PRUEBA OFICIAL PARA DETERMINAR ACTIVIDAD DE LA UREASA EN PRODUCTOS DE SOJA

Definición

Este es el método oficial de la AOCS (American Oil Chemists Society) Ba 9-58, el cual está
basado en la prueba original desarrollada por Caskey y Knapp (1944).

Principio de la prueba

La prueba determina la presencia de actividad de la enzima ureasa en productos de soja. La

presencia y el grado de actividad de la ureasa indica la presencia y el grado de actividad del
factor inhibidor de la tripsina (antitripsina).

Fundamento químico de la prueba

La ureasa actúa sobre la urea produciendo amoníaco que aumenta el pH. El cambio de pH
puede medirse directamente con un peachímetro o indirectamente con el cambio de color
de una sustancia indicadora. La sustancia indicadora que se utiliza es el rojo de fenol, que es
color amarillo a pH 6,8 y rojo a pH 8,2.

Equipamiento para la prueba cuantitativa

1) Peachímetro con electrodo de vidrio y calomel, con compensación automática de

temperatura, con precisión y sensibilidad para lecturas de ± 0,02 (si puede ser ± 0,01
es mejor).
2) Baño María con agua destilada que mantenga la temperatura en 30 °C, con precisión
de ± 0,5 °C.
3) Molinillo eléctrico para moler las muestras.
4) Balanza analítica para pesar con 3 decimales (0,001 gramos).
5) Espátula para pesar los reactivos sólidos.
6) Buzos imantados.
7) Agitador magnético.
8) Matraces aforados de borosilicato 1000, 500 y 100 ml.
9) Vasos de precipitado de borosilicato de 100, 50 y 10 o 5 ml.
10) Probetas de borosilicato de 10 ml.
11) Tubos de borosilicato de 15 cm de largo y 2 cm de diámetro, con tapones de goma o
tapas a rosca.
12) Gradilla para los tubos.
13) Termómetro.
14) Cronómetro.
15) Pizeta para enjuagar con agua destilada.
16) Pipetas Pasteur plásticas.
17) Heladera.

Reactivos

1) Agua destilada o bidestilada (preferentemente recién destilada, a temperatura

ambiente).
2) Fosfato de potasio monobásico (KH2PO4, grado analítico).
1
3) Fosfato de potasio dibásico (K2HPO4, grado analítico).
4) Urea (grado analítico).
5) Rojo de fenol (sal hidrosoluble, grado analítico).
6) Hidróxido de sodio (grado analítico).
7) Ácido sulfúrico o Ácido clorhídrico (grado analítico).
8) Tolueno (grado analítico).
9) Buffers pH 7 y pH 10 para calibrar el peachímetro.

Preparación de las soluciones

 Solución indicadora de rojo de fenol 0,1 %:

Disolver en un vaso de precipitado de 50 ml, 0,100 g de rojo de fenol con 1,5 ml de
hidróxido de sodio 0,2N y agregar 50 ml de agua destilada, mezclar hasta que se
disuelva bien. Trasvasar a un matraz aforado de 100 ml, lavando el vaso de precipitado
varias veces con agua destilada y completar el aforo hasta llegar a los 100 ml.

 Solución buffer de fosfatos 0,05M:

Disolver en un vaso de precipitado 3,403 g de fosfato de potasio monobásico en 100 ml
de agua destilada. Disolver en otro vaso de precipitado 4,355 g de fosfato de potasio
dibásico en 100 ml de agua destilada. Combinar ambas soluciones en un matraz de 1000
ml y adicionar 10 ml de solución indicadora de rojo de fenol al 0,1 %, aforar a 1000 ml
con agua destilada. El pH final debe ajustarse a 7,0 antes de usarse. La vida útil de esta
solución es de 90 días en la heladera.

 Solución buffer con urea:

Disolver en un vaso de precipitado 15 g de urea en 500 ml de solución buffer de fosfatos
0,05 M. El pH final debe ajustarse a 7,0 antes de usarse. La vida útil de esta solución es
de 90 días en la heladera. Se pueden agregar 5 ml de tolueno como preservante lo que
aumenta la vida útil. A temperatura ambiente y sin preservante, la urea se puede
degradar rápidamente y la solución pierde la calidad (vira al rosado).

Molienda
Moler una cantidad suficiente de muestra en el molinillo, de tal manera que el 95 % de
la misma pase por una malla de tamaño 1 mm. Mezclar bien el material molido antes de
pesar.

Desarrollo de la prueba

Por cada muestra se utilizan 2 tubos, en ambos tubos se pesan exactamente 0,2000
(±0,001) g de muestra. Agregar 10 ml de la solución buffer de fosfatos en uno de los
tubos (BLANCO), tapar, mezclar sin invertir el tubo y colocarlo en el baño María que ya
está previamente calentado a 30 °C. A los 5 minutos de puesto el primer tubo en el baño
María, se agregan 10 ml de la solución buffer con urea al otro tubo (PRUEBA) y se coloca
en el baño María. Cada 5 minutos se agitan varias veces los dos tubos. Cumplidos los 30
minutos de incubación en el baño María se retira el primer tubo, se transfiere la parte
líquida a un vaso de precipitado de 10 o 5 ml y se lee rápidamente el valor de pH en un
lapso no mayor a 5 minutos. Cumplidos los 30 minutos de incubación en el baño María
se retira el segundo tubo, se transfiere la parte líquida a otro vaso de precipitado de 10 o
5 ml y se lee rápidamente el valor de pH en un lapso no mayor a 5 minutos.
2
Cálculos

Se calcula la diferencia entre el valor de pH del tubo BLANCO y el valor de pH del tubo
PRUEBA. La diferencia en unidades de pH es un índice de actividad de la ureasa en la
muestra y por lo tanto del grado de cocimiento. Cada muestra se debería procesar por
duplicado (4 tubos por muestra, 2 BLANCOS y 2 PRUEBAS), si la diferencia entre
duplicados en el valor de diferencia en unidades de pH es mayor a 0,05 se debe repetir la
prueba.

Interpretación del valor de diferencia en unidades de pH y del cambio de color

Grado de cocimiento de la soja Diferencia de pH Color del tubo PRUEBA*

cruda 2,00 o más rosado fuerte

subcocida de 0,30 (0,50) a 2,00 rosado a rosado fuerte
cocido adecuado de 0,02 a 0,30 (0,50) rosado muy pálido a rosado
posiblemente sobrecocida** menos de 0,02 ámbar (amarillo)

*el color del tubo BLANCO debería ser ámbar (amarillo), si el color es rosa y no difiere del
color del tubo PRUEBA, se puede sospechar que la muestra contiene alguna sal o
sustancia que aumentó el valor de pH.
**la prueba de la ureasa no sirve para determinar si la soja está sobrecocida, pero si la
diferencia de pH es cercana a cero, se puede sospechar que hubo sobrecocimiento.
Existen otras pruebas complementarias para determinar si hubo sobrecocimiento, el
sobrecocimiento produce una disminución del valor nutricional de la soja por pérdida de
digestibilidad de la proteína.

PRUEBA RÁPIDA COLORIMÉTRICA

La prueba rápida colorimétrica se basa simplemente en la observación del cambio de

color del rojo de fenol. Se utilizan las mismas soluciones que en la prueba oficial, pero
para chequear solamente desactivado o no desactivado se puede usar solamente la
solución buffer con urea. Se colocan aproximadamente 0,200 g de muestra molida en
tubos con tapa y con suficiente capacidad para contener 10 ml del reactivo. Se agregan
10 ml de la solución buffer con urea (ver preparación de las soluciones). Se mezcla,
agitando el tubo cada 5 minutos, en un ambiente que debe estar entre 25-30 °C
(sosteniendo el tubo con la mano cerrada se podría alcanzar esta temperatura). A los 5
minutos ya se puede observar un cambio de color si hay actividad de ureasa. Cumplidos
los 30 minutos de incubación, se observa el cambio de color final. Lavar los tubos y
enjuagarlos con agua destilada antes de volver a usarlos, si se puede además repasar con
alcohol y dejar secar.

Referencia

Caskey C.D. and Knapp F. C. 1944. Method for detecting inadequately heated soybean oil
meal. Industrial and Engineering Chemistry, 16 (10):640-641.