Prof. Mabel Pinilla Fernández PhD.

Actividad de aplicación RT-PCR cuantitativa

Expresión relativa con datos de RT-PCR cuantitativa

Objetivo de la actividad: Aplicar los conocimientos de PCR real time, en
relación a cálculos de expresión relativa de genes.
Instrucciones Generales
Usted dispone de un archivo Excel donde encontrara los resultado de una RT-
PCR cuantitativa, para 51 genes (8 housekeeping y 43 genes blanco) de 32
muestras (31 muestras de estudio y una muestra control).
El resultado de la RT-PCR es mostrado a través de la curva de amplificación,
curva de temperatura de melting y valor de cycle threshold (CT), en los archivos
Excel y PDF.
Por sorteo, a usted se le asignaron 5 genes housekeeping y 2 genes de interés.
Instrucciones específicas
Usted debe:
 Describir los genes de interés asignados (8ptos)
 Calcular el nivel (L) de expresión original de cada gen (L=2-Ct) (5ptos)
 Determinar el/los gen(es) que utilizará como normalizador(es) (7ptos)
 Calcular la expresión relativa de las muestras según la ecuación de Pfaffl
y col., 2002 (2-Ct) (4ptos)
 Realizar el análisis de expresión diferencial (Fold Change, FC) de los
genes asignados entre los grupos de muestras que le corresponden
(24ptos).
Usted deberá entregar sus resultados completando el formulario que
encontrará en la próxima página y realizando los cálculos en la planilla Excel,
creando una nueva pestaña para cada gen interés, ambos documentos deben
ser entregados.

Seminario de Biología Molecular Carrera de Tecnología Médica

Alumno: Cinthia Carrasco Anabalón Actividad de aplicación RT-PCR cuantitativa

Puntaje ____/48pts
Descripción del gen asignado (1)*
Nombre completo del Gen Cell division cycle 42
Gen Symbol CDC42EP
Función biológica Codifica para la proteína GTPasa de la subfamilia Rho, que
regula las vías de señalización que controlan diversas
funciones celulares incluyendo la morfología celular, la
migración, la endocitosis y la progresión del ciclo celular.
Esta proteína es muy similar a Saccharomyces cerevisiae
Cdc 42, y es capaz de complementar la levadura cdc42-1
mutante. Esta proteína podría regular la polimerización de
actina a través de su unión directa a la proteína del
síndrome de Wiskott-Aldrich neuronal (N-WASP), que
posteriormente activa el complejo Arp2/3. El empalme
alternativo de este gen produce múltiples variantes de
transcripción. Pseudogenes de este gen se han identificado
en el cromosoma
Temperatura de melting de la PCR 87.1°C
Descripción del gen asignado (2)
Nombre completo del Gen MAP6 domain containing 1
Gen Symbol MAP6D1
Función biológica Codifica una proteína muy similar al dominio MAP6 de
ratón que contiene la proteína 1, la que está relacionada
con las proteínas STOP. Basado en el estudio de la proteína
de ratón, la proteína codificada puede funcionar como una
proteína neuronal regulada por calmodulina que se une y
estabiliza los microtúbulos, pero también se asocia con las
membranas de Golgi a través de una palmitoilación N-
terminal.
Temperatura de melting de la PCR 77.5°C

* Se realizó de búsqueda de información del gen CDC42EP cómo ‘‘CDC42’’ para obtenerla.

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Alumno: Cinthia Carrasco Anabalón Actividad de aplicación RT-PCR cuantitativa

Elección de normalizador
Genes ACTB
normalizadores BCR
asignados GAPDH
(Ausencia del ítem GUSB
descuenta 1pto)
RPLP0
Criterios de selección, muestre cada una de las tablas y gráficos, indicando con un círculo rojo
el/los genes seleccionados en cada análisis.
Tabla

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Alumno: Cinthia Carrasco Anabalón Actividad de aplicación RT-PCR cuantitativa

Gráfico de
líneas

Genes ACTB
normalizadores GAPDH
seleccionados:
Justificación de Para elegir ACTB y GAPDH se realizó un análisis de ellos mediante geNorm. De
la elección: este se desprende los dos genes, dentro de los cinco en total, eran los que
presentaban un valor M más cercano a 1,5 (ACTB más que GAPDH), es decir, son
los más estables con los que se puede trabajar.
Se debe mencionar que, del total de genes analizados, RPLP0 fue el que tuvo un
valor M más alejado de 1,5, razón por la cual se eliminó y se realizó nuevamente
el análisis obteniendo valores inferiores diferentes de tal forma de poder elegir
realmente dentro de los 4 genes que quedaron cuales son los más estables.
Se justifica el utilizar dos genes constitutivos y no solo uno ya que de esta manera
el resultado es aún mejor, por ende, se puede llegar a un mejor valor de
normalización. Además, según el análisis del grafico de líneas, ACTB y GAPDH son
los que están más a la derecha, lo que reafirma que sean los que presentan más
estabilidad.
Generalmente siempre es mejor elegir los dos últimos y el penúltimo gen que
aparece en el gráfico de líneas, pero en este caso, GUSB no presenta una clara
estabilidad, debido a lo cual se descartó la opción de seleccionarlo.

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Alumno: Cinthia Carrasco Anabalón
Análisis de expresión diferencial del gen asignado (1) CDC42EP
Utilizo algún criterio de exclusión de
muestras
Justifique su elección
FC Comparación 1: Luminar A /Basal
Gráfico Comparación 1
Resultado de diferencias
FC Comparación 2: Con y sin marcación FC: 22,95
IHQ para Ki67
Gráfico Comparación 2
Relate su resultado de FC en relación a
los grupos comparados
Seminario de Biología Molecular
Actividad de aplicación RT-PCR cuantitativa
SI X NO
Se excluyó del análisis la muestra 23 debido a que en
la curva de disociación de la Tm, ésta genera un pico
de melting inespecífico, indicando la presencia de un
producto que no es especifico de lo que deseamos.
FC: 1,80
Debe pegar una imagen editada del gráfico, donde se
señale: el nombre y media de los grupos, FC entre
ellos. Utilice esta página para hacer los gráficos
https://plot.ly/plot
Considerando que los genes diferencialmente
expresos FC ≥|2.0| y que a nuestro resultado FC fue
1.8 entre los grupos Luminal A y Basal, podemos decir
que no existen diferencias de expresión entre los
grupos comparados.
Se debe mencionar que cuando no existen diferencias
de expresión entre los grupos comparados, la
confirmación por análisis estadísticos (t –test) y el valor
de P no tiene mayor relevancia.
Debe pegar una imagen editada del gráfico, donde se
señale: el nombre y media de los grupos, FC entre
ellos. Utilice esta página para hacer los gráficos
https://plot.ly/plot
Se aprecia que los con marcación IHQ para Ki67 en
relación con los sin marcación IHQ para Ki67 tuvieron
22,95 veces mayor expresión de ACTB
Se aprecia que existen diferencias de expresión entre
el grupo Luminal B y HER2+ para el gen VILL (FC >
|2.0|), en donde el gen VILL se encuentra 2,71 veces
más expreso en el grupo Luminal B que en el grupo
HER2+, pero al realizar el análisis estadístico T-
student se obtuvo que no son diferencias
estadísticamente significativas ( T= 1.11468 ; p=
0.28376)
Carrera de Tecnología Médica
Alumno: Cinthia Carrasco Anabalón Actividad de aplicación RT-PCR cuantitativa

Relate sus resultados de diferencias de expresión en

relación a los grupos comparados indicando si existe
o no diferencia de expresión “significativa”

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Alumno: Cinthia Carrasco Anabalón
Análisis de expresión diferencial del gen asignado (2)
Utilizo algún criterio de exclusión de
muestras
Justifique su elección
FC Comparación 1: Luminar A /Basal
Gráfico Comparación 1
Resultado de diferencias
FC Comparación 2: Con y sin marcación FC: 10,04
IHQ para Ki67
Gráfico Comparación 2
Relate su resultado de FC en relación a
los grupos comparados
Seminario de Biología Molecular
Actividad de aplicación RT-PCR cuantitativa
SI NO
No se excluyó del análisis la muestra 23 debido a que
en la curva de disociación de la Tm, ésta genera un
pico de melting inespecífico, indicando la presencia
de un producto que no es especifico de lo que
deseamos.
FC: 1,18
Debe pegar una imagen editada del gráfico, donde se
señale: el nombre y media de los grupos, FC entre
ellos. Utilice esta página para hacer los gráficos
https://plot.ly/plot
Considerando que los genes diferencialmente
expresos FC ≥|2.0| y que a nuestro resultado FC fue
1.18 entre los grupos Luminal A y Basal, podemos decir
que no existen diferencias de expresión entre los
grupos comparados.
Se debe mencionar que cuando no existen diferencias
de expresión entre los grupos comparados, la
confirmación por análisis estadísticos (t –test) y el valor
de P no tiene mayor relevancia.
Debe pegar una imagen editada del gráfico, donde se
señale: el nombre y media de los grupos, FC entre
ellos. Utilice esta página para hacer los gráficos
https://plot.ly/plot
Se aprecia que los con marcación IHQ para Ki67 en
relación con los sin marcación IHQ para Ki67 tuvieron
10,04 veces mayor expresión de GAPDH
existen diferencias de expresión entre el grupo
Luminal B y HER2+ para el gen VILL (FC > |2.0|), en
donde el gen VILL se encuentra 2,71 veces más
expreso en el grupo Luminal B que en el grupo HER2+,
pero al realizar el análisis estadístico T-student se
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Alumno: Cinthia Carrasco Anabalón Actividad de aplicación RT-PCR cuantitativa

obtuvo que no son diferencias estadísticamente

significativas ( T= 1.11468 ; p= 0.28376)

FC 2,4 significa que los apcientes con tratamiento

para cáncer de próstata en relaciona los apcientes sin
tratamiento tuvieron 2,4 veces mayor expresipon de
la IL2

Relate sus resultados de diferencias de expresión en

relación a los grupos comparados indicando si existe o
no diferencia de expresión “significativa”

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