FILIAL NORTE

BIOQUÍMICA
GUÍA DE PRÁCTICAS

SEGUNDO AÑO

Profesores: Biól. Lezama Vigo, Hélmer, MSc. (Responsable)

Biól. Jerí Apaza, César (Asesor)
Ing. Quím. Benel Fernández, Doyle, Mg (Coordinador)
Ing. Quím. Quiñones Chapoñán, Liliana.
Méd. Llimpe Mitme, Rafael
Ing. Quím. Monteza Arbulú, César
Ing. Quím. Coronado Zuloeta, Iván
Ing. Quím. Guerrero Braco, JamesBiól.
Méd. Gordillo Carboinel, Johnny.

2018-II

1
 INTRODUCCIÓN

La Bioquímica es la ciencia de la vida que estudia el metabolismo de los

organismos vivos, es decir el conjunto de todas las reacciones químicas, y sus
diferentes mecanismos, vías y regulación que hacen posible la vida. Las
aplicaciones de la investigación básica en bioquímica son numerosas, siendo
indispensable el conocimiento del metabolismo para el desarrollo de cualquier
medicamento, su aplicación y la determinación de sus efectos.

La guía de prácticas del curso de Bioquímica tiene como objetivo entrenar al

estudiante con los procedimientos llevados a cabo en el laboratorio y
desarrollar su pensamiento científico que lo lleve a comprender los términos
básicos de la Bioquímica.

El estudiante debe emplear esta guía en cada práctica de laboratorio y estar

informado sobre la práctica que se llevará a cabo en cada sesión.

El alumno debe cumplir con los objetivos planteados al final de cada práctica.
Así mismo debe presentar su guía de práctica terminada la misma.

PROGRAMACIÓN DE CONTENIDO

PRACTICAS DE LABORATORIO D. Benel

1 JU-02-08 Introducción y organización de grupos. L. Quiñones
2 JU-09-08 1. Bioseguridad. C. Monteza
3 JU-16-08 2. Instrumentación: centrifugación I. Coronado
4 JU-23-08 3. Instrumentación: colorimetría J.Guerrero
5 JU-30-08 FERIADO
6 JU-06-09 4. Instrumentación: potenciometría
7 JU-13-09 5. Cinética Enzimática
8 JU-20-09 1. Digestión de carbohidratos
PRIMERA EVALUACION CONTIN UA
9 JU-27-09 SEMANA DE EVALUACIONES
10 JU-04-10 SEMANA DE LA MEDICINA
11 JU-11-10 2 Glicólisis
12 JU-18-10 3. Lipoproteínas sanguíneas
13 JU-25-10 4. Transaminasas y cromatografía
14 JU-01-11 FERIADO
15 JU-08-11 1. Evaluación nutricional
16 JU-15-11 SEGUNDA EVALUACIÓN CONTINUA

2
 SEMANA N° 1
INTRODUCCION

PRÁCTICA GUIADA Nº I.1 SEMANA N° 2

BIOSEGURIDAD

El trabajo en el Laboratorio requiere la observación de una

serie de normas de seguridad que eviten posibles accidentes debido al
desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia de los
alumnos que estén en un momento dado, trabajando en el Laboratorio.

A continuación alistamos una serie de medidas e indicaciones de seguridad

que deben tomarse durante las prácticas de laboratorio.

NORMAS PERSONALES

1. Lea con atención, antes de cada práctica, las indicaciones de su guía. Siga
todas las instrucciones a menos que el profesor realice alguna
modificación.
2. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su
material. Se trabajará con cuidado y de manera organizada. Así mismo se
mantendrá cada mesa de trabajo limpia, seca y ordenada.
3. Es obligatorio la utilización de mandil que le cubra brazos, piernas, torso y
pies. Están prohibidos el uso de sandalias, pantalones cortos, faldas, polos
cortos, etc. en el laboratorio. La persona inapropiadamente vestida para
trabajar en el laboratorio le será negado el ingreso.
4. No deben llevarse las manos a la boca ni a la cara pues pueden estar
contaminadas.
5. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido.
6. Está terminantemente prohibido fumar, tomar bebidas ni comidas.
7. En caso de derrame, accidente o daño avise inmediatamente al profesor.
8. Al término de cada práctica limpiar el área de trabajo y lavar los materiales
utilizados con agua de caño. Lavarse las manos meticulosamente con agua

3
 y jabón. Finalmente cerciorares que las llaves de gas y agua estén
cerradas.

REACTIVOS QUIMICOS

1. Usar lentes de seguridad cuando trabaje con reactivos químicos peligrosos

que puedan salpicar o derramarse.
2. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se
necesita, fijarse bien el rótulo.
3. Como regla general, no coger ningún producto químico. El profesor o
profesora te lo proporcionará.
4. Nunca devuelva los sobrantes de los productos a los frascos de origen sin
consultar con el profesor.
5. Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se
viertan en la pila de desagüe, aunque estén debidamente neutralizados,
debe dejarse que circule por la misma, abundante agua.
6. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos.
7. No pipetear con la boca. Utilizar una bombilla de succión.
8. Los ácidos requieren un cuidado especial. Cuando queramos diluirlos,
siempre echaremos el ácido sobre agua.
9. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben estar lejos de
fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al
baño María, nunca directamente a la llama.
10. Manipule con precaución los solventes volátiles e inflamables como el
éter, acetona y metanol. Nunca evapore estos solventes en una hornilla al
abierto. Utilice siempre un sistema de condensación eficiente.
11. Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate
inmediatamente con mucha agua y avisa al profesor.
12. Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y
rotulado convenientemente.
13. Encienda fuego en el laboratorio solo si no existen solventes inflamables
en la vecindad. La persona que encienda el fuego debe primero verificar
que no exista otra persona que este trabajando con solventes inflamables
en el laboratorio.

MATERIAL DE VIDRIO

1 Use material de vidrio limpio y no rajado.

4
 2 El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar
quemaduras use guantes o trapos.
3 Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo,
observa cuidadosamente estas dos normas:

-Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no
apunte a ningún compañero. Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo
que podrías ocasionar un accidente.
-Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita
suavemente (mira la figura).

EQUIPOS ELÉCTRICOS

1 Manipule cualquier equipo eléctrico con las manos secas y asegúrese que el
área de trabajo también este seca.
2 Ningún cordón electrifico debe colgar fuera de la mesa de trabajo.
3 Cuando desconecte algún equipo de tomacorriente, jálelo por el enchufe
y no por el cordón.

UTILIZACION DE BALANZAS

1 Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza, se

colocará papel sobre los platos de la misma y si el producto fuera corrosivo,
se utilizará una luna de reloj.
2 Se debe evitar cualquier perturbación que conduzca a un error, como
vibraciones debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los
platos de la balanza, etc.

MANIPULACIÓN DE ESPECÍMENES
1 Manipule los microorganismos crecidos en una placa petri o tubo de cultivo
con extremo cuidado. Siempre utilice técnicas de esterilidad (a la llama del
mechero, guantes, palillos estériles, etc.).
2 Nunca llevar a la boca plantas o partes de ellas como semillas, frutos y
hojas.

NIVELES DE RIESGO BIOLOGICO EN UN LABORATORIO

Clasificación de microorganismos por grupos de riesgo para el trabajo de

laboratorio:

Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo)

Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades
en el ser humano o los animales.

Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)

5
Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales
pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el
personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La
exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen
medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es
limitado.

Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)

Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales
graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen
medidas preventivas y terapéuticas eficaces.

Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)

Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser
humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro,
directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y
terapéuticas eficaces.

BARRERAS DE CONTENCION
Los laboratorios presentan diversas barreras de contención que previenen el
escape y dispersión de agentes biológicos de riesgo.

Barrera primaria: Es aquella que protege al personal y al ambiente inmediato

del agente de riesgo (vestimenta de uso exclusivo, cabina de bioseguridad y
equipos provistos de dispositivos de seguridad).

Barrera secundaria: Es aquella que protege el ambiente externo contra los

agentes de riesgo (diseño del laboratorio e implementación de equipos de
seguridad de acuerdo al nivel de Bioseguridad).

Barrera microbiológica: Es un dispositivo o sistema que evita o limita la

migración de microorganismos entre los espacios situados a ambos lados del
mismo y permite controlar la concentración de microorganismos en el
ambiente, dentro de límites prefijados. Tiene como objetivo proteger al
operador o al operador y al proceso.

Barrera microbiológica parcial: Es un dispositivo o sistema que limita la

migración de microorganismos entre los ambientes situados a ambos lados del
mismo. En este tipo de barrera se recomiendan Prefiltros, Filtros HEPA (Filtros
de alta eficiencia para el control de partículas en suspensión) así como
cabinas de bioseguridad clase I o II, lo cual dependerá del tipo de trabajo que
se efectúa en un determinado laboratorio.

Barrera microbiológica absoluta: Es un dispositivo o sistema hermético, a

prueba de filtraciones de aire o gas, que evita en forma total la migración de
microorganismos entre el ambiente confinado por la barrera y el ambiente
exterior de la misma. La barrera microbiológica absoluta puede confinar al
producto o proceso, dejando al operador fuera de la misma o viceversa. En
este caso se recomienda una cabina de bioseguridad de tipo III.

6
Barrera química: Son dispositivos o sistemas que protegen al operador del
contacto con substancias irritantes, nocivas, tóxicas, corrosivas, líquidos
inflamables, sustancias productoras de fuego, agentes oxidantes y sustancias
explosivas. En este caso se recomiendan una cabina de seguridad química.

Barrera física: Son dispositivos o sistemas de protección individual o colectiva

que protegen contra las radiaciones ionizantes, no ionizantes, ruidos, carga
calórica, quemaduras y vibraciones excesivas.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD

De acuerdo con el nivel de riesgo, el tipo de laboratorio, la barrera de

contención requerida, los procedimientos y técnicas a usar, se han establecido
los siguientes niveles de Bioseguridad.
Nivel de Bioseguridad I: Es aquel que corresponde a las actividades
desarrolladas en un laboratorio básico, por personal adiestrado en los
procedimientos que se ejecutan en él. En este nivel se trabaja con agentes
clasificados en el Grupo de riesgo I por presentar un peligro mínimo para el
personal del laboratorio y para el ambiente. En el nivel de Bioseguridad I no se
requiere equipo especial ni un diseño específico de las instalaciones. El
personal de estos laboratorios es generalmente supervisado por un científico
con entrenamiento en microbiología.

Nivel de Bioseguridad II: Es aquel que corresponde a las actividades

desarrolladas en un laboratorio básico, por personal adiestrado en el manejo de
agentes de riesgo del grupo II. Es similar al nivel I y en él se manejan agentes
de peligro moderado hacia el personal y el ambiente, pero difiere del nivel I en
las siguientes características:
1. El personal de laboratorio tiene entrenamiento específico en el manejo de
agentes patógenos.
2. El acceso al laboratorio es restringido cuando se está realizando algún
trabajo.
3. Se toman precauciones extremas con instrumentos punzo cortantes
contaminados.
4. Ciertos procedimientos en los cuales pueden salpicar los agentes o
aerosoles se llevan a cabo en cabinas de trabajo microbiológico.

Nivel de Bioseguridad III: Es aquel que corresponde a las actividades

desarrolladas en el laboratorio de contención. El personal debe contar con
adiestramiento específico para el manejo de agentes de alto riesgo clasificados
en el grupo de riesgo III. En el laboratorio se realiza trabajo con agentes que
pueden causar un daño serio y potencialmente mortal como resultado de la
inhalación o exposición a los mismos. El laboratorio cuenta con un diseño y
características especiales tendientes a proteger al operador y al ambiente.
Todos los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipo de
protección siguiendo protocolos rigurosos. Los laboratorios se mantienen con
una presión de aire negativa, lo cual ayuda a impedir que los agentes nocivos
escapen al ambiente.

7
Nivel de Bioseguridad IV: Es aquel que corresponde a las actividades
desarrolladas en el laboratorio de contención máxima. Este nivel es el que se
utiliza para trabajar con agentes biológicos clasificados en el grupo de riesgo IV
por representar un alto riesgo individual de contagio y que además son un
riesgo para la vida. Los agentes nuevos que presentan características
antigénicas, patogénicas u otras similares a agentes de nivel III y IV son
confinados a nivel IV hasta que exista suficiente información científica para
establecer a cual grupo de riesgo pertenecen.
El personal que trabaja en los laboratorios de nivel IV tiene entrenamiento
específico y extensivo en el manejo de agentes infecciosos, y cuenta con
entrenamiento para trabajar en el ambiente estéril y controlado. El laboratorio
cuenta con un diseño y características especiales tendientes a proteger al
operador y al ambiente. Todos los materiales son manipulados utilizando
vestimenta y equipo de protección de características superiores a las exigidas
para el trabajo en un laboratorio de nivel III. Los trajes están diseñados para
cubrir la totalidad del cuerpo, presentan un sistema de respiración individual
asociado y una leve sobrepresión interna para evitar así la entrada accidental
de partículas infecciosas. Los laboratorios se mantienen con una presión de
aire negativa, lo cual ayuda a impedir que los agentes nocivos escapen al
ambiente.

TIPOS DE LABORATORIOS
En relación con el grado de riesgo los laboratorios combinan las características
de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y
procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos
de los distintos grupos de riesgo. De esta manera los laboratorios se clasifican
en 3 categorías:
Laboratorio básico: Dividido en dos grupos, el de nivel de bioseguridad 1;y el
de nivel de bioseguridad 2;
Laboratorio de contención: con nivel de bioseguridad 3, y
Laboratorio de contención máxima: con nivel de bioseguridad 4.

PRÁCTICA GUIADA Nº 1

1.-Complete los nombres de los distintos símbolos de bioseguridad que

se presentan a continuación.

8
 1.- complete el recuadro :

NIVEL DE CARACTERISTICAS EJEMPLOS DE

BIOSEGURIDAD PATOGENOS

Firma del alumno Firma del profesor

9
 PRACTICA N° I.2 SEMANA N° 3

INSTRUMENTACIÓN: CENTRIFUGACION

P
rocedimiento por el cual se aplica la FUERZA CENTRÍFUGA para
separar partículas que se encuentran en suspensión en un medio
líquido. El incremento de la fuerza centrifuga condicionará que las
partículas migren alejándose del eje de rotación de la centrifuga. El
proceso migratorio de las partículas se denomina sedimentación y la velocidad
con que sedimentan es proporcional a la fuerza centrifuga expresada como
incrementos de la gravedad (G).
La constante gravitatoria es proporcional a la velocidad de giro del rotor –
soporte del medio que se centrifuga – y del radio del mismo. El radio del rotor
de la centrifuga depende si ésta es del tipo ángulo fijo o flotante. En el primer
caso es un promedio entre el radio mínimo y el máximo, y en el segundo es la
distancia entre fondo del tubo y el eje.

La velocidad de la sedimentación se altera por la fuerza centrífuga, pero

además por la forma de las partículas, y por la viscosidad del medio líquido que
las suspende. También depende de la temperatura en cuanto ésta altere la
viscosidad del medio o de las cargas eléctricas de las partículas.
Los equipos que permiten la centrifugación se llaman centrífugas y constan de
un motor con controles, que mueven un rotor que sostiene los tubos de
centrifugación. Los rotores son de dos clases, de ángulo fijo y flotantes, tal
como se ve más arriba.
La mayoría de la centrífugas de laboratorio alcanzan las 5000 rpm, aunque
algunas alcanzan los 16 000 rpm. Algunas centrífugas tienen refrigeración lo
que permite separar partículas biológicamente activas tales como factores de
coagulación, enzimas, etc.
Las ultracentrífugas son centrífugas con vacío, refrigeración y velocidades de
más de 500 000 x g. Permiten la separación de los componentes tisulares, tal
como se aprecia en el cuadro adjunto y poder estudiar cada uno de ellos a
partir del homogenizado de un tejido cualquiera.

10
Para evaluar con certeza la capacidad de una centrífuga para separar los
componentes celulares debemos manejar gravedades en lugar de revoluciones
por minuto, por lo que frecuentemente usamos el nomograma de Dole y Cotziar
que presentamos a continuación.
Suspender el tejido al 10%
Homogenizar en Potter E.

Centrifugar a 600g x 10´

Sedimento: núcleos, restos

celulares

Centrifugar el sobrenadante
a 4000g x 15´

Sedimento:
mitocondrias

Centrifugar el sobrenadante
a 16 500g x 15´

Sedimento:
lisosomas

Centrifugar el sobrenadante
a 100 000g x 40´

Sedimento:
microsomas

Sobrenadante: citosol

TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN

1. Diferencial: separa de acuerdo a las diferentes velocidades de

sedimentación de distintas partículas. La usamos en la clínica para
separar sedimentos de orina, o componentes del plasma.
2. Zonal: usando una gradiente de densidad lograda con un soluto denso,
la más usada la sacarosa, las moléculas sedimentan de acuerdo a su
coeficiente de sedimentación. La sacarosa densa evita que las bandas
se mezclen.

11
La gradientes pueden ser discontinuas – preparadas mediante la colocación de
soluciones de diversa densidad una sobre otra- y continuas – preparada
mediante un equipo de mezcla de soluciones, que va incrementando la
densidad progresivamente.

NOMOGRAMA DE CALCULO VELOCIDAD Y RADIO DE CABEZAL DE CENTRÍFUGA

TUBOS DE CENTRIFUGACIÓN:

Existen tubos de centrífuga de diversa composición:

1. Policarbonato: vidrio transparente, autoclavable y resistente a los
ácidos y bases de baja dilución.
2. Borisilicato: vidrio muy resistente a químicos de alta concentración .
3. Polietileno: plástico muy resistente a los químicos, pero sensible a la
temperatura.
4. Propileno: plástico bastante resistente a la temperatura – autoclavable-
y resistente a casi todos los químicos.

12
PORTATUBOS
Son de plástico o de metal y poco resistente a ácidos y bases fuertes. Deben
ser conservados muy limpios.

Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N° I.3 SEMANA N° 4

INSTRUMENTACIÓN: COLORIMETRIA
Es el análisis de la concentración de una muestra por el color que presenta.
Todos hemos tenido la experiencia de valorar la concentración de sustancias
coloreadas en solución, por observación directa, una taza de café o té, un vaso
de refresco, son apreciados de esa manera. El examen se funda en la mayor o
menor absorción de luz de acuerdo al mayor número de moléculas y tonalidad
dependerá de la capacidad de absorber una u otra longitud de onda de luz,
específicamente. La fotocolorimetría manipula las variables de este fenómeno
controlando la luz incidente proveniente de un foco luminoso y su pureza, de
modo tal que sólo incida aquella luz que es específicamente absorbida por la
partícula que medimos. 450nm
Rayos X 540nm Microondas:
1nm a 1pm 640nm 25um a 1mm

Rayos γ Ultravioleta: Infrarrojo: Ondas de radio

< 1pm 400nm a 1nm 750nm a 25 um > 1mm
Los cuerpos luminosos como el sol o las lámparas eléctricas emiten un gran
espectro electromagnético que comprende amplias longitudes de onda, de las
cuales muy pocas corresponden al espectro visible. En el cuadro anterior se
aprecian todas las radiaciones electromagnéticas conocidas.
Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y
reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores
complementarios) Esta luz reflejada es la que observamos como color propio
del cuerpo coloreado. No interesa particularmente los colores que absorbe la
solución que queremos medir. La selectividad de absorción que queremos
medir. La selectividad de absorción de una partícula por una longitud de onda
se basa en el hecho de que cada longitud de onda de luz corresponde a un

13
distinto nivel de energía, y para excitar los electrones de cada partícula
necesitamos un particular nivel de energía.
Si consideramos que cada molécula absorbe luz de acuerdo a la concentración
en que se encuentre dentro de la solución, a mayor absorción de luz y menor
luz trasmitida. Estos factores están considerados en la ley de Lambert y Beer.

Longitud de onda Color Colores complementarios

400-435 violeta amarillo-verde
435-480 azul amarillo-verde
480-490 verde-azul anaranjado
490-500 azul-verde rojo
500-560 verde purpura
560-580 amarillo-verde violeta
580-595 amarillo-verde azul
595-610 anaranjado verde-azul
610-750 rojo azul-verde
Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y
reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores
complementarios). Esta luz reflejada es la que observamos como color propio
del cuerpo coloreado. Interesa particularmente los colores que absorben la
solución que queremos medir. La selectividad de absorción de una partícula
por una longitud de onda se basa en que cada longitud de onda de luz
corresponde a un distinto nivel de energía y para excitar los electrones de cada
partícula se necesita un particular nivel de energía.
Sí consideramos que cada molécula absorbe luz de acuerdo a la concentración
en que se encuentre dentro de la solución, a mayor concentración de
sustancia, mayor absorción de luz y menor luz trasmitida. Estos factores están
considerados en la Ley de Lambert y Beer, que es la siguiente:

Log Io/It = e.l.c

Donde: Io = Luz incidente, It = Luz transmitida, C = concentración, L =
longitud de paso, e = constante.

FOTOCOLORIMETRIA – ESPECTROFOTOMETRIA

La fotocolorimetría es la medida de la luz absorbida por una solución mediante

un aparato que es un fotocolorímetro. El equipo consta de una fuente de luz
artificial, un monocromador que separa exclusivamente luz de una sola longitud
de onda (la que sea preferente para la medida), un recipiente o tubo de vidrio
(que alberga la solución a medir), una célula fotoeléctrica que transforma la luz
trasmitida en corriente eléctrica y una unidad de medida de la corriente
eléctrica o galvanómetro.

14
 Luz Incidente Io Luz trasmitida It

La calificación de colorímetro o espectrofotómetro depende del

monocromador, sí éste es un filtro tendremos un fotocolorímetro, pero si es un
prisma, o cualquier aditamento que proporcione luz de diversas longitudes de
onda tendremos un espectrofotómetro.

Fuente de luz blanca Muestra: Absorción Galvanómetro

Monocromador Celda

Los fotocolorímetros y los espectrofotómetros reportan sus resultados bajo dos

formas: absorbancia o luz absorbida por las partícula de la solución y
transmitancia a o luz transmitida luego de atravesar el tubo con la solución. La
transmitancia se expresa en valores numéricos entre 0 y 100%, es decir que
una solución que no tiene particular trasmitirá el 100% y una perfectamente
opaca el 0%. La absorbancia, también llamada densidad óptica DO, se expresa
en valores semilogarítmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a la solución que
no tiene partículas y por lo tanto no absorbe la luz.
Para encontrar la concentración de una solución problema, debemos comparar
su lectura frente a un blanco – agua destilada o reactivos sin modificarse – con
la lectura de un patrón o solución estándar bajo las mismas condiciones. Una
solución estándar es generalmente una que contiene el problema con una
concentración perfectamente medida en el laboratorio.

CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UN PROBLEMA

Para hallar la concentración de una muestra problema tenemos dos

procedimientos:

15
1. Factor de Calibración
2. Curvas de calibración

Factor de calibración: es la concentración de sustancia que corresponde a

una unidad de medida, generalmente 0,001 de absorbancia.

Se obtiene Factor de calibración: concentración del patrón

Lectura del patrón (en absorbancia)

Esta fórmula deriva de la densidad óptica o absorbancia del problema:

DOP= eP lP cP

Si el coeficiente de extinción (e) es el mismo en ambos casos y el diámetro del

tubo de lectura(l) es el mismo, la única diferencia está en la concentración.
Luego:

DOst CS
=
DOp CP

Despejando la concentración del problema cp, se obtiene:

cs
cp=Dp x --------
Dost

Concentración del problema = Densidad Óptica del Problema X Factor de

calibración
La curva de calibración consiste en la obtención de las lecturas de absorción 0
de % de trasmitancia que corresponde a una secuencia creciente de
concentraciones, estas son graficadas en un papel milimétrico si se trata de
absorbancia o densidad óptica y de papel semilogarítmico si se trata de % de
transmitancia.

PARTE EXPERIMENTAL

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN

El experimento consiste en preparar tubos de concentración creciente de un
colorante y leerlos al fotocolorímetro o al espectrofotómetro, llevando a cero (0)
el aparato con agua destilada. Construir una gráfica usando papel milimetrado
para las lecturas hechas en DO (densidad óptica) o papel semilogarítmicos
para las lecturas hechas en % transmitancia.
Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer las
soluciones al espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda. Practicar esta
lectura tanto en DO como en % de transmitancia.

16
Construir dos curvas de calibración, una en papel milimetrado y otra en papel
semilogarítmico.

Tubo Nº
Contenido 1 2 3 4 5
mL Azul metileno al (5 mg/mL) 2 4 6 8 10
mL Agua destilada 8 6 4 2 0

Concentración (mg/mL) %T A (A=2-logT%)

Desconocido 1
Desconocido 2

1.40
1.20
Abs (540 nm)

1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0 1 2 3 4 5 6 7
Concentración (mg/mL)

COMENTARIO
………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………...
Usando los valores obtenidos en % de trasmitancia, grafique usando el papel
semilogarítmico de esta página.

17
 100
80

% T (540 nm)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Concentración (mg/mL)

COMENTARIO
……………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
…………….

Firma del alumno Firma del profesor

SEMANA N° 5

FERIADO

PRACTICA N° I.4 SEMANA N° 6

18
 INSTRUMENTACIÓN: POTENCIOMETRIA
La potenciometría es el procedimiento de elección para la medida del pH. El pH
en una expresión numérica que corresponde al logaritmo de la inversa de la
concentración de iones H+. La potenciometría se basa en la diferencia de
potencial (voltaje) entre dos electrodos, el de medida y el de referencia, ambos
sumergidos en la solución y bajo condiciones de equilibrio.
El instrumento consta de un ELECTRODO DE REFERENCIA que se mantiene
constante durante la medida, un ELECTRODO DE MEDIDA que varia de
acuerdo a la concentración de hidrógeno de la solución y un dispositivo o
potenciómetro que mide la diferencia de potencial. El electrodo de referencia
puede ser de dos clase: de calomel, mercurio metálico y cloruro mercurioso y
de plata plata y cloruro de plata. El potencial de ese electrodo depende de la
solución de cloruro de potasio en que está sumergido internamente.
El electrodo de medida, es también llamado electrodo de vidrio, está constituido
por un tubo de vidrio cuyo extremo es particularmente selectivo al paso de
iones hidrógeno. En su interior hay ácido clorhídrico HCl 0,1 M y un alambre de
plata, cloruro de plata,

Batería

0V 1V

AAg.Aa Solución KCl.Hg2Cl2.Hg

HclgCl.HCl.Vidrio
Problema
.

En el potenciómetro, un voltaje variable se opone al de la celda de medida. Un

galvanómetro actúa como detector del punto nulo para indicar que es igual al
voltaje opuesto de la celda de medida. Conectando la celda desconocida al
circuito se produce un desnivel de voltaje que debe corregirse hasta alcanzar el

19
punto nulo. La magnitud de la corrección puede leerse como fuerza
electromotriz o como pH directamente.
En la práctica se ha usado los electrodos de pH para medir la concentración de
otros iones. Los electrodos tienen una membrana adicional que sólo es
selectiva al paso de determinado electrolito, sodio, potasio, calcio son medidos
bajo esta manera con facilidad. También existe el electrodo de CO2 que deja
pasar moléculas se este gas las que modifican el pH y por lo tanto son medidas
con el electrodo de vidrio de pH.

PARTE EXPERIMENTAL

TITULACIÓN DE UN ÁCIDO DÉBIL CON UNA BASE FUERTE.

Se trata de determinar el pH de un grupo de tubos con varios niveles de

titulación de ácido acético con hidróxido de sodio. Cuando se titula un ácido
débil con una base fuerte se produce un aumento de pH inicialmente rápido
para luego hacerse lento, dentro de ciertos márgenes y al final se alcaliniza
rápidamente. La identificación del cambio de pH en cierto período de la
titulación, se debe a la formación transitoria de una combinación de ácido débil
y la sal correspondiente. En el caso del experimento será la combinación de
ácido acético y acetato de sodio y son los componentes ordinarios de una
solución amortiguadora o solución buffer.
Para la experiencia preparar 11 tubos de acuerdo al siguiente esquema:

Tubo No mL acético 0,1 N mL NaOH 0,1 N mL agua destilada

1 5,0 0,0 5,0

2 5,0 0,5 4,5
3 5,0 1,0 4,0
4 5,0 1,5 3,5
5 5,0 2,0 3,0
6 5,0 2,5 2,5
7 5,0 3,0 2,0
8 5,0 3,5 1,5
9 5,0 4,0 1,0
10 5,0 4,5 0,5
11 5,0 5,0 0,0

Leer los tubos en el potenciómetro y graficar los resultados

14
13
12
11
10
9
8
pH

7 20
6
5
COMENTARIO

……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………

Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N° I.5 SEMANA N° 7

CINETICA ENZIMATICA
Las enzimas son proteínas que aceleran las reacciones químicas hasta su
punto de equilibrio.

La ecuación general de las enzimas es:

E + S ES E+P
C’ C››

21
La actividad enzimática se manifiesta y mide por:

Desaparición de sustrato
Formación de producto
Modificación de cofactor

Muchos factores modifican la actividad enzimática:

pH
Temperatura
Concentración de sustrato
Concentración de enzima
Tiempo de incubación

En nuestra práctica observamos el efecto de la pepsina sobre la albúmina del

huevo. La actividad enzimática se apreciará por la pérdida de la turbidez
proteica. La actividad enzimática reportar en función del % de formación de
producto par ello hacer uso de la siguiente ecuación:
% Formación de producto (FC) = 100 – (Abs tubos/Abs albúmina)*100
Donde: Abs tubo = Absorbancia de los tubos después del incubado.
Abs albúmina = Absorbancia de la albúmina (Abs = 0.995)

3. EXPERIMENTO.- Efecto del pH

El pH actúa sobre los grupos ionizados que pertenecen a los centros activos
de las enzimas. Los grupos que pierden la ionización pierden la capacidad de
interaccionar con el sustrato. Cada enzima tiene un pH óptimo de trabajo.

Preparar cinco tubos con:

TUBO Nº 1 2 3 4 5
pH 1,0 1,5 6,0 9,5 11
mL albúmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
mL HCL 1N 2,0 0,5 0,0 0,0 0,0
mL CO3Na2 0,0 0,0 0,0 0,5 2,0
mL agua destilada 0,0 1,5 2,0 1,5 0,0

Preincubar los cinco tubos más un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1%

a 37ºC por 5 minutos. Luego añadir rápidamente 3 mL de la pepsina
preincubada a cada uno de los tubos 1–5. Mezclar e incubar a 37ºC por 10 min.
Observar la diferencia o leerla en fotocolorímetro con filtro azul (420 nm).

4. EXPERIMENTO: Efecto de la temperatura.

Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimática por aumento

de la energía de activación. Pero paralelamente se va produciendo una
desnaturalización parcial de la enzima que la inactiva.

22
Preparar cinco tubos con:

TUBO Nº 1 2 3 4 5
mL albúmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL agua destilada 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

Preparar otros cinco tubos con:

TUBO Nº 6 7 8 9 10
mL pepsina 1% 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura:

TUBO Nº 1y6 2y7 3y8 4y9 5 10

Temperatura O ºC Amb. 37 ºC 70 ºC 37 ºC 100 ºC

Agregar los respectivos tubo Nº 6 al Nº 10 a los que hay que incubar a las
temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 – 5.

5. EXPERIMENTO. -Efecto de la concentración de la enzima

Aunque las enzimas no se destruyen ni con las reacciones, el aumento de ellas

en la cubeta de reacción incrementa la velocidad.

Preparar 5 tubos con:

TUBO Nº 1 2 3 4 5
mL albúmina 5,0 5,0 5.0 5,0 5,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0.5 0,5 0,5
mL agua destilada 1,5 2,5 3.5 4,0 4,5
mL pepsina 0,0 0,0 0.0 0,0 0,0

Incubar los 5 tubos a 37ºC por 5 minutos y enseguida añadir:

TUBO Nº 1 2 3 4 5
mL pepsina incubada 3,0 2,0 1,0 0.5 0,1

Incubar por cinco minutos a 37ºC. Observar al fotocolorímetro a 420 nm

(filtro azul), contra una lectura de agua.

6. EXPERIMENTO.-Efecto de la concentración del sustrato

23
 Si es una reacción enzimática incrementamos progresivamente la
concentración del sustrato, aumentará la velocidad enzimática (velocidad
inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta plana que no
modifica aunque sigamos aumentando el sustrato, habremos saturado la
enzima.
Preparar 6 tubos con:

TUBO Nº 1 2 3 4 5 6
mL albúmina 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL agua destilada 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0
mL pepsina 1% 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37ºC. Colocar 0,5
mL que pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5 minutos a 37ºC. Leer al
fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Restar la segunda lectura de la primera.
Graficar y comentar los resultados.

Experimento: Efecto del pH Experimento: Efecto de la

100
temperatura
100
% Formación producto

% Formación producto

80
80
60
60

40
40

20
20

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 20 40 60 80 100
pH Temperatura (ºC)
Comentario: Comentario:
………………………………………………… …………………………………………………
………………………………………………… …………………………………………………
………………………………………………… …………………………………………………
………………………………………………… …………………………………………………
………………………………………………… …………………………………………………

Experimento: Efecto de la Experimento: Efecto de la

concentración de enzima
concentración de sustrato
% Formación producto
% Formación producto

100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 3 24
4 5 6
Concentración enzima (mg/mL) Concentración de sustrato
Comentario: Comentario:
………………………………………………… …………………………………………………
………………………………………………… …………………………………………………
………………………………………………… …………………………………………………
………………………………………………… …………………………………………………
………………………………………………… …………………………………………………

Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N° II.1 SEMANA N° 8

DIGESTION DE CARBOHIDRATOS
El carbohidrato más importante en la alimentación es la glucosa, la cual
ingerimos bajo la forma de disacáridos (maltosa, sacarosa y lactosa) o de
almidón, polisacáridos formado por muchas moléculas de glucosa. El almidón
es el constituyente esencial de cereales, leguminosa, tubérculos y raíces. La
digestión del almidón se produce en el intestino delgado gracias a la presencia
de enzimas digestivas producidas por las glándulas salivares, el páncreas y la
pared intestinal. Estas enzimas son:
La alfa amilasa salivar
La alfa amilasa pancreática
La amilo 1,6 glucosidasa de la pared intestinal

Las alfa amilasas son enzimas que actúan a pH neutro y en presencia de iones
cloro. Rompen los enlaces amilo 1,4 dando como resultado oligosacáridos y
glucosa.
Existe dos formas de evaluar la actividad enzimática de la amilasa:
Por desaparición de sustrato: forma como desaparece el almidón el que
se aprecia por la reacción del lugol.

25
 Por formación de producto: forma como aparecen carbohidratos
reductores (glucosa) en el medio, los que se aprecian por reducción del
cobre.

En nuestra práctica evaluaremos la actividad enzimática de la amilasa sobre el

almidón mediante la reacción del remanente de almidón frente al yodo a mayor
decoloración, mayor actividad enzimática.

1. EXPERIMENTO.- Digestión del almidón por la amilasa salivar.

Para la experiencia preparar cuatro tubos de ensayo de acuerdo al siguiente

esquema.

TUBO 1 2 3 4
ml almidón 1% 2 2 2 2
ml Buffer fosfato pH 6,6 1 1 1 0
ml HCL 0,3N 0 0 0 3,4
ml Suero fisiológico 3 2,4 0 0
ml Agua destilada 0 0 2,4 0
Colocar en baño de María a 37ºC por 5 minutos. Agregar:
ml solución de saliva 0 0,6 0,6 0,6
Colocar en baño de maría a 37ºC por 20 minutos
Pasado este tiempo tomar 0,5ml de cada tubo y preparar cuatro tubos
más de acuerdo al esquema

TUBO
1 2 3 4
ml digestión tubo 1 0, 5 0 0 0
ml digestión tubo 2 0 0,5 0 0
ml digestión tubo 3 0 0 0,5 0
ml digestión tubo 4 0 0 0 0,5
ml HCL 0,05N 5 5 5 5
ml Solución yodada 0,5 0,5 0,5 0,5
Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolorímetro con filtro rojo
(660nm)

INFORME DE LA PRÁCTICA III

Nombre:
Grupo : Fecha:

Experimento 7.- Digestión del almidón por la amilasa salivar

26
 1.05

0.90

0.75

0.60
Abs

0.45

0.30

0.15

0.00
COMENTARIO:
……………………………………………………………………………………………
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
…………….

Firma del alumno Firma del profesor

SEMANA N° 9

SEMANA DE EVALUACIONES

SEMANA N° 10
27
 SEMANA DE LA MEDICINA

PRACTICA N° II.3 SEMANA N° 11

GLICOLISIS
La vía metabólica más importante para la glucosa es la vía glicolítica o de
Embden Meyehof. Esta presente, naturalmente, en todos los tejidos y es
responsable del aprovechamiento energético de la glucosa y aún de otros
carbohidratos. Tiene dos formas de manifestarse: la forma anaeróbica cuando
la concentración de oxígeno es baja, produce ácido pirúvico y ácido láctico, y
genera escasamente dos moléculas de ATP, tal como se aprecia en la
siguiente fórmula global.

GLUCOSA + 2ADP + Pi 2 lactato + 2ATP + 2H2O

Cuando la glicólisis transcurre en presencia abundante de oxígeno, tiene

como producto final el ácido pirúvico, el cual se transforma en acétil CoA
mediante el proceso de decarboxilación oxidativa, en ingresa al Ciclo de Krebs
donde produce 38 moléculas de ATP.

28
1. EXPERIMENTO.- Glicólisis.

La glicólisis anaeróbica (parcialmente) se demuestra por el aumento

de compuestos ácidos (pirúvico y láctico) en el tubo de reacción.
Para el efecto preparar cuatro tubos de acuerdo al esquema.

TUBO
1 2 3 4
ml solución de Potter pH 7,4 2,5 2,5 2,5 2,5
ml Glucosa 0,1 m 0,5 0,5 0,5 0,5
ml NAD 10m g/ml 0,2 0,0 0,2 0,2
ml ATP 5m g/ml 0,2 0,2 0 0,2
ml Nicotinamida 0,4m 0,1 0,1 0,1 0,1
ml Yodoacetato 0,1m 0 0 0 0,1
ml Agua destilada 0,1 0,3 0,3 0
Colocar en baño de maría 37ºC por 5 minutos
Gotas de rojo de fenol Ii Ii ii Ii
ml homogenizado de hígado 0,5 0,5 0,5 0,5

29
 Tapar e incubar 1 hora a 37ºC
Titular cada tubo con NaOH 0,01N hasta el color original

COMENTARIO:
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………….

RESPIRACIÓN TISULAR

La respiración tisular es el proceso por el cual se

aprovecha la energía almacenada en los
nutrientes (glucosa, ácidos grasos, aminoácidos)
a través del Acétil CoA, mediante procesos de
oxidación.
Durante el proceso de oxidación del Acil Coa se
forman equivalentes reductores en forma de
hidrógeno o electrones que ingresan a la cadena
respiratoria, localizada en las mitocondrias y
genera muchas moléculas de ATP. Como puede
apreciarse en el esquema adjunto hay tres
fuentes de generación de electrones que
producen 3 moléculas de ATP, el isocitrato, el
cetoglutarato y el malato y una que sólo
proporciona dos ATP que es el succinato, debido
a que ingresa al ciclo de Krebs a nivel de la
Coenzima Q y no del NAD como las otras.
El punto final del transporte de los electrones por
la cadena respiratoria es el oxígeno. Dos átomos de hidrógeno se unen a ½
molécula de oxígeno para forma una molécula de agua. El proceso
oxidativo de los nutrientes se puede seguir por el consumo de oxígeno. .

2. EXPERIMENTO: Respiración Tisular

El experimento estudia la respiración tisular mediante la manometría. Un

manómetro es un instrumento que mide los cambios en la presión de los
gases. Esta basado en el principio de vasos comunicantes, si colocamos un
líquido en dos recipientes que se comunican entre sí, ambas ramas serán
iguales siempre que sobre ellas exista la misma presión sobre una de ellas
disminuye los niveles de líquido se desigualan. Los equipos que usaremos
serán iguales o semejantes a los que se observan en el gráfico, es decir
constan de un ambiente cerrado para la reacción, un medio de absorción de
CO2 que puede combinar

Preparar dos frascos de acuerdo al siguiente esquema:

FRASCO Nº 1

30
ml Solución de Potter pH 7,4 3
ml Succinato de potasio 0,5m 0,3
ml Agua destilada 0,7
ml Homogenizado 0,5

Cerrar bien los frascos. Incubar a temperatura ambiente. Medir cada 2 minutos
la modificación del nivel del manómetro. Prepara un gráfico de consumo de
oxígeno vs tiempo.

Consumo de oxígeno en el tiempo

0.5
Volumen O2 consumido

0.4

0.3
(cm3)

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Comentario: Tiempo (Minutos)
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………

Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N° II.4 SEMANA N° 12

31
 COLESTEROL DE FRACCIONES LIPOPROTEICAS
Las proteínas son lípidos complejos resultado de unir la grasa con proteínas.
Los lípidos sanguíneos se encuentran bajo esta forma y divididos en cuatro
tipos de lipoproteína:

Alfa lipoproteína (HDL) ricas en proteínas y fosfolípidos

Pre –beta lipoproteínas (VLDL): ricas en triglicérido
Beta lipoproteínas (LDL): ricas en colesterol
Quilomicrones (Q): ricos en triglicéridos dietéticos

Toda las lipoproteínas tienen colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y proteínas,

pero en distinta concentración relativa.
El colesterol es la grasa que genera la arterioescleroris al depositarse en las
paredes de los vasos sanguíneos. El colesterol de las betalipoproteínas está en
actitud de depositarse en los vasos constituye la mayor parte del colesterol
sanguíneo. El colesterol de las alfa lipoproteínas (HDL) es aquel que está
siendo retirado de los vasos, por lo que su presencia es beneficiosa.
Para investigar el colesterol de las alfa lipoproteínas usamos un reactivo
precipitante (fosfotúngstico-cloruro de calcio) que precipita a las betas y
prebetalipoproteínas dejando en solución a las alfa, sobre las que se realiza la
reacción de color típica del colesterol.

1. EXPERIMENTO Dosaje colesterol total y colesterol HDL en sangre.

Se toma una muestra de sangre del paciente en ayuno de por lo menos 24

horas. La sangre se coloca en tubo limpio sin anticoagulante.

Preparar un tubo al que se le coloca:

1ml de suero límpido

0.1 ml de reactivo precipitante HDL o II gotas

32
Agitar y dejar en reposo por minutos al ambiente Centrifugar a 3 000 por 10
minutos separar el sobrenadante.

Preparar cuatro tubos límpidos y colocar:

TUBO Nº 1 2 3 4
ml Suero límpido
0,02 0 0 0
ml Sobrenadente anterior
0 0,02 0 0
ml Patrón de colesterol
0 0 0,02 0
ml Agua destilada
0 0 0 0,02
ml Reactivo de color
2 2 2 2

Agitar: Incubar por 15 minutos a 37ºC.

Leer al fotocolorímetro a 520 mu los tubos 1,2 y 3, llevando a cero con el

blanco (tubo4)
Cálculos
200

Colesterol mg/dl= -------- X D.O.(1 ó 2)

D.O (3)

2. EXPERIMENTO : Dosaje de triglicéridos

Preparar tres tubos con:

TUBO Nº 1 2 3
ml Suero
0 0,02 0
ml Patrón de triglicéridos
0 0 0,02
ml Reactivo de color
2 2 2

Agitar, incubar a 37ºC por 15 minutos

Leer al fotocolorímetro a 520 nm los tubos 2 y 3 llevando a “O” con el tubo 1

Conc. patrón

Triglicéridos mg/dl = ------- x D.O.(2)

D.O (3)

33
 INFORME DE LA PRÁCTICA : RIESGO CORONARIO

Nombre:
...............................................................................................................................
...............................................................................................................................
...............................................................................................................................
....................................

Experimento 3: Dosaje de colesterol total y colesterol HDL en sangre

Patrón:
Lectura:
Concentración:
Factor de Calibración:
Colesterol total:

3. EXPERIMENTO : Valoración de las lipoproteínas por electroforesis

en acetato de celulosa

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o

ácidos nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Los
ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al
polo positivo, mientras que las proteínas son moléculas cuya carga neta
depende del contenido de una serie de aminoácidos (fundamentalmente ácido
glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e histidina). Para la separación se
usa un gel de agarosa, poliacrilamida o acetato de celulosa. Al poner la mezcla
de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir
pasando por el papel, por la que las pequeñas se moverán mejor y
rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes
quedarán cerca del lugar de partida.
En resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un
campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de:
1) su carga eléctrica
2) su tamaño
3) la intensidad del campo eléctrico y
4) la temperatura del medio.
Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables
(principalmente -COO-y -NH3+), pueden encontrarse cargadas positiva o
negativamente, o bien permanecer eléctricamente neutras según la proporción
de los diversos grupos ionizados a un determinado pH.

En suero humano la composición normal es:

 Proteína total: 6,4 a 8,3 g/dL
 Albúmina: 3,5 a 5,0 g/dL
 Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dL
 Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dL
 Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dL
 Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dL

34

ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

Se usa para la separación y caracterización de proteínas y otras moléculas. El

soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de
adsorción mínimas, por lo que se evita la formación de colas y los solutos
pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras ventajas son:
1) La separación es muy rápida
2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeñas
3) Las tiras pueden hacerse transparentes
4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados
5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos

MATERIAL Y REACTIVOS

Material
- Tiras de acetato de celulosa (“Cellogel”)
- Papel de filtro para secar las tiras de acetato
- Cubeta de electroforesis
- Aplicador
- Fuente de electroforesis

Reactivos
-Tampón Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=8,6
-Solución de tinción: 0.1% (p/v) ponceau S stain en ácido acético 1%
-Solución de lavado: ácido acético 1%
-Suero

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Electroforesis:
- Humedecer en tampón las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su
uso, para su equilibrado.
- Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie
- penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve
cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la
esquina inferior derecha
- Depositar la muestra de suero en la tira de acetato de celulosa, en el extremo
próximo al cátodo.
- Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 100 voltios
durante 60 minutos.
Revelado:
- Finalizada la separación, depositar las tiras en una cubeta con solución de
tinción, de modo que queden cubiertas por el líquido, durante 10 minutos.
- Lavar las tiras en solución de destinción hasta que se observen bien las
bandas de proteína (rojo) sobre un fondo blanco.

TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS

Dibujar el patrón de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de
proteínas séricas, indicando la posición de ánodo y cátodo así como el punto

35
de aplicación de la muestra. Identificar las proteínas que corresponden a cada
banda y justificar el orden.

Comentario:
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……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
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Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N° II.5 SEMANA N° 13

TRANSAMINASAS
Una de las reacciones generales de los aminoácidos es la transaminación o
trasporte de un grupo amino de un aminoácido a un cetoácido, trasformado al
primero en cetoácido y al segundo en aminoácido.
Esta transformación posibilita la formación de carbohidratos a partir de
aminoácidos, esto es el fenómeno de la neoglucogénesis.
LA ecuación general de estas reacciones es:

R=CH-COOH + R-C-COOG R-C-COOH+R-CH-COOH

Nh2 O O NH2

En el caso de nuestro experimento la transaminasa que estudiaremos es la

transaminasa glutámico pirúvica que transforma el alfa cetoglutárico (cetoácido)
en glutámico (aminoácido) y a la alanina (animoácido) en perúvico (cetoácido).
Esa enzima que es particularmente rica en el tejido hepático es un excelente
herramienta de estudio clínico de ese órgano, en problemas como la hepatitis o
la cirrosis hepática.
El procedimiento de análisis se llevará a cabo mediante la cromatografía en
capa fina.

36
 PROCEDIMIENTO CROMATOGRÁFICOS

La cromatografía es un procedimiento de análisis por el cual una mezcla de

moléculas es separada en sus componentes mediante el uso de una fase
estacionaria y una móvil.
La fase estacionaria o soporte da nombre al tipo de cromatografía: papel,
columna, capa fina y la fase móvil es líquida o gaseosa.
La separación de componentes se produce por el fenómeno de partición por
solventes, esto es ante una mezcla de líquidos no miscible entre sí, algunos
componentes tendrán mayor posibilidad de localizarse en uno u otro
componente, aquellos que se localicen en el componente más lejano del
soporte migraran más y aquellos cercanos serán adsorbidos por el soporte.
Existen una forma identificatoria de medir la migración de las moléculas
analizadas y es el Rf. Este valor corresponde a la relación entre los cm
migrados por la molécula y aquellos migrados por el medio móvil.

1. EXPERIMENTO: Demostración de transaminación por cromatografía

Preparar 4 tubos de acuerdo la esquema:

TUBO Nº 1 2 3 4
ml cetoglutarato 0,2 M
0,3 0,3 0 0
ml alanina 0,2M
0,3 0,3 0 0
ml piruvato 0,2M
0 0 0,3 0,3
ml glutamato 0,2M
0 0 0.,3 0,3
ml arsenito 0,1M
0,4 0,4 0,4 0,4
ml Enzima activa
0 1 0 1
ml Enzima inactiva
1 0 1 0

37
 a
RF =-----------------
b

b a
a

Incubar todos los tubos por 45 minutos a 37ºC. Retirar los tubos del baño de
María y agregar 6ml de alcohol etílico a cada tubo. Agitar y esperar por dos
minutos. Centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografía.

Cromatografía
Marcar a 3 cm del borde una línea suave con un lápiz, tratando de no dañar la
sílica gel. Marcar en esa línea seis puntos separados por 2 cm cada uno.
Colocar en cada punto cinco gotas del respectivo sobrenadante y en las dos
últimas 5 gotas de alanina y cinco de glutamato respectivamente. Dejar secar
Colocar la cromatoplaca en una cámara de cromatografía con una mezcla de
propanol: agua en la proporción de 8: Dejar correr hasta que el nivel líquido le
falte 1 cm para llegar al extremo de la placa. Marcar el nivel al que alcanzó el
líquido con un lápiz y dejar secar.

Aplicar con un spray una solución de ninhidrina al 0,1% e butanol. Colocar a la

estufa por 10 minutos. Marcar las manchas obtenidas.

Obtener el Rf de cada mancha mediante la fórmula:

Distancia de origen al punto medio de la mancha

Rf:

Distancia de origen al nivel máximo del solvente

Comentario:
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………….

Firma del alumno Firma del profesor

38
 SEMANA N° 14

FERIADO

PRACTICA N° III.1 SEMANA N° 15

EVALUACION NUTRICIONAL
Experimento 1.- Manejo de Tablas de Composición de Alimentos

La forma más exacta de evaluar la ingesta de nutrientes por un sujeto es a

través del cálculo de la ingesta alimentaria, bien documentada y exacta y
mediante las Tablas de Composición de Alimentos. En la presente práctica
analizaremos:

1. Las necesidades calóricas de un sujeto: tomando en cuenta, peso y

trabajo. Así conocemos que una persona gasta como Metabolismo Basal
1 kcaloría /kg. Peso/hora. A ello añadimos aproximadamente un 50% por
trabajo de mediana intensidad.
2. Las necesidades proteícas de un sujeto: tomado su peso, aceptamos
una necesidad de 1g/kg de peso/día( en condiciones mínimas 0,5/kg
peso/día).
3. Las necesidades de nutrientes (proteína, carbohidratos y grasa) de un
día al azar. Con ello podemos establecer su ingesta calórica y proteíca y
por lo tanto su déficit o adecuación.

Para el efecto usaremos la siguiente Tabla de Composición de Alimentos

resumida.

TABLA DE COMPOSICIÓN DE ALIMENTOS

g/100g de alimento

Alimento Proteína Lípido Carbohidratos

Atún (conserva) 29,0 4,8 0,0

Bacalao (seco) 81,8 2,8 0,0
Calamar 16,4 0,9 0,0
Camarón 17,3 0,2 2,5

39
 Carne (cerdo) 15,0 15,1 0,0
Carne (Pavo) 20,1 20,2 0,0
Carne (pollo) 18,2 10,2 0,0
Carne (pulpa) 21,3 1,6 0,0
Carne Seca 48,1 9,4 0,0
Chicharrones 11,3 61,4 0,0
Cojinova 20,2 0,7 0,0
Corvina 19,9 0,9 0,0
Hígado 19,5 6,6 3,6
Huevo (total) 12,8 11,8 1,0
Jamón del País 15,9 26,6 0,0
Jamón Inglés 25,8 20,5 0,0
Leche fresca 2,9 3,3 7,0
Lenguado 19.0 0,5 0,0
Merluza 19,3 0,8 0,0
Pejerrey 18,7 1,2 0,0
Queso Fresco 16,0 10,3 3,7
Queso mantecoso 25,8 20,2 7,4
Tocino 9,1 65,0 1,6
Trucha 18,2 1,0 0,0

Alimento Proteína Lípido Carbohidratos

Arroz (seco) 6,5 0,7 78,1

Arveja (verde) 8,3 0,7 24,2
Avena 10,6 0,9 68,5
Bizcocho 8,8 6,9 64,4
Camote 1,2 0,2 27,1
Fideos 8,7 0,3 78,3
Frejol negro 21,2 1,7 53,3
Frejol soya 33,4 16,4 35,5
Frejol tarhui 40,9 13,4 27,3
Galletas (soda) 9,4 14,7 67,9
Galletas (Vainilla) 6,0 12,7 75,0
Garbanzo 19,1 5,1 61,4

Alimento Proteína Lípido Carbohidratos

Lentejas 22,8 1,2 59,4

Maíz (cancha) 6,7 2,7 79,8
Maíz (choclo) 3,3 0,8 27,8
Maní 28.8 46,9 18,1
Nuez 13,7 67,2 13,2
Olluco 0,8 0,1 14,2
Pallares 19,9 1,1 61,8

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 Pan (frances) 9,2 0,3 68,2
Papa blanca 2,1 0,3 22,4
Papa Seca 8,3 0,5 73,2
Quinua 11,9 4,7 67,6
Yuca 0,8 0,2 39.3
Aceitunas 1,2 33,2 6,8
Blanquillo 0,6 0,1 17,1
Cebolla 0,9 0,1 7,4
Coco 3,8 18,9 19,7
Col 1,4 0,0 5.2
Coliflor 2,0 0,6 5,8
Lechuga 1,4 0,2 3,3
Nabo 0,8 0,2 5,2
Pepina 0,5 0,1 2,7
Rabanitos 0,8 0,0 3,1
Tomate 0,8 0,2 4,0
Zanahoria 0,6 0,4 9,5
Zapallo 0,7 0,2 6,4

Alimento Proteína Lípido Carbohidratos

Aceite 0,0 100 0,0

Azucar 0,0 0,0 99,5
Chocolate 2.0 30,0 60,0
Cocoa 9,0 19,0 31,0
Gelatina(seca)* 85,6 0,1 0,0
Limón 0.5 0,0 11,2
Maizena 8,0 3,0 74,0
Margarina 0,6 81 0,4
Naranja 1.2 0,0 11,2
Palta 1,7 12,6 6,5
Papaya 0,4 0,1 8,3
Platano isla 0,8 0,2 23,8
Uva negra 0,3 0,1 17,9

* Se usan al 3-4g%

GASTOS DE ENERGIA DE ACUERDO A ACTIVIDAD Y SEXO

ACTIVIDAD MUJER : HOMBRE :

Kcal /kg/hora Kcal /k Kg/hora
Durmiendo 1,1 1,0 – 1,2 ,9-
Muy Ligera: manejo de auto, 2,0 1,2 – 2.5
laboratorio, mecanografía, coser 1,1-
y planchar
Ligera: caminar, carpintería, 3,9 2,5-4,9
mecanica, lavado de ropa 2,0-
Moderada: fregar pisos, 5,9 5,0-7,4
ciclismo, tenis, baile 4,0-

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 Pesada: albañil, natación, fútbol, 10,0 7,5-12,0
básquetbol. 6,0-

Firma del alumno Firma del profesor

SEMANA N° 16

EVALUACION CONTINUA

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