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Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú, Casilla Postal 11-
058, Lima 11, Perú.
Resumen
En esta práctica de laboratorio se realizó dos herramientas básicas y fundamentales para el análisis
biomolecular: PCR y electroforesis en gel de agarosa. Se trabajó con las muestras de DNA extraídas
y caracterizadas en las prácticas anteriores de Pisum sativum y Argopecten purpuratus, para
amplificar una secuencia específica se utilizó un marcador mitocondrial 16S (Sbr-H forward y Sba-
L reverse), fue necesario analizar las temperaturas óptimas para la eficiencia de la PCR; así mismo
la docente encargada amplificó las muestras de las tres mesas de laboratorio con marcadores para
eucariotas 16S, procariotas 16S, los cuales fueron sometidos a análisis electroforetico, se usó como
marcador principal el MassRuler Low Range DNA Ladder.
Palabras claves: Electroforesis, PCR, Gel, agarosa, 16s, ADN
Abstract
In this laboratory experience, two basic and fundamental techniques for biomolecular analysis are
performed: PCR and agarose gel electrophoresis. These methods were carried out with the DNA
samples extracted and characterized in previous laboratory experiences of Pisum sativum and
Argopecten purpuratus. To amplify a specific sequence a 16S mitochondrial marker (Sbr-H forward
and Sba-L reverse) was used. It was also necessary to analyze the optimum temperatures for the PCR
efficiency. Our teacher amplified the samples of the three laboratory groups with markers for
eukaryotes 16S, prokaryotes 16S, which were subjected to electrophoretic analysis, the MassRuler
Low Range DNA Ladder was used as the main marker for accurate quantification and sizing of DNA
fragments on the agarose gel.
Keywords: Electrophoresis; PCR; Gel; Agarose; DNA
Presentado: 7 de octubre del 2018 se moverán a través de una matriz de agarosa
en un campo eléctrico hacia el polo positivo.
Introducción
Los ácidos nucleicos más cortos podrán
La electroforesis en gel de agarosa separa los migrar a través de la matriz más rápido que los
fragmentos de ADN según su tamaño. La más grandes durante un período de tiempo
separación de los ácidos nucleicos en función determinado. Dependiendo del porcentaje de
de su tamaño es necesaria para muchas agarosa utilizada para hacer el gel, el rango de
prácticas comunes de laboratorio. La separación lineal variará.
separación de los ácidos nucleicos mediante Esta técnica tiene muchas aplicaciones. En
electroforesis en gel de agarosa funciona general, puede analizar los fragmentos de
mediante el aprovechamiento de la carga ADN que resultan de una digestión
negativa del esqueleto de fosfato de los ácidos enzimática de una pieza más grande de ADN
nucleicos. Las moléculas de ADN y ARN para visualizar los fragmentos y determinar el
tienen una carga neta negativa distribuida tamaño de los fragmentos. Además de su
uniformemente en toda su longitud, por lo que utilidad en las técnicas de investigación, la
electroforesis en gel de agarosa es una técnica que el proceso hubiera sido demasiado
forense común y se utiliza en la toma de engorroso.
huellas dactilares de ADN. Antes de Taq, se utilizó el ADN polimerasa de
La técnica de reacción en cadena de la E. coli, una enzima que no podía soportar un
polimerasa (PCR), inventada en 1985 por calentamiento y enfriamiento rápidos, en la
Kary B. Mullis, permitió a los científicos segunda etapa de la PCR. Usando E. Coli, la
hacer millones de copias de una muestra muy polimerasa se reemplazó manualmente en
pequeña de ADN. Este ha sido un gran avance cada paso de la reacción a medida que se
en el mundo científico y, con el tiempo, la degradaba por el calor.
técnica ha evolucionado más allá de los En 1987, Perkin Elmer, otra compañía de
límites de su diseño inicial simple y ha abierto biotecnología con sede en Estados Unidos,
vías increíbles para los investigadores. Se han lanzó un termociclador, un instrumento que
hecho muchas mejoras a la técnica básica y se está programado para regular la temperatura
han desarrollado muchas adaptaciones, de una reacción, calentando o enfriando las
incluyendo PCR de transcripción inversa (RT- muestras según sea necesario. Una vez más,
PCR), PCR cuantitativa en tiempo real este avance minimiza la interacción humana
(qPCR), qPCR de transcripción inversa (RT- en la reacción, lo que lleva a un proceso
qPCR) y PCR digital (dPCR). elegante, eficiente y optimizado.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Gracias a su extraordinaria versatilidad, hoy
utiliza la síntesis enzimática in vitro para en día, la PCR se está utilizando en diversos
amplificar secuencias de ADN específicas. La campos, como la ciencia forense, los estudios
amplificación por PCR puede producir ambientales, la tecnología de alimentos y la
aproximadamente 100 mil millones de copias medicina de diagnóstico. El avance masivo a
de una molécula de ADN en unas pocas horas. lo largo de los años en nuestra comprensión
Este método ha revolucionado la del genoma de los humanos y varias otras
investigación en ciencias biológicas y especies no hubiera sido posible sin la técnica
medicina, y ha influido en la criminología y el notable y simple llamada PCR.
derecho. Varios descubrimientos científicos árboles. También se utilizó para la captura
importantes, incluida la purificación del ADN de insectos de vuelo rápido, como
polimerasa y la elucidación del mecanismo de mariposas, avispas y libélulas. Se movió
replicación del ADN, fueron esenciales para con la mayor velocidad posible la red
el desarrollo de la tecnología de PCR actual.
hacia el insecto e inmediatamente se giró
En 1993, Kary Mullis recibió el Premio Nobel
la red para evitar que salga.
por el descubrimiento de la PCR.
Dos avances significativos han permitido que
la PCR se convierta en la tecnología que es
hoy en día: la polimerasa Taq y el
termociclador.
MATERIALES Y METODOS
En 1986, los científicos de Cetus aislaron la AMPLIFICACION DEL DNA MEDIANTE
polimerasa Taq de Thermus aquaticus, una PCR
bacteria que se encuentra en aguas termales.
Las muestras de ADN animal y vegetal
Debido a que Taq podía soportar altas utilizadas en esta práctica fueron las obtenidas
temperaturas, eliminó la necesidad de a partir de las muestras de Argopecten
intervención humana durante la reacción,
purpuratus y Pisum sativum provenientes de
simplificando y acortando el proceso. Sin una
la práctica de ‘‘Extracción de ADN’’
enzima resistente al calor como la polimerasa realizada a comienzos del curso, y los datos de
Taq, la PCR no podría usarse a gran escala, ya
su caracterización los provenientes de la un marcador de tamaño molecular
segunda practica del mismo. (MassRuler™ Low Range DNA Ladder,
Para la preparación del master mix con el cual ready-to-use, 60.8 ng/µL).
se procederá a amplificar estas dos muestras, En la corrida electroforética, se conectaron los
fue necesario calcular los volúmenes de cables de la fuente de poder (Standard Power
reacción y del kit de PCR a utilizar. Los Pack Biometra P25 con función de
componentes de esta mezcla fueron cronometro) a la cámara electroforética y se
adquiridos del laboratorio de Thermo Fisher realizó la corrida a 95V por 30 minutos. Se
Scientific. Estos volúmenes fueron entonces apagó la fuente poder, se retiró el gel y se
medidos con exactitud gracias a las tres colocó el mismo en un transiluminador para la
micropipetas provistas por el laboratorio observación de las bandas. El resultado fue
(Nichipet EXII 0.5-10 µl 00-NPX2-10, fotografiado y agregado a este artículo.
Micropipeta Axygen 20- 200 µl AP-200 y
Nichipet EXII 10-100 µl 00-NPX2-100). Esta
mezcla se agregó entonces al DNA molde en
otro tubo, y fueron llevados al termociclador.
La amplificación del DNA se realizó en el
termociclador Eppendorf®, Mastercycle
Personal, 5332 000.014 (European) en el cual
se dio 35 ciclos. Con temperaturas y tiempos
de 94ºC y 35s para la denaturacion, 50ºC y 40s
para el annealing, 72ºC y 75s para la
extensión.
Concentración
MUESTRA A260/280 A260/230
ng/µL
ADN Animal 204.9 2.0 1.1
ADN Vegetal 187.3 1.7 0.7
Tabla 2. Resultados de las muestras de ADN, extraídas de Argopectum purpuratus (muestra
animal) y Pisum sativum (muestra vegetal). Estas muestras fueron caracterizadas mediante el
uso de un nanodrop provisto por la profesora responsable de la práctica. Los valores de
concentración obtenidos aquí son similares a los conseguidos por el grupo, lo que les da validez.
Los valores obtenidos en la proporción A260/280 para el grado de pureza, en cambio, arrojan
la existencia de más proteínas contaminantes en las muestras, al ser estas mucho menores que
lo calculado por el grupo.
Parámetros a considerar para establecer el tiempo y temperatura del ciclo de PCR a utilizar
Pasos Parámetros
Según la longitud de la muestra de DNA que contiene a la
Denaturación inicial
secuencia que se amplificará.
Según la longitud del segmento a amplificar y la proporción de
Denaturación
G+C que contenga la cadena.
Según la secuencia y longitud de los primers a utilizar
Annealing
(Temperatura de melting)
Según las necesidades de la DNA polimerasa a utilizar y de la
Extensión
longitud del fragmento de DNA a amplificar.
Tabla 3. Características a considerar para cada uno de los ciclos de PCR que se van a
realizar.
Preparación del master mix (MM)
DNA Molde (Template):
DNA Animal DNA Vegetal
𝑛𝑔 𝑛𝑔
𝐶𝐼 = 204,9 𝐶𝐼 = 163,0
µ𝐿 µ𝐿
𝑛𝑔 𝑛𝑔
𝐶𝐹 = 50 𝐶𝐹 = 50
µ𝐿 µ𝐿
𝑉𝐼 = ? 𝑉𝐼 = ?
𝑉𝐹 = 50 µ𝐿 𝑉𝐹 = 50 µ𝐿
𝑛𝑔 𝑛𝑔 𝑛𝑔 𝑛𝑔
204,9 × 𝑉𝐼 = 50 × 50 µ𝐿 163,0 × 𝑉𝐼 = 50 × 50 µ𝐿
µ𝐿 µ𝐿 µ𝐿 µ𝐿
𝑉𝐼 = 12,20µ𝐿 𝑉𝐼 = 13,35µ𝐿 ≅ 13,4µ𝐿
𝑉𝐻20 = 37,8µ𝐿 𝑉𝐻20 = 36,6µ𝐿
Volumen para 1 Volumen para 5
Rx CCi CCf
rx rx
Buffer PCR 10x 1x 1.5 µL 7.5 µL
dNTPs 10 mM 200 µM 0.3 µL 1.5 µL
Primer F: 16Sar 10 µM 0.1 µM 0.15 µL 0.75 µL
Primer R: 16Sbr 10 µM 0.1 µM 0.15 µL 0.75 µL
MgCl2
Taq Pol 1U 0.15 µL 0.75 µL
DNA template 50 ng/µL 1 µL 5 μL
H2O 11.75 µL 58.75 µL
Volúmen de reacción 15 µL 70 µL
Tabla 4. Cantidades y concentraciones para preparar el Master Mix, asumiendo que como producto
final se requiere un volumen de 15 µL. Al necesitar solución para 4 reacciones, se consideró un
volumen para 5, debido a lo siguiente: 1 control negativo, 1 control positivo, 2 muestras de DNA por
analizar y 1 reacción adicional debido al error que se puede producir al pipetear.
Amplificación de ADN
En la parte anterior, se muestran los pasos a seguir para trabajar con la página web
calculadora de temperatura de melting. En la inferior, los resultados que se utilizaran para
el PCR.
Pasos Temperatura Tiempo # ciclos
Denaturación inicial Tº de preservación hasta 94ºC 1 ciclo
Denaturación 94ºC 35s
Annealing 50ºC (44.6ºC con Tmcalculator) 40s 35 ciclos
Extensión 72ºC 75s
Extensión Final 72ºC hasta Tº de preservación 1 ciclo
Tabla 5. Temperaturas y tiempos de cada uno de los pasos que conforman el PCR.
Posillo 1 2 3 4 5 6
Secuencia ADN target PCR 16 S eucariota PCR 16 S procariota
Muestra Animal Vegetal Vegetal Animal Animal Vegetal
Tabla 6. Orden de las muestras depositadas en los pocillos del gel de agarosa al 3%
I. PCR
Parámetros
Pasos Nro de ciclos
Temperatura (°C) Tiempo (seg.)
Denaturación inicial 95 180 1
Denaturación 94 35
Annealing 50-52 30-60 35
Extensión 72 60
Extensión final 72 300-600 1
146F1 ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG
146R1 TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA
146F2 GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA
146R2 TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT
ANALÍSIS BIOINFORMÁTICO
Secuencia de referencia: U50923
Descripción dada por nBLAST de NCBI: Penaeus monodon (Jumbo shrimp)
nonoccluded baculovirus III SalI fragment genomic sequence / fragmento de la
secuencia genómica SalI de baculovirus III no ocluido presente en Panaeus monodon
(camarón jumbo).
Se deben analizar los primers proporcionados debido a que este es un virus posee
varias cepas con la misma secuencia y se quiere descubrir cuál es la correcta.
- Primer 146F1: ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG
- Primer 146R1: TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA
Imagen 2. Coincidencias del primer 146F1.
Se puede observar que el primer 146F1 tiene coincidencia con todas las cepas
encontradas en la base de datos con 100% de identidad. El mismo resultado se
obtiene cuando se utiliza nBLAST en la secuencia 146R1.
- Primer 146F2: GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA
- Primer 146R2: TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT
En el caso del segundo juego de primers ocurre la misma situación en la que estos
tienen una coincidencia con todas las cepas encontradas en la base de datos con
una identidad del 100%.
REACCIÓN DE PCR
i.Primer paso de PCR:
Utilizando 1µL de ADN problema se preparar el Master Mix (MM) con 0.15µL del
primer juego de primers: 146F1 ACTACTAACTTCAGCCTATCTAG y 146R1
TAATGCGGGTGTAATGTTCTTACGA en concentración de 0.1µM; 1.5µL de
buffer; 0.3µL de dNTP en concentración de 200µM; 0.15µL de TaqPol; y 11.75µL de
agua destilada.
El ciclo de PCR constara de una denaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de
un annealing a 46°C2 por un minuto y una extensión a 72°C por 2 minutos. Seguiran
39 ciclos de denaturaciones a 94°C por 1 minuto, annealing a 46°C 21 por un minuto y
una extensión a 72°C por 2 minutos; y una extensión final de 5 minutos.
Luego se extraerán los productos obtenidos de la primera reacción de PCR y con este
se realizará la segunda reacción de PCR.
ii.Segundo paso de PCR:
Utilizando 1µL de producto de la primera reacción de PCR se preparar el Master Mix
(MM) con 0.15µL del primer juego de primers: 146F2
GTAACTGCCCCTTCCATCTCCA y 146R2 TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT
en concentración de 0.1µM; 1.5µL de buffer; 0.3µL de dNTP en concentración de
200µM; 0.15µL de TaqPol; y 11.75µL de agua destilada.
El ciclo de PCR constara de una denaturación inicial de 4 minutos a 94°C, seguido de
un annealing a 55°C2 por un minuto y una extensión a 72°C por 2 minutos. Seguiran
39 ciclos de denaturaciones a 94°C por 1 minuto, annealing a 46°C 21 por un minuto y
una extensión a 72°C por 2 minutos; y una extensión final de 5 minutos.
LECTURA EN GEL DE AGAROSA
Se realizará una electroforesis en gel de agarosa al 1% utilizando GelRed® y
LowRange Mass Ruler Ladder con buffer TBE 0.5X. Se espera obtener
amplificaciones de 1447 bp y de 941 bp en los resultados finales. Se debe incluir tanto
un control positivo como un control negativo en la corrida de tal manera que se
descarte la posibilidad de errores.
II ELECTROFORESIS
1. Explicar la función de los diferentes compuestos utilizados en la electroforesis de
DNA. Aplicaciones de los geles de agarosa para la caracterización de muestras.
- Buffer TBE23: tiene doble función gracias a sus componentes
o Tris y borato: la primera es una molécula que sirve de buffer básico y el
borato ayuda a mantener el ajuste del pH para el correcto corrimiento del
ADN.
o EDTA: quelante que atrapa los iones Mg2+ evitando la acción de las
posibles nucleasas presentes.
- GelRed4: es un colorante que se intercala entre las bases nitrogenadas de los
ácidos nucleicos y su fluoróforo da un color naranja al ser expuesto a la luz UV
permitiendo la lectura de la electroforesis en el transiluminador.
- Agarosa5: este polisacárido forma la matriz gracias a la cual se puede separar los
fragmentos de ADN según su tamaño ya que los poros de la matriz que forma al
solidificarse retrasan el movimiento de los fragmentos más extensos.
- MassRuler Low Range DNA Ladder24:
o Debido a los fragmentos de ADN puros de tamaños determinado sirve de
referencia para aproximar el tamaño de la muestra de ADN.
o Viene acompañado con un Loading dye21 que además de aumentar la
densidad de la muestra para que pueda caer hasta los pocillos donde
empezará a correr ayuda a tiñendo la muestra de tal manera que se pueda
reconocer en que momento debe detenerse la corrida.
El gel de agarosa ayuda a caracterizar la muestra debido a que separa los
fragmentos de ADN de diferentes tamaños al no permitir que todos pasen a la
misma velocidad por los poros de su matriz.
2. Si necesito correr ARN en un gel de agarosa, ¿qué consideraciones o variaciones
cree usted que debo tener en cuenta?
Se debe considerar que los ARN pueden plegarse formando estructuras que
dificulten su corrimiento haciendo que no se separen según su tamaño, sino que
también dependa de las conformaciones que adquieran. Para evitar esto se colocan
compuestos que puedan romper los puentes de hidrogeno, como los es formamida 25,
propiciando que la separación solo dependa del tamaño de la molécula.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
(1) Lodish, Berk, Kaiser, Krieger, Bretscher, Ploegh, Amon, Scott. Biología Celular y
Molecular. 7a edición. México D.F.: Editorial Médica Panamericana, 2016. p. 245, 246.
(2) Programa control de calidad de muestras | Articles | Universidad de Salamanca
[Internet]. Bancoadn.com [citado el 30 de septiembre del 2018]. Disponible en:
http://www.bancoadn.org/docs/programa-control-calidad-muestras.pdf
(3) Salazar, Sandoval, Armendariz. Biología Molecular Fundamentos y aplicaciones en la
ciencia de la salud. 1ra edición. México D.F.: Editorial Mc Graw Education, 2013.p
145-157.
(4) TermoFisher Scientific [Internet] [citado el 02 de octubre del 2018]. Disponible en:
https://www.thermofisher.com/us/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-
biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-
library/thermo-scientific-web-tools/tm-calculator.html
(5) Bio Ted. PCR gen 16S ARNr bacteriano. [Internet]. [Consultado el 6 de octubre del
2018]. Disponible en: [Internet]. [Consultado el 6 de octubre del 2018]. Disponible en:
http://bioted.es/protocolos/PCR-GEN-16S-ARNr-BACTERIANO.pdf.
(6) The Microbiome. 16S Primers. [Internet]. [Consultado el 6 de octubre del 2018].
Disponible en: [Internet]. [Consultado el 6 de octubre del 2018]. Disponible en:
http://themicrobiome.com/en/16s/16s-primers#.W7l0PWgzbIV.
(7) Thermo Fisher Scientific. Tm Calculator. [Internet]. [Consultado el 6 de octubre del
2018]. Disponible en: https://www.thermofisher.com/pe/en/home/brands/thermo-
scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-
resource-library/thermo-scientific-web-tools/tm-calculator.html.
(8) Bio Ted. PCR gen 16S ARNr bacteriano. [Internet]. [Consultado el 6 de octubre del
2018]. Disponible en: [Internet]. [Consultado el 6 de octubre del 2018]. Disponible en:
http://bioted.es/protocolos/PCR-GEN-16S-ARNr-BACTERIANO.pdf.
(9) The Microbiome. 16S Primers. [Internet]. [Consultado el 6 de octubre del 2018].
Disponible en: [Internet]. [Consultado el 6 de octubre del 2018]. Disponible en:
http://themicrobiome.com/en/16s/16s-primers#.W7l0PWgzbIV.
(10) Manual de Prcticas de BM (2018) [Internet]. [Consultado el 6 octubre 2018],
disponible en:
http://www.cua.uam.mx/pdfs/conoce/libroselec/Manual_de_Prcticas_de_BM.pdf
(11) Guía rápida sobre Geles de Agarosa. [Internet], [Consultado el 6 octubre 2018],
disponible en: http://www.microgaia.net/2014/11/guia-rapida-sobre-geles-de-
agarosa.html
(12) Resolución de problemas. (2018). Biomodel.uah.es. Retrieved 7 October 2018, from
http://biomodel.uah.es/an/plasmido/0/probl.htm
(13) The Significance of the 260/230 Ratio in Determining Nucleic Acid Purity | Articles
| Compiled by Hillary Luebbehusen [Internet] [Consultado el 6 de octubre del 2018]
(14) What are these bright PCR products that don’t migrate through the gel. [Internet]
[Consultado el 6 de octubre del 2018] from
https://www.researchgate.net/post/What_are_these_bright_PCR_products_that_dont_
migrate_through_the_gel
(15) What could be the cause of PCR product bands not moving from the well of the gel
electrophoresis [Internet] [Consultado el 6 de octubre del 2018] from
https://www.researchgate.net/post/What_could_be_the_cause_of_PCR_product_band
s_not_moving_from_the_well_of_the_gel_electrophoresis
(16) Dron M, Rahire M, Rochaix J-D. Sequence of the chloroplast 16S rRNA gene and
its surrounding regions ofChlamydomonas reinhardii. Nucleic Acids Research.
1982;10(23):7609–20. [Consultado el 6 octubre 2018],
(17) Palmer JD, Herbon LA. Plant mitochondrial DNA evolved rapidly in structure, but
slowly in sequence. Journal of Molecular Evolution. 1988;28(1-2):87–97. [Consultado
el 6 octubre 2018],
(18) Leal C.A.G., Carvalho-Castro G.A., Cottorello A.C., Leite R.C., Figueiredo H.C.P.
Comparative analysis of conventional PCR and real-time PCR to diagnose shrimp
WSD. Brazilian Journal of Microbiology. 2013; 44(3): 901-904.
(19) New England BioLabs. Inc. Tm Calculator. [Internet]. [Consultado el 5 de octubre
del 2018]. Disponible en: http://tmcalculator.neb.com/#!/main.
(20) Kingsley K, James White Laboratory. Buffers for Electrophoresis: TAE, TBE, TPE,
and SB. [Internet]. Nueva Jersey, EEUU. [Consultado el 2 de octubre del 2018].
Disponible en:
http://www.rci.rutgers.edu/~white/pdf/protocols/pcr/Electro_Buffers.pdf .
(21) Biotium: Glowing products for science. GelRed® Nucleic Acid Gel Stain. [Internet].
[Consultado el 2 de octubre del 2018]. Disponible en:
https://biotium.com/product/gelred-nucleic-acid-gel-stain/
(22) CONDA, Pronadisa. Agarosas. [Internet]. [Consultado el 2 de octubre del 2018].
Disponible en: https://www.condalab.com/pdf/folleto_agarosas09.pdf .
(23) Thermo Fisher Scientific. MassRuler Low Range DNA Ladder. [Internet].
[Consultado el 2 de octubre del 2018]. Disponible en:
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/SM0383.
(24) Thermo Fisher Scientific. DNA Gel Loading Dye (6X). [Internet]. [Consultado el 2
de octubre del 2018]. Disponible en:
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0611.
(25) Lonza Bioscience. Section VIII: Separation of RNA in agarose gels. [Internet].
[Consultado el 2 de octubre del 2018]. Disponible en:
file:///C:/Users/Esteban/Downloads/Lonza_BenchGuides_SourceBook_Section_VIII_
-_Separation_of_RNA_in_Agarose_Gels_29569.pdf.