
Reg SAG N° 2063 BP

•Próximamente: oral SRS + ISA


IPN oral
Programa seguimiento inmunológico

Agua Dulce Engorda


1. Inmunidad Humoral (Títulos de
anticuerpos específicos)
2. Inmunidad celular (Títulos de
Linfocitos T)
3. Portación o infección del
600 UTA APROX.
patógeno
4. Reacciones Adversas (RAM)
Resultado Curva Ac específicos contra P. salmonis-ISAv
1.40
Absorbancia 450 nm (UR)

1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600
UTA post vacunación
El problema del booster inyectable
Infección vía de Inyección

Stress asociado al manejo Ayuno prolongado

Tiempos de Faena
Inmunosupresión post inyección

COSTOS
Vacuna Oral
Los peces son capaces de
absorber y presentar antígeno
en el segundo segmento del
tracto intestinal.

Desventajas:
- Requiere que el pez “coma”
-Integridad del antígeno
- mantenga por un tpo mínimo
Ventajas:
-Ahorro inyección y efectos
relacionados
-Posibilidad de booster(s)
MicroMatrixTM
Sistema de Liberación en el sitio objetivo

MicroMatrix Gastric Juice Duodenal Juice

Bacterias/virus(inactivadas)
son encapsuladas en matrices
que las protegen activamente
del pH del estómago.

Estas matrices son


hidrolizadas lentamente una
vez que llegan al intestino,
liberando así los antígenos de
la vacuna.
Vacuna Oral contra P. salmonis/ISA
Construyendo la Matriz

1. Antígeno: Elemento que entrega inmunidad específica.

2. Inmunoestimulante y encapsulante: Atrayente de células inmunológicas


(Macrófagos y Linfocitos).

3. Cobertura adherente con elementos nutrientes para flora intestinal:


Liberan el antígeno a la vez que se enriquece la flora intestinal, como se
adhiere, esto ocurre a medida que pasa el tiempo en la mucosa.

4. Cobertor de pH: Moléculas inertes, en presencia de ácido protegen


cualquier elemento que contengan.
MicroMatrixTM
Sistema de Liberación en el sitio objetivo

-Dosis: 6 mg de vacuna diaria, durante 10


días. Adsorbida en el alimento.

-La dosis de antígeno diaria es equivalente


al de una inyección.

La Vacuna es
agregada en el
alimento y luego
entregada como
alimento normal
MicroMatrixTM
Sistema de Liberación en el sitio objetivo

La Vacuna es Liberada en
el Intestino distal

SRS-MM no es afectada por


El ácido estomacal
Vacuna oral SRS
Estudios en condiciones
controladas
Estudios de primovacunación

-Salmón del Atlántico, 30 gramos de peso.

-Dosis: 6 mg de vacuna diaria, durante 10 días. Adsorbida en el alimento.

-La dosis de antígeno diaria es equivalente al de una inyección.

-Evaluación de
parámetros
inmunológicos y
sobrevivencia al desafío.
Inducción de la respuesta inmune
humoral

Título de anticuerpos sistémicos Título de anticuerpos Intestinales

Anticuerpos anti-P.salmonis
Anticuerpos anti-P.salmonis

0.8 0.28 Oral-SRS


Oral-SRS
0.26 Control
Control
0.24 Inyectable-SRS
0.6 Inyectable-SRS
0.22
0.20
0.4
0.18
0.16
0.2 0.14
0.12
0.0 0.10

24 8

70
347
7

8
24 8
347
7

70

9
9

61

94
61

94

13
13

UTA post vacunación UTA post vacunación

Tobar y cols., Vaccine, 2011


La vacuna SRS-Oral entrega protección eficaz desde
las 300 UTA post vacunación.

120

100
% Sobrevivencia

80
Control
60 SRS-Oral
SRS-Inyectable
40
SRS libre
20

0
0 10 20 30 40 50 60
Días post desafío

Tobar y cols., Vaccine, 2011


Esta protección se mantiene al menos hasta las 600
UTA post vacunación.

120

100
% Sobrevivencia

80
Control
60 SRS-Oral
SRS-Inyectable
40
SRS libre
20

0
0 10 20 30 40 50 60
Días post desafío

Tobar y cols., Vaccine, 2011


La vacuna oral contra SRS no afecta la ganancia de
peso en peces vacunados

120
SRS-Oral
100 SRS-Inyectable
Control
80
Peso (g)

60

40

20

0
610 948 1370
UTA post vacunación

Tobar y cols., Vaccine, 2011


Ensayo de eficacia en
Booster oral SRS

1200
Primer desafío 300 UTA post booster
(1500 UTA totales)

120 1500 (300 UTA)

100
% Sobrevivencia

80 Control
Booster
60

40

20
20 30 40 50 60 70
Días post desafío

Tobar y cols., Vaccine, 2011


Segundo desafío 600 UTA post booster
(1800 UTA totales)

120 1800 (600 UTA)

100
% Sobrevivencia

80 Control
Booster
60

40

20
20 30 40 50 60 70
Días post desafío

Tobar y cols., Vaccine, 2011


Curva de anticuerpos (Ig M anti p.salmonis)

Anticuerpos sistémicos Anticuerpos sistémicos


intestinales
Anticuerpos anti-P.salmonis

Anticuerpos anti-P.salmonis
0.65 0.35
0.60
0.55 0.30
0.50 Control Control
0.45 Booster 10d 0.25 Booster 10d
0.40
0.35 Booster 30d 0.20 Booster 30d
0.30 0.15
0.25
0.20 0.10
0.15
0.10 0.05
0.05
0.00 0.00
0

6
4

6
4

0
98

98
19
29

42

70

19
29

42

70
UTA post vacunación UTA post vacunación
Vacuna oral SRS
Estudios en condiciones de
cultivo
Incorporación al vacío

Top coating
Vacunas Inyectables y oral aplicadas. 2010

3% 3% 2% 1%
4% SRS/ISA oral

6% IPN+SRS

IPN+SRS+Vo

19% SRS Inyectable


62%
IPN Inyectable
Distribución de aplicaciones de vacuna
oral SRS según especie. Año 2010

Salar
trucha
23,6%
37,9%

coho
38,4%
Distribución de aplicaciones de vacuna
oral SRS según tipo de agua en vacunación. 2010

Piscicultura
11%
Estuario
20%

Mar
69%
Distribución de aplicaciones de vacuna
oral SRS según estrategia de Vacunación. 2010

Booster a i.p.
1% Primovacunación (30 gs)
11% primovacunación (800 grs)

88%
Vacuna utilizada en primovacunación
con boosters Oral SRS Centrovet. 2010

Centrovet
40%
Otros
Laboratorios
60%

En salmones, no existe una evidencia directa acerca de potenciales


diferencias en la respuesta cuando el booster es SIMILAR al primer
antígeno (Caso Otros Laboratorios) o IDÉNTICO al primer antígeno
(aso Centrovet)
Brotes SRS en el período y grupos
analizados durante 2010
Con Brote
20%

Sin Brote
80%

La presencia de brote no significa ineficiencia de la vacuna:


- Mortalidades bajas (menores o iguales al RPS)
- Manifestación del brote fuera del período de protección
Distribución causa de mortalidad
>2000 UTA > 2000
(Estuario) UTA (Mar) Sin Vacuna
20% 6% 4%

Estuario
70%

La entrega tardía del Booster (en condiciones de bajo título de


anticuerpos) se correlaciona con signología o brote SRS.
Vacuna liofilizada
oral contra ISAv
Vacuna contra ISAv
La estrategia de formular una vacuna virina es compleja a escala industrial :
→ Células hospederas de crecimiento lento
→ Titulo viral bajo: entre 105 y 106; otros labs 108
• Estrategia: Generación de proteínas de superficie del V similares a las
presentes en el virus, en forma Libre y NATIVA

Hemaglutinina

Matriz

Material genético

Proteína de
fusión (NA)

Virus ISA Vacuna


Beneficio: concentración de proteínas específicas (y necesarias) mucho mayores,
optimizando los boosters de primovacunaciones. Equivalente a 1011 partículas virales.
→ No contiene material genético por lo que no es detectada por métodos de diagnóstico
como el RT-PCR.
Estudios de
Eficacia Vacuna
oral contra ISAv
Vacuna ISA

Concentraciones antigénicas por ml de vacuna en cada


uno de las series pilotos:

Lotes Antígeno Hemaglutinina/ml Antígeno Neurominidasa/ml


vacuna vacuna
Lote 1 6 ug 6 ug
Lote 2 7,5 ug 7,5 ug
Lote 3 9 ug 9 ug
Mortalidad acumulada al ser desafiados
310 UTA post vacunación ISA oral

Mortalidad Vacuna Experimental ISA Oral


310 UTA Post vacunación
100
Mortalidad Acumulada (%)

80
Control
60 VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
40 VEX ISAVO-260209

20

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Días post-desafío
Mortalidad acumulada al ser desafiados
650 UTA post vacunación ISA oral

Mortalidad Vacuna Experimental ISA Oral


650 UTA Post vacunación
100
Mortalidad Acumulada (%)

80
Control
60 VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
40 VEX ISAVO-260209

20

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Días post-desafío
Mortalidad acumulada al ser desafiados
830 UTA post vacunación ISA oral

Mortalidad Vacuna Experimental ISA Oral


830 UTA Post vacunación
100
Mortalidad Acumulada (%)

80
Control
60 VEX ISAVO-200209
VEX ISAVO-230209
40 VEX ISAVO-260209

20

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Días post-desafío
Estudios de Eficacia vacuna ISA oral
Mortalidad acumulada específica post desafío con ISAv

100
90
Mortalidad (%)

80
70
60 Serie IO-21220901
50
Serie IO-22270901
40
Serie IO-23030901
30
20 Grupo Control
10
0
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52

Días post desafío

Grupo Porcentaje de mortalidad RPS60 RPS


acumulada
IA – 46120801 19 79 77
IA – 46130801 15 87 82
IA – 46140801 17 82 80
Pesos promedio peces vacunados (ISA oral) y no
desafiados en cada serie mas el grupo control en cada uno
de los tres desafíos (310, 650, y 830 UTA post vacunación).

Peso previo al desafío


25
20
Gramos

15
10
5
0
Control

Control
Control
VEX ISAVO-200209

VEX ISAVO-260209

VEX ISAVO-230209

VEX ISAVO-260209

VEX ISAVO-200209

VEX ISAVO-260209
VEX ISAVO-230209

VEX ISAVO-200209

VEX ISAVO-230209
310 UTA 650 UTA 830 UTA
Estudios de estabilidad de la vacuna
formulada en alimento

Figura 1. Gráfico de mortalidad acumulada post desafío del grupo de peces Figura 2. Mortalidad acumulada post desafío en un grupo control sin vacunar
vacunados con tres series piloto de vacuna inactivada oral contra ISA, y en las tres series piloto de vacuna inactivada oral contra ISAv, formulada y
mezclada con el alimento y mantenida por 30 días a 25 C, y el grupo control utilizada inmediatamente después de producida la vacuna.
sin vacunar.

Tabla 2. Tabla de contingencia para los alores de RPS60 de cada lote de vacuna al vacunar peces con alimento formulado y
utilizado inmediatamente (No incubada) o con alimento formulado y utilizado 30 días después de la formulación (Incubada).

Serie RPS Clásico

Incubada No incubada
IO-21220901 79 81
IO-22270901 87 82
IO-23030901 82 84
Estudios de primo vacunación oral contra
ISAv
primovacunación+ booster oral ISA

-Evaluación de sobrevivencia
al desafío.
Curva de mortalidad acumulada en peces control y vacunados contra
ISA
Booster: 1600 UTA; Desafío: 2500 UTA
100
Mortalidad Acumulada (%)

80
85%
Control
60
Vacunado

40
60%
Vacunado +
Booster

20
20%
0
0 10 20 30 40 50
Días post desafío
2500 UTA

1600 UTA 900


Estudios de terreno:
Resumen de vacunaciones
aplicadas 2009 - 2010
Distribución de aplicaciones de vacuna
ISA según estrategia de Vacunación.
Año 2010

Con booster
27%

Sin booster
73%
Distribución de aplicaciones de vacuna
ISA inyectable entregada.
Año 2009-2010

Con booster,
18%

Sin booster,
82%
Vacuna utilizada en primovacunación
con boosters Oral ISA Centrovet

Centrovet
25%

Otros
laboratorios
75%
El Booster oral recupera los niveles protectores de
anticuerpos específicos anti p.salmonis e ISA

IgM anti-SRS/ISA
IgM anti-SRS/ISA muestreos vacuna+ Booster oral
muestreo Vacuna inyectable

1.5
4
Absorbancia 450 nm (UR)

Absorbancia 450 nm (UR)


3
1.0
Booster oral
Ventana de
2 susceptibilidad
0.5

0 0.0

9
0
0
00
70
66
79
70
60
60
89
0
17
60
91
8

83

66

39

22

63
0

12
17
20
25
32
34
36
38
28

60

10

14

20

26

35

UTA post vacunación


UTA post vacunación
Cinética de IgM desde la vacunación

Cinética curva anticuerpos vacuna Cinética curva anticuerpos vacuna


IgM anti-P.salmonis oral
inyectable
M uestreos vacuna SRS Centrovet
1.6
Absorbancia 450 nm (UR)

1.4

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0
1

.1

.7

.2

.2
0

6
93
6.

0.

9.

69

17

43

53
24

46

68

12

16

19

20

UTA post vacunación


PDI: 300
PDI: 600
Esquema vacunación sugerida
900-1000 pb

UTA 1000 1700-1800 2600

engorda
600 UTA

1.40
Absorbancia 450 nm (UR)

1.20
1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600
UTA post vacunación
VACUNA LIOFILIZADA ORAL
Vía alimento
Respuesta inmune adquirida
También llamada “adaptativa” ó “adaptable”

Mecanismo de defensa específico, donde participan diferentes tipos de


células.

Linfocitos B
(Inmunidad Humoral)
CD8+
CD4+

Linfocitos T
(Inmunidad celular)

Célula presentadora
de Antígeno
Hemaglutinina
HE 349-351 352-354
motivo

Poca
Virulencia

Media
Virulencia

Alta
Virulencia
Entendiendo las condiciones de éxito de
una VACUNA
Además de los requerimientos básicos de una vacuna (Título,
representatividad, rango de acción, y efectos adversos)

CD8
CD4

El cómo mantener este intermediario como un buen respondedor es lo que


marcará la diferencia al momento de evaluar una misma vacuna.
Estudios de Eficacia ISA inyectable

Grupo RPS60 RPS % Mortalidad Acumulada

Vacuna 1.1 75 % 72 % 22
Vacuna 1.2 79 % 84 % 13
Vacuna 1.3 82 % 86 % 11
Curva de mortalidad acumulada en peces control y vacunados contra
ISA
Desafío: 600 UTA
100

80%
Mortalidad Acumulada (%)

80

60
Control

40
Vacunado

20 20%

0
0 10 20 30 40 50
Días post desafío
600 UTA
Incorporación al vacío

• Ingresa alimento extrusionado seco al aceitador al vacío,


previamente pesado y se le aplica vacío, esto es, se baja la
presión atmosférica dentro del aceitador a niveles de 70
milibar de presión.
• Se pesa el aceite de pescado según la fórmula en un estanque
utilizando un agitador y a una temperatura promedio de 30°C.
• A ese aceite se incorpora el medicamento previamente
pesado para el batch, y se mezcla por un tiempo no mayor a
de 5 minutos
• se aplica el aceite-medicamento al alimento extrusionado
seco.
• Una vez terminado el aceitado se abre la válvula de entrada
de aire para llegar a la presión atmosférica.
Top coating
• Ingresa a la línea medicados, alimento extruido (producto
terminado) que cumple las especificaciones de calidad
respectivas (proximales garantizados, % Flotación, % polvo y
partido, etc.) y previamente pesado.
• El producto se deposita en un mixer de mezclado; Mientras se
agita por 30 segundos, se incorpora el medicamento
previamente pesado para el batch.
• Se continúa la agitación del mixer por 150 segundos a
velocidad constante, mientras se agrega un 0,1% de de aceite
de pescado por aspersión, que formaran una película de
recubrimiento del pellet medicado
• Se descarga el batch para dar paso a la siguiente.
RPS y RPS 60 obtenidos en los desafíos realizados a peces
vacunados con las tres formulaciones experimentales de
vacuna ISAV a diferentes UTA post vacunación ISA oral

RPS Vacuna ISA Oral Experimental RPS60 Vacuna ISA Oral Experimental
100 100

80 80

VEX ISAVO-200209 60 VEX ISAVO-200209


60

RPS
RPS

VEX ISAVO-230209 VEX ISAVO-230209


40 40
VEX ISAVO-260209 VEX ISAVO-260209
20 20

0 0

310 650 830 310 650 830

UTA post-vacunación al desafío UTA post-vacunación al desafío


Crecimiento de P. salmonis para desarrollo
de una Vacuna

Crecimiento en línea de células embrionarias de


Salmón Chinook (CHSE-214)

Infección genera un efecto citopático que es total


alrededor de los 7 días

Los títulos bacterianos oscilan


entre 106 a 107 TCID50/ml de
cultivo
Crecimiento de P. salmonis en células Sf-21

Spodoptera frugiperda

Vacuna con mayor título SRS del mercado 108,47

Birkbeck et al. Infect Immun. 72:3693-3694. 2004.


Vacunas para peces registradas por
CENTROVET

•Monovalentes: IPN, SRS, VO, ISA

•Bivalente: SRS+IPN
IPN+VO

•Trivalente: SRS+IPN+VO

•Cuádruple: SRS+IPN+VO+AS
SRS+IPN+VO+ISA

•Quintuple: SRS+IPN+VO+Ae+ ISA

•Vacunas orales: Oral SRS, oral ISA

•Próximamente: oral SRS+ ISA


IPN oral; IPN inmersión
*Registro Enviado al SAG
Ensayo en “terreno”

• Piscicultura Isla Chiloé


•Vacunados con vacuna triple
• 100 Salmones por grupo, peso prom. 1 Kg
• Dos estrategias de vacunación:
•10 días seguidos
•10 días c/descanso por 2 días
• Booster 1200 UTA post vacunación

Grupos:
Control
MM1
MM1 por 10 días
Estructura del virus ISA
Proteína
Proteínade
defusión
fusión
(NE)
• ISA pertenece a la familia
Hemaglutinina Orthomyxoviridae (influenza) del
1 HA
2 género Isavirus
3
4 Matriz
5
6
RNAs
7
8
• El virus presenta una forma
Membrana
lipídica esférica de 100-130 nm de
diámetro y posee una envoltura
lipídica
PROTEINA PROPIEDADES
1 PB2 Subunidad polimerasa • Su genoma esta compuesto por 8
2 PB1 Subunidad polimerasa RNAs de hebra simple negativo
3 NP Nucleoproteína
4 PA Subunidad polimerasa
5 F Proteína de fusión
6 HE Hemaglutinina esterasa
7 P32/NEP/p11
8 M1/p16 Proteína de matriz
Esquema vacunación (primovacunación oral-booster iny)
BOOSTER i.p

1700 pb 900 pb

UTA 300 900 2100 2800 3700

300 UTA engorda

Booster oral : cada 900 UTA posterior a las 900 UTA post primo vacunación oral,