Isolation and identification of potassium-solubilizing bacteria from tobacco rhizospheric 

soil and their effect on tobacco plants 

Chengsheng Zhanga,b,∗, Fanyu Konga,b 
a Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS), Qingdao 266101, PR China b Key 
Laboratory of Tobacco Pest Monitoring Controlling & Integrated Management, State Tobacco Monopoly Bureau, Qingdao 
266101, PR China 
a r t i c l e i n f o 
Article history: Received 16 October 2013 Received in revised form 4 May 2014 Accepted 6 May 2014 Available online 5 June 
2014 
Keywords: Tobacco Potassium solubilizing bacteria (KSB) Growth promoting 
a b s t r a c t 
Soil  potassium  supplementation  relies  heavily  on  the  use  of  chemical fertilizer, which has a considerable negative impact on the 
environment. Potassium-solubilizing bacteria (KSB) could serve as inoculants. They convert insoluble potassium in the soil into a 
form  that  plants  can  access.  This  is  a  promising  strat- egy for the improvement of plant absorption of potassium and so reducing 
the  use  of  chemical  fertilizer.  The  objectives  of  this  study  were  to  isolate  and  characterize  tobacco  KSB  and  to  evaluate  the 
effects  of  inoculation  with  selected  KSB  strains  on  tobacco  seedlings.  Twenty-seven  KSB  strains  were  isolated  and  identified 
through the comparison of the 16S ribosomal DNA. Among them, 17 strains belonged to Kleb- siella variicola, 2 strains belonged 
to  Enterobacter  cloacae,  2  strains  belonged  to  Enterobacter  asburiae,  and  the  remaining  6  strains  belonged  to  Enterobacter 
aerogenes,  Pantoea  agglomerans,  Agrobacterium  tumefa-  ciens,  Microbacterium  foliorum,  Myroides  odoratimimus, 
andBurkholderia  cepacia,  respectively.  All  isolated  KSB  strains  were  capable  of  solubilizing  K-feldspar  powder  in  solid  and 
liquid  media.  K.  variicolaoccurred  at  the  highest  frequency  with  18  strains.  Four  isolates,  GL7,  JM3,  XF4,  and  XF11,  were 
selected  for  a  green-  house  pot  experiment  because  of  their  pronounced  K-solubilizing  capabilities. After being treated with the 
four  KSB  strains,  plant  dry  weight  and  uptake  of  both  K  and  nitrogen  (N)  by  tobacco  seedlings  increased  significantly.  These 
increases  were  higher  with the combination of KSB inoculation and K-feldspar pow- der addition. Isolate XF11 showed the most 
pronounced  beneficial  effect  on  plant  growth  and  nutrient  uptake  by  tobacco  seedlings.  Combining  the  inoculation of KSB and 
the  addition  of  K-feldspar  powder  could  be  a  promising  alternative  to  commercial  K  fertilizer  and  may  help  maintain  the 
availability  of  soil  nutrients.  Further  studies  are  necessary  to  determine  the  effects  of  these  bacterial  strains  on  mobilization  of 
potassium-bearing minerals under field conditions. 
© 2014 Elsevier B.V. All rights reserved. 
1. Introduction 
Potassium  (K)  is  essential  to  plant  growth  and  development.  It  is  involved  in  the  adjustment  of  plant  cellular  osmotic  pres- 
sure  and  the  transportation  of  compounds in plants. It promotes the activation of enzymes, the utilization of nitrogen (N), and the 
syntheses  of  protein  and  sugar.  It  also boosts plant photosynthe- sis (Sparks, 1987). Plants can only take in K through the soil. In 
plants,  K  deficiency  causes  yellowing  of  the  leaf  edges,  giving  them  a  burned  appearance.  It  can  also  cause  slow  growth  and 
incomplete root development (Munson, 1985). Before the 1980s, almost all 
∗ 
Corresponding  author  at:  Tobacco  Research  Institute  of  Chinese  Academy  of  Agricultural  Sciences  (CAAS),  Qingdao 
266101, PR China. Tel.: +86 532 88703236; fax: +86 532 88703236. 
E-mail addresses: zhchengsheng@126.com, zhangchengsheng@caas.cn (C. Zhang). 
agricultural  operations  in  China  used  only  organic  fertilizer,  which  did  not  contain  sufficient  K.  Potassium  fertilizer  has  been 
widely  used  since  the  1980s,  but  the  great  increase  in  crop  yield  further  exacerbated  soil  K  deficiency,  which  stimulates  the 
application of K fertilizer (Shi et al., 2008). The consumption of K exceeded 10.4 mil- lion tons in 2011, when 40% of all China’s 
K  fertilizer  was  imported  (Qi  et  al.,  2012).  This  indicates  that  soil  K  deficiency  and  K  fer-  tilizer  deficiency  have  become 
important  limiting  factors  for  the  development  of agriculture in China (Sheng et al., 2002). The mass application of fertilizer can 
increase  costs,  decrease  the  efficiency  of  K  fertilizer  (Zhang  et  al.,  2008),  and  damage  the  environment.  An  alternative  to 
chemical K fertilizer is necessary for the sustainable development of agriculture. 
One  possible  alternative  could  be  to  fully  exploit the reservoir of K in the soil. Soil has rich reserves of K, among which only 
1–2%  can  be  directly absorbed by plants (Malinovskaya et al., 1990). About 90–98% of the soil K exists in silicate minerals such 
as K-feldspar and mica, which only release K slowly (Goldstein, 1994). This presents 
http://dx.doi.org/10.1016/j.apsoil.2014.05.002 0929-1393/© 2014 Elsevier B.V. All rights reserved. 
journal homepage: www.elsevier.com/locate/apsoil 
Applied Soil Ecology 82 (2014) 18–25 
Contents lists available at ScienceDirect 

Applied Soil Ecology 

 
C. Zhang, F. Kong / Applied Soil Ecology 82 (2014) 18–25 19 
the  paradox  that  soil  is  both  K  deficient  and  K  rich.  It  may  be  more  economically  viable  to  transform  the fixed slow-release K 
into  available  K  that  can  be  absorbed  by  plants.  Studies  have  shown  that  a  variety  of  soil  microbes  can  release  soluble K from 
K-bearing  minerals  such  as  K-feldspar,  mica,  and  illite.  These  microbes  release  organic  acid,  which  quickly  dissolves rock and 
chelate  silicon  ions,  releasing  K  ions  into  the  soil  (Bennett  et  al.,  1998;  Friedrich  et  al.,  2004).  It  has  been  shown  that Bacillus 
mucilaginosus  and  Bacillus  edaphicus  can  generate  polysaccharide  and  carboxylic  acids,  such  as  tartaric  acid and citric acid, to 
solubilize  K  compounds  (Richards  and  Bates,  1989;  Lin  et  al.,  2002).  Using  K-solubilizing  microbes  to  increase  the 
concentration of available K ions in the soil may mitigate K deficiency (Barker et al., 1998). 
Tobacco  is  an  economically  important  crop.  One  million  acres  of  tobacco  are  planted  each  year  in  China  (Zhu,  2008). 
Tobacco  growth  largely  depends  on  the  availability of K supply in the soil. Potas- sium is not only a crucial nutrient for tobacco; 
it  also  improves  the  flammability  of  tobacco  leaves  and  so  decreases  the  amount  of  tar  produced  during  burning.  Potassium 
content is one of the most significant indices of tobacco quality (Barshad, 1964; Mitchell, 1975). 
Chemical  K  fertilizer  is  the  largest  source  of  available  soil  K.  Using  larger  amounts  of  K  fertilizers  and  promoting  the 
availability  of  K  can  increase  K  content  in  tobacco  leaves  (Ma,  2006;  Li  et  al.,  2007). However, in addition to increasing costs, 
the  extensive  use  of  fertilizers  can  destroy  soil  structures,  decrease  the  amount  of  organic  matter  in  the  soil,  and  aggravate 
environmental  pollution.  In  recent  years,  the  importance  of  food  security  and  environmen-  tal  sustainability  has  gained  more 
attention,  contributing  to  the  rapid  development  of  organic  farming in China. The production of organic tobacco increased when 
strict  limits  were  placed  on  the  use  of  chemical  fertilizer  and  pesticides.  To  complement  the  require-  ments  for  K  in  organic 
tobacco  planting,  minerals  containing  K,  such  as  K-feldspar  and  mica,  have  been  used.  It  is  the  largest  and  the  most  widely 
distributed  reservoir  of  non-soluble  K  resources  in  China  (Hu  et  al.,  2005).  Potassium  feldspar  provides  K  for  plant  growth 
through  chemical  and  biological  transformations.  One  type  of  transformation, the conversion of K-feldspar to K fertilizer, is dif- 
ficult  and  costly.  Another option, converting K-feldspar into plant available forms, can be accomplished using bacteria (Nishanth 
and  Biswas,  2008).  Some  studies  have  shown  that  the  application  of  K-solubilizing  bacteria  (KSB)  and  K  bearing  minerals 
increases  the  amount  of  available  K  in  the  soil  and  promotes  plant  uptake  of  K  (Sheng  et  al.,  2002;  Sheng,  2005;  Basak  and 
Biswas, 2009; Abou-el- Seoud and Abdel-Megeed, 2012). 
Using  KSB  to  increase  the  concentration  of  K  available  in  the  soil  has  considerable  potential  for  practical  application. 
However,  reports  of  KSB  in  tobacco  rhizosphere  and  the  effects  of  KSB  on  tobacco  growth  are  lacking  in  the  literature. 
Therefore,  the  goals  of  this  study  are  to  (1) isolate and characterize tobacco KSB and (2) study the effects of KSB on the release 
of K from K-feldspar and their effects on tobacco growth. 
2. Materials and methods 
2.1. Materials 
2.1.1. Soil sampling 
Fifteen  rhizospheric soil samples of approximately 500g each were collected from three tobacco fields (five samples per field) 
covering  a  total  area  of  16,667  m2 in June 2010. The three tobacco fields were located at Gulan County in Luzhou City, Sichuan 
Province,  Jimo  County  in  Qingdao  City,  Shandong  Province,  and  Xianfeng  County  in  Enshizhou  Region,  Hubei  Province. The 
rhizo- sphere soil was sampled in June, which is peak growing season 
for  tobacco.  The  soil  samples  were  taken  within  10  cm  of  tobacco  plants.  The  top  5  cm  of  the  topsoil  was  removed  before the 
collec-  tion  of  soil  samples  from  6  to  10cm  soil  layer,  where  roots  were  concentrated.  From  about  0  to  2.5  mm  away  from the 
root  surface,  a  zone  of  soil  is  located  that  is  significantly  influenced  by  living  roots  and  is  referred  to  as  the  rhizosphere. 
Rhizosphere  soil  and  roots  were  separated  from  the  bulk  of  the  soil  by  hand.  Ten  plant  samples  were  taken  randomly  in  every 
667m2  (1  m)  and  10g  of  rhizosphere  soil  was  collected  around  each  plant.  The  mixture  obtained  from  10  plant  samples 
constituted  a  sample.  All  soil  sam-  ples  were  sealed  in  sterilized  ziplock  bags,  stored  in  an  ice  chest,  and  used  within  8  h  of 
collection.  Some  physicochemical  properties  of the experimental soils were determined by using the follow- ing methods and the 
results were shown in Table 1. Total organic C was determined by potassium dichromate method (Lu, 1999). Alkali-hydrolyzable 
N  was  determined  by alkali solution method (Lu, 1999). Available P was determined by molybdenum blue colori- metric method 
after  extraction  by  sodium  bicarbonate  (Lu,  1999).  Available  K  was  determined  by  ammonium  acetate  extraction  and  flame 
photometric method (Lu, 1999). 
2.1.2. Mineral samples 
K-feldspar powder (containing ≈11% K 
2 
O;  manufactured  by  Qingdao  Xinyun  Metallurgical  Materials  Co.,  Ltd)  was 
purchased  and  passed  through  a  #100  sieve.  The  sieved  powder  was  sub-  merged  in  sterilized  water  for  three days to eliminate 
soluble K. 
2.1.3. Culture substrates 
Aleksandrov medium (Hu et al., 2006): 0.5% glucose, 0.05% magnesium sulfate heptahydrate (MgSO 
4 
·7H 
2 
O), 0.0005% iron (III) chloride (FeCl 
3 
), 0.01% calcium carbonate (CaCO 
3 
), 0.2% cal- cium phosphate (CaPO 
4 
), and 0.2% potassium aluminum silicate (KAlSi 
3 
O 
8 
), pH 7.0–7.5. Solid nutrient agar: 0.3% beef extract, 0.5% peptone, 18% agar, pH 7.0–7.5. 
Solid Gauze’s medium no. 1: 2% soluble starch, 0.0005% sodium chloride (NaCl), 0.1% potassium nitrate (KNO 
3 
), 0.0005% dipotas- sium hydrogen phosphate trihydrate (K 
2 
HPO 
4 
·3H 
2 
O), 0.0005% magnesium sulfate heptahydrate (MgSO 
4 
·7H 
2 
O), 0.00001% iron (II) sulfate heptahydrate (FeSO 
4 
·7H 
2 
O), pH 7.4–7.6. 
2.2. Isolation of KSB from tobacco rhizosphere 
Modified solid Aleksandrov medium (K-feldspar powder was added to the solid Aleksandrov medium as the sole source of K) 
was  used  to  screen  KSB  in  the  soil.  Five  grams  of  soil sample from the rhizosphere was diluted to 10−5–10−6 suspension using 
100mL  sterilized  water.  The  soil  suspension  of  50  L  was  then  spread  over  a petri dish containing culture medium for KSB. The 
petri  dishes  were  placed  in  the  incubator  at  30  ◦C  for 72h. Each of fast-growing isolates that showed solubilization zones on the 
agar  plates  were  retested  in  triplicate  using  the  methods  described  above.  The diameter of the solubilization zone was measured 
in  cm  and  the  values  are  reported  as  mean  ±standard deviation for each sample. Screened strains were transferred to a slant with 
solid  nutrient  agar  medium  for  bacteria,  or  to  solid  Gauze’s  medium  no.  1  for actinomycete, which were then stored at 4 ◦C for 
future use. 
2.3. Assessment of the solubilization ability of soil KSB from tobacco rhizosphere 
2.3.1. Incubation of KSB on shaker 
K-feldspar  powder  was  added  to  liquid  Aleksandrov  medium  as  the  sole  source  of  K  to  test  the  ability  of  the  isolates  to 
solubilize  the  mineral.  To  further  analyze  the  ability  of  KSB  in  solutions  to  solubilize  K,  50  mL  of  Aleksandrov  solution  was 
added into 250 mL 
 
20 C. Zhang, F. Kong / Applied Soil Ecology 82 (2014) 18–25 
Table 1 Some physicochemical properties of the experimental soils. 
Sampling site Elevation (m) Soil type Total organic C (%) Available P (mg kg−1) Available K (mg kg−1) Alkali-hydrolyzable N 
(mg kg−1) pH 
Gulin  920  Yellow  soil  2.12 1.35 45 132 6.5 Jimo 30 Brown Soil 1.20 3.52 62 103 5.8 Xianfeng 850 Yellow brown soil 1.71 3.10 
96 119 6.8 
flasks.  The  flasks  with  the  Aleksandrov  solution  were  sterilized  by  autoclaving  at  0.1  MPa  for  20  min.  The  cooled  flasks were 
inoculated  with  1mL  KSB  solution.  Uninoculated  Aleksandrov  solution  was  used  as  a  control.  Three  flasks  for  statistical 
replication were used to incubate at 150 rpm and 28± 1 ◦C for 7 days. Available K content was measured on the 7th day. 
2.3.2. Assessment of available K in the supernatant 
The  incubated  solution  containing  KSB  was  diluted  to  50  mL  and  centrifuged  at  500  rpm  for  10  min  to  eliminate insoluble 
materials.  Ten  milliliters  of  the  solution  was  centrifuged  at  10,000rpm  for  10min  to  indicate  the  K  content  in  the  supernatant 
using  flame  spectrophotometry  (Sugumaran  and  Janarthanam,  2007).  Potas-  sium  chloride  solution  was  used  to  prepare  the 
standard curve. The experiment was repeated five times. The results are reported as mean ±standard deviation for each sample. 
2.4. Phylogenic analysis of KSB 
DNA  was  extracted  using  methods developed by Kim et al. (1995) and Rainey et al. (1996). Purified bacteria were added to 2 
L  sterilized  deionized  water  using  a  sterilized  tooth  pick,  boiled  for  10min,  and  cooled  in  an  ice  bath for 2min. They were then 
centrifuged  at  12,000rpm,  4  ◦C  for  5min. The sample was cen- trifuged before each use to ensure proper performance during the 
polymerase  chain  reaction  (PCR).  A  3  L of supernatant was used in a 50 L PCR system. 16S rRNA universal primers of bacteria 
were  used  for  PCR-amplification.  The  sense  strand  primer  used  for  PCR  was  5 -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 (F27), and 
the  anti-  sense  strand  used  was  5  -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 (R1492). The PCR system (50 L) was composed of 0.5 
L  of  DNA,  4  L  of  2.5  mmol  L−1  dNTP  mixture,  1  L  of  forward  and  reverse  primer  each,  0.5  L  of  TansTaqDNA  polymerase 
(Fermentas),  5  L of buffer solution (10× buffer), and 38 L of deionized water. The PCR took place as follows: 30 cycles of 94 ◦C 
for 1 min, 94 ◦C for 30 s, 48 ◦C for 30 s, 48 ◦C for 30 s, 72 ◦C for 5 min, and 72 ◦C for 10 min. 
PCR  products  were  sequenced  by  Shaihai  Yingjun  Biotechnol-  ogy  Ltd.,  Beijing  Station.  The  sequencing  results  were 
analyzed  using  NCBI  database  for  homologous  sequences  of  16S rDNA. The Kimura 2-parameter method was used to calculate 
the  differences  in  nucleotides  (Kimura,  1980).  The  neighbor-joining  method  was  used  to  build  a  phylogenetic  tree  (Saitou  and 
Nei, 1987). 
2.5. Promotional effects of KSB on tobacco growth 
Based  on  the  solubilizing ability of KSB isolates, 4 isolates with strong K solubilizing ability, i.e. GL7, JM3, XF4, and XF11, 
were  selected  to  test  their  effects  on  tobacco  growth  and  nutrient  uptake.  The  KSB  isolates  were  incubated  on  nutrition  agar 
medium  plates,  and  isolate  was  transferred  to  flasks  containing  100mL  of  meat  broth  and then incubated on a shaker at 180rpm 
and  28 ◦C for 48 h. The bacterial suspension was diluted with sterilized water to 106 CFU mL−1 and then applied to 5 weeks-old 
tobacco seedlings (tobacco variety K326 with 6 true leaves). 
The  seedling  experiment  was  carried  out  in  environmental  chambers at 28 ◦C, 80% humidity, and 300 mol m−2 s−1 for 12 h 
per day. The sandy soil used in this experiment came from Jimo tobacco fields in Qingdao, Shandong Province. The soil has a pH 
value of 
7.1.  It  contained  18.42gkg−1  organic  matter,  0.594gkg−1 avail- able N, 15.41mgkg−1 available phosphorus (P), 4.93gkg−1 total 
K,  and  105mgkg−1  available  K.  The  soil  was  sterilized  and  then  used  for  planting  in  pots  5cm in diameter and 50cm in height. 
Tobacco  seedlings  with  5–6  true  leaves  were  carefully excavated. The attached soil was removed and the seedlings were planted 
in individual pots. 
A  pot  experiment  was  conducted  in  quintuplicate.  Each  repli-  cate  included  5  seedlings.  The  experiment  included  the 
following  10  treatments,  i.e.  T1,  control  (no  feldspar,  no  bacterial  culture);  T2, feldspar powder, 100 mg kg−1 soil; T3, GL7 (K 
solubilizer);  T4,  JM3  (K  solubilizer);  T5,  XF4  (K  solubilizer);  T6,  XF11  (K solubilizer); T7, feldspar powder, 100mgkg−1 soil, 
mixed  with  GL7;  T8,  feldspar  powder,  100  mg  kg−1  soil,  mixed  with  JM3;  T9,  feldspar  powder,  100  mg kg−1 soil, with XF4; 
T10,  feldspar  powder,  100mgkg−1  soil,  with  XF11.  The  control  (T1)  was set up with 10mL of ster- ilized Aleksandrov solution 
medium  applied  to  the  roots  of  the  tobacco  seedlings.  The  treatments  consisted  of  10  mL  stable  combi-  nations  of  bacterial 
colony  in  106  CFU  mL−1  of  bacterial  suspension,  which  was  applied  to  the  tobacco  roots.  The  starting  day  was defined as the 
inoculation  day. Thirty days after inoculation, the seedlings were excavated completely and the soil was rinsed off from the roots. 
Seedling heights were measured. The seedlings were then oven-dried to constant weight and the dry weight was measured. 
2.6. Plant nutrient analyses 
Plant  samples  were  finely  ground  after  drying  at  approximately  65  ◦C  for  48  h. The ground samples were used to determine 
the  N,  P,  and  K  concentrations  of  tobacco  seedlings  in  the  manner  described  by  Wang  et  al.  (2003).  The  total  N  concentration 
was  assayed  by  the  Kjeldahl  method.  The  P  concentration  was  determined  using  the  sodium  carbonate  fusion  method.  The  K 
concentration was measured using the sodium hydroxide molten flame photometric method. 
2.7. Chemical properties of rhizosphere soils 
The  rhizosphere  soil  samples  were  aseptically  separated  from  roots  to  assess the chemical properties of the soil. Soil pH was 
measured  in  a  2:1  water/soil  suspension  using  a  pH  meter.  Avail-  able  K  was  extracted  using  the ammonium acetate extraction 
method  and  analyzed  using  the  flame  photometric  method  and  molybdate  blue  method  (Lu, 1999). Specifically, 5 g of air-dried 
soil  was  passed  through  1mm  sieve.  Then  50mL  ammonium  acetate  solution (1 mol L−1) was mixed with the sieved soil in 100 
mL Erlen- meyer flask by oscillation for 30 min. The mixture was filtered using regular qualitative filter paper. The concentration 
of  available  K  in  the  filtrate  was  measured  on  a  flame  photometer  with  a  series  of  standard solutions of potassium, which were 
used to create the standard curve. 
2.8. Data analyses 
All  data  obtained  in  the  pot  experiments  were  subjected  to  analysis  of variance (ANOVA), and means were separated by the 
Fisher’s protected LSD test using the SPSS package (version 11.0). 
 
C. Zhang, F. Kong / Applied Soil Ecology 82 (2014) 18–25 21 
0.35 
0.3 
0.25 
0.2 
0.15 
0.1 
0.05 
0 
Strain No. 
Fig. 1. Solubilization zones of different potassium-solubilizing bacteria isolates. Each bar represents a mean diameter of 
solubilization zone in cm. Error bars represent standard errors for three samples from three replications. 
Differences  obtained  at  the  P  ≤0.05  level  were  considered  sig-  nificant.  A  Pearson’s  correlation matrix was used to evaluate the 
relationship between biomass yields, nutrients taken up by tobacco, and available K in the soil. 
3. Results 
3.1. Isolation of KSB from tobacco rhizosphere 
A  total  of 27 strains of KSB were found in the tobacco rhizosphere in Gulan, Xianfeng and Jimo. Among these strains, 7 were 
found  in  Gulan,  Sichuan  Province:  GL4,  6,  7,  9,  10,  11,  and  13;  10  were  found  in  Jimo, Shandong Province: JM2, 3, 5, 10, 11, 
12,  13,  16,  17,  and  19;  10  were  found  in  Xianfeng,  Hubei  Province:  XF2,  4,  5, 6, 7, 9, 11, 13, 15, and 16. A potassium feldspar 
powder  agar  plate  was  used  in  the  quantitative  measurement  of  the  K  solubilization  ability  of  the  KSB.  All  the  bacteria  were 
found to be capable of solubilizing K, and the solubilization zone ranged from 0.11 to 0.30 cm (Fig. 1). Strain 
XF11  showed  the  most  pronounced  ability  to  solubilize K (0.30 cm in diameter). It was followed by GL7 (0.264 cm), JM2 (0.26 
cm), and JM19 (0.258 cm). JM5 solubilized the least K (0.11 cm). 
3.2. Potassium solubilizing activity of the bacteria 
The  ability  of  all  27  KSB  strains  from  the  tobacco  rhizosphere  to  solubilize  potassium  was  assessed  (Fig.  2).  All  of  the 
bacteria  exam-  ined  were  able  to  solubilize  K  but  not  always  to  the  same  extent.  The  ability  of  the KSB to solubilize K ranged 
from  0.59mgL−1  to  4.4  mg  L−1.  Out  of  the  27,  15 isolates (55.56%) showed solubilization ability below 1.0 mg L−1, 8 isolates 
(29.63%)  showed  solubilization  activity  between  1.0  mg  L−1  and  2.0  mg  L−1,  and  4  isolates  (14.81%)  showed  solubilization 
activity  greater  than  2.0mgL−1.  The  XF11  isolate  had  the  most  pronounced  ability to solubilize K (4.4 mg L−1), which was 8.8 
times  that  of  the  control.  It  was  followed  by  JM2  (3.34  mg  L−1).  GL7  and  XF4  also  showed  good solubilization activity (>2.0 
mg L−1). 
5.00 
4.50 
4.00 
3.50 
3.00 
2.50 
2.00 
1.50 
1.00 
0.50 
0.00 

Strain No. 
Fig. 2. Potassium solubilization activity of KSB isolates in liquid medium. Each bar represents a mean (±standard deviation) 
solubilize K content in mg L−1. Uninoculated Aleksandrov solution was used as a control (1st bar). Error bars represent standard 
errors for three samples from three replications. 
 
22 C. Zhang, F. Kong / Applied Soil Ecology 82 (2014) 18–25 
Table 2 Genetic characterization of selected KSB strains to gene level. 
Microbe group Respective strain Collection site GenBank accession no. Closest relatives in NCBI (GenBank accession no.) 
Max. identity (%) 
Klebsiella GL4 Gulin Shuikou KC853283 Klebsiella variicola (NR 025635) 100 GL6 Gulin Shuikou KC853284 Klebsiella 
variicola (CP001891) 99 GL9 Gulin Shuikou KC853286 Klebsiella variicola (HQ407252) 99 JM2 Jimo Wenquan KC853290 
Klebsiella variicola (HQ259961) 99 JM3 Jimo Wenquan KC853291 Klebsiella variicola (HQ259961) 99 JM5 Jimo Wenquan 
KC853292 Klebsiella variicola (HQ259961) 99 JM10 Jimo Wenquan KC853309 Klebsiella variicola (HQ259961) 99 JM12 Jimo 
Wenquan KC853294 Klebsiella variicola (HQ259961) 99 JM13 Jimo Wenquan KC853295 Klebsiella variicola (HQ407252) 99 
JM16 Jimo Wenquan KC853296 Klebsiella variicola (HQ259961) 99 XF4 Xianfeng Wanjiaba KC853300 Klebsiella variicola 
(CP001891) 99 XF6 Xianfeng Wanjiaba KC853302 Klebsiella variicola (JF690980) 100 XF7 Xianfeng Wanjiaba KC853303 
Klebsiella variicola (CP001891) 99 XF9 Xianfeng Wanjiaba KC853304 Klebsiella variicola (CP001891) 99 XF11 Xianfeng 
Wanjiaba KC853305 Klebsiella variicola (HQ259961) 99 XF13 Xianfeng Wanjiaba KC853306 Klebsiella variicola (HQ259961) 
99 XF16 Xianfeng Wanjiaba KC853308 Klebsiella variicola (HQ259961) 99 Enterobacter GL7 Gulin Shuikou KC853285 
Enterobacter cloacae (JF772064) 99 JM11 Jimo Wenquan KC853293 Enterobacter cloacae (JF772064) 99 XF2 Xianfeng 
Wanjiaba KC853299 Enterobacter asburiae (JQ659657) 99 XF5 Xianfeng Wanjiaba KC853301 Enterobacter asburiae 
(JQ271799) 99 XF15 Xianfeng Wanjiaba KC853307 Enterobacter aerogenes (EU855208) 99 Pantoea GL10 Gulin Shuikou 
KC853287 Pantoea agglomerans (EU590682) 99 Agrobacterium GL11 Gulin Shuikou KC853288 Agrobacterium tumefaciens 
(FN433082) 99 Microbacterium JM17 Jimo Wenquan KC853297 Microbacterium foliorum (EU714341) 100 Burkholderia GL13 
Gulin Shuikou KC853289 Burkholderia cepacia (FN178432) 100 Myroides JM19 Jimo Wenquan KC853298 Myroides 
odoratimimus (GU186112) 99 
3.3. Phylogenic analysis of tobacco rhizosphere KSB 
The  16S  rDNA  sequences  of  the  27  KSB strains were com- pared to those of known 16S rDNA sequences using BLAST and 
the  GenBank  database.  The  results  showed  that  the 27 isolates of KSB from the tobacco rhizosphere can be categorized into five 
groups  (Table  2,  Fig.  3).  Among  them,  23  isolates  were  gammaproteobacteria  (85.19%),  and  the  other  4  were  alphapro- 
teobacteria,  betaproteobacteria,  actinobacteria,  and  bacteroidetes,  respectively.  Eighteen  isolates  (62.96%)  were  found  to  be 
closely  phylogenetically  related  to  Klebsiella,  showing  with  99–100%  sim-  ilarity  in  their  16S  rDNA  sequences,  making 
Klebsiella  the  most  dominant  genus.  Five  isolates  (18.52%)  were  found  to  be  closely  phylogenetically  related  to  Enterobacter, 
making Enterobacter the second most dominant genus. 
3.4. Plant growth and nutrient uptake among tobacco seedlings 
Inoculation  influenced  the  plants’  growth  and  ability  to  absorb  nutrients  (Table  3).  Tobacco  seedlings  inoculated  with  JM3, 
XF4,  and  XF11  showed  greater  height  and  dry  weight  than  uninocu-  lated  tobacco  seedlings  (P≤0.05).  The  GL7  did  not 
significantly 
influence  plant  height,  but  it  did  significantly  increase  plant  dry  weight.  Uninoculated  soil  showed  no  significant  difference 
between  plants  treated  with  K-feldspar  and  those  not  so  treated.  However,  after  inoculating  soil  with  KSB,  the  height of plants 
treated  with  added  K-feldspar  differed  from  that  of  plants  without  K-feldspar addition in the XF11 inoculation treatment. Plants 
inoc-  ulated with JM3, GL7, and XF4 and treated with added K-feldspar did not show significant differences in height from those 
not  treated  with  added  K-feldspar.  However,  the  dry  weight  of  plants  inocu-  lated  with  JM3,  GL7,  XF4,  and  XF11  and treated 
with K-feldspar addition was significantly different from that of plants not treated with added K-feldspar. 
Inoculation  with  JM3,  GL7,  XF4,  and  XF11  significantly  increased seedling absorption of N, P, and K. Seedlings exposed to 
K-feldspar  absorbed  significantly  more  N  and  K  than  those  not  exposed  to  added  K-feldspar.  The  only  KSB  isolate  that  had 
significant effects on P absorption was JM3. 
3.5. Changes in pH and available K content in tobacco rhizosphere 
Inoculation with KSB decreased soil pH value and increased available K content in the tobacco rhizosphere (Table 3). 
Treatment 
Table 3 Effects of K-solubilizing bacteria on plant growth, nutrient uptake and soil chemical properties. 
Treatment Tobacco seedling Rhizosphere soil of tobacco 
Plant height (cm) 
Dry weight 
Total K uptake 
Total N uptake 
Total P uptake 
pH Available K (g) 
(g kg−1) 
(g kg−1) 
(g kg−1) 
(mg kg−1) 
Control  7.95ea  0.48f  38.40i  22.23j  4.59e  7.0a  121.78g  Feldspar  powder  8.10e  0.49f  39.23h  23.39i  4.81e  6.9b  131.79f  GL7 
8.30de  0.63e  41.87f  24.71h  5.28d  6.9b  135.47e  JM3  9.04b  0.70d  43.68e  25.61g  5.58cd  6.8c  145.09d  XF4  8.80c  0.63e  41.63g 
26.46f  5.42d  6.8c  130.53f  XF11  10.10a  0.81c  46.00c  28.11d  5.93b  6.7d  149.18c  Feldspar  powder  +  GL7  8.56cd  0.69d  44.87d 
26.76e  5.58cd  6.8c  151.08c  Feldspar  powder  +  JM3  9.05b  0.87b  47.38b  29.36b  5.93b  6.8c  165.48b  Feldspar  powder  +  XF4 
8.60cd 0.71d 43.63e 28.62c 5.78c 6.8c 144.65d Feldspar powder + XF11 8.48d 1.02a 49.30a 30.71a 6.21a 6.70d 185.38a 
a Values within a column followed by the same lower case letters are not significantly different P< 0.05. 
 
Fig. 3. Phylogenetic tree of K-solubilizing bacteria from tobacco rhizosphere soil based on 16S rDNA sequences. All tested 
isolates had their 16S rRNA gene partially sequenced and were grouped according to its genus or species designation. 
with  both  KSB  and  K-feldspar  increased  the  concentration  of  K  in  the  tobacco rhizosphere over that of plants treated with KSB 
alone.  Among  the  KSB  isolates,  XF11  showed  the  highest  increase  in the concentration of available K in the soil and the lowest 
pH value. 
3.6. Correlation matrix 
A  significant  correlation  (P<0.01)  was  observed  between  tobacco  biomass,  nutrient  uptake  by  tobacco,  and  soil  available  K 
content.  Biomass  yield  was  significantly  (P<0.01)  and  posi-  tively  correlated  with K uptake (r= 0.98), N uptake (r= 0.94), and P 
uptake  (r=  0.95)  by  tobacco  and  with  available  K  content  in  the  soil  (r=  0.95).  Similarly,  a  significant  positive  correlation  was 
observed between K uptake and the amount of available K in the soil (r= 0.95). 
4. Discussion 
Potassium  is  one  of  the  mass  nutrients  essential  for  plant  growth  and  development.  Most  of  the  K  in  soil  exists  in  various 
insolu-  ble  rocks, minerals, and sedimentary materials (Goldstein, 1994). Soil K may be solubilized and absorbed by plants under 
cer- tain circumstances. Microbes play an important role in natural K cycles. Many studies have shown that soil contains a variety 
of  KSB  (Friedrich  et  al.,  2004).  These  microbes  decompose  silicate  minerals such as K-feldspar and mica. They transform solid 
K in the soil into available K that can be directly absorbed by plants, and they secrete active substances that promote plant growth 
(Sheng  et  al.,  2001).  The  use  of  KSB  as  a  biological  fertilizer  is  a  hotspot  in  the  study  of  agriculture  and  environmental 
conservation (Deng et al., 2003). 
C. Zhang, F. Kong / Applied Soil Ecology 82 (2014) 18–25 23 
 
24 C. Zhang, F. Kong / Applied Soil Ecology 82 (2014) 18–25 
KSB  can  be  obtained  from  the  crop  rhizosphere  easily  (Altamare  et  al.,  1999).  For  example,  KSB  have  been  successfully 
isolated  from  rice crops, corn crops, and coconut trees (Murali et al., 2005). Most of the KSB obtained from the plant rhizosphere 
are  Bacillus  sp.  and  Pseudomonas  sp.,  but  glial Bacillus B. mucilaginosus is the most widely studied species of KSB (Liu, 2001; 
Murali  et  al.,  2005;  Zhou  et  al.,  2006;  Sugumaran  and  Janarthanam,  2007). However, there are relatively few studies on KSB in 
the  tobacco  rhizosphere.  Zhang  et  al.  (2011)  found  a  KSB  isolate  K03  in  the  tobacco  rhizosphere.  Luo  et  al.  (2011)  found  an 
isolate  that  could  solubilize  K  very  efficiently  Bacillus  laterosporus  K77.  In  our  study,  27  isolates  of  KSB  were  found  in  the 
tobacco  rhizosphere.  There  were  7  species  in  these 27 isolates based on 16S rDNA sequence test. Among these isolates, 17 were 
Klebsiella  variicola,  2  were  Enterobacter  cloacae,  2  were  Enterobac-  ter  asburiae,  and  Pantoea  agglomerans,  Agrobacterium 
tumefaciens,  Microbacterium  foliorum,  Burkholderia  cepacia,  and Myroides odor- atimimus each contributed 1. K. variicola and 
E. asburiae were the dominant species here. 
The  solubilizing  zones  of  different  isolates  were  found  to  vary  from  0.65  cm  to  1.50  cm  on  silicate  culture  media.  Further 
exam-  ination  of  the  solubilization  activity  of  the  KSB  showed  that  solubilization  activity  varied  from  0.59  mg  L−1  to  4.4  mg 
L−1  among  different isolates. The same isolate also showed different levels of K solubilization activity. Among the 17 isolates of 
K.  variicola,  GL6,  GL9, and JM3 showed the least solubilization activity (0.60 mg L−1). The solubilization activity of XF11 was 
4.40mgL−1.  This  is  con-  sistent  with  the  findings  of  previous  studies  (Mikhailouskaya  and  Tcherhysh,  2005;  Sugumaran  and 
Janarthanam,  2007).  There  were  smaller  differences  in  the  solubilization  activity of E. cloacae and A. enterobacter. This may be 
because of the small number of isolates of these two species found in this study relative to isolates of K. variicola. 
Previous  studies  have  shown  that  KSB  can  promote  plant growth (Lin et al., 2002; Egamberdiyeva and Hoflich, 2003; Basak 
and  Biswas,  2009).  These  studies  have  indicated  that  inocula  can  enhance  plant  growth  and  increase  plant  K  content.  Studies 
have  shown  that  inoculating  soil  with  KSB  boosts  the  growth of rye and its absorption of N and K (Basak and Biswas, 2010). In 
the  present  study,  we  examined the effects of active KSB isolates, specifically JM3, GL7, XF4, and XF11 (solubilization activity 
>  2.0  mg  L−1)  on  the  growth  of  tobacco  plants.  This  showed  that  all  four  isolates  pro-  moted  the  growth  of  tobacco  plants  to 
different  degrees.  XF11  had  the  most  pronounced  ability  to  promote  growth.  This was for two reasons. First, KSB promotes the 
growth  of  tobacco  plants by secret- ing auxin, and the growth of the plants promotes nutrient uptake. Second, KSB were found to 
dissolve  slow-release  K  compounds  in  the  soil,  which  increased  the  concentration  of  available  K  in  the  soil, further facilitating 
plant  growth.  Correlation  analysis showed that tobacco biomass and K content were positively correlated with soil K ion content. 
Our results confirmed these theories. 
Granite  can  release  K,  which is then absorbed by plants (Coroneos et al., 1996; Hinsinger et al., 1996). It has been shown that 
the  degradation  of  slow-release  K  compounds,  such  as  K-feldspar,  is  related  to  the  organic  acids  secreted  by  plant  roots  (Song 
and  Huang,  1988;  Wang  et  al.,  2000;  Moritsuka  et  al.,  2004).  After  the  addition  of  K-feldspar  powder, tobacco biomass, and K 
content  were  all  found  to  have  increased  in  the  T2  treatment  group  (uninoc- ulated). This indicates that rocks containing K may 
be  suitable  for use as fertilizer. The combination of K-feldspar powder and KSB inoculation also promoted the growth of tobacco 
plants,  tobacco uptake of K, and increases in soil K content. This effect may be due to the fact that KSB solubilize a large amount 
of K from K-feldspar powder, as supported by previous research (Barker et al., 1998). 
In  this  study,  a  total  of  27 KSB strains were found in the tobacco rhizosphere. We studied the diversity of this population and 
the ability each strain to solubilize potassium. The effects of four KSB 
isolates  on  the  growth  and  nutrient  absorption of tobacco and soil K content were examined. Strains XF11 and JM3 significantly 
improved  seedling  height,  dry  weight,  and  absorption  of  N  and  P. This promotive effect was clearer when combined with added 
K-  feldspar.  Using  KSB  may  reduce  the  negative  influence  of  chemical  fertilizers  on  the  environment  and  facilitate  the 
sustainable  devel-  opment  of  agriculture  in  China.  The  XF11  and  JM3  isolates  observed  in our experiment show great potential 
for  use  as  biological  K  fertil-  izer.  However,  our results were obtained in a greenhouse and may differ from field results. Further 
studies of the mechanism by which KSB solubilize K-feldspar and the effectiveness of their use in the field are needed. 
Acknowledgements 
This  research  was  financially  supported  by  Shandong  Corpora- tion of State Tobacco Monopoly Bureau (project no. 200901) 
and Hubei Corporation of State Tobacco Monopoly Bureau (project no. 027Y2012-083). 
References 
Abou-el-Seoud, I.I., Abdel-Megeed, A., 2012. Impact of rock materials and biofer- tilizations on P and K availability for maize 
(Zea maize) under calcareous soil conditions. Saudi J. Biol. Sci. 19, 55–63. Altamare, C., Norvell, W.A., Bjorkman, T., Harman, 
G.E., 1999. Solubilization of phos- phates and micronutrients by the plant growth promoting and bacterial fungus Trichodera 
harzianum Rifai. Appl. Environ. Microbiol. 65, 2926–2933. Barker, W.W., Welch, S.A., Chu, S., Banfield, J.F., 1998. 
Experimental observations of the effects of bacteria on aluminosilicate weathering. Am. Mineral. 83, 1551–1563. Barshad, I., 
1964. Chemistry of soil developing. In: Beat, F.E. (Ed.), Chemistry to Soil. 
, second ed. Reinhold Publishing Co., New York, pp. 1–70. Basak, B.B., Biswas, D.R., 2009. Influence of potassium 
solubilizing microorganism (Bacillus mucilaginosus) and waste mica on potassium uptake dynamics by sudan grass (Sorghum 
vulgare Pers.) grown under two alfisols. Plant Soil 317, 235–255. Bennett, P.C., Choi, W.J., Rogers, J.R., 1998. Microbial 
destruction of feldspars. Miner. 
Mag. 8, 149–150. Basak, B.B., Biswas, D.R., 2010. Co-inoculation of potassium solubilizing and nitrogen fixing bacteria on 
solubilization of waste mica and their effect on growth pro- motion and nutrient acquisition by a forage crop. Biol. Fertil. Soils 
46, 641–648. Coroneos, C., Hinsinger, P., Gilkes, R.J., 1996. Granite powder as a source of potassium for plants: a glasshouse 
bioassay comparing two pasture species. Fertil. Res. 45, 143–152. Deng, S.B., Bai, R.B., Hu, X.M., Luo, Q., 2003. 
Characteristics of a bioflocculant pro- duced byBacillus mucilaginosus and its use in starch wastewater treatment. Appl. 
Microbiol. Biotechnol. 60, 588–593. Egamberdiyeva, D., Hoflich, C., 2003. Influence of growth promoting bacteria on the 
growth of wheat in different soils and temperatures. Soil Biol. Biochem. 35, 973–978. Friedrich, S., Platonova, N.P., Karavaiko, 
G.I., Stichel, E., Glombitza, F., 2004. Chemical 
and microbiological solubilization of silicates. Acta Biotechnol. 11, 187–196. Goldstein, A.H., 1994. Involvement of the quino 
protein glucose dehydrogenase in the solubilization of exogeneous mineral phosphates by gram negative bacteria. In: 
Torriani-Gorini, A., Yagil, E., Silver, S. (Eds.), Phosphate in Micro-organisms: Cellular and Molecular Biology. ASM Press, 
Washington, DC, pp. 197–203. Hinsinger, P., Bolland, M.D.A., Gilkes, R.J., 1996. Silicate rock powder: effect on selected 
chemical properties of a range of soils from Western Australia and on plant growth as assessed in a glasshouse experiment. Fertil. 
Res. 45, 69–79. Hu, B., Han, X., Xiao, Z., Lu, Y., Chen, M., 2005. Distribution of potash feldspar 
resources in China. Chem. Miner. Geol. 27, 25–31 (in Chinese). Hu, X., Chen, J., Guo, J., 2006. Two phosphate- and 
potassium-solubilizing bacteria isolated from Tianmu Mountain, Zhejiang, China. World J. Microbiol. Biotechnol. 22, 983–990. 
Kim, S.B., Yoon, J.H., Kim, H., Lee, S.T., Park, Y., Goodfellow, M., 1995. A phyloge- netic analysis of the genus 
Saccharomonospora conducted with 16S rRNA gene sequences. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 351–356. Kimura, M., 1980. A simple 
method for estimating evolutionary rates base substitut- ions through comparative studies of nucleotide sequences. J. Mol. Evol. 
16, 111–120. Li, Q., Li, Z., Huang, Y., 2007. Status of potassium studies and approaches to improving 
potassium content in tobacco leaves in China. Agric. Sci. Technol. 35, 452–455. Lin, Q., Rao, Z., Sun, Y., Yao, J., Xing, L., 
2002. Identification and practical application 
of silicate-dissolving bacteria. Agric. Sci. China 1, 81–85. Liu, G., 2001. Screening of silicate bacteria with potassium 
releasing and antagonis- 
tical activity. Chin. J. Appl. Environ. Biol. 7 (1), 66–68. Lu, R., 1999. Agricultural Chemistry Analysis of Soil. China 
Agricultural Science and 
Technology Press, Beijing. 
 
C. Zhang, F. Kong / Applied Soil Ecology 82 (2014) 18–25 25 
Luo, H., Chang, R., Wang, S., Xu, J., Zhou, X., Zhang, J., 2011. Screening of highly effective potassium bacteria in rhizosphere 
soil of high-end brand tobacco in Yunnan, Southwest China. J. Agric. Sci. 24, 1816–1817. Ma, C., 2006. Research advance and 
expectation of tobacco nutrition and potassium 
content in tobacco leaf. Crop Res. 2, 190–193. Malinovskaya, I.M., Kosenko, L.V., Votselko, S.K., Podgorskii, V.S., 1990. 
Role of Bacillus mucilaginosus polysaccharide in degradation of silicate minerals. Micro- biology 59, 49–55. Mitchell, W.A., 
1975. Heavy minerals. In: Gieseking, J.E. (Ed.), Soil Components. 
Inorganic Components, vol. 1.2. Springer-Verlag, New York, pp. 449–480. Mikhailouskaya, N., Tcherhysh, A., 2005. 
K-mobilizing bacteria and their effect on 
wheat yield. Latvian J. Agron. 8, 154–157. Moritsuka, N., Yanai, J., Kosaki, T., 2004. Possible processes releasing non- 
exchangeable potassium from the rhizosphere of maize. Plant Soil 258, 261–268. Munson, R.D., Madis on: ASA/CSSA/SSSA 
1985. Potassium in Agriculture., pp. 
754–794. Murali, G., Gupta, A., Nair, R.V., 2005. Variations in hosting beneficial plant associated microorganisms by root 
(wilt) diseased and field tolerant coconut palms of west coast tall variety. Curr. Sci. 89, 1922–1927. Nishanth, D., Biswas, D.R., 
2008. Kinetics of phosphorus and potassium release from rock phosphate and waste mica enriched compost and their effect on 
yield and nutrient uptake by wheat (Triticum aestivum). Biores. Technol. 99, 3342–3353. Qi, S., Duan, S., Liu, F., Mei, Z., 2012. 
Status and development of forecast of potash fertilizer supply production in China in recent years. Phosphate Compd. Fertil. 27, 
1–3 (in Chinese). Rainey, F.A., Ward-Rainey, N., Kroppenstedt, R.M., Stackebrandt, E., 1996. The genus Nocardiopsis 
represents a phylogenetically coherent taxon and a distinct acti- nomycete lineage: proposal of Nocardiopsaceae fam. nov. Int. J. 
Syst. Bacteriol. 46, 28–96. Richards, J.E., Bates, T.E., 1989. Studies on the potassium-supplying capacities of southern Ontario 
soils. III. Measurement of available K. Can. J. Soil Sci. 69 (3), 597–610. 
Saitou, N., Nei, M., 1987. The neighbor-joining method: a new method for recons- 
tructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406–425. Sheng, X., He, L., Huang, W., 2001. The conditions of releasing 
potassium by a silicate 
dissolving bacterial strain NBT. Agric. Sci. China 1 (6), 662–666. Sheng, X., 2005. Growth promotion and increased 
potassium uptake of cotton and rape by a potassium releasing strain of Bacillus edaphicus. Soil Biol. Biochem. 37, 1918–1922. 
Sheng, X., He, L., Huang, W., 2002. The conditions of releasing potassium by a silicate- 
dissolving bacterial strain NBT. Agric. Sci. China 1, 662–666. Shi, Y., Wang, L., Liu, S., Nie, H., 2008. Development of 
chemical fertilizer indus- try and its effect on agriculture of China. Acta Pedol. Sin. 45, 852–863 (in Chinese). Song, S., Huang, 
P., 1988. Dynamics of potassium release from potassium-bearing minerals as influenced by oxalic and citric acids. Soil Sci. Soc. 
Am. J. 52, 383–390. Sparks, D.L., 1987. Potassium dynamics in soils. Adv. Soil Sci. 6, 1–63. Sugumaran, P., Janarthanam, B., 
2007. Solubilization of potassium containing min- erals by bacteria and their effect on plant growth. World J. Agric. Sci. 3 (3), 
350–355. Wang, J., Zhang, F., Cao, Y., Zhang, X., 2000. Effect of plant types on release of mineral 
potassium from gneiss. Nutr. Cycl. Agroecosyst. 56, 37–44. Wang, R., Wang, Y., Chen, H., 2003. Tobacco Chemistry. China 
Agriculture Press, 
Beijing. Zhang, F., Wang, J., Zhang, W., Cui, Z., Ma, W., Chen, X., Jiang, R., 2008. Nutrient use efficiencies of major cereal 
crops in China. Acta Pedol. Sin. 45, 915–922 (in Chinese). Zhang, Z., Wang, B., Xi, S., Liu, T., Cao, Y., Qiu, L., 2011. 
Identification of a silicate bacterium from flue-cured tobacco rhizosphere and application in flue-cured tobacco production. Acta 
Agr. Zhejiangensis 23, 553–558 (in Chinese). Zhou, H., Zeng, X., Liu, F., Qiu, G., Hu, Y., 2006. Screening, identification and 
desilica- 
tion of a silicate bacterium. J. Cent. South Univ. Technol. 13, 337–341. Zhu, Z., 2008. Current status and prospect of tobacco leaf 
production and research 
in China. Acta Tabacaria Sinica 14, 70–72 (in Chinese).