Laboratorio de Bioquímica

Espectros de absorción y cuantificación espectrofotométrica de antioxidantes

(Vitamina C) en una muestra de Psidium guajava (Guayaba)

Camila Buenaventuraa y María Valentina Castiblancob

a
Universidad de la Sabana, Facultad de Ingeniería, Bogotá, Colombia
b
Universidad de la Sabana, Facultad de Ingeniería, Bogotá, Colombia
INFORMACIÓN D E L A RT Í C U L O ABSTRACT
Palabras clave: El ácido ascórbico o vitamina C, es un compuesto que se encuentra de manera
Vitamina C natural en varios frutos, este posee una estructura eno-diol, en los carbonos 2 y 3. Se
Ácido ascórbico ha encontrado que la vitamina C cumple funciones específicas dentro de los
Guayaba sistemas biológicos al ser un antioxidante que juega un papel importante en el
Antioxidantes sistema inmunológico, así como un excelente aditivo en la industria de alimentos, al
Ley de Lambert-Beer fortificar o conservar el contenido vitamínico de algunos productos. Para
Radicales libres determinar la concentración de ácido ascórbico, así como el coeficiente de extinción
Coeficiente de extinción molar molar del mismo fue necesario aplicar como método analítico la espectroscopía UV-
Vis en un extracto vegetal diluido y sin diluir correspondiente a la cáscara de la
Psidium guajava (Guayaba). Al realizar este estudio se halló que las
concentraciones del ácido ascórbico varían dependiendo de las características
varietales a la que fue sometido la muestra vegetal.

humano puesto que vitamina Mediante la

son capaces de hidrosoluble y espectroscopía UV-
1. Introducción
atacar las células esencial, sintetizada visible se puede
La bioquímica sanas del sistema químicamente a determinar de
es una rama de la provocando así una partir de glucosa. manera cuantitativa
ciencia que estudia degeneración de En humanos este la cantidad de
la estructura, estas.[2] tipo de antioxidante antioxidantes
metabolismo, es un (vitamina C) en una
síntesis, función y Los radicales micronutriente muestra de Psidium
degradación de los libres son esencial, necesario guajava (Guayaba)
componentes conocidos en el para todas las y de esta manera
químicos ámbito biológico funciones comprobar su
constituyentes de como los causantes biológicas, importancia como
los seres vivos del envejecimiento incluidas las aditivo funcional.
como son: las esto sucede en el reacciones
moléculas momento en el que enzimáticas y las
2. Materiales y
orgánicas,[1] entre toman el electrón antioxidantes. Se
métodos
ellas se encuentran que les hace falta absorbe en el
los antioxidantes, de las células del intestino delgado 2. 2.1 Reactivos
sustancias capaces colágeno de la piel; por un proceso
como resultado, la activo dependiente 2-nitroanilina
de inhibir la
piel pierde su de sodio, debido a (C6H6N2O2), nitrito de sodio
degradación (NaNO2), etanol absoluto
oxidativa, de tal elasticidad, luce su estructura es
(C2H6O), ácido oxálico
manera que un seca y arrugada. [3] muy sensible a la
(C2H2O4), agua destilada
antioxidante degradación.
(H2O) y extracto de cáscara
principalmente Entre los Diversos factores de guayaba [fuente de
actúa, gracias a que antioxidantes influyen a la vitamina C (ácido ascórbico,
puede reaccionar podemos encontrar degeneración, entre C6H8O6)].
con radicales libres un gran grupo de ellos el pH, la
del oxígeno vitaminas, enzimas, concentración de
(átomos que tienen entre otros. El más oxígenos, etc. [4] 2.2 Instrumentación
un electrón (e-) sobresaliente es el
desapareado en ácido L-ascórbico La vitamina C 2.2.1 Espect rof ot ómet
comúnmente está muy extendida ro UV- Vi si bl e
capacidad de
aparearse, por lo llamado vitamina C entre las frutas y Tiene como objetivo el
que son muy (ácido de azúcar), verduras como: los análisis cuantitativo de
el cual es cítricos, grosellas alguna molécula. Se basa en
reactivos),[2] estos
considerado como negras, pimientos, la interacción de la radiación
se forman
uno de los agentes verduras verdes electromagnética con la
continuamente en materia. A través de esta
el organismo por el antioxidantes del como el brócoli y
organismo; se las coles de interacción las moléculas
metabolismo pueden pasar de un estado
normal, siendo encuentra bruselas, y fruta
inicial a uno energético
eliminados por las principalmente como las fresas, (excitado), absorbiendo una
fuerzas concentrado en mango y kiwi son cantidad de energía radiante
antioxidantes, esta órganos como: el fuentes igual a la diferencia
interacción ocurre ojo, hígado, bazo, especialmente energética existente entre los
ya que los radicales cerebro, glándulas ricas. [5] dos niveles. [6]
libres son dañinos suprarrenales y
para el cuerpo tiroideas. Es una
2.2.2 Agi t ador vórt ex
Tiene como principal
función mezclar pequeños
viales de líquidos. Cuando
se presiona un tubo de
ensayo u otro recipiente
apropiado dentro de la copa
de goma, el movimiento se
transmite al interior del
líquido y se crea un vórtice.
[7]
2.2.3 Bal anza
anal í ti ca
Una balanza analítica es
un instrumento de pesada.
La carga de la mayoría de
las balanzas analíticas se
encuentra entre 160 a 200g,
y las medidas se pueden
realizar con una desviación
estándar de ±0.1mg. Las
balanzas electrónicas se
controlan accionando un
panel con varios botones de
control. Una posición apaga
o enciende el instrumento,
otro automáticamente
calibra el instrumento frente
a un peso patrón y una
tercera ajusta el cero en la
pantalla con o sin objeto en
el platillo. [8]
2.3. Ecuaciones
2.3.1. Ecuación ley de
Lambert-Beer
Expresa la relación entre
absorbancia de luz
monocromática (de longitud
de onda fija) y 2.4.1
concentración de un
cromóforo en solución: [9]
2.3.2. Ecuación densidad
La densidad es una
magnitud referida a la
cantidad de masa contenida
en un determinado volumen,
y puede utilizarse en
términos absolutos o
relativos. [10]
2.3.3. Ecuación de factor de
dilución
Esta fórmula se utiliza en
el momento de realizar
diluciones o titulaciones, ya
que nos muestra de una
manera sencilla una forma
de encontrar la
concentración y/o el
volumen inicial que debería
agregar de un liquido para
obtener una concentración
y/o volumen deseado.
2.4 Metodología
Antes de empezar con los
procedimientos
posteriormente descritos se
cortó finamente la cáscara
de guayaba (materia vegetal)
y se pesó 1,0599g de esta,
luego se maceró en 10mL de
ácido oxálico (C2H2O4), para
así sacar el extracto de la
cascara, seguidamente se
purificó el zumo usando el
método de filtración, el cual
consiste en la remoción de
partículas suspendidas y
coloidales presentes en una
suspensión acuosa que
escurre a través de un medio
poroso.[11] Por último, la
mezcla se transfirió a un
matraz cubierto totalmente
con papel aluminio. A partir
del zumo filtrado se calculó
la densidad de este.
Preparaci ón de
l a curva pat rón
Se realizaron dos
soluciones problema cada
una en un tubo Eppendorf,
los cuales se encontraban
recubiertos con papel
aluminio. Las
especificaciones de cada
solución se describen
seguidamente.
a) Solución sin diluir:
Agregar 1mL del
zumo filtrado con
9mL de ácido oxálico
(C2H2O4), mezclar
manualmente.
b) Solución diluida:
Añadir 100µL del
extracto filtrado con
9,9mL de ácido
oxálico (C2H2O4),
mezclar
manualmente.
2.4.2 Preparación de la
curva de
calibración
Se tomaron los tubos de
ensayo, se cubrieron con
papel aluminio y se
enumeraron del 1 al 6. En
ellos se depositaron las
siguientes cantidades:
Tabla 1: Volúmenes de
reactivos (2-nitroanilina Masa
y del extracto filtrado (g)
nitrito de sodio) para Volumen del extracto filtrado
preparar curva de
calibración.
Densidad (g/mL)
Reactivo 1 2
2-nitroanilina (mL) 0,1 0,1
Nitrito de sodio
0,2 0,2
(mL)
Manualmente se agitaron
los tubos de ensayo para
mezclar bien los reactivos y
se dejó en reposo 10
minutos. Una vez había
trascurrido el tiempo se
añadió:
Tabla 2: Volúmenes de
reactivos (etanol absoluto y
filtrado) para preparar
curva de calibración.
Reactivo 1 2
Etanol absoluto
3,8
(mL)
Filtrado (mL) 1,0
Se mezcló manualmente
y se dejó en reposo 20
minutos antes de agregar los
últimos reactivos.
Tabla 3: Volúmenes de
reactivos (NaOH y Agua
destilada) para preparar
curva de calibración
Reactivo 1 2 (coeficiente de extinción
NaOH 10% (mL) 1,2
Agua destilada (mL) 3,7
Con ayuda del vórtex se
mezclaron los reactivos y se
midió el pH con el papel
indicador de pH, el cual,
dependiendo del valor,
indica si la reacción se dio
apropiadamente o no.
Finalmente, con un
espectrofotómetro a 540nm
se midió la absorbancia de la
mezcla.
3. Resultados
3.1. Densidad
Tabla 4: Masa y
volumen del
extracto filtrado
(zumo de cascara
de guayaba)
1,1268
1
(mL)
1,1268
Haciendo uso de la
ecuación de densidad y el
valor de la masa (en gramos)
y el volumen (en mL) del
extracto de la cáscara de
guayaba filtrado se halló el
valor de la densidad, la cual
corresponde a 1,1268 g/mL
Al tomar el pH de la
muestra con ayuda del papel
indicador de pH, de acuerdo
con el color, el valor oscila
entre 11-12, lo cual
corresponde a un pH básico.
3,8 3.2. Curva de calibración
1,0 Para lograr calcular la
concentración de ácido
ascórbico (vitamina C) y el
coeficiente de extinción
molar ( ) fue necesario la
elaboración de una curva de
calibración la cual nos
relaciona la concentración
de ácido ascórbico con una
propiedad de este, en este
caso, la absorbancia. De esta
manera se puede encontrar
una segunda propiedad
1,2 molar) reflejada en la
3,7 pendiente de dicha curva.
Sin embargo, en este caso
la concentración de cada
muestra se calcula de una
manera diferente, para ello
se utiliza la ecuación de
factor de dilución,
conociendo que el valor de
C1 es de 500mg/L, el cual
corresponde a la mínima
concentración de vitamina
C, V1 referente al valor de
ácido ascórbico agregado en
cada muestra y por último
V2 perteneciente al dato del
volumen final de cada
muestra, siendo este dato
igual para todas las muestras
y teniendo un valor de
10mL.
Tabla 5. Concentraciones
y absorbancia (540nm)
curva patrón
Ác. Ascórbico
Concentración
Muestra
(mL)
1 0,1
2 0,2
3 0,4
4 0,6
5 0,8
6 1,0
Utilizando los datos de
esta tabla se elaboró la
gráfica de concentración vs
absorbancia, pero se
descartó el dato de la
muestra 2 y 4 debido a que,
al realizar un análisis de
barras de error, fue posible
identificar la variabilidad de
la medida empleada como
función de resumen en el
gráfico (ya sea la media,
desviación estándar, etc.).
En este análisis se utilizó
una confiabilidad del 95%.
Figura 1. Curva de la vitamina C, se
Calibración ácido ascórbico 3.3. Los resultados convirtieron las unidades de
(Vitamina C) la concentración del ácido
Fue necesario realizar una
conversión de unidades para ascórbico, pero como este se
encontraba en mg/100g
poder realizar un análisis de
En la figura 1 se halló la zumo, en un inicio se
los datos obtenidos de la
fórmula de la recta la cual es convirtió a g/100g zumo y
practica con los reportados en
la literatura. este dato se multiplico con
el peso inicial del zumo
En primera instancia (1,1268g) para así lograr
Teniendo esta un valor de convertir mg/mL a mg/100mL
eliminar los g de zumo,
coeficiente de determinación de zumo, para hallar este
luego este dato se realizo un
(R2) de 0,9741 que refleja valor se realizó una regla de
factor de conversión de μg a
una tendencia lineal clara y tres, sabiendo que en 1mL de
zumo se encuentran la
UI (International Unit) ,
conociendo que la forma
cantidad de mg reportados en sabiendo que 1UI son 50μg
estándar de este tipo de
la tabla 5. De esta manera se de vitamina C. (Fao, s.f.).
ecuación es
y = mx + b, donde “m” es la hace la multiplicación de los
mg con los 100mL de zumo, y Esta es una unidad de
pendiente, fue posible
con este resultado se hace la medida de la cantidad de
despejar el este valor.
razón con 1mL; calculándose una sustancia, basada en su
Realizando el despeje, se
así el valor de concentración actividad biológica mediada
halló el valor de “m”, que
en las unidades deseadas (o sus efectos). Es usada
corresponde
a
(mg/100mL zumo). para vitaminas, hormonas,
0,0099L/mgcm, el cual a su
algunas drogas, vacunas,
vez representa al coeficiente Se realizó una segunda
conversión de mg/100mL
productos sanguíneos y
de extinción molar de la
zumo a mg/100mg de zumo. sustancias biológicamente
vitamina C.
Fue posible hallar este valor activas similares. (Pérez, R.,
convirtiendo los 100mL a g 2002)
Por otra parte, para
encontrar la concentraciones utilizando la densidad
Tabla 7. Cantidades de
de las muestras tanto sin (1,1268g/mL) encontrada con
ayuda de los datos de la tabla ácido ascórbico en
diluir como diluidas se diferentes unidades
despejo “x” de la ecuación 4, de esta manera se realizó
una regla de tres, conociendo
de la recta, en la cual se Vitamina C Vitamina
en 1g de zumo encuentran los Muestra
reemplaza “y” con el valor (mg) (μg)
mg reportados en la tabla 5.
de la absorbancia en cada Diluida A -10,01 -10010,
muestra, además fue Tabla 6. Concentraciones de
Diluida B -9,7 -9707,0
necesario hacer una ácido ascórbico en
mg/100mL de zumo y Diluida C -9,4 -9404,0
conversión de unidades en la
mg/100g de zumo Sin diluir A 67,56 67565,6
concentración, ya que esta
resultaba en (mg/L) y para Sin diluir B 60,29 60292,9
Concentración ConcentraciónSin diluir C
realizar el análisis
(mg/100mL Promedio (mg/100g 61,4 61404,0
correspondiente se zumo) zumo)
necesitaba (mg/mL), dando
como resultado los datos -1,001 4. Discusión
-0,888
contenidos en la tabla 5.
4.1. Cuantificación de ácido
-0,97 -0,97 -0,861 ascórbico
Tabla 5. La Psidium guajava
-0,940 -0,834 (Guayaba) es una fruta en la
Concentraciones y
absorbancia de cada cual el contenido de ácido
muestra 6,756 5,996 ascórbico varía, aumentando
6,02 y/o disminuyendo después
Concentración Promedio Absorbancia 6,308 5,35 de ser cosechado, en base a
(mg/mL) sus características varietales,
-0,01 -0,0097 0,0936,14 5,449 como lo son, la edad de la
planta, condiciones
-0,0097 0,096
climáticas y de cultivo a las
-0,0094 0,099 3.4. Valor en unidades que haya sido expuesta.
internacionales de la [12]
0,067 0,063 0,861
vitamina C En varias investigaciones
0,0602 0,789 se ha encontrado que la
Para realizar la
0,061 0,8 comparación nutricional cáscara de la guayaba tiene
mayor concentración de
 ácido ascórbico y fenoles negativo correspondiente a valor de la pendiente, que de esta sustancia en la fruta,
que la propia pulpa, aunque la concentración de las acuerdo con la ley de como lo son las condiciones a
estos no posean una muestras diluidas es Lambert Beer corresponde las que fue sometida la fruta
tendencia clara respecto al consecuencia de que esta se al coeficiente de extinción en su etapa pre y pos-cosecha.
estado de maduración, se ha encuentra por debajo de la molar, se obtuvo el valor de Referencias
encontrado que la mínima concentración (500 0,0099L/mgcm, la cual en
concentración de ácido mg/L vitamina C). términos de molaridad seria [1] Nature (s.f.).
ascórbico disminuye a 1743,58/Mcm a una longitud Biochemistry.
En la literatura se reporta
medida que avanza la Recuperado el
que la concentración de de onda de 540nm. Este
maduración. [12]
ácido ascórbico presente en valor en la literatura fue de 4 de agosto de
Para el tipo de guayaba las guayabas colombianas se 1,627×10-4 /Mcm a una 2018, del sitio
común se reportan 4 valores encuentra en un rango de longitud de onda de 550nm web
de concentración de ácido 62,6-342,1 mg/100g zumo La diferencia en el nature.com: htt
ascórbico en la cáscara, los (Rojas y Narváez, 2009), sin coeficiente se debe a que no ps://www.natur
cuales estás reportados en la embargo, al comparar este se trabaja la misma longitud
tabla 7. dato con los obtenidos en la e.com/subjects/
de onda en el
práctica (5,598 y -0,861 espectrofotómetro, y el valor biochemistry
Tabla 8. Concentración [2] Londoño, J.
mg/100g zumo), se de � depende de dicha
ácido ascórbico en la (s.f.)
evidencia que estos valores longitud, sin embargo, se
guayaba se encuentran desviados de esperara que la diferencia no Antioxidantes:
Ácido los datos hallados en sea significativa cuando los importancia
Variedad ascórbico investigaciones anteriores.
Fuente valores de longitud de onda biológica y
(mg/100g) Esto puede ser resultado de son cercanos. métodos para
que estos datos no poseen
Restrepo- Un factor que en este medir su
una tendencia clara, ya que
55-397 Sánchezlaet al.
concentración de ácido caso puede ser determinante actividad.
(2009)
ascórbico en la guayaba se en la desviación del valor Recuperado
incrementa desde su estado del coeficiente de extinción de:
Campbell molar es el desarrollo del
verde hasta la madurez
(1984); Menzel http://repositor
Hasta 2000 óptima, complejo coloreado, pues en
(1985); Martin et en la cual este tiene base a lo que se halla en la
y.lasallista.edu.
Común el
al. (1987 más alto contenido de co/dspace/bitst
ácido ascórbico, una vez literatura, el coeficiente es
reportado en base al color ream/10567/13
200-400 Kader llega
(1999) a una sobre
formado. 3/3/9.%20129-
maduración esta
Vázquez- 162.pdf
concentración decrece, dicha 4.4. Tablas nutricionales
Ochoa [3] Agüero, L.
82-163 disminución puede estar
explicada porque el ácido
y Colinas-León (2013). Los
En base a las tablas
ascórbico es un compuesto
(1990) radicales libres
nutricionales reportadas por
antioxidante que está el INVIMA (Instituto y su efecto en
Regional presente en gran cantidad de Nacional de Vigilancia de el cuerpo.
Blanca, frutas, las cuales, al
62,6-342,1 Rojas y Medicamentos y Alimentos) [online].
egional Roja, madurar, incrementan la
ra y Manzana Narváez (2009) Extraido el 10
cantidad de azucares, y por
de agosto de
Colombiano) consiguiente aumenta la 5. Conclusion
cantidad de radicales libres. 2018, de:
En base a las Otro factor que explica este En la cuantificación de https://www.hu
concentraciones reportadas decrecimiento es la facilidad ácido ascórbico se evidenció ffingtonpost.co
en la tabla 5 y a los cálculos de degradación del ácido a la existencia de una relación m/leticia-
realizados para obtener estos altas temperaturas. [12] inversamente proporcional
aguero/radicale
valores en las unidades entre la dilución y la
Asimismo, la variación concentración, es decir aquel s-
reportadas en la literatura
(mg/100g zumo) para las en la concentración también extracto que estaba diluido libres_b_2129
muestras sin diluir 5,598 depende de le variedad de se le encontró una menor 509.html
mg/100g zumo y en las guayaba que se trabaje y las concentración de ácido [4] Serra, H. y
diluidas con - 0,861 condiciones a las que esta ascórbico con respecto al Cafaro, T.
mg/100g zumo, existe una fue expuesta en la etapa de que no se diluyó. (2007). Ácido
clara evidencia que en el pre y pos-cosecha. ascórbico:
Asimismo, en base a la
extracto vegetal que se 4.3. Coeficiente de práctica y a lo reportado en desde la
encontraba sin diluir hay una la literatura se puede química hasta
mayor concentración de concluir que no existe un
extinción molar ( ) del su crucial
ácido ascórbico que en la rango fijo de concentración
diluida, esto se debe a que función
de vitamina C en la Psidium protectiva en
en esta última la cantidad de ácido ascórbico guajava (Guayaba), debido a
soluto disminuye con Al realizar la curva de ojo. Acta
varios factores que
respecto a la cantidad del calibración y determinar el comprometen la presencia de Bioquímica
solvente, además el valor Clínica
 Latinoamerica la práctica en [12] Parra, A.
na, 41(4), 526- el laboratorio (2014).
527 de química Maduración y
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