Extracción de ADN

Técnicas Aplicadas en
Herramientas Moleculares
de MGV Plantas con Dna

Dna Purificado

Extracción de ADN Extracción de ADN

¿Qué Necesitamos?
¿Qué hay en una planta además
de Adn?? Nitrógeno Líquido – Morteros
Buffer de Extracción
RNAasa (opcional)
Cloroformo-Octanol (24:1)
Isopropanol
Etanol
Agua Destilada

¿Dónde está el Adn en la célula Eppendorf, pipetas, Incubadora,

Centrífuga, etc.
vegetal??

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Extracción de ADN Extracción de ADN
Buffer de Extracción:
Paso 1
CTAB (Detergente, solubiliza proteínas y
membranas, evitando que el DNa quede atrapado, Moler en mortero el tejido vegetal (N2).
forma complejos con Proteínas y Polisacáridos y los Objetivo: Romper la pared celular por acción
precipita) mecánica.
ClNa 5M (Solubilidad diferencial de ADN y Llenar un eppendorf de 2 ml hasta la ½ aprox con téjido
Polisacáridos, que precipitan por fuerza centrífuga) molido. Agregar 1 ml de buffer de extracción. Incubar a 65º
Genera una sc con alta [ ] Iónica. durante 45 minutos. Centrifugar 15 minutos.
EDTA 0.5M pH 8(Quelante de Iones Ca y Mg, Objetivo: Solubilizar el Adn, y liberarlo de los restos
cofactores de nucleasas: rompen el ADN) celulares.
Tris 1M pH 8 (efecto buffer o amortiguador del pH)
β-Mercaptoetanol (antioxidante) (rompe ptes
disulfuro)
H2O Destilada
65º C: Desnaturalización de Proteínas

Extracción de ADN Extracción de ADN

Paso 3
Pasar el sobrenadante a un eppendorf de 1.5 ml.
Agregar 1 µl de Arnasa. Incubar 60 minutos a 37 ºC.
Paso 2 Objetivo: Eliminar el ARN que se esté purificando
junto al ADN.
Pipetear el sobrenadante (fase acuosa con ADN en
solución) a otro Eppendorf. Agregar 450 µl de cloroformo:octanol 24:1. Emulsionar
durante 5 min. Centrifugar 15 minutos.
Agregar 450 µl de cloroformo:octanol 24:1.
Objetivo: Eliminar restos de Arnasa y otras
Emulsionar durante 5 minutos, y centrifugar 15 minutos.
sustancias que hayan quedado del lavado previo.
Objetivo: Lavado de proteínas y otros restos celulares

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Extracción de ADN Extracción de ADN
Paso 4 Paso 5
Pasar el sobrenadante a un eppendorf de 1.5 ml.
Eliminar el Isopropanol.
Agregar 600 µl de Isopropanol Frío (-20ºC). Colocar en
Agregar 500 µl de Etanol Frío. Centrifugar durante 10
el frezzer a -20ºC 10 minutos.
minutos.
Objetivo: Precipitar el ADN, dado que el mismo es
insoluble en alcohol y se deshidrata en el mismo. Se Objetivo: último lavado del pellet de ADN para
forma una medusa. eliminar restos de sales, y comenzar a rehidratar el
DNA.
Centrifugar 10 minutos.
Objetivo: Formar un pellet en el fondo del
Eliminar el etanol. Dejar secar hasta que se evapore el
eppendorf con el DNA precipitado. etanol.

Extracción de ADN Calidad y Cantidad de ADN Purificado

Paso 6
Agregar 50 µl de H2o Destilada. Asegurarse la Distintos Métodos:
correcta re-suspensión, para lo cual puede
permanecer 24 hs en heladera. Espectrofotometría: Evalúa Cantidad pero
no Calidad
Objetivo: Obtener una solución de ADN
para su posterior uso en diversas tareas Electroforesis en Gel de Agarosa: Evalúa
(marcadores moleculares, PCR, etc). Cantidad y Calidad.
Almacenar la muestra de DNA a -20ºC hasta Nanodrop: Técnica Rápida, evalúa Calidad y
utilizarla. Cantidad.

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 Electroforesis en Gel de Agarosa
Electroforesis en Gel de Agarosa
Utilizado para cuantificar muestras de DNA, en algunos
marcadores moleculares, en transgénesis: permite ver el
resultado de PCR.
Se construye un gel con agarosa disuelta en buffer (TAE Tomado de Scitable-NatureEducation
1X-sales). Se incorpora Bromuro de Etidio, una molécula
intercalante, que se introduce en la doble-hélice, hace
visible el ADN bajo la luz UV. Se siembran muestras de
ADN en “huecos” dejados por el peine: CALLES, junto
con un marcador de corrida (Loading Buffer) En 2 calles se
siembra un marcador de peso molecular (DNA
Ladder//Lambda HindIII ).
Las moléculas de ADN corren por las calles por el
gradiente eléctrico generado. Las moléculas más livianas
corren más rápido, y las más pesadas (ADN Genómico)
corren poco, quedando cerca del punto donde fueron
sembradas.

Electroforesis en Gel de Agarosa

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
(Polymerase Chain Reaction)

Kary
Mullis-
Premio
Nobel de
Gel de agarosa Química
sembrado con en 1993
muestras de ADN
Genómico para su La reacción se basa en la alternancia de ciclos a 3 T° distintas,
permitiendo la separación de las moléculas de ADN, unión de
cuantificación. primers, replicación y nuevamente separación, repitiendo el ciclo.
Imágenes tomadas de: http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html

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 PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
(Polymerase Chain Reaction) (Polymerase Chain Reaction)
Permite obtener (amplificar) múltiples copias de un fragmento de ADN de
interés, a partir de una pequeña cantidad de ADN Genómico.
Se basa en la
Se emplea una polimerasa TERMOESTABLE, extraída de microorganismos
adaptados a la vida en ambientes a muy altas T°. En el caso de la Taq Polimerasa
actividad de una
(Tópt: 72ºC), se extrae de Thermus aquaticus (bacteria habitante de fuentes de enzima polimerasa
agua caliente-aislada en Yellowstone National Park-EEUU). (Taq polimerasa)
Se repiten ciclos de:
que trabaja a altas
temperaturas.
95°C: Se separan las hebras de ADN
52-54°C: Se unen los primers (Annealing)
¿Qué característica tienen las
72°C: La ADNpolimerasa se une a los primers, y comienza la transcripción.
moléculas de DNA que reconoce
95°C: Se vuelven a separar las hebras. Se repiten los ciclos anteriores. la ADN Polimerasa?
Los primers se unen a las regiones que flanquean el gen, no sobre la secuencia
del gen de interés.

TaqPolimerasa-Tomado
de Protein Data Bank
Tomado de: Learn Genetics – University of Utah - http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

(Polymerase Chain Reaction) (Polymerase Chain Reaction)
Nucleótidos 95°C 50-55°C
Termociclador Primers Libres- ddNTPs

Taq
Polimerasa Desnaturalización del DNA a alta Descenso de T°: Unión de Primers
T°: se separan las hebras de ADN flanqueantes de la Secuencia Target

72°C

Cuba de Electroforesis Mg Cofactor de Unión de la TaqPol a la zona de unión

Muestra de
para correr los productos TaqPol de los primers: comienzo de la
ADN
transcripción en sentido 5’ 3’
Tomado de: Scitable – Nature Education: http://www.nature.com/scitable/course-content/Essentials-of-Genetics-8/6934217
Tomado de: Scitable – Nature Education: http://www.nature.com/scitable/course-content/Essentials-of-Genetics-8/6934217

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 PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
(Polymerase Chain Reaction) Región de ADN diana (Polymerase Chain Reaction)
(target) a amplificar
Calentamiento:
Separación de Hebras

Enfriamiento: Unión de
Primers

DNA pol cataliza la

síntesis de DNA 5’ 3’ Secuencia
TARGET

Se repiten los pasos

anteriores

Tilling: Targeting Induced Local Lesions IN Tilling: Targeting Induced Local Lesions IN
Genomes Genomes
Permite identificar polimorfismos de un solo
nucleótido en genes cuya ubicación en el genoma
y su secuencia son conocidos.
Se basa en la Reacción en Cadena de la
Polimerasa, y en una enzima: CEL I que reconoce
y digiere el ADN al encontrar un mismatch (par de
bases no apareadas).
Se parte de una población mutagenizada, en gral
con un mutágeno químico, buscando inducir
mutaciones de un sólo nucleótido.

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Tilling: Targeting Induced Local Lesions IN
Genomes
Tilling: Targeting Induced Local Lesions IN
Genomes
Se mutagenizan semillas con un mutágeno químico, se ponen
a germinar para producir la M1. Las plantas M1 se autopolinizan
y producen la M2, de la cual se extrae DNA para hacer los
análisis, y la cual se autopoliniza, y se guardan las semillas(M3)
para posibles futuros análisis.
Se forman pooles de 8 muestras de ADN (esto varía según
nivel de ploidía y cantidad natural de ocurrencia de SNP’s en la
sp)
Se amplifica el gen usando un primer forward marcado que es
visualizable a una long de onda de 700 nm y un primer reverse
que se visualiza a una long de onda de 800 nm (unido al extremo
5’).
Los productos de PCR se calientan y enfrían cuidadosamente,
para formar los heteroduplexes entre las muestras del pool; el
resultado de esto es un pool que contiene una mezcla de
homoduplexes y heteroduplexes.
Tilling: Targeting Induced Local Lesions IN
Genomes
Tilling: Targeting Induced Local Lesions IN
Genomes
Se agrega la enzima CEL I (mismatch endonucleasa) que
detecta los pares de bases mal apareados y los cliva,
produciendo dos fragmentos. Esos fragmentos, y aquellos no
clivados se visualizan en dos longitudes de onda: 700 y
800nm.
Cuando se detectan muestras de mutantes, se procede a
secuenciar el gen mutado, para corrobar la inducción de la
mutación y conocer donde se produjo.
EcoTILLING se realiza de la misma manera, excepto que
en lugar de partir de una población de mutantes inducidas,
se parte de una población natural, sobre la cual se realizan
las extracciones de ADN, a partir de allí los pasos a seguir
son los mismos.
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Enzimas de Restricción Enzimas de Restricción
Son las tijeras de la Ingeniería Genética.
Las enzimas de restricción son enzimas de origen
bacteriano, que fragmentan el ADN, realizando el corte al
reconocer secuencias específicas de ADN, llamadas dianas
de restricción.
Una enzima de restricción cortará el ADN en un conjunto
de fragmentos de restricción, que estarán determinados por
la localización de las diferentes dianas de restricción.
Reconocen secuencias palindrómicas: ambas cadenas de
ADN tienen la misma secuencia de nucleótidos, pero en
una orientación antiparalela. ≠ enz de restricción
reconocen ≠ secuencias palindrómicas.
Los extremos producto del corte pueden ser extremos
romos (cortes nivelados) o cohesivos.
Los extremos cohesivos, al ser cadena simple, pueden
aparearse a una secuencia complementaria (Hibridación).
Son muy útiles en la tecnología del DNA recombinante.

Enzimas de Restricción Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción

hacen cortes en ambas
hebras del ADN,
produciendo extremos
cohesivos o romos.
Tomado de : DNA recombinante: Las Herramientas del Oficio en:
Tomado de Scitable-NatureEducation http://biolarioja.com.ar/Biologia/Seccion%203/3%20-%20Capitulo%2016.htm

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RFLP’s: Polimorfismo deLargo de Fragmentos
de Restricción
Bibliografía
Scitable-Nature Education:
http://www.nature.com/scitable/topics
Griffiths, 9th Ed. Cap 17 y 20.

Electroforesis en Agarosa e
hibridación con una sonda
marcada (con fluorescencia o
radioactividad) para localizar
fragmentos específicos en el
pool de DNA.