TEORIA.

LAS BACTERIAS DEL SUELO

Son los microorganismos más abundantes y pequeños (0,1 a 1 micras). Pueden ser aerobias (crecen con
oxígeno), anaerobias (crecen sin oxígeno) o facultativas (crecen con o sin oxígeno). Pueden tolerar pH ácido
(acidófilas), pH básico (basófilas) o pH neutro (neutrófilas). En suelos ácidos algunas bacterias neutrófilas tienen
la capacidad de neutralizar el suelo donde se están desarrollando para cumplir su función.

Si las bacterias se alimentan de compuestos orgánicos son heterótrofas. Si se alimentan de inorgánicos, son
autótrofas. Las que se desarrollan a temperaturas medias (15 a 40 grados centígrados) son mesófilas, a
temperaturas menores a 15 grados centígrados son psicrófilas y a temperaturas mayores a 40 grados
centígrados son termófilas. La mayoría de las bacterias del suelo que son importantes para las plantas son
heterótrofas, aerobias y mesófilas.

Algunas bacterias producen endósporas y quistes latentes que les proporcionan resistencia a las variaciones de
temperatura, los niveles extremos de pH y a la desecación del suelo. De esta forma pueden crecer de nuevo
cuando encuentran condiciones favorables. Otras se protegen de la depredación y de la desecación emitiendo
una cápsula de sustancias mucoides. Otras se desplazan en la solución del suelo mediante un flagelo para
encontrar más fácilmente el sustrato alimenticio.

Su capacidad de multiplicación les permite crear poblaciones muy grandes en un tiempo muy corto, colonizando
rápidamente los sustratos a degradar. La clase y abundancia de bacterias presentes en una fracción de suelo
dependen de los sustratos que la compongan y de sus condiciones (suelo ácido, con materia orgánica alta,
anegado, de sabana, etc). Los grupos bacterianos que actúan primero sobre los sustratos disponibles son
dominantes hasta que termina su acción y luego dan oportunidad a que otros grupos crezcan en el residuo del
metabolismo de los primeros. Por lo tanto hay grupos bacterianos que permanecen y otros que entran en
latencia hasta que encuentran condiciones favorables para su crecimiento.

Las bacterias tienen especial importancia en la relación suelo-planta y son responsables del incremento o
disminución en el suministro de nutrientes.

Los suelos agrícolas que están sometidos a la mecanización continua, al monocultivo, al riego, a la aplicación de
agroquímicos y fertilizantes de síntesis, a la compactación y a las quemas, tienen una flora microbiana muy baja
que afecta su fertilidad.

Las bacterias benéficas del suelo son indispensables para recuperar la estructura perdida por las prácticas
agrícolas, para hacer disponibles los nutrientes que hay en el suelo y para incorporarle la materia organiza que
necesita para mejorar la fertilidad.

Entre los géneros bacterianos más importantes agrícolamente por la transformación de los compuestos
orgánicos e inorgánicos y que favorecen la nutrición de las plantas están: Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter,
Azospirillum, Beijerinckia, Nitrosomonas, Nitrobacter, Clostridium, Thiobacillus, Lactobacillus, y Rhyzobium.
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
CARACTERÍSTICAS

Pseudomonas aeruginosa pertenece a la familia Pseudomonaceae. Se trata de un bacilo recto o ligeramente

curvado Gram negativo, con un tamaño de 2–4 x 0,5-1 micras, y móvil gracias a la presencia de un flagelo polar.

En relación con su metabolismo, es aerobio (aunque puede desarrollarse en condiciones anaerobias utilizando
nitrato), catalasa positivo y oxidasa positivo.

Se caracteriza por producir una variedad de pigmentos, como la piocianina (de color azul verdoso), la pioverdina
(pigmento fluorescente de color verde amarillento) y la piorrubina (de color rojo).

RESERVORIO

Suelo húmedo, agua, aguas residuales, vegetación, humanos y animales. Hospedadores Humanos y animales.

CLASIFICACIÓN

Reino: Bacteria

Filo: Proteobacteria

Clase: Gamma Proteobacteria

Orden: Pseudomonadales

Familia: Pseudomonadaceae

Género: Pseudomonas

Especie: P. aeruginosa

PSEUDOMONAS FISIOLOGIA Y ESTRUCTURA

 BaciloGram (-) con flagelos móviles y encapsulados

 Aerobios obligados, Toleran 4-42 oC
 Producen pigmentos verdes y azules que se difunden (piocianina o pioverdina, fluoresceína).
 Oxidan carbohidratos pero no los fermentan
 Patógeno oportunista
 Especie importante P. aeruginosa

ESPECIES DE IMPORTANCIA MÉDICA CAUSANTESDE INFECCIONES NOSOCOMIALES:

10 ESPECIES Grupo Pseudomonas fluorescente aeruginosa Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida

Grupo no Pseudomonas fluorescente stutzeri Pseudomonas mendocina
 MICROORGANISMO EN EL SUELO

Son los verdaderos descomponedores de restos orgánicos transformándolos en compuestos inorgánicos,

cerrando el ciclo de los elementos. Constituyen cerca del 85% de la fracción viva del suelo. Debido a que son
microscópicos muchas veces es difícil de estimar la significancia del peso absoluto de microorganismos en un
suelo. A modo de ejemplo, se puede hacer un cálculo muy general que ayuda a visualizar 67 que, si bien la
biomasa individual es muy pequeña, la gran cantidad de individuos hace que la biomasa absoluta sea muy
grande.

Los microorganismos son los componentes más importantes del suelo. Constituyen su parte viva y son los
responsables de la dinámica de transformación y desarrollo. La mayor actividad de los microorganismos se
realiza desde la superficie del suelo hasta unos 20 centímetros de profundidad. Las colonias de
microorganismos permanecen adheridas a las partículas de arcilla y humus (fracción coloidal) y a las raíces de
las plantas que les suministran sustancias orgánicas que les sirven de alimento y estimulan su reproducción.

Entre las funciones más importantes que cumplen asociadamente en los procesos de transformación están:

 Suministro directo de nutrientes (Fijación de nitrógeno)

 Transformación de compuestos orgánicos que la planta no puede tomar formas inorgánicas que si
pueden ser asimiladas (Mineralización).Ejemplo: Proteína hasta aminoácidos y a nitratos.
 Solubilización de compuestos inorgánicos para facilitar la absorción por las plantas. Ejemplo. Fosfato
tricálcico a Fosfato monocálcico.
 Cambios químicos en compuestos inorgánicos debido a procesos de oxidación y reducción. Ejemplo.
Oxidación del azufre mineral a sulfato. Oxidación del nitrógeno amoniacal a nitrato.
 Aumento del desarrollo radicular en la planta que mejora la asimilación de nutrientes, la capacidad de
campo y el desarrollo.
 Reacciones antagónicas, parasitismo y control de fitopatógenos.
 Mejoramiento de las propiedades físicas del suelo. La microflora del suelo está compuesta por
bacterias, actinomicetos, hongos, algas, virus y protozoarios.
 PROCEDIMIENTO.

PREPARACIÓN DE MEDIOS Y CALDOS.

AGAR CITRATO DE SIMMONS.

 Recomendado para diferenciación de coliformes.

 Suspender 24.2 gramos del polvo en u litro de agua destilada. Dejar remojar durante 5 a 10 minutos.
Mezclar bien y calentar suavemente agitando frecuentemente hasta que el medio hierva durante un
minuto.
 Distribuirán tubos y esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minutos.
 Deje enfriar en una posición inclinada, aunque también se puede emplear el medio en placas.
 3mL por tubo eran 3 tubos en total 9 mL, se usó 0.2196g de agar.

MEDIO MIO.

 Suspender 31 gramos en un litro de agua purificada.

 Mezcle bien.
 Calentar con agitación frecuente y hervir durante un minuto para disolver completamente el polvo.
 Autoclave a 121 ° C durante 15 minutos.
 Pruebe las muestras o el producto terminado para obtener un rendimiento utilizando cultivos de
control estables y típicos.
 3mL por tubo eran 3 tubos en total 9 mL, se usó 0.279g de medio.
 CALDO NUTRITIVO

 Base para el cultivo de microorganismos no difíciles.

 Suspender 8 gramos del polvo en 1 L de agua purificada. Mezcle bien.
 Caliente agitando frecuentemente y hierva 1 minuto para disolver completamente el polvo.
 Autoclave 121°C durante 15 minutos.
 Analice muestras del producto final para verificar su rendimiento usando cultivos de control típicos y
estables.
 9mL por tubo eran 3 tubos en total 27 mL, se usó 0.216g.

AGAR DE HIERRO Y TRIPLE AZUCAR (TSI).

 Disolver 59.4 gramos de medio deshidratado en un litro de agar destilada

 Remojar de 10 a 15 minutos
 Calentar agitando frecuentemente hasta ebullición y completa disolución
 Distribuir en tubos de 13x100 mm.
 Esterilizar a 118°C durante 15 minutos.
 Los tubos se deben enfriar en posición inclinada de manera que el medio de cultivo en el fondo del
tubo alcance una profundidad de 1.5 a 2.0 cm.
 3mL por tubo eran 3 tubos en total 9 mL, se usó 0.5346 gr de agar.
 AGAR DE EOSINA Y AZUL DE METILENO (EMB).

 Disolver 36 gramos del polvfo en un litro de agua destilada o desionizada

 Mezclar y remojar unos 10 minutos para que hidrate completamente el agar
 Calentar agitando con frecuencia y hervir 1 minuto.
 Esterilizar en autoclave a 121°C surante 16 minutos, enfrie entre 40°-60°C
 Agitar suavemente evitando la formacion de grumos, para que lacomposicion del medio se
uniformice y vaciar en cajas petri esteriles.
 9mL por caja eran 3 tubos en total 90 mL, se usó 3.24g de agar.

INOCULACIÓN DEL MEDIO

 Tomar la muestra de suelo con gran humedad (1g).

 Inocular en el tubo con 9 mL de caldo nutritivo.
 Incubar 24- 48 hrs a 37°C.
SEMBRADO EL AGAR SELECTIVO.

 Sembrar por estría en agar selectivo EMB.

 Se calienta el asa de inoculación hasta que quede color rojo intenso para eliminar cualquier
microorganismo, dejar que el asa se enfrié durante 3-5 segundos.
 Recoger una muestra del cultivo bacteriano en una sola inoculación de la caja petri a partir de un caldo.
 Levantar la tapa de la placa Petri que se va a sembrar en un ángulo de 45°
 A continuación disminuir la colonia arrastrando microorganismos de la sección inicial de dos a tres
secciones adicionales, achicando eficazmente la población de microorganismos.
 Incubar 24-48 hrs a 37°C
 TINCIÓN DE GRAM

 Esteriliza un portaobjetos de vidrio para microscopio

 Coloca la muestra en el portaobjetos

Si vas a tomar bacterias de una placa de Petri, esteriliza un asa bacteriológica en la llama de un mechero
Bunsen hasta que brille, luego deja que se enfríe. Úsala para colocar una gota de agua esterilizada sobre el
portaobjetos y luego esteriliza y enfría el asa otra vez antes de transferir una pequeña muestra de bacteria
al portaobjetos y revolverla suavemente en el agua.

 Fija la muestra por calor.

Pasa rápidamente el portaobjetos dos o tres veces por la llama de un mechero Bunsen, la llama debe ser
un cono pequeño y azul, no uno alto y anaranjado.

 Posiciona el portaobjetos en una bandeja para tinción

 Empapa la muestra con cristal violeta.

Usa una pipeta para empapar la muestra de la bacteria con varias gotas de tinte cristal violeta

Espera de 30 a 60 segundos. En una solución acuosa, el cristal violeta (CV) se disocia en CV+ e iones de
cloruro (Cl-). Estos iones penetran a través de la pared celular y la membrana celular de células tanto Gram
positivas como Gram negativas. El ion CV+ interactúa con los componentes con carga negativa de las
células bacterianas para mancharlas de violeta.
  Enjuaga suavemente el cristal violeta.

El agua debería escurrirse sobre la superficie de la mancha pero no estar apuntada directamente a ella. No
enjuagues excesivamente, lo cual pueden quitar la tinción de las bacterias Gram positivas

 Empapa la mancha con yodo y luego enjuaga.

Usa una pipeta para cubrir la mancha con yodo. Déjala reposar por lo menos por 60 segundos, luego
enjuágala cuidadosamente con el mismo método.

El yodo, en la forma de iones con carga negativa, interactúa con los iones CV+ para formar grandes
compuestos de cristal violeta y yodo (compuestos CV-I) dentro de las capas interiores y exteriores de la
célula. Esto atrapa el color del cristal violeta en la célula, en el lugar en el que la haya teñido.
  Agrega un decolorante y luego enjuaga rápidamente
 Empapa la mancha con un colorante secundario y luego enjuaga.

Se usa un colorante secundario, normalmente safranina o fucsina, para agregar un contraste adicional
entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas, tiñendo las bacterias decoloradas (Gram negativas) de
rosado o rojo. Deja el colorante en la muestra por lo menos por 45 segundos, luego enjuágalo.

 Seca el portaobjetos.

Puedes dejar que el portaobjetos se seque con el aire.

 Observar los resultados al microscopio con el objetivo de 100x de inmersión
 SIEMBRA DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

A partir del crecimiento presente de las cajas Petri con agar de eosina y azul de metileno (EMB).

 Agar citrato de Simmons.

Por estría y picadura.

 El Agar-hierro-triple azúcar (TSI).

  MIO medio de movilidad indol ornitina

RESULTADOS:

MIO MEDIO DE MOVILID AD INDOL ORNITINA.

Se obtuvo movilidad en el medio.

TSI AGAR HIERRO TRIPLE AZÚCAR.

Se obtuvo producción de gas.

AGAR CITRATO DE SIMMONS.

Se obtuvo un consumo de sustrato como fuente de carbono.

RESULTADOS

Agar EMB
 CONCLUSIONES

Prueba Pseudomona. E.coli

Morfología Bacilos cortos gram (-) Bacilos gram (-)

Movilidad Positivo Positivo

Producción de gas Negativo Positivo

Sustrato Positivo Negativo

De acuerdo a los resultados se descartó pseudomonas dado que estas no producían gas, y en la prueba
bioquímica se produjo gas en el tubo, mientras que descartamos e.coli ya que no utiliza el sustrato como única
fuente de carbono, en cuanto la morfología ambas coinciden, bacilos gram (-), una de las observaciones más
marcadas fue el hecho del crecimiento en el agar EMB el cual corresponde a colonias de e.coli, tienen 2 a 4
mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo verde metálico cuando se
observan con luz refleja.

En conclusión podemos decir que se tendrían que recurrir a pruebas de identidad más específicas para poder
identificar de manera más certera y concisa el microorganismo presente en nuestro medio.

BIBLIOGRAFÍA:

 http://www.florgarcia.com/wp-content/uploads/2011/11/MICROBIOLOGIA_DEL_SUELO.pdf
 https://es.slideshare.net/diegomaier/pseudomonas-14807341
 http://www.insht.es/RiesgosBiologicos/Contenidos/Fichas%20de%20agentes%20biologicos/Fichas
/Pseudomonas%20aeruginosa%202017.pdf
 https://es.wikihow.com/hacer-una-tinci%C3%B3n-de-Gram
 https://es.slideshare.net/Prymer/medios-bioqumicos
 http://www.bvsde.paho.org/cd-gdwq/docs_microbiologicos/Bacterias%20PDF/Pseudomonas.pdf
 https://es.slideshare.net/0zbii/prueba-mio
 https://es.scribd.com/doc/58421295/Pruebas-bioquimicas-Baterias-Microbiologia
 https://issuu.com/jospa7/docs/final
 http://agro.unc.edu.ar/~microbiologia/wp-content/uploads/2014/04/unidad-4-ecologia.pdf
 https://www.uv.mx/personal/sbonilla/files/2011/06/Escherichia-coli-I.pdf