GL-UJTL Versión 1

GUÍAS DE Elaboró. Reviso Página 1 de 1

LABORATORIO y aprobó, Javier
DE BIOLOGÍA LABORATORIO Hernández
2018 Fernández,
MOLECULAR profesor

II. Extracción de ADN de tejido

1. Objetivos:

Introducir a los estudiantes a las técnicas básicas de biología molecular,

realizando la extracción de ADN de tejido, empleando un método tradicional.

2. Definición y Abreviaturas:

2.1. Definición:

La extracción de ADN se define como la obtención de ácido desoxirribonucleico

libre de proteínas y ARN, a partir de tejido animal mediante la adición de una
solución buffer o tampón de extracción, en presencia de agentes quelantes, de
soluciones de baja o alta fuerza iónica (para que sea soluble el ADN) y de altas
concentraciones de NaCl. Los agentes quelantes permiten la protección del ADN
de las enzimas nucleasas capturando los cationes e impidiendo que actúen como
cofactores de nucleasas. Las altas concentraciones de NaCl previenen la
contaminación de la muestra con polisacáridos que afectan la pureza del ADN y
finalmente los detergentes aniónicos, permiten solubilizar las proteínas, tejidos y
membranas, evitando que el ADN quede atrapado en los desechos celulares.

2.2. Abreviaciones:

ADN: Acido desoxirribonucleico

H2O2: Agua destilada
Tris HCl: Solución de Sal Acida o Tris Base- Ácido Clorhídrico
TBE: Tris/Borato/EDTA
SDS: Dodecilsulfato Sódico
EDTA: Acido Diaminoetanol - Tetra acético
OHBr: Azul de Bromofenol
U.V.: Luz Ultra Violeta
pb: pares de bases
M: Molar
mM: Milimolar
w/v: Peso / Volumen
gr: Gramos
ml: Militros
µl: Microlitros
V.: Voltios
min: Minutos
[ ]: Concentración
°C: Grados centígrados

3. Preparación de Reactivos:

Tris-Base (Tris-HCl) 1 M:
Disuelva 121.1 gr de Tris-Base en 800 ml de agua destilada. Ajuste a pH 8.0
adicionando 42 ml HCl (concentrado al 37%). Completar con agua destilada a
1000 ml y almacenar a temperatura ambiente.

Ácido Diaminoetanol- Tetra Acético (EDTA) 0,5 M:

En una probeta de 1000 ml disuelva 186.1 gr EDTA en 800 ml de agua destilada;
agitar vigorosamente hasta que el precipitado desaparezca, no olvide ajustar el
pH a 8 con NaOH; llevar a 1000 ml. Almacenar a temperatura ambiente.

Dodecilsulfato Sódico (SDS) al 10%:

Disolver 10 gr de SDS en 90 ml de agua destilada, calentar a 68°C, completar el
volumen a 100 ml de agua destilada y almacenar a temperatura ambiente.

Azul de Bromofenol (Buffer de Carga):

En un tubo falcón de 50 ml mezcle: 0.125 gr de Azul de Bromofenol, 20 gr de
Sacarosa y complete con agua destilada a 50 ml. Almacenar a temperatura
ambiente.

Etanol al 70%:
Diluir 70 ml de Etanol absoluto con 30 ml de agua destilada. Almacenar a -20°C.

Solución de Acetato de Potasio:

En un recipiente de 250 ml mezcle 60 ml de Acetato de potasio 5 M, con 11,5

ml de ácido acético glacial y 28,5 ml de agua, disuelva bien. Almacenar a
temperatura ambiente.

Cloroformo Alcohol Isoamilico (24:1):

Mezclar bien, en un recipiente de vidrio estéril con tapa, 24 partes de cloroformo
con 1 parte de alcohol isoamilico. Almacenar a temperatura ambiente.
Almacenar a 4°C

4. Introducción

La Biología Molecular ha tenido un desarrollo impresionante desde 1953, año en

el que Watson y Crick propusieron una estructura molecular para el DNA. Desde
entonces la extracción de ADN se ha implementado para la utilización de
marcadores genéticos en estudios de filogenia, identificación de especies,
genética de poblaciones y otras.
En general obtener ADN, se ha convertido en una tarea fundamental para toda
técnica derivada de DNA recombinante e Ingeniería Genética, estos
procedimientos han logrado un avance en el conocimiento del código genético,
técnicas que ya han hecho posible clonar organismos enteros (Paniagua, 1999).
Inicialmente, los procedimientos eran largos y tediosos, gastando gran cantidad
de horas diarias para la obtención del ADN de buena calidad y cantidad suficiente
para poder manipular, en cambio hoy en día se extrae suficiente ADN de buena
calidad en poco tiempo.

5. Método de Trabajo:

5.1. Productos Empleados:

 Solución de Lisis de Tejido (Tris-HCl 10 mM pH 8.0, EDTA 1 mM y 0,1% SDS)

 Solución de Acetato de Potasio
 Nitrógeno Liquido
 Proteinasa K 100 mg/ml
 Etanol absoluto 100%
 Etanol 70%
 Agua destilada desionozada

5.2. Equipos y Materiales:

 Guantes de látex
 Bisturí
 Cámara de Flujo Horizontal
 Morteros
 Espátula
 Set de tubos Eppendorf. 1,0 ml
 Set de tubos Eppendorf 1,5 ml
 Set de puntas de micropipeta 0,5-10 µl
 Set de puntas de micropipeta 10-100 µl
 Set de puntas de micropipeta 100-1000 µl
 Centrifuga
 Fotodocumentador
 Balanza analítica
 Set de micropipetas
 Cámara horizontal de electroforesis
 Vortex
5.3. Material Biológico:

 Hígado y corazón de pollo y/o vaca suministrado por un almacén de cadena

y almacenado a 4°C. para su posterior utilización.

6. Extracción de ADN de tejido:

Pese 5 gr de tejido, deposítelos en un mortero y agregue nitrógeno líquido,

macere cuidadosamente hasta pulverizar la muestra. En un tubo Eppendorf
de 1.5 ml mezcle 600 µl de solución de lisis (10 nM Tris-HCl pH 8.0, 1 nM
EDTA y 0.1 (W/S) de SDS) con 50 mg de muestra y homogenice en el vortex
durante 3 a 5 minutos, adicione 5 µl de proteinasa K e incube a baño maría
durante 30 minutos a 80°C. Una vez finalizado el tiempo de incubación deje
enfriar la muestra a temperatura ambiente. Luego, centrifugue durante 3
minutos a 14.000 rpm. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y agregue
un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1) homogenice por
inversión varias veces hasta obtener una mezcla blanca y centrifugue
nuevamente por 3 minutos a 14.000 rpm. Saque cuidadosamente el tubo de
la centrifuga y en otro tubo adicione la fase acuosa.

Figura 1. Ejemplo paso a paso del método de extracción de ADN de tejido eucariota (Leer
en el texto la explicación)

Agregue 200 µl de solución de acetato de potasio (60 ml de acetato de potasio

5M, 11.5 ml de ácido acético glacial y 28.5 ml de agua) y homogenice por 20
segundos, enseguida centrifugue a 14.000 rpm por 3 minutos (el pellet de
proteínas se debe ver al fondo del tubo, si no es visible incubar la muestra por 5
minutos en hielo y repetir la centrifugación). Transfiera el sobrenadante a un tubo
nuevo y agregue 600 µl de etanol absoluto, homogenice la solución y centrifugue
a 14.000 rpm por 5 minutos. Luego elimine cuidadosamente el sobrenadante y
agregue sobre el pellet 600 µl de etanol al 70%, homogenizar por inversión y
centrifugar por 5 minutos, descartar el sobrenadante y permitir que el pellet se
seque por 15 minutos a temperatura ambiente. Disolver el pellet de ADN en 50
µl de agua destilada desionizada y almacenar a -20°C.

7. Preinforme:

 Realice un diagrama de flujo que muestre de forma clara y concisa cada uno
de los pasos que se llevarán a cabo en el desarrollo de la práctica de
laboratorio enunciada en esta guía. No omita tiempos, concentraciones de
los reactivos, temperaturas, ni volúmenes. Recuerde que el diagrama debe
permitir realizar la práctica sin ningún error.
 Conteste las siguientes preguntas utilizando bibliografía especializada y la
literatura recomendada en esta guía. No olvide citar las fuentes de donde fue
sacada la información y realizar la respectiva bibliografía al final del
cuestionario.

8. Cuestionario:

 ¿Qué importancia tiene para la Biología Molecular, ecología, evolución,

botánica, biología de la conservación y zoología realizar estudios con ADN
nuclear, mitocondrial y de cloroplastos?
 ¿Qué diferencias existen entre la extracción de DNA bacteriano y la de
células eucariotas como hígado de pollo?
 ¿De qué está compuesta la cromatina? ¿Qué aminoácidos en mayor
proporción presentan las histonas? Y qué razón tendría la presencia de esos
aminoácidos?
(Vaya a esta dirección y lea la información presentada:
http://www.dnaftb.org/29/index.html)
 ¿Por qué es importante extraer el ARN, y en que estudios de Ingeniería
Genética y Biología Molecular se pueden implementar?

9. Bibliografía:

 Junqueira, I.C. y Carneiro, J. 1998. Biología Celular y Molecular, 6ª ed.

Omega, McGraw-Hill Interamericana, Madrid.
 Lewin, B. 2008. Genes IX. Novena Edición. McGraw-Hill Interamericana
Editores, S.A. de C.V. México.
 Luque, J. & Herráez, A. 2001. Texto Ilustrado de Biología Molecular e
Ingeniería Genética, Conceptos, Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la
Salud. Ediciones Harcourt, S.A. Madrid, España.
 Paniagua. 1999. Biología Celular. McGraw-Hill Interamericana, Madrid.
 Sambrook, J. y Russell, D. 2001. Molecular Cloning a Laboratory Manual. 3 ra
ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.
10. Bibliografía Recomendada:

 Dahm, R. 2005. Friedrich Miesher and the Discovery of DNA. Developmental

Biology 278: 274-288
 Isaksson, J., Acharya, S., Barman, J., Cheruku, P. and Chattopadhyaya, J.
2004. Single-Stranded Adenine-Rich DNA and RNA Retain Structural
Characterizatics of Their Respective Double-Stranded Conformations and
Show Directional Differences in Stacking Pattern. Biochemistry. 43:15996-
16010
 Rodríguez, D., Bastida, R. and Olsson, P. 2002. DNA Extraction from
Formalin Fixed Franciscana Tissue. Lajam 1(1):123-128, Special Issue 1
 Alonso, C. D., Santana, H. G., Vigil, A. M. A., González, Y. S., Martínez, L.
F., & Moleón, V. R. (2015). Nuevos métodos de extracción de ácidos
ribonucleicos (ARN): herramientas básicas en la biología molecular. Revista
Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia, 31(4).
 Rodríguez-Correa, H., González-Rodríguez, A., & Oyama, K. (2017).
Perspectivas de la Ecología Molecular en un país megadiverso. Revista
Mexicana de Biodiversidad, 88, 3-13.
 Almendáriz, A., Brito, J., Batallas, D., Vaca-Guerrero, J., & Ron, S. R. (2017).
Una especie nueva de rana del género Chiasmocleis (Microhylidae:
Gastrophryninae) de la Cordillera del Cóndor, Ecuador. Papéis Avulsos de
Zoologia, 57(10), 119-136.
 Argüello-Sánchez, L. E., & García-Feria, L. M. (2014). La genética como
herramienta para el estudio y conservación del género Alouatta en
México. Acta zoológica mexicana, 30(2), 387-394.
 Rodríguez, M. D. P. C., Santos, A. M., & García, J. M. G. (2016).
Biodiversidad y especiación en los caprélidos (Crustacea: Amphipoda):¿
Cuánto falta por descubrir?. Chronica naturae, (6), 24-32.
 Martínez-Luque, E. O., Zurita-García, M. L., & Zaldívar-Riverón, A. (2016).
Inventario de las especies de elatéridos (Coleoptera: Elateridae) de un
bosque tropical caducifolio mexicano. Revista mexicana de
biodiversidad, 87(3), 956-965.
 Peña-Salamanca, E. (2017). El complejo Bostrychietum: la flora de algas
asociadas a las raíces del manglar en la costa pacífica colombiana. Revista
de la Academia Colombiana de Ciencias Exactas, Físicas y
Naturales, 41(160), 338-348.
 Noa-Carrazana, V. J. C. (2015). Ecología, biotecnología y conservación del
género.