Eletroforese

Eletroforese –para separar e às vezes purificar macromoléculas –

proteínas e ácidos nucléicos – diferentes tamanhos, carga ou
conformação

Quando moléculas são colocadas em um campo elétrico, migram

para o pólo positivo ou negativo. Proteínas (carga líquida negativa ou
positiva) e DNA sempre negativa (fosfato)

Eletroforese ocorre dentro de uma matriz ou gel

O gel é submerso em um tampão que possui íons para a corrente passar
E também para manter o pH mais ou menos constante.
Gel: composto de agarose ou poliacrilamida

Agarose é um polissacarídeo extraído de alga marinha.

Usada em concentrações de 0,5 to 2%. Fácil de preparar.
Não-tóxico.

Géis de Agarose possuem ampla capacidade de separação

mas baixa resolução
Dependendo da concentração podem separar fragmentos de
DNA de 200 a 50.000 bp, via eletroforese.
Poliacrilamida é um polímero de ligação cruzada de acrilamida. Comprimento
das cadeias do polímero dependem da concentração usada (3,5 a 20%).
São mais difíceis de preparar. Como oxigênio inibe a polimerização precisam
ser montados entre placas de vidro.

Acrilamida: potente neurotóxico e deve ser manipulado com cuidado!!!

Luvas e máscaras devem ser usadas para pesar o pó. A poliacrilamida é
considerada não tóxica mas luvas devem ser usadas pela possível presença
de acrilamida livre

Géis de poliacrilamida possuem baixa capacidade de separação mas

alta capacidade de resolução. Para DNA a poliacrilamida é usada para
separar fragmentos de menos de 500 bp. Às vezes podem ser separados
fragmentos com tamanho de apenas uma base de diferença. Também usados
para separação de proteínas.
Equipamento e reagentes para gel de agarose:
•Uma cuba de eletroforese e um fonte de força
•Bandejas de Gel, em diferentes tamanhos de plástico transparente à UV.
As extremidades são abertas para montar o gel e depois removidas na eletroforese

•Pentes para fazer poços aonde as amostras serão aplicadas

•Tampão de eletroforese (corrida), Tris-acetato-EDTA (TAE) ou

Tris-borato-EDTA (TBE).

•Tampão de amostra material denso (glicerol por ex.) e com cor para ver a amostra
Migração: Azul de bromofenol (300bp) e xileno cianol (4000bp)

•Brometo de Etídeo, corante fluorescente usado para corar ácidos nucléicos.

Atenção: Luvas sempre pois o brometo de etídeo é um agente mutagênico

•Transiluminador (caixa de luz UV), usado para visualizar o DNA corado com EtBr
Atenção: sempre usar proteção nos olhos (UV)
http://www.stolaf.edu/people/muth/7-16-04%20007.jpg
Tampão de amostra
 VISUALIZAÇÃO APÓS A ELETROFORESE
O corante mais comum para géis de agarose é o brometo de etídio
(EtBr). Ele fluoresce sob luz UV quando intercalado nas bases de DNA
(ou RNA)

Correndo o DNA em um gel tratado com EtBr e olhando sob UV

podemos ver as bandas de DNA.

http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis
SYBR Green > Molecular Probes 1995
> Revolucionou a detecção de DNA em géis

A intensidade da fluorescência do SYBR

Green é aumentada em 100X quando se
liga ao DNA. Consegue-se ver picogramas
de DNA.

Junto a sua sensibilidade superior o SYBR

Green tem outras vantagens sobre o EtBr:
- É muito menos mutagênico,
- Pode ser adicionado diretamente à
amostra antes da eletroforese.
Eletroforese Vertical
 VISUALIZAÇÃO APÓS SDS-PAGE

Coomassie Blue

Coomassie Brilliant Blue R250,

se liga inespecificamente a
praticamente todas as
proteínas. É menos sensível
que corar com a prata mas
efetivo também, além de ser
fácil de corar.

http://www.theses.ulaval.ca/2005/22772/22772049.jpg
 Método da Prata

A maior vantagem é a sensibilidade sobre

os outros métodos. Tipicamente 50X maior
que com Coomassie* Brilliant Blue R-250.

Sensibilidade maior oferece vantagens

como menos amostra no gel e análise de
amostra diluída.

A prata pode detectar também ácidos

nucléicos, glicoproteínas e lipoproteínas.