ENZIMAS.

Lisbeth A. Nanclares.
Programa de, Facultad de , Universidad del Cauca

Fecha de la práctica: / /2015, Fecha de entrega: / /2015

RESUMEN
En la práctica realizada en el laboratorio, se estudió la actividad enzimática de la amilasa salival a
través de diferentes condiciones tales como: temperatura y pH, la especificidad y la influencia de los
activadores e inhibidores, mediante diferentes procedimientos. Las enzimas son moléculas de
naturaleza proteica y estructural que catalizan reacciones químicas, en estas reacciones, las enzimas
actúan sobre otras moléculas denominadas sustratos, para dar diferentes productos. Casi todos los
procesos en las células necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. [1]

1. RESULTADOS  Labilidad Térmica de las Enzimas.

Se tomó 3 tubos de ensayo, en cada uno se adiciono 1 mL de saliva diluida (amilasa), la enzima del
tubo 1 se llevó hasta ebullición por 1 o 2 minutos. Y se procedió con cada tubo de la siguiente
manera:
El tubo 3 se colocó en hielo y los tubos 1 y 2 se colocaron en el termostato a 37 °C, y se les añadió a
cada tubo 2 mL de la solución de almidón, después de 10 minutos a cada tubo se le añadió una gota
del reactivo de lugol. Los resultados se encuentran en la Tabla 1.

Tubo Enzima Condiciones del Sustrato Incubación Coloración

experimento con yodo
1 Amilasa Enz calentada prev Almidón 10 min, 37ºC Azul oscuro

2 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 37ºC Azul claro

3 Amilasa Enzima nativa Almidón 10 min, 0ºC Azul intenso

Tabla 1. Labilidad térmica de las enzimas.

 Influencia del pH sobre la actividad de las enzimas.

En tres tubos de ensayo se adiciono 2 mL de las disoluciones amortiguadoras, de diferentes pH,
posteriormente se añadió 1 mL de saliva diluida y 2 mL de almidón, se mezcló y se incubo durante 10
minutos en termostato a 37°C. Por ultimo en cada tubo se añadió 1 gota del reactivo de Lugol. Los
resultados obtenidos fueron los siguientes:

Tubo Enzima pH del medio Sustrato Incubación Coloración

con yodo
1 Amilasa 5 Almidón 10 min, 37ºC Azul oscuro
2 Amilasa 6.8 Almidón 10 min, 37ºC Azul oscuro
3 Amilasa 8 Almidón 10 min, 37ºC Transparente
Tabla 2. Influencia del pH.

 Especificidad de la Enzima.
Se tomó 4 tubos de ensayo, en los tubos 1 y 2 se adiciono 2 mL de almidón y en el tubo 3 y 4, 2 mL de
sacarosa, posteriormente al tubo 1 y 3 se añadió 1 mL de saliva diluida y a los tubos 2 y 4, 1 mL de
solución de invertasa. Se llevó al termostato a 37°C por 10 minutos. En seguida a los tubos 1 y 2 se
añadió 1 gota del reactivo de lugol y a los tubos 3 y 4 0.5 mL del reactivo de fehling y se calienta. Los
resultados obtenidos fueron los siguientes:

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 Tubo Enzima Sustrato Incubación Coloración Reacción
con yodo de Fehling
1 Amilasa Almidón 10 min, 37ºC Azul claro --
2 Invertasa Almidón 10 min, 37ºC Blanco --
3 Amilasa Sacarosa 10 min, 37ºC -- Azul claro
4 Invertasa Sacarosa 10 min, 37ºC -- Café-rojizo
Tabla 3. Especificidad de las Enzimas.

 Influencia de los activadores e inhibidores.

Se tomó 2 tubos de ensayo y se adiciono en cada uno 2 mL de disolución de almidón, en el tubo 1 se
añadió 1 mL de la disolución de cloruro sódico 1%, en el tubo 2, 0.5 mL de disolución de sulfato
cúprico 1%. A ambos tubos se les adiciono 0,5 mL de saliva diluida, se mezcló y se incubo durante 10
minutos en termostato a 37°C, posteriormente se añadió 1 gota de lugol a cada tubo. Los resultados
obtenidos experimentalmente fueron los siguientes:

Tubo Enzima Sustrato Incubación Coloración con

yodo
1:NaCl Amilasa Almidón 10 min, 37ºC Azul claro
2:CuSO Amilasa Almidón 10 min, 37ºC Azul claro
4
Tabla 4. Influencia de los activadores e inhibidores.

2. ANALISIS DE RESULTADOS

La saliva humana se caracteriza por ser un

fluido que cumple con una variedad de
funciones en el organismo como la digestión,
la lubricación de los alimentos para permitir un
mejor transporte del bolo alimenticio, mantener
el pH a un valor de 6,5 - 7,2 por lo que se dice
que tiene capacidad de buffer, este pH es
óptimo para que pueda actuar la amilasa
salival o ptialina [2]. La composición de la
saliva se estima en un 99% de agua y en 1%
de diferentes solutos.
Las condiciones óptimas de la amilasa salival o
ptialina son:
pH optimo 7.0
Temperatura óptima: 37°C
La α-amilasa es la responsable de la
degradación del almidón y del glucógeno
presentes en los alimentos, para formar
azucares simples (glucosa y maltosa), esta
enzima actúa sobre los enlaces α 1-4 (ver
figura 1), que unen a las glucosas (enlaces
glicosidicos) generando disacáridos
oligosacáridos como la Maltosa, Maltotriosas,
etc. [3 y 4]
Figura 1. Estructura del almidón, los enlaces
de coloración azul corresponden a los enlaces
α1-4, los cuales se romperán por la alfa
amilasa, generando disacárido de maltosa
(sección punteada)
Existen diversas reacciones cualitativas para
poder identificar los carbohidratos presentes
en los productos finales después del
tratamiento con la amilasa salival, o de
cualquier otro tratamiento químico, uno de los
utilizados en la práctica de laboratorio es el
reactivo de Lugol, que es una solución
compuesta por una disolución de yodo- diyodo
disuelto en una disolución de yoduro de
potasio, esta solución permite mantener al

2/4
yodo en forma ionizada, y generar una especie
I3-, el cual reacciona con la amilosa que forma
una espiral lineal, el I3- se incrusta en ella
dando una coloración (ver figura 2), azul, si el
almidón está parcialmente hidrolizado la
coloración será pardo rojiza.
Figura 2. Incrustación del yodo en la elice de
la amilosa.
Otro método utilizado es el del reactivo de
Fehling. Esta prueba se utiliza para el
reconocimiento de azucares reductores. Los
azucares reductores en medio alcalino, son
capaces de reducir el ion Cu 2+ de color azul a
Cu+ de color rojo. [5]
En la práctica se utilizó un compuesto un
azúcar reductor (sacarosa), el cual debe dar
positivo para el reactivo de Fehling.
El fin de nuestro estudio es analizar y observar
los cambios que sufre la actividad de la
amilasa cuando se varía alguno de los
parámetros del sistema, los parámetros
estudiados son la labilidad térmica, influencia
de pH, la especificidad de una enzima e
influencia de inhibidores y activadores.
Iniciemos observando el parámetro de la
labilidad térmica y así sucesivamente en el
orden anterior.
Es sabido que el aumento de la temperatura
en una reacción química proporciona una
mayor cinética en el sistema generando una
mayor probabilidad de choques efectivos, lo
que da como resultado una mayor velocidad
en la reacción, por cada 10 °C de incremento
en la temperatura la velocidad de reacción se
duplica [6], esta ley cinética es seguida también
por las enzimas en general, Sin embargo por
ser proteínas pueden sufrir una
desnaturalización por rompimiento de los
enlaces de hidrogeno que mantienen la forma
nativa de las proteínas, por lo que es necesario
una temperatura optima que genere el mayor
efecto cinético, esto es una mayor actividad
enzimática, sin que haya una desnaturalización
de la enzima, este tipo de desnaturalización es
irreversible; la disminución de la temperatura
también ocasiona una desnaturalización pero
esta es reversible, la cinética disminuye al
igual que los choques efectivos que
proporciona la reacción química, por lo que la
actividad de la enzima también disminuye,
pero no se suprime.
En la figura 3 se muestra un esquema en
general de la temperatura óptima de una
enzima, la temperatura de desnaturalización
reversible e irreversible.
Figura 3. Temperatura óptima, temperatura de
desnaturalización reversible e irreversible.
Si se observa la Tabla 1, se obtuvieron
diferentes resultados para la variación de la
temperatura, el tubo de ensayo 1 se sometió a
una temperatura alta (100 °C) lo que conllevo a
la desnaturalización irreversible de la enzima
por lo tanto una pérdida total de su actividad
enzimática, la coloración presente fue azul
oscuro al momento de adicionar el reactivo de
Lugol por lo que se concluye la presencia de
almidón, el tubo de ensayo 2 se incubo a 37 °C
la cual se obtuvo como la temperatura óptima
permitiendo que la actividad enzimática sea
máxima y así garantizar una óptima hidrólisis
de los enlaces α 1-4 del almidón, al adicionar
el reactivo de Lugol se obtuvo una coloración
azul claro, lo que indico también presencia de
almidón, en este caso se podría decir que
empezó a haber hidrolisis del almidón, es decir
empieza a degradarse en disacáridos o
3/4
glucosa, ya que la coloración fue más clara, el
tubo de ensayo 3 se llevó a una
desnaturalización reversible disminuyendo su
temperatura, al adicionar Lugol se obtuvo una
solución Azul intensa, lo que indica presencia
de almidón. [7 y 8]
Las enzimas son proteínas, y por lo tanto son
poli electrolitos, como consecuencia de ello el
pH tiene un efecto importante sobre la
velocidad de las reacciones enzimáticas. La
carga neta de las proteínas varia con el pH,
por esta razón a determinados valores las
cargas de los residuos de los aminoácidos que
participan en el sitio activo está en condiciones
óptimas para la actividad catalítica [9] .Por lo
tanto a ese pH la velocidad de la reacción será
máxima si se toma esta variable como única
claro está. Por supuesto, en valores de pH
demasiados ácidos o alcalinos, no solamente
podrá ser modificado el sitio activo, si no que la
estructura ternaria de toda la molécula se
encontrara alterada e incluso puede llegar a
desnaturalizarse inhibiéndose la actividad
enzimática. Para cada enzima existe un pH
óptimo en relación con la actividad, para la α-
amilasa el rango se encuentra entre 6,7 - 7,2
[10]
pH optimo
V
1 2 3 4 5 6 7 8
pH
Figura 4. pH óptimo para la α-amilasa
Los pH que se emplearon para determinar la
influencia de este parámetro en la enzima
salival fueron 5, 6,8 y 8. Como ya se había
mencionado anteriormente se espera que los
pH extremos; es decir muy ácidos o muy
básicos inactiven la enzima, cuando la α-
amilasa entra en contacto con el almidón se
produce la hidrolisis de este polisacárido a
unidades de azucares más pequeñas, al
adicionar el reactivo de Lugol (que se utiliza
como un test colorimétrico que detecta el
almidón), compuesta por con una solución de
iodo/ioduro de potasio (I 2/KI) interacciona con
el polisacárido formando un complejo en
solución que adquiere una coloración azul
característica cuando la actividad enzimática
no se lleva a cabo completamente en las
condiciones óptimas, en los tubos 1 y 2 esta
coloración se observó pues en estas
condiciones la α-amilasa no hidroliza
completamente al almidón, contrariamente
sucede cuando el pH es 8,0; procedimiento
realizado en el tubo 3, dando como resultado
una solución incolora sin embargo se esperaría
que fuera en el tubo 2 donde se obtuviera este
resultado, ya que está en un valor cercano al
pH optimo por ende debió tener una mejor
actividad catalítica en pH 6.8. el error pudo
haberse dado en la rotulación de los tubos o
en un error de procedimiento.
Una de las características más importantes de
los enzimas es su alta especificidad sobre la
reacción que catalizan. Cada enzima cataliza
un solo tipo de reacción, y casi siempre actúa
sobre un único sustrato o sobre un grupo muy
reducido de ellos. Esta especificidad se debe a
la complementariedad que debe existir entre el
sustrato y el centro activo del enzima.
En la tabla 3 se puede observar claramente lo
anteriormente enunciado, por ejemplo la
amilasa solo actúa sobre almidón y la sacarasa
(invertasa) sobre sacarosa, este tipo de
especificidad es denominada especificidad de
sustrato, lo que significa que cada enzima sólo
puede actuar sobre un determinado sustrato o
sobre un reducido número de sustratos.
La sacarasa es también llamada invertasa
debido a que puede disociar a la sacarosa en
sus monómeros esenciales, glucosa y fructosa
Figura 5. Reacción de inversión de la
sacarosa en sus monómeros constituyentes
Tal y como se puede observar en la Tabla 3 la
amilasa solo actúa sobre el almidón, se puede
observar que para el tubo 1 y 2, en el tubo 1 el
almidón se degrada por la acción de la
amilasa, disminuyendo la intensidad del color
azul. Y en el caso de la sacarosa tubos 3 y 4 la
invertasa solo actúa sobre la sacarosa
generando una coloración café-rojizo (ladrillo)
característica para la prueba de fehling, que se
4/4
utiliza para indicar presencia de azucares
reductores.
La actividad de los enzimas está regulada
tanto por su medio interno como externo; por
una serie de diferentes tipos de sustancias de
bajo peso molecular que actúan sobre la
enzima. Estas sustancias pueden causar
efectos activadores, acciones que son
llevadas a cabo por algunas sustancias no
proteicas como iones metálicos y algunos
aniones. Otro tipo de compuestos disminuyen
la actividad por lo que se denominan
inhibidores, pueden alterar la conformación de
la enzima por lo tanto su actividad. Los
iones cloruro hacen parte la composición
salival, activan a la α-amilasa ya que se
introducen en su sitio activo aumentando la
actividad enzimática.
Activadores Inhibidores
Cloruro Sales de Hg y Ag (plata)
Yoduro Proteína (germen del trigo)
Bromuro --
Nitratos --
Tabla 5. Algunos activadores e inhibidores que
actúan sobre la α-amilasa
En la práctica se utilizó NaCl y CuSO4 para
determinar la influencia de los activadores e
inhibidores, en el tubo de ensayo 1 la actividad
debería aumentar pues el ion cloruro es un
activador de la enzima, como respuesta a la
prueba se obtuvo una solución de tonalidad
azul, el resultado ideal es la obtención de una
solución incolora por lo tanto se puede
concluir parcialmente que para este caso la
adición de la sal iónica no activo
completamente a la enzima, en el tubo de
ensayo 2 la coloración con el yodo dio como
resultado una solución de coloración azul lo
que indica que los iones Cu 2+ actúan como
inhibidor pues no permite la hidrolisis de los
enlaces glucosidicos del almidón.
3. CONCLUSIONES
- El pH es un parámetro que influye en
la conformación de las enzimas, se
debe encontrar un valor óptimo para
que la actividad enzimática sea
máxima y por lo tanto la actividad
catalítica sea mayor. El pH óptimo para
la α- amilasa está en el rango de 6.7 –
7.2.
- La temperatura puede aumentar la
actividad de una determinada enzima,
pero esta (la temperatura) debe ser
regulada ya que si se sobrepasa la
temperatura optima puede presentarse
una desnaturalización de la enzima
debido a los rompimientos de los
enlaces de hidrogeno que mantienen
la enzima en forma nativa, además
una disminución de la temperatura
hace que la actividad enzimática se
pierda pero este fenómeno es
reversible, ya que los enlaces de
hidrogeno se conservan y puede
regenerar la enzima a su forma nativa
- La selectividad de una enzima está
determinada por la complementariedad
que existe en entre la enzima y
sustrato, un ejemplo muy típico para
explicar este concepto es la teoría de
llave cerradura, para una determinada
cerradura solo existirá un llave.
- Las pruebas cualitativas realizadas
permitieron corroborar si la enzima
tenía una actividad máxima, media o
nula, según los procedimientos
realizados.
4. PREGUNTAS PRELIMINARES.
4.1. Cuáles son los factores que
afectan la velocidad enzimática.
Factores que afectan la actividad
enzimática.
- Concentración del sustrato: a mayor
concentración del sustrato, a una
concentración fija de la enzima se
obtiene la velocidad máxima. Después
de que se alcanza la velocidad, un
aumento en la concentración del
sustrato no tiene efecto en la velocidad
de la reacción.
- Concentración de la enzima: siempre
y cuando haya sustrato disponible, un
aumento en la concentración de la
enzima aumenta la velocidad
enzimática hacia cierto límite.
- Temperatura. Un incremento de 10 °C
duplica la velocidad de reacción, hasta
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 ciertos límites. El calor es un factor
que desnaturaliza las proteínas por lo
tanto si la temperatura se eleva
demasiado, la enzima pierde su
actividad.
- Presencia de cofactores: muchas
enzimas dependen de los cofactores,
sean actividades o coenzimas para
funcionar adecuadamente. Para las
enzimas que tienen cofactores, la
concentración del cofactor debe ser
igual o mayor que la concentración de
la enzima para obtener una actividad
catalítica máxima. [11]
4.2. Cuáles son las condiciones
óptimas para que actué con la
velocidad catalítica máxima la
enzima que se encuentra en la
saliva (amilasa).
Condiciones óptimas para la ptialina o
amilasa salival.
pH óptimo - 7.0
Temperatura óptima - 37ºC
Presencia de ciertos iones
activadores:
Cloruro y bromuro - son los
efectivos
Ioduro – menos efectivo
Sulfato y fosfato – son los menos
efectivos [12]
4.3. Cuál es el código según la IUPAC
designado para la amilasa (salivar)
y la sacarasa.
Amilasa: EC 3.2.1.1
Sacarasa: EC 3.2.1.10 [13]
5. BIBLIOGRAFIA.
[1]. https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima
[2].http://www.medigraphic.com/pdfs/revhabcie
med/hcm-2012/hcm124d.pdf
[3]. https://es.wikipedia.org/wiki/%CE%91-
Amilasa
[4]. https://books.google.com.co/books?id=-
L05LnysBesC&pg=PA198&dq=amilasa+salival
&hl=es-
419&sa=X&ved=0CD0Q6AEwB2oVChMIrrXi0s
LZyAIVzJceCh2JCQAW#v=onepage&q=amilas
a%20salival&f=false
[5]. http://bioquimicamarzo-
julio.blogspot.com.co/2014/06/prueba-de-
fehling.html
[6].http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/en
z22.htm#t
[7].https://sites.google.com/site/laboratoriosbio
quimica/bioquimica-i/prueba-del-almidon
[8].https://books.google.com.co/books?
id=8SAtkthrFEkC&pg=PA103&dq=amilasa+sali
val&hl=es-
419&sa=X&ved=0CCAQ6AEwAWoVChMIrrXi0
sLZyAIVzJceCh2JCQAW#v=onepage&q=amila
sa%20salival&f=false
[9]. Peña; Arroyo; Gomez, Bioquímica, Editorial
Limusa S.A, México D.F. , 2004, pág.200 Libro
Virtual.
y [10]. Quesada S, Manual de experimentos de
laboratorio para Bioquímica; Editorial
universidad estatal a distancia, San Jose ,
Costa Rica 2007, pág. 41. Libro Virtual
más
[11].http://genesis.uag.mx/edmedia/materia
l/quimicaII/enzimas.cfm
[12]. https://es.wikipedia.org/wiki/%CE%91-
Amilasa
[13]. https://es.wikipedia.org/wiki/Sacarasa
https://es.wikipedia.org/wiki/Amilasa
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