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Pretratamiento en dos etapas con sulfonación alcalina y tratamiento con vapor de

biomasa leñosa de Eucalyptus para mejorar su digestibilidad enzimática para la


producción de bioetanol

Abstract
Este trabajo propuso un pretratamiento en dos etapas con sulfonación alcalina y tratamiento con
vapor, e investigó su eficacia para convertir la biomasa leñosa de Eucalyptus en azúcares
fermentables y bioetanol. Comparando con el pretratamiento con vapor y la subsiguiente sulfonación,
este pretratamiento con sulfonación alcalina y vapor mejoró la recuperación de hidratos de carbono
al mantener un pH más neutral durante todo el proceso de pretratamiento, mientras promovía la
digestibilidad enzimática de la biomasa mediante la eliminación y modificación de lignina. Los
resultados mostraron que el pretratamiento con sulfonación alcalina-vapor provocó la eliminación de
lignina del 69,37% y la incorporación de 120,28 mmol / kg de grupos ácidos en el sustrato, lo que
podría conducir a una accesibilidad de celulosa significativamente mejorada. Aproximadamente el
80% de los azúcares presentes en el carbohidrato original (celulosa y hemicelulosa) se liberaron, lo
que podría recuperarse después del pretratamiento y la hidrólisis enzimática. Los azúcares liberados
de la hidrólisis enzimática del sustrato pretratado mediante sulfonación alcalina-pretratamiento con
vapor podrían convertirse eficientemente en etanol, lo que indica que el pretratamiento en dos etapas
con sulfonación alcalina-vapor es un enfoque pretratamiento prometedor de la biomasa
lignocelulósica para la producción de biocombustibles.

1. Introduccion
Biorrefinería significa el proceso para utilizar biomasa lignocelulósica para producción de una amplia
gama de combustibles, productos químicos y materiales [1].
Entre una gran variedad de biomasa lignocelulósica, se propone que Eucalyptus sea un recurso
prometedor para la biorrefinería debido a su rápido crecimiento, amplia distribución y bajo costo [2].
Sin embargo, la compleja estructura de la celulosa-lignina-hemicelulosa en la biomasa bruta hace
que sea recalcitrante hacia la degradación enzimática para obtener azúcares fermentables para la
bioconversión aguas abajo. Por lo tanto, los métodos adecuados de pretratamiento son necesarios
para mitigar la complejidad de la estructura lignocelulósica, y para maximizar la producción de azúcar
en la hidrólisis enzimática posterior [3, 4].

En las últimas dos décadas, varios métodos de pretratamiento han sido propuesto e investigado.
Entre ellos, el pretratamiento con vapor ha sido ampliamente estudiado, debido a varios méritos tales
como la compatibilidad con el medio ambiente, el bajo requerimiento de energía y la alta efectividad
para una gran variedad de biomasa lignocelulósica [5]. En un pretratamiento de vapor típico, el vapor
a alta temperatura provoca la liberación de grupos acetilo para formar ácido acético, catalizando
principalmente la solubilización de hemicelulosa. Como resultado, aumenta la digestibilidad
enzimática de la biomasa. Sin embargo, después del pretratamiento con vapor, el contenido de
lignina en la fracción insoluble en agua es mayor que en la biomasa no tratada debido a la
solubilización de hemicelulosa, que puede afectar negativamente a la hidrólisis enzimática posterior
[6,7]. Además, estudios recientes han demostrado que la repolimerización de la lignina durante el
pretratamiento con vapor agrava los efectos inhibidores de la lignina en la hidrólisis enzimática,
principalmente a través de la adsorción intensiva no productiva de las enzimas de la celulasa [4,8].

Para mitigar la limitación impuesta por la lignina, se aplican varios pretratamientos de segunda etapa
sobre pulpas tratadas con vapor antes de la hidrólisis enzimática, incluido el uso de álcali, peróxido
de hidrógeno, deslignificación con oxígeno y sulfonación, etc., para eliminar o modificar la lignina [9
-12]. Los pretratamientos alcalinos de segunda etapa se usan comúnmente, ya que pueden eliminar
la lignina y aumentar el acceso a la biomasa [11,13]. Además, la modificación de la lignina, en la que
se modifica la estructura química de la lignina, también se ha demostrado que es tan efectiva como
la eliminación de la lignina para mejorar el rendimiento de la hidrólisis de las pulpas de vapor [4,14].
Por ejemplo, la incorporación de los grupos ácidos por sulfonación tiene el potencial de una adsorción
no productiva disminuida de enzimas a la lignina residual, lo que resulta en una mejor facilidad de
hidrólisis enzimática [14].
Se han evaluado varios pretratamientos en dos etapas con diferentes configuraciones, con el objetivo
de maximizar la sacarificación de biomasa [15-20]. Se ha sugerido que la secuencia de
pretratamiento en dos etapas también puede jugar un papel importante en la digestibilidad enzimática
de la biomasa. Por ejemplo, se ha informado que los pretratamientos de dos etapas de ácido alcalino
son mucho más efectivos que los pretratamientos de dos etapas ácido-alcalino en términos de
potenciar la sacarificación de biomasa y mejorar la recuperación de azúcares [18,21]. Se propone
que el pretratamiento de firststage alcalino principalmente conduce a la eliminación de lignina, lo que
resulta en una porosidad mejorada del sustrato [13,19]. La porosidad mejorada tiene un potencial
para elevar la efectividad del pretratamiento ácido o ácido de segunda etapa que causa
principalmente la solubilización de hemicelulosa [19,20].
En este estudio, se realizó un pretratamiento en dos etapas basado en vapor-sulfonación o
sulfonación-vapor en biomasa leñosa de Eucalyptus. Inicialmente, investigamos la influencia de cada
estrategia en la hidrólisis enzimática y el rendimiento total de azúcar. Para cada escenario, también
se tuvo en cuenta el impacto de la severidad del pretratamiento con vapor en el rendimiento total de
azúcar. Luego, se llevó a cabo una comparación exhaustiva entre estas dos estrategias. A través de
la comparación, tratamos de determinar el papel de la repolimerización de lignina durante el
pretratamiento con vapor en las propiedades de los sustratos y el rendimiento total de azúcar.
Finalmente, el bicarbonato de sodio se complementó en el pretratamiento de sulfonación de la
primera etapa, con el fin de mejorar aún más la selectividad de la deslignificación y el rendimiento
de azúcar a partir de la biomasa. La fermentabilidad del hidrolizado enzimático resultante también
se evaluó.

2. Materiales y métodos

2.1. Recogida de muestras de madera y productos químicos utilizados

El eucalipto (residuos de procesamiento de la madera) fue proporcionado amablemente por la


Academia de Silvicultura de Guangdong, China. La biomasa secada al aire se almacenó en bolsas
de plástico selladas a temperatura ambiente. El contenido de humedad de la biomasa secada al aire
fue 8.73%. El dióxido de azufre (SO2), el bicarbonato de sodio (NaHCO3) y el sulfito de sodio
(Na2SO3) se compraron a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.

2.2. Pretratamiento con vapor seguido de sulfonación

La biomasa (malla 20-100) se envolvió con un tamiz de malla 120 y se colocó en una pistola de vapor
(Jiangsu Kangwei Biological Co., Ltd., Jiangsu, China). Luego se inyectó Steam en el reactor y se
mantuvo a una temperatura de 200 ° C o 210 ° C durante 5 min (Steam200 y Steam210). El licor de
pretratamiento y los residuos sólidos se recogieron después del pretratamiento con vapor.
Posteriormente, los residuos sólidos se sometieron a un tratamiento de sulfonación (Steam200-
Sulphonation y Steam210 Sulphonation) en un reactor discontinuo de acero inoxidable (NS-250I-
C276, Anhui Kemi Machinery Technology Co., LTD, Anhui, China). Brevemente, el sustrato tratado
con vapor se resuspendió en una solución acuosa que contiene sulfito de sodio. La relación entre el
licor de tratamiento previo y el peso seco del sustrato fue de 10 (v / p). La carga de sulfito de sodio
sobre el peso seco del sustrato fue del 12% (p / p). La mezcla se calentó a 130 ° C y se incubó
durante 1 h. Al final de la sulfonación, el reactor se enfrió a temperatura ambiente con agua corriente.
La suspensión se separó en fracción soluble en agua (WSF) y fracción insoluble en agua (WIF). La
fracción soluble en agua se lavó con agua del grifo y se mantuvo a 4 ° C para su uso posterior. La
fracción soluble en agua y el agua de lavado se recogieron para la determinación de la concentración
de azúcares.
2.3. Sulfonación seguida de tratamiento con vapor

La biomasa se mezcló con una solución acuosa que contenía sulfito de sodio. La relación de licor de
pretratamiento al peso seco del sustrato fue de 5 (v / p). La carga de sulfito de sodio sobre el peso
seco del sustrato fue del 12% (p / p). La mezcla se cocinó a 130 ° C durante 30 min. Después de la
primera sulfonación, los residuos sólidos se recogieron y se sometieron a un tratamiento de vapor
de segunda etapa a 200 ° C (SulphonationSteam200) o 210 ° C (Sulphonation-Steam210) durante 5
min.

2.4. Sulfonación alcalina seguida de tratamiento con vapor

La biomasa se mezcló con agua (autohidrólisis) o una solución acuosa que contenía sulfito de sodio
y bicarbonato de sodio (Na2SO3-sulfonación-vapor). La relación entre el licor de tratamiento previo
y el peso seco del sustrato fue de 1 (v / p). La carga de sulfito sódico y bicarbonato sódico sobre el
peso seco del sustrato fue del 12% y 4% (p / p), respectivamente. Otro conjunto de pretratamiento
en dos etapas con sulfonación alcalina usando SO2 y bicarbonato de sodio (SO2
SulphonationSteam) también se llevó a cabo para comparar. La biomasa se mezcló con una solución
de bicarbonato de sodio en una bolsa con cierre de plástico. La relación entre el licor de tratamiento
previo y el peso seco del sustrato fue de 1 (v / p). La carga de bicarbonato de sodio sobre el peso
seco del sustrato fue del 8% (p / p). Luego, se introdujo SO2 en las bolsas plásticas con cremallera
con una cantidad del 6% (p / p). Todas las muestras se empaparon en bolsas de plástico con
cremallera durante la noche, luego se transfirieron al reactor discontinuo. Se añadió agua al reactor
hasta una relación final de masa de licor a seco de 5 (v / p). La mezcla se sometió a una cocción
suave a 130 ° C durante 30 minutos. Después de la sulfonación, los residuos sólidos se recogieron
y se sometieron a un tratamiento de vapor de segunda etapa a 210ºC durante 5 minutos.

2.5. Hidrolisis enzimática

Las enzimas utilizadas para la hidrólisis enzimática fueron cóctel de celulasa CTec 2 (actividad de
papel de filtro de 191.25 FPU / g) y una preparación de β-glucosidasa NZ188 (actividad de β-
glucosidasa de 349.46 U / g), que se obtuvieron de Sigma-Aldrich China Inc La hidrólisis enzimática
de los sustratos pretratados se realizó en tampón acetato (50 mM, pH 4,8) a 50 ° C con agitación a
180 rpm. La dosificación enzimática fue de 20 FPU de celulasa y 10 U de β-glucosidasa por gramo
de celulosa. La hidrólisis enzimática se realizó a una carga de sustrato del 10% (p / v) en un matraz
Erlenmeyer de 100 ml. Las muestras se tomaron después de 48 h de hidrólisis enzimática. Todos
los experimentos se realizaron por duplicado.

2.6. Fermentación del hidrolizado enzimático

Después del tratamiento alcalino de sulfonación y vapor con sodio ulfite y bicarbonato de sodio e
hidrólisis enzimática, el hidrolizado enzimático (fracción líquida de hidrólisis enzimática) se separó
de los sólidos residuales por filtración. Se aplicó una fermentación secuencial usando azúcares
fermentables en el hidrolizado enzimático de la siguiente manera: después de la concentración del
hidrolizado enzimático, se añadió Saccharomyces cerevisiae al hidrolizado concentrado con una
densidad óptica inicial (OD600) de 10. Luego se realizó la fermentación de glucosa a pH 5,5, 30 ° C
y 100 rpm, durante 24 h. Después de la fermentación de glucosa, S. cerevisiae se eliminó mediante
centrifugación. El etanol generado se destiló, usando un evaporador rotativo (BüCHI R-200, Swiss)
a 70 ° C, 160 mbar. Posteriormente, la fermentación de xilosa se llevó a cabo a pH 6,0, 30 ° C y 150
rpm durante 36 h, con una dosificación inicial de Pichia stipites a DO600 13. Estas cepas de levadura
para la fermentación de glucosa y xilosa se obtuvieron de Co-Innovation Center for Efficient
Processing y Utilización de productos forestales, Nanjing Forestry University. Después de la
fermentación, la concentración de azúcar residual y etanol generado se determinó mediante
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Y la tasa de conversión de azúcar-etanol (g / g) se
calculó como gramo de etanol producido por gramo de azúcar consumido. Todos los experimentos
se realizaron por duplicado.
2.7. Métodos analíticos

Los componentes químicos de la materia prima y las muestras pretratadas se determinaron con base
en el procedimiento desarrollado por el Laboratorio Nacional de Energía Renovable para analizar el
material de biomasa [22]. Las concentraciones de monosacárido se determinaron usando un sistema
de cromatografía líquida de alta resolución con un detector de índice de refracción (RI). La
separación se realizó en una columna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) con H2SO4 5 mM como
eluyente a un caudal de 0,6 ml / min. Todos los análisis se realizaron por triplicado. Para evaluar la
accesibilidad de la celulosa, la tinción con naranja directa se realizó según lo descrito por Oliveira
Santos et al. [23]. La hinchazón de la fibra se determinó por el valor de retención de agua (WRV),
que se midió de acuerdo con el método UM 256 de la Asociación Técnica de la Industria de Pulpa y
Papel (TAPPI). Brevemente, se disgregaron 0,5 g del sustrato y se remojaron en 8 ml de agua
durante la noche. La mezcla se filtró cuidadosamente a través de un tamiz de 200 mallas en una
taza de centrífuga. El filtrado se recirculó tres veces para evitar la pérdida de finos y las almohadillas
de pulpa restantes se centrifugaron a 900 G durante 30 minutos a 25 ° C. Entonces, el mojado
las muestras se pesaron y se secaron a 105 ° C durante la noche y se pesaron de nuevo. Los grupos
ácidos en los sustratos se determinaron mediante valoración conductométrica según lo descrito por
Katz et al. [24]. En resumen, se resuspendieron 0,1 g de masa seca del sustrato en 15 ml de HCl 0,1
M, y se incubaron a 15 ° C durante la noche. La pulpa se lavó luego con agua pura mediante la
adición de 35 ml de agua, la mezcla y la centrifugación a 5.000 rpm durante 10 minutos. El
sobrenadante se recogió cuidadosamente y la pulpa se lavó adicionalmente cinco veces con 50 ml
de agua. La muestra se enjuagó luego y se resuspendió en NaCl 0,001 M (50 ml), se impregnó con
20 μl de HCl 0,50 M y se valoró frente a NaOH 0,05 M. Todos los experimentos se realizaron por
duplicado.

3. Resultados y discusión

3.1. Efecto del pretratamiento con vapor en la digestibilidad enzimática de la biomasa

En este trabajo, el pretratamiento con vapor se llevó a cabo a 200 ° C (Steam200) o a 210 ° C
(Steam210), lo que dio como resultado una solubilización de hemicelulosa significativa (Fig. 1). Como
consecuencia, la accesibilidad a la celulosa, estimada como adsorción directa de colorante naranja
sobre las fibras, se mejoró considerablemente (figura 2), dando como resultado una facilidad
mejorada de hidrólisis enzimática en comparación con la materia prima (figura 3). Especialmente, el
rendimiento de hidrólisis del sustrato Steam210 fue obviamente mayor que el de Sustrato Steam200
debido a la mayor accesibilidad a la celulosa, aunque este incremento del rendimiento de la hidrólisis
se logró a expensas del 30% mayor solubilización de hemicelulosa y aproximadamente 20% más de
degradación de hemicelulosa (Tabla 1).

La eliminación de la lignina del pretratamiento con Steam200 y Steam210 fue de alrededor del 10%
(Tabla 1), lo que indica que la mayoría de la lignina se mantuvo en la fracción insoluble en agua.
Además, también fue interesante ver que los grupos de ácidos en la materia prima disminuyeron
desde originalmente alrededor de 40 mmol / kg a 16.33 y 10.16 mmol / kg, después del pretratamiento
con Steam200 y Steam210, respectivamente. Los resultados sugirieron que el pretratamiento con
vapor causaba la pérdida de grupos ácidos de sustrato, y una mayor gravedad daba como resultado
una mayor pérdida de grupos ácidos. Las razones podrían ser que la creciente severidad de la
autohidrólisis, como el pretratamiento con vapor y el pretratamiento líquido con agua caliente,
intensificaría las reacciones de repolimerización catalizada por ácido de la lignina, lo que provocaría
una mayor pérdida de grupos funcionales en la estructura de la lignina [9,25]. Como se informó, la
pérdida de grupos funcionales podría disminuir la extractabilidad, la reactividad y la funcionalidad de
las ligninas para modificaciones adicionales como la sulfonación y las aplicaciones de valor agregado
aguas abajo [26,27]. Además, la pérdida de grupos de ácido hidrófilo podría aumentar la
hidrofobicidad de los sustratos, intensificando las interacciones hidrofóbicas entre la lignina residual
y las enzimas, inhibiendo así la hidrólisis enzimática posterior [8].

El rendimiento de la hidrólisis de glucano se mejoró significativamente del 12.23% de la materia


prima al 42.41% (Steam200) y 57.89% (Steam210) (Fig. 3), respectivamente. Sin embargo, el
rendimiento de hidrólisis razonable (60-70%) no fue logrado [28], probablemente debido al alto
contenido de lignina residual en el sustrato pretratado a vapor. Como en el trabajo relacionado,
cuando las pulpas de vapor derivadas de maderas blandas más recalcitrantes se deslignificaron por
completo [29], la celulosa se convirtió casi teóricamente, incluso a una baja carga de enzima de 5
FPU / g de celulosa. Aunque la deslignificación completa de las pulpas de vapor podría eliminar las
barreras físicas y químicas planteadas por la lignina, se consideró demasiado intensivo
químicamente como el enfoque de pretratamiento de la biomasa lignocelulósica [30].

3.2. Efecto de los pretratamientos de Steam-Sulphonation en la digestibilidad enzimática


de la biomasa

Un trabajo anterior mostró que un pretratamiento de segunda etapa como la sulfonación


eliminar / modificar la lignina residual en el álamo pretratado con vapor fue efectiva para mejorar la
digestibilidad enzimática de la biomasa [14]. Por lo tanto, se llevó a cabo un tratamiento de
sulfonación de segunda etapa en sustratos Steam200 y Steam210. Se observó que el tratamiento
de sulfonación de segunda etapa causó aproximadamente un 20% más de eliminación de lignina de
ambas pulpas de vapor (Tabla 1), lo que contribuyó al aumento de la accesibilidad a la celulosa
(Figura 2) y mejoró la facilidad de hidrólisis enzimática (Figura 3). Trabajos previos también sugirieron
que la sulfonación podría causar la formación de grupos ácidos como ácido sulfónico (ácido fuerte)
y ácido carboxílico (ácido débil) en la cadena lateral de la estructura de la lignina [31].
Obviamente, la sulfonación de la segunda etapa en este trabajo, en el sustrato Steam200 o
Steam210, condujo al incremento detectable en el contenido de grupos sulfónicos en el sustrato,
pero a una ligera incorporación de grupos carboxílicos (Fig. 2). Cuando el sustrato Steam210 se
sometió a un proceso de sulfonación posterior, se observó un contenido de grupos ácidos totales
menor de 30,61 mmol / kg en comparación con el sustrato de sulfonación Steam200 (65,22 mmol /
kg). Esto es probablemente porque la repolimerización de la lignina más severa durante el
pretratamiento con vapor a un nivel más alto la temperatura disminuyó la reactividad de la lignina,
haciéndola menos susceptible a la sulfonación [8]. La incorporación de grupos ácidos a través de la
sulfonación se informó que aumentaba la hidrofilicidad de los sustratos, lo que disminuiría la
adsorción no productiva de enzimas [32]. Además, se descubrió que el sustrato Steam210-
sulfonación ganaba menos incorporación de grupo ácido y menor extensión de hinchamiento de la
fibra, pero aún se obtenía un mayor rendimiento de hidrólisis de celulosa (Fig. 3). Se consideró que
el mayor acceso a la celulosa se debía a un mayor grado de solubilización de la hemicelulosa y la
eliminación de la lignina desempeñaba un papel principal (Tabla 1) [33].

Para evaluar directamente la eficacia del proceso de pretratamiento en recuperando carbohidratos


(celulosa y hemicelulosa) mientras mejora Se propuso la hidrólisis enzimática, el concepto de
"rendimiento total de azúcar" después del pretratamiento y la hidrólisis enzimática (o el rendimiento
basado en el contenido original de carbohidratos de la materia prima). El rendimiento total de azúcar
representó la suma de los azúcares presentes en la fracción soluble en agua enriquecida en
hemicelulosa y los azúcares liberados durante la hidrólisis enzimática de la fracción pretratada e
insoluble en agua. Obviamente, los pretratamientos con mayor severidad (Steam 210, Steam210-
sulfonación) y la hidrólisis enzimática dieron como resultado un mayor rendimiento total de azúcar a
partir de la biomasa original, en la que se liberaron más azúcares de la hidrólisis enzimática (Fig. 4),
comparándolos con pretratamientos con menor severidad (Steam200, Sulfonación Steam200). Los
resultados también implicaron que, aunque el pretratamiento de mayor severidad causó una mayor
degradación del azúcar, la mejor hidrolizabilidad de la fracción insoluble en agua después de los
pretratamientos compensó la pérdida de azúcar del pretratamiento, lo que condujo a un mayor
rendimiento total de azúcares.
3.3. Influencia de los pretratamientos de Sulphonation-Steam en enzimáticos
digestibilidad de la biomasa
El trabajo previo indicó que un pretratamiento alcalino seguido de un tratamiento con vapor podría
mejorar claramente la digestibilidad enzimática de la biomasa [14,20]. Sin embargo, el trabajo
anterior no examinó el posible efecto que la gravedad del pretratamiento con vapor podría tener
sobre las características del sustrato y, por lo tanto, la facilidad de la hidrólisis enzimática. En el
trabajo, la biomasa se sometió a pretratamiento alcalino utilizando sulfito de sodio (130 ° C, 30 min)
y un posterior pretratamiento con vapor (200 ° C o 210 ° C, 5 min). Las severidades del pretratamiento
con vapor de la segunda etapa se compararon para la capacidad de cambiar las propiedades y las
composiciones del sustrato.

Se demostró que el pretratamiento Sulphonation-Steam210 resultó en mayor eliminación de lignina


que el pretratamiento con sulfonación-Steam200 (Tabla 1). Las razones de este fenómeno fueron
probablemente que el tratamiento de vapor de la segunda etapa más duro provocó una mayor
fragmentación y solubilización de la lignina al romper el hidrógeno y otros enlaces covalentes [18,34]
Además, encontramos que la retención de hemicelulosa en la fracción insoluble en agua después
del pretratamiento con sulfonación-Steam210 fue ligeramente más alta que en el sustrato
Sulphonation-Steam200 (Tabla 1), lo que significaba una solubilización de hemicelulosa por
pretratamiento con Sulphonation-Steam210 relativamente menor. Esto fue probablemente porque la
extracción de lignina mostró un efecto negativo en la eliminación de la hemicelulosa, y la inhibición
se debió principalmente al efecto de hinchamiento de la celulosa.
por pretratamiento alcalino, que dificulta la hidrólisis de hemicelulosas [35]. Como resultado de una
mayor eliminación de lignina, el sustrato SulphonationSteam210 mostró una mayor accesibilidad a
la celulosa (Fig. 2) y un mayor rendimiento de hidrólisis enzimática (Fig. 3), en comparación con
Sulphonation-Steam200 sustrato, a pesar de la menor solubilización de hemicelulosa. Los resultados
también indicaron que la eliminación de lignina, que no sea hemicelulosa la solubilización, debe ser
el efecto predominante para mejorar sacarificación enzimática de biomasa.

Fig. 1. Composición química de la materia prima y de los sustratos pretratados (Steam-Sulphonation:


pretratamiento con vapor a 200 ° C o 210 ° C seguido de tratamiento de sulfonación; Sulphonation-
Steam: sulfonación seguido de pretratamiento con vapor a 200 ° C o 210 ° DO).
Fig. 2. Características de la materia prima y los sustratos pretratados, incluida la hinchazón de la
fibra (WRV), la accesibilidad a la celulosa (adsorción del colorante naranja) y la incorporación de
grupos ácidos a través de la sulfonación.

Fig. 3. Hidrólisis enzimática de la materia prima y los sustratos pretratados (la hidrólisis se realizó a
50 ° C con una concentración de sólidos del 10% durante 48 h).
3.4. Comparación de los pretratamientos Steam-Sulphonation y Sulphonation-Steam sobre
la hidrólisis enzimática + y el rendimiento total de azúcar a partir de la biomasa

Como se discutió anteriormente, el pretratamiento con vapor fue un pretratamiento ácido, cuando se
liberó ácido acético durante el pretratamiento con vapor, principalmente causando la solubilización
de hemicelulosa mediante la división de enlaces químicos fuertes a alta temperatura, mientras que
la sulfonación fue un pretratamiento alcalino y otros enlaces covalentes [18]. Comparando con los
pretratamientos de Steam-Sulphonation, los tratamientos previos de Sulphonation-Steam
recuperaron más componentes de hemicelulosa, en los que permaneció una mayor cantidad en la
fracción insoluble en agua (Tabla 1). Este resultado estaba de acuerdo con los hallazgos del trabajo
previo [21] que alkaliacid los pretratamientos en dos etapas causaron una mayor retención de
hemicelulosa en la fracción insoluble en agua que los pretratamientos ácido-álcali en dos etapas.

Esto fue probablemente debido a que la hinchazón de la celulosa y la desacetilación de las


hemicelulosas a través del pretratamiento alcalino de la primera etapa disminuyó la severidad del
pretratamiento ácido de segunda etapa, obstaculizó la hidrólisis de hemicelulosas [35]. Además, los
enlaces de hidrógeno extensos en los sustratos deslignificados con álcali también pueden dificultar
la hidrólisis de las hemicelulosas [36]. Otra razón para la mayor recuperación de hemicelulosa en
este trabajo fue que el valor de pH de la suspensión total después de la sulfonación de primera etapa
fue de alrededor de 7, que disminuyó a alrededor de 5 después del pretratamiento con vapor de
segunda etapa a 200 ° C o 210 ° C (datos no mostrados). Comparando con el pretratamiento de
vapor (pH 3.6 y 3.2 después de Steam200 y Steam210, respectivamente) seguido de sulfonación,
se mantuvo un pH relativamente neutro a través del SulfonatoSteam pretratamiento, lo que resulta
en una mejor recuperación de azúcar. Estos resultados de acuerdo con el trabajo de Hendriks y
Zeeman [37], que informó esa es una manera de minimizar la degradación de hemicelulosa durante
el tratamiento con vapor fue manteniendo el pH entre 5 y 7 durante el proceso de pretratamiento. La
alta retención de hemicelulosa en el sólido fase también se consideró importante, ya que esta fase
podría ser enzimáticamente sacarificado y convertido en combustibles o productos químicos por
procesos biológicos o catalíticos conocidos [38].

Además de la recuperación de hidratos de carbono, fue evidente que los pretratamientos de


Sulphonation-Steam mostraron una eliminación de lignina más significativa, que fue más del 10%
mayor que la obtenida por los pretratamientos de Steam-Sulphonation (Tabla 1). Este incremento en
la eliminación de la lignina posiblemente se deba a que el pretratamiento alcalino de la primera etapa
podría aumentar notablemente la porosidad del sustrato, lo que da como resultado un sustrato
poroso que era más susceptible al tratamiento con vapor de segunda etapa [19]. La accesibilidad a
la celulosa que se estimó por adsorción de colorante naranja también se mostró en la Fig. 2.
Claramente, se obtuvieron sustratos tratados con sulfonato y vapor. mayor accesibilidad a la celulosa
cuando se compara con vapor pretratado y sustratos sulfonados, en los que la eliminación de lignina
jugó un papel primario papel. Con respecto a la solubilización y degradación de carbohidratos
(celulosa y hemicelulosa) durante el proceso de eliminación / modificación de lignina, la selectividad
de deslignificación se calculó como la lignina eliminada por gramo de carbohidrato eliminado de la
biomasa bruta (Tabla 1) [20], para evaluar directamente la capacidad de un pretratamiento para la
lignina solubilización y preservación de hidratos de carbono. Por ejemplo, Steam210 el
pretratamiento poseía la selectividad de deslignificación más baja, ya que solo se retiraron 0,20 g de
lignina de la biomasa por gramo de carbohidrato solubilizado. Como era de esperar, los
pretratamientos de Sulphonation-Steam mostraron una selectividad de deslignificación mucho mejor
que los pretratamientos de Steam-Sulphonation. Los resultados confirmaron que los pretratamientos
de Sulphonation-Steam favoreció la degradación de lignina sobre la solubilización de carbohidratos
más que los pretratamientos de Steam-Sulphonation, lo que lo hace mejorar la conversión de
azúcares fermentables para la producción de bioetanol a partir de biomasa lignocelulósica [39].

Los resultados mostraron que el pretratamiento Suphonation-Steam no solo aumentó eliminación de


lignina, pero también causó un mayor grado de sulfonación. Como se detectaron 75.80 mmol / kg y
92.01 mmol / kg de grupos ácidos totales en los sustratos Sulphonation-Steam200 y Sulphonation-
Steam210, respectivamente, en comparación con el contenido de grupos ácidos de 65.22 y 30.61
mmol / kg en Steam200-Sulphonation y Steam210-Sulphonation sustratos. El aumento en el grado
de sulfonación fue probablemente debido a la mejor reactividad de la lignina en bruto en comparación
con la lignina residual repolimerizada presente en las subestaciones tratadas con vapor, como
discutido arriba. Además, se especuló que la incorporación de grupos de ácido sulfónico en la
posición α de la cadena lateral de lignina suprimir la repolimerización de la lignina durante el posterior
tratamiento con vapor [32]. Como se informó, las reacciones de repolimerización de la lignina podrían
ocurrir predominantemente entre el sitio C-5 o C-6 y el sitio C-α posición de estructuras de lignina
adyacentes [4,8]. En el pretratamiento con Sulphonation-Steam, el C-α se sulfonó en el
pretratamiento de la primera etapa y no estaría disponible para reacciones de repolimerización
adicionales en el pretratamiento con vapor de segunda etapa [4].

El grado de hinchamiento de la fibra se determinó calculando el valor de retención de agua centrífuga


(WRV), que también podría predecir accesibilidad a la celulosa y susceptibilidad de los sustratos a
la hidrólisis enzimática [32]. Los resultados de WRV en la Fig. 2 mostraron que SulphonationSteam
los pretratamientos condujeron a un mayor grado de hinchamiento de la fibra en los sustratos que
los pretratamientos de Steam-Sulphonation (2.16 y 2.47 vs. 1.79 y 1.70). Este WRV más alto podría
interpretarse por el mayor contenido de hemicelulosa y grupos ácidos, así como por el menor
contenido residual de lignina en los sustratos de Sulfonación-Steam. Debido a que las hemicelulosas
y los grupos ácidos promovieron la hinchazón de la fibra al formar una capa hidrófila sobre la
superficie de la celulosa, mientras que la lignina restringió adversamente la hinchazón de la fibra
[40].

La hidrólisis enzimática (Figura 3) ilustró que el rendimiento de la hidrólisis de los sustratos tratados
con Sulfonation-Steam era más elevado que el de los sustratos tratados con SteamSulphonation. El
resultado estuvo de acuerdo con el trabajo previo [18] en que los pretratamientos de dos etapas con
ácido alcalino fueron mucho más efectivos en la mejora de la sacarificación de biomasa que los
pretratamientos ácido-álcali en dos etapas. Esto se debió a que los pretratamientos de Sulphonation-
Steam llevaron a una mayor cantidad de eliminación de lignina de la biomasa lignocelulósica, lo que
resultó en un mayor grado de accesibilidad a la celulosa y sacarificación enzimática de la biomasa
[13,18]. El rendimiento más alto de hidrólisis de glucano y xilano de 76.13% y 81.09% se obtuvo en
el sustrato Sulphonation-Steam210 (Fig. 3). Aprovechando tanto la mayor recuperación de hidratos
de carbono (Tabla 1) como la facilidad de la hidrólisis enzimática (Fig. 3), el pretratamiento
Sulphonation-Steam210 condujo al rendimiento de azúcar total más alto de más del 70% (Fig. 4),
mientras que proporcionó concentración de azúcares disponibles en hidrolizado enzimático (62.99 g
/ L) azúcares totales). Sin embargo, se informó que, para hacer que el proceso de materiales
lignocelulósicos a etanol sea económicamente factible, Se requirió una conversión del 75-80% del
total de polisacáridos en la madera a azúcares fermentables [41]. Para mejorar aún más la
recuperación de azúcar y el rendimiento de la hidrólisis de la biomasa leñosa pretratada con vapor,
modificamos aún más el proceso de sulfonación previo al pretratamiento con vapor.

Tabla 1
Recuperación de azúcares y eliminación de lignina después de pretratamientos
a) La recuperación de celulosa es la suma del porcentaje de glucosa inicial presente en el líquido y
las fracciones sólidas después del pretratamiento con vapor.
b) La recuperación de hemicelulosa es la suma del porcentaje de recuperación de manosa,
galactosa, xilosa y arabinosa (azúcares monoméricos y oligoméricos) en el agua soluble
fracción (WSF) y fracción insoluble en agua (WIF).
c) La selectividad de delignificación se define como g lignina eliminada por g de carbohidratos
eliminados.

Fig. 4. Rendimiento total de azúcar de la biomasa original después de los pretratamientos e


hidrólisis enzimática a 50 ° C con una concentración de sólidos del 10% durante 48 h
Tabla 2
Composición química de sustratos, recuperación de azúcar y eliminación de lignina después de la
sulfonación alcalina-pretratamiento con vapor.

a) Sulfonación con bicarbonato de sodio y SO2 seguido de pretratamiento con vapor.


b) Sulfonación alcalina con bicarbonato de sodio y sulfito de sodio seguido de pretratamiento
con vapor

Tabla 3
Características de los sustratos pretratados con sulfonación alcalina-vapor, incluidos
incorporación de grupos ácidos, hinchazón de la fibra (WRV) y accesibilidad a la celulosa
(adsorción de colorante naranja).
Fig. 5. Hidrólisis enzimática y producción total de azúcar a partir de biomasa pretratada mediante
sulfonación alcalina seguida de tratamiento con vapor

Fig. 6. Modelo de hipótesis del pretratamiento en dos etapas con sulfonación alcalina y tratamiento
con vapor para mejorar la digestibilidad enzimática de la biomasa leñosa de Eucalyptus: "+" y "-"
indicadas para aumentar y reducir las características del sustrato y la digestibilidad enzimática.
Fig. 7. Fermentación secuencial de hidrolizado enzimático concentrado: (a) fermentación de glucosa
que se realizó a pH 5,5, 30 ° C y 100 rpm, durante 24 h; (b) xilosa fermentación que se realizó a pH
6.0, 30 ° C y 150 rpm, durante 36 h.

3.5. Pretratamiento en dos etapas con sulfonación alcalina y vapor tratamiento para maximizar
el rendimiento total de azúcar de la biomasa para bioetanol producción

En esta sección, la biomasa estaba sujeta a la sulfonación en álcali medios por adición de
bicarbonato de sodio, con el fin de aumentar aún más la selectividad de deslignificación. Se sugirió
que la adición de álcali a la sulfonación podría facilitar la reacción hacia la deslignificación, que podría
aumentar aún más la porosidad y el área de superficie interna de sustrato [9]. En medios alcalinos,
el grupo hidroxilo libre ubicado en
las subunidades de lignina fenólica se desprotonizaron, mientras que las unidades fenólicas se
convirtieron en intermedio de metida de quinona. Esta reacción causó incorporación de un anión
sulfito en el carbono α que facilitó la desplazamiento nucleofílico del sustituyente β- o γ por iones
sulfito [32]. Además, se informó que el uso de bicarbonato de sodio para hinchar efectivamente la
estructura de la fibra de madera [42], lo que favorece la reacción entre los productos químicos y la
lignina.

En comparación con el pretratamiento de autohidrólisis, pH mucho más alto


Se observó el valor del licor agotado, especialmente para el pretratamiento con bicarbonato de sodio
y sulfito de sodio (pH 7,9 y 7,1 después de la primera y pretratamiento de segunda etapa,
respectivamente). Se informó que este valor de pH reduce la degradación alcalina y la reacción de
pelado secundario de los polisacáridos durante el pretratamiento, promoviendo así la recuperación
de carbohidratos [43]. Como resultado, la recuperación de hemicelulosa después el pretratamiento
se mejoró a 80.56% y 82.65%, después de dos etapas pretratamientos con sulfonación alcalina y
vapor usando SO2 y Na2SO3, respectivamente, en los cuales 53.69% y 59.32% permanecieron en
el fracción sólida Como se anticipó, la eliminación de lignina se mejoró significativamente a 57.09%
y 69.37%, respectivamente (Tabla 2). Con el aumento eliminación de lignina y pretratamiento de
solubilización de hidratos de carbono disminuida, la selectividad de deslignificación se mejoró a 1,64
y 2,21. Se detectó una mayor incorporación de grupos ácidos, particularmente ácido sulfónico (70.14
y 93.52 mmol / kg, respectivamente). Y grado de fibra
la hinchazón se mejoró aún más a 2.54 y 2.77, respectivamente (Tabla 3).
Particularmente, la mayor accesibilidad a la celulosa de 146.50 mg de colorante naranja directo
adsorbido por gramo seco se obtuvo en el sustrato pretratado. por sulfito de sodio (Sulfonación-
Steam de Na2SO3). Enzimático la hidrólisis de estos dos sustratos también se llevó a cabo, y
significativa se encontró una mejora en comparación con la de los sustratos de autohidrólisis (Fig.
5). Como consecuencia de la eliminación / modificación de lignina, glucano y rendimiento de la
hidrólisis de xilano del sustrato pretratado con sulfito de sodio (Na2SO3) Sulphonation-Steam) se
incrementaron a 84.11% y 87.10%, respectivamente (Fig. 5). El rendimiento total de azúcar se elevó
a 79.71%, y un azúcar final concentración de 77.04 g / L en el hidrolizado enzimático, lo que favorece
la obtención de etanol de alto título en la fermentación posterior.

El trabajo previo reveló las dos principales influencias de la lignina, tanto en la restricción de la
hinchazón de la fibra como en la unión directa con las enzimas celulosas [29]. En este trabajo, la
sulfonación alcalina seguida de vapor el tratamiento causó una gran eliminación de lignina y
solubilización parcial de hemicelulosa, lo que condujo a una inflamación de las fibras
significativamente mayor y celulosa
accesibilidad. Por otro lado, se informó que la incorporación de grupos ácidos a través de la
sulfonación tiene el potencial de aumentar la hidrofilicidad, reduciendo la unión de celulasas a lignina
residual
[30]. Al superar las limitaciones infligidas por ambas restricciones de la lignina sobre la accesibilidad
a la celulosa y la unión no productiva de las enzimas [18,21], la digestibilidad enzimática de la
biomasa se mejoró ampliamente y el modelo de hipótesis se ilustró en la Fig. 6.

Finalmente, la más alta hidrólisis enzimática y azúcares fermentables concentración se obtuvieron


después del pretratamiento en dos etapas con alcalina sulfonación usando Na2SO3 y tratamiento
con vapor (pretratamiento con Na2SO3-Sulfonación-Vapor) seguido de hidrólisis enzimática.
Fermentabilidad del hidrolizado enzimático resultante después de Na2SO3 También se evaluó el
pretratamiento de sulfonación-vapor para producir etanol. El hidrolizado enzimático (fracción líquida
de hidrólisis enzimática) se concentró aproximadamente 3 veces antes de la fermentación para lograr
un alta concentración de glucosa inicial de 163.80 g / L y concentración de xilosa de 42.84 g / L. Se
aplicó una estrategia de fermentación secuencial sobre el hidrolizado concentrado, ya que durante
la fermentación secuencial, el la utilización separada de glucosa y xilosa podría asegurar que cada
fermentación etapa utilizar microorganismos adecuados y condiciones, por lo tanto, lo que permite
alta conversión de azúcar a etanol a lo largo de la fermentación proceso. Con el agotamiento de la
glucosa disponible a las 24 h de fermentación de glucosa, se obtuvieron 74,24 g / l de etanol, con
una tasa de conversión de etanol de azúcar de 0,46 g / g. La posterior fermentación de xilosa mostró
que 41.96 g / l de xilosa se convirtió en 14.72 g / l de etanol a las 36 h de fermentación, para una
tasa de conversión de azúcar-etanol de 0.36 g / g (figura 7). Los resultados indicaron que los
azúcares liberados de la hidrólisis enzimática de El sustrato de sulfonación-vapor de Na2SO3 se
convirtió de manera eficiente en etanol. Sugirió que el tratamiento previo de dos etapas de
sulfonación alcalina y vapor, que maximiza el rendimiento total de azúcar mientras conduce a la
eficiencia la producción de etanol a partir de la biomasa bruta, tiene el potencial de ser un enfoque
de pretratamiento prometedor de la biomasa lignocelulósica para producir biocombustibles.
4. Conclusion

En este trabajo, un pretratamiento en dos etapas con sulfonación y vapor el tratamiento se realizó
en biomasa leñosa de Eucalyptus. El pretratamiento con sulfonación se dirige principalmente a la
eliminación / modificación de lignina, mientras que el pretratamiento con vapor podría solubilizar
principalmente la hemicelulosa. Comparado con Pretratamiento con vapor de sulfonación,
pretratamiento con vapor de sulfonación demostró ser más eficaz para mejorar la hidrólisis
enzimática, lo que dio como resultado un mayor rendimiento total de azúcar a partir de la biomasa.
Además, la adición de bicarbonato de sodio en el proceso de sulfonación podría mejorar aún más la
recuperación de carbohidratos y la selectividad de deslignificación. Como resultados del
pretratamiento de sulfonación alcalina-vapor, la digestibilidad enzimática de la biomasa se mejoró
significativamente, y los azúcares fermentables resultantes (glucosa y xilosa) se convirtieron de
manera eficiente en etanol.

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