UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA

BIOLOGÍA

“CASPASAS INFLAMATORIAS EN O. mykIss”

Josué Misael Domínguez Fuentes

Biología

“POR MI RAZA HABLARÁ EL ESPÍRITU”

 INTRODUCCIÓN

La acuicultura es el sector productor de alimentos de más rápido crecimiento a nivel mundial,

constituye el 50 % del alimento acuático en el mundo y se percibe como la actividad con el mayor
potencial para satisfacer la demanda de alimentos ya que desde el año 2011 esta actividad supero
en tasa de crecimiento a sectores ganaderos (FAO, 2017). La trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss)
es originaria de América del Norte y pertenece a la familia de los salmónidos (Blanco, 1995). En
México, el cultivo de trucha arco iris es una industria acuícola en crecimiento (Contreras-MacBeath
et al., 1998), sin embargo, los productores acuícolas no están utilizando plenamente el potencial
genético de la trucha arco iris (Fornshell, 2002). La harina de pescado es la principal fuente de
proteínas en las dietas comerciales (Hardy, 1996) y la demanda de harina de pescado excederá la
oferta en unos pocos años (Gatlin et al., 2007). Los alimentos de origen vegetal son una alternativa
a la harina de pescado (Hardy, 2010), pero las sustituciones de alimentos con proteína vegetal son
todavía bajas (Slawki et al., 2011) ya que tales alimentos generalmente contienen altos niveles de
fibra, almidón, carbohidratos no solubles y antinutrientes que afectan la digestibilidad, crecimiento
normal de peces (Krogdahl et al., 2010) y la respuesta inmune (Burrells et al., 1999). Por lo tanto, la
acuicultura requiere encontrar formas de utilizar con mayor efectividad los alimentos de origen
vegetal para el desarrollo futuro de la industria (Gatlin et al., 2007; Kaushik y Seiliez, 2010). En
truchas arcoiris alimentadas con dietas experimentales de proteína vegetal las caspasas representan
un objeto de estudio ya que participan en procesos apoptoticos, inflamatorios y de la respuesta
inmune innata. Las caspasas son una familia de proteasas, contienen cisteína en su sitio activo y
escinden sobre residuos específicos de ácido aspártico; son sintetizadas como pro-caspasas
(zimógenos) que son activadas por escisión proteolítica, existen tres tipos de caspasas de acuerdo
a su función: caspasas iniciadoras, ejecutoras e inflamatorias (Green, 2015). El grupo de las
caspasas inflamatorias está conformado por las caspasas 1, 4, 5 (Green, 2015), 11, 12 y 13 (Connolly
& Hearnhead, 2017). La estructura general de las caspasas inflamatorias es que, en el extremo N-
terminal, en la región del pro-dominio, presentan un dominio de reclutamiento conocido como sitio
de activación de caspasa y dominios de reclutamiento (CARD por sus siglas en inglés) seguido por
la subunidad grande p20 y la subunidad pequeña p10. La caspasa-1 es definida como el prototipo
de la subfamilia inflamatoria de las caspasas (Martinon y Tschopp, 2007) y se activa en diferentes
complejos inmunes innatos conocidos como inflamosomas, su actividad es la regulación de
secreción de distintas proteínas involucradas en la inflamación y reparación celular. Por ejemplo,
procesa los precursores inactivos de las citoquinas IL-1b e IL-18 las cuales son reguladores cruciales
de la inflamación y la inmunidad (Sollberger et al., 2012). La caspasa-4 humana es una proteasa
poco caracterizada, la cual puede autocatalizarse y además está implicada en la apoptosis inducida
por el estrés del retículo endoplásmico y juega un papel importante en la inflamación y la inmunidad
innata a través de la activación de la caspasa-1 (Faucheu et al., 1995). La caspasa-5 humana en
una proteasa que junto con la caspasa-4 median la liberación de IL-1α e IL-1β de monocitos
humanos, además ambas caspasas son determinantes clave de la activación del inflamasoma
(Vigano et al., 2015). Análisis de los niveles de mRNA endógeno de la caspasa-5 mediante RT-PCR
revelan que la distribución de esta caspasa 5 es muy similar a la caspasa 1 en varios tejidos humanos
(Schroder & Tschopp, 2010). Diferentes estudios sugieren que la caspasa-1 y la caspasa-5 humana
pueden ejercer alguna sinergia funcional en el procesamiento de citoquinas inflamatorias (Schroder
& Tschopp, 2010; Yazdi et al., 2010; Kamens et al., 1995; Munday et al., 1995; Hosomi et al., 2003;
Rawlings & Salvesen, 2013). Tacchi et al (2012) realizaron un análisis transcriptomico debido a la
sustitución de alimentos con harina de pescado por alimentos formulados con proteínas vegetales
en el salmón atlántico, determinaron que en el intestino medio de salmones alimentados con
proteínas vegetales los genes de la caspasa-3, -8 y -14 fueron significativamente mayores respecto
a los salmones alimentados con harina de pescado, por el contario reportaron que el gen de la
interleucina-8 (IL-8, función inflamatoria) fue significativamente menor, lo anterior indica que el
proceso inflamatorio es bajo en salmón atlántico alimentado con proteínas vegetales, lo cual sugiere
indirectamente que de existir las caspasa-4 y -5 en salmónidos, alimentados con proteína vegetal,
la expresión de estas proteasas seria a niveles bajos. En O. mykiss solo se ha identificado a la
caspasa 1, 3 y 6 (Rojas et al., 2015, Rojas et al., 2012 y Laing et al., 2001) es por ello que el objetivo
de este trabajo es determinar la presencia y expresión de las caspasas-4 y -5 en juveniles de truchas
arcoíris alimentado con una dieta experimental.

OBJETIVOS

Objetivo general

 Conocer los requerimientos nutricionales de especies acuáticas de importancia comercial

(peces comestibles y de ornato) y los efectos de exceso y deficiencia de nutrientes en su
estado de salud.
 Determinar la presencia y expresión de las caspasas 4 y 5 en juveniles de truchas arcoíris
(Oncorhynchus mykiss)

Objetivos particulares

 Dar mantenimiento a las peceras del acuario (limpieza y manejo de organismos)

 Apoyar en las actividades que se realizan en el laboratorio de producción acuícola.
 Extraer linfocitos de sangre periférica de truchas arcoíris
 Extraer macrófagos de riñón de truchas arcoíris
 Aislar el intestino de truchas arcoíris
 Determinar la presencia y expresión de los genes de las caspasa-4 y -5

MATERIALES Y METODO

Apoyo a las actividades del acuario

Se realizará el servicio social en el Laboratorio de Producción Acuícola (Acuario) ubicado en la FES

Iztacala, donde se realizarán diversas actividades. Se dará mantenimiento del acuario (limpieza,
reparación y manejo de organismos), así como el cuidado de las especies en exhibición.

PROYECTO TÉCNICO

Animales de estudio

Juveniles machos y hembras de trucha arcoíris (O. mykiss) con un rango de peso de 150 a 250 g,
serán criados desde la etapa de huevo en el laboratorio de producción acuícola de la FES-I UNAM.
La dieta de los peces se realizará con una dieta comercial y una experimental.

Obtención muestras sanguíneas

Los organismos serán anestesiados y se obtendrá sangre periférica de la vena caudal de los
organismos mediante punción con vacutainer®. Se utilizarán tubos con heparina sódica para la
posterior obtención de linfocitos e igualmente se usarán tubos para la obtención de suero sanguíneo
(centrifugado los tubos a 2,500 rpm durante 10 minutos). El contenido de proteína del suero
sanguíneo se determinará mediante la técnica de Lowry con un kit comercial (Sigma Diagnostics,
MO, EUA).

Sacrificio de los organismos y obtención de riñones e intestino

Después de la extracción de muestras sanguíneas, los organismos serán sacrificados por
decapitación y se disectarán los riñones manteniéndolos en medio L-15 (Leibovitz, Gibco)
suplementado con 0.1 % de suero fetal bovino (Burrells et al., 1999) y el intestino manteniéndolo en
solución Ringer (Gelder et al., 2018).

Extracción de macrófagos de riñones

Inmediatamente después de extraer el riñón de la trucha arcoíris, se procederá a la extracción de

macrófagos de acuerdo a Chung & Secombes 1988.

Extracción de linfocitos de sangre periférica

De la sangre periférica obtenida se extraerán linfocitos mediante centrifugación por gradiente de

densidad de acuerdo a Riol et al (1999).

Extracción de RNA de macrófagos y linfocitos

Se extraerá el RNA total de macrófagos y linfocitos con Trizol de acuerdo a Camilot (2008). Finalizada
la extracción el RNA extraído se cuantificará en un espectrofotómetro y la integridad del mismo se
visualizará en una electroforesis a 310nm en un equipo fotodocumentador.

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

El RNA obtenido se usará como templado para sintetizar la secuencia de cDNA correspondiente a la
secuencia del gen de la caspasa-4 y -5 (Se diseñarán oligonucleótidos específicos para la caspasa-
4 y -5). Finalmente, para visualizar los productos de cada reacción se realizarán electroforesis en
geles de agarosa al 1.2% teñidos con EtBr en TBE al 0.5x. Los geles se observarán en un equipo
fotodocumentador a 310nm.

PCR Cuantitativa en tiempo real (qPCR)

La PCR en tiempo real se realizará por triplicado, utilizando como plantilla el cDNA sintetizado a
partir del RNA obtenido, se usarán distintos juegos de oligonucleótidos específicos para la caspasa-
4 y -5. Las reacciones se realizarán en un sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus ™ (Applied
Biosystems Inc., Foster City, CA, EE. UU.). Las condiciones de ciclado serán 95°C (20 s) seguidas
de 50 ciclos de 95°C (3 s) y 60°C de (30 s).

Western Blot, Transferencia de geles a membranas PVDF e Inmunoblot

Los linfocitos, macrófagos e intestino se resuspenderán y solubilizarán con amortiguador de lisis

RIPA 1x para la lisis celular. Las muestras de lisis celular se incubarán en hielo durante 30 minutos
y se centrifugarán a 4 ° C a 15,800×g durante 10 minutos. Se recuperará el sobrenandante y se
cuantificará mediante el ensayo de Bradford (1976). Se agregará buffer de Laemmli. Desnaturalizar
durante 5 min a 95 ° C. Con las muestras obtenidas se procederá a realizar electroforesis en geles
de acrilamida para la separación proteica. Se utilizarán geles separadores al 15% y geles de
apilamiento al 5%. Se utilizará buffer de corrida 1x. Se diluirán cantidades iguales de proteína total
(30 µg) con tampón de carga y se cargarán en los pozos, se dejará correr el gel a 70 volts durante
20 minutos y luego se aumentará la corriente eléctrica a 100 volts durante 90 minutos, se utilizará
un marcador de peso molecular marca Fermentas y otro de la marca Bio-Rad. Finalizada la
electroforesis el gel se dejará en tinción con solución teñidora (Azul de Comassie al 0.2%, Ac. acético
al 7% y metanol al 50%) durante 40 minutos aproximadamente, una vez teñido, lavar con H2O, y
después se colocará en solución desteñidora (Ac. acético al 7% y metanol al 5%) durante 60 minutos.
Se tarnsferiran las proteínas de los geles a membranas de PVDF, finalizada la transferencia el papel
se teñirá con rojo Ponceau (0.5 g rojo de Ponceau en solución de Ac. acético al 2%) con la finalidad
de observar las bandas transferidas, posteriormente se desteñirá con agua destilada para la
realización de la inmunodeteccción. Para realizar el inmunoblot se bloqueará la membrana de PVDF
con buffer de bloqueo durante 120 minutos a temperatura ambiente y se lavará 5 veces con TBST
1x, posteriormente se adicionarán los anticuerpos: Anti-Caspasa-4 (antibody ab27485) Abcam® y
Anti-Caspasa-5 (antibody ab62401) Abcam®, ambos en una concentración de 1:500 diluidos en
buffer de adición (leche descremada al 2% en TBST 1x), durante 24 horas a 4°C, después se lavará
3 veces con 10 ml de buffer de adición durante 10 minutos y después se adicionarán los anticuerpos
secundarios: Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) (ab20572) para Anti-Caspasa-4 y Goat Anti-Rabbit
IgG H&L (HRP) (ab205718) para Anti-Caspasa-5, ambos en una concentración 1:1000, diluidos en
buffer de adición dejándolos incubar por 60 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se
lavará nuevamente 3 veces con 10 ml de TBST 1x durante 10 minutos y finalmente se revelará en
una película radiográfica con el equipo Wester Blotting Luminol Reagent (sc-2048Santa Cruz
Biotech, USA).

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