TEMA : Determinación de una curva de calibración y

análisis de una muestra d desconocida

RESUMEN

En la presente práctica se muestra el uso de la técnica de espectrofotometría UV en la

determinación de la concentración de cafeína en bebidas como Fanta roja, Guaraná, Aquarius,
Sprite y por último Volt. Se utilizaron estándares primarios a concentraciones de 1, 3, 5 y 10
ppm con el fin de determinar a qué longitud de onda se encuentra la máxima absorbancia de
la cafeína y ya con estos datos obtener la Curva de calibración que nos permita cuantificar la
concentración de cafeína en las gaseosas. Las diluciones a trabajar fueron de 1/50 (Fanta roja),
2/100 (Guaraná), 1/100 (Aquarius), 5/50 (Sprite), 1/50 (Volt) y 1/100 (Volt).
 PRINCIPIOS TEÓRICOS

Un procedimiento analítico muy utilizado en análisis cuantitativo es el llamado de

calibración que implica la construcción de una “curva de calibración”. Una curva de
calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en función de la
concentración de un analito. La calibración incluye la selección de un modelo para
estimar los parámetros que permitan determinar la linealidad de esa curva y, en
consecuencia, la capacidad de un método analítico para obtener resultados que sean
directamente proporcionales a la concentración de un compuesto en una muestra, dentro
de un determinado intervalo de trabajo. En el procedimiento se compara una propiedad
del analito con la de estándares de concentración conocida del mismo analito (o de algún
otro con propiedades muy similares a éste). Para realizar la comparación se requiere
utilizar métodos y equipos apropiados para la resolución del problema de acuerdo al
analito que se desee determinar.
La etapa de calibración analítica se realiza mediante un modelo de línea recta que
consiste en encontrar la recta de calibrado que mejor ajuste a una serie de “n” puntos
experimentales, donde cada punto se encuentra definido por una variable “x” (variable
independiente, generalmente concentración del analito de interés) y una variable “y”
(variable dependiente, generalmente respuesta instrumental). La recta de calibrado se
encuentra definida por una ordenada al origen (b) y una pendiente (m), mediante la
ecuación y = mx + b.

Para construir la curva de calibración se utilizan disoluciones que contienen

concentraciones conocidas de analito, llamadas disoluciones patrón o estándar.
Los estándares o disoluciones patrón para construir la recta de calibrado deben ser
preparadas en forma independiente, a partir de una o varias soluciones madre; el número
de puntos a escoger dependerá del uso que se dé a la recta de calibrado.
Si bien con dos puntos se puede construir una curva, estadísticamente se requieren por
los menos tres para que la curva sea confiable; este número se suele aplicar a métodos
de rutina perfectamente establecidos y validados (proceso por el cual se demuestra, por
estudios de laboratorio, que la capacidad del método satisface los requisitos para la
aplicación analítica deseada) (Dosal & Villanueva Marzo, 2008).
La cafeína es una sustancia que se encuentra naturalmente en ciertas plantas o se
produce sintéticamente y se usa como aditivo en ciertos productos alimenticios. Entre
sus principales fuentes consta el café cuya cantidad de cafeína varía según la calidad
del grano, el tiempo y forma de preparación fluctuando entre 30 y 175 mg por 150 mL,
en el descafeinado entre 2 y 8mg por 150mL.

Las metilxantinas (cafeína, teofilina y teobromina) por su semejanza a las purinas se

unen a los receptores A1 y A2 de la adenosina, actuando como antagonistas
competitivos (concentraciones de 10-40 micromolar/L). Esto produce una inhibición de la
fosfodiesterasa que da lugar a un aumento de las concentraciones de AMPc y de GMPc,
una activación de canales de K+ y una inhibición de los canales de Ca2+ de tipo N.
En el cerebro los receptores de adenosina inhiben la liberación de numerosos
neurotransmisores (GABA, acetilcolina, dopamina, glutamato, noradrenalina y
serotonina), la cafeína producirá el efecto contrario. Los receptores A2 se coexpresan
con receptores de encefalina y dopamina D2 en las neuronas del estriado (Mandel,
2002).
La cafeína potencia la neurotransmisión dopaminérgica en esa área cerebral y en parte
podría explicar su potencial de abuso. Además, la cafeína actúa a concentraciones
mucho mayores de las que antagonizan la adenosina como inhibidor directo de la
fosfodiesterasa (400 micromol/L) (Ayesta & Camí, 2003).
Según la AMA (Agencia Mundial Antidopaje) en el Programa de Seguimiento 2014 la
cafeína no se considera como sustancia prohibida. Su Dosis letal (DL50) depende del
peso y la sensibilidad individual y se estima que cerca de 150 a 200 mg/ kg de masa
corporal, alrededor de 80 a 100 tazas de café para un adulto promedio. Las
intoxicaciones más frecuentes se dan en personas no consumidoras de cafeína, pero
también se dan casos en usuarios que aumentan su dosis habitual o consumidores
habituales de altas dosis de cafeína.
Los síntomas más frecuentes por sus efectos farmacológicos son la taquicardia,
inquietud, nerviosismo, temblor e insomnio. Tras el uso continuado de cafeína la
intoxicación puede no aparecer a pesar de la ingesta de grandes cantidades de cafeína
debido al desarrollo de tolerancia. Los criterios descritos DSM IV-TR para el diagnóstico
de la intoxicación por cafeína. (Consumaseguridad, 2003).
Otros signos descritos han sido el edema de pulmón, arritmias (desde taquicardia a
fibrilación auricular o ventricular) infarto de miocardio y rabdomiolisis. La intoxicación en
el neonato puede presentarse en forma de agitación, irritabilidad, hipertonía,
sudoración, taquicardia, dilatación gástrica, insuficiencia cardiaca, edema de pulmón y
alteraciones hidroelectrolíticas y metabólicas. La dosis letal aguda de cafeína estimada
en adultos estaría entre 5 y 10 g vía intravenosa u oral. (Underm, 2006).
 REACCIONES QUÍMICAS
La cafeína puede sufrir las siguientes transformaciones metabólicas: 1. Desmetilación
inicial para dar origen a dimetilxantinas como teofilina, teobromina y paraxantina (1,7-
dimetilxantina). 2. Oxidación en C, para generar el ácido 1,3,7-trimetilúrico. 3. Hidratación
y ruptura del anillo, en C8 y N9, para dar dimetiluracilo. Las dimetilxantinas sufren luego
una nueva desmetilación y se metabolizan a través de reacciones similares a 2 y 3 (Carral
Mahía, 2011).
 PROCEDIMIENTO
PREPARACIÓN DE ESTÁNDARES

Pesar 100 g
de cafeína.

Disolver la
cafeína en una
fiola de 100 mL.

Enrasar con
agua destilada.

PATRÓN A (estándar 4): 10ppm estándar 3: 5ppm

Tomar 1 mL
de la Tomar 5 mL
solución del patrón A.
anterior.

Llevar a la fiola Llevar a la fiola

de 100 mL. de 10 mL.

Enrasar con Enrasar con

agua destilada. agua destilada.
estándar 2: 3 ppm estándar 1: 1 ppm

Tomar 3 mL Tomar 5 mL
del patrón A. del patrón A.

Llevar a la fiola Llevar a la fiola

de 10 mL. de 50 mL.

Enrasar con Enrasar con

agua destilada. agua destilada.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Tomar 30 mL de la
bebida en un vaso
precipitado.

Desgasificar las
bebidas en un
agitador magnético.

Tomar los mL
especificados en la
tabla.

Llevar a fiolas y
enrasar con agua
destilada.
 BEBIDA VOLUMEN A VOLUMEN DE LAS FACTOR DE
DILUIR FIOLAS DILUCIÓN
Fanta roja 1 mL 50 mL 1/50
Guaraná 2 mL 100 mL 2/100
Aquarius 1 mL 100 mL 1/100
Sprite 5 mL 50 mL 5/50
Volt 1 mL 50 mL 1/50
Volt 1 mL 100 mL 1/100

Leer en el
espectrofotómetro.
 RESULTADOS
Longitud máxima de absorción de la cafeína: 273 nm

Gráfico # 1

Curva de calibración con lo estándares

MUESTRA CONCENTRACIÓN (ppm) ABSORBANCIA

Blanco 0.000 0.000
Estándar 1 1.000 0.073
Estándar 2 3.000 0.230
Estándar 3 5.000 0.381
Estándar 4 10.000 0.740

Gráfico #2
Concentración de cafeína de las muestras de bebidas

MUESTRA CONCENTRACIÓN (ppm) ABSORBANCIA

2.630 0.198
Fanta roja(1/50)
2.177 0.164
Guaraná(2/100)
5.261 0.393
Aquarius(1/100)
2.026 0.153
Sprite(5/50)
2.968 0.223
Volt (1/100)
6.261 0.468
Volt (1/50)

Gráfico #3

MUESTRA CONCENTRACIÓN (ppm)

2.630 x (50/1) = 131.5
Fanta roja
2.177 x (100/2) = 108.85
Guaraná
5.261 x (100/1) = 526.1
Aquarius
2.026 x (50/5) = 20.26
Sprite
2.968 x (100/1) = 296.8
Volt (1/100)
6.261 x (50/1) = 313.05
Volt (1/50)
 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

Longitud máxima de absorción de la cafeína:

Se observa en la gráfica #1 que, a una absorbancia de 0.076, encontramos la longitud
de onda máxima de la cafeína (273nm). Este valor concuerda relativamente con la
longitud de onda máxima teórica (272nm), aunque haya un exceso de 1nm.

Curva de calibración de los estándares:

La gráfica #2 nos muestra la curva patrón, que nos permitirá hallar las concentraciones
de las muestras respectivas. Podemos observar que la regresión lineal se ajusta, no de
manera idónea, pero la necesaria para que los puntos generados a partir de una
dispersión, se ajusten al modelo de la recta, obteniendo un valor de coeficiente de
correlación R2 =0.99964

Concentración de cafeína de muestras de bebidas:

Para las gaseosas Fanta Kola Inglesa, Guaraná, Sprite, Volt (1/100) y Volt (1/50) se
obtiene respetivamente 131.5 ppm, 108.85 ppm, 20.26 ppm, 296.8ppm y 313.05ppm.
Estos valores se encuentran dentro del rango establecido de concentración de cafeína
según la Norma Indecopi ( ex – ITINTEC ) 214.001 Bebidas gasificadas, jarabeadas ,
nos menciona una concentración de cafeína menor a 320 ppm y éstas 5 bebidas la
cumplen.
 CONCLUSIONES

 La máxima absorbancia de la cafeína obtenida en el laboratorio se da a 273nm.

 Ya que nuestro coeficiente de correlación fue de R2 =0.99964 (prácticamente 1)

podemos concluir que los estándares se ajustan a la curva de calibración.

 Haciendo una comparación con las concentraciones de Fanta Kola Inglesa,

Guaraná, , Sprite, Volt (1/100) y Volt (1/50) ( con 131.5 ppm, 108.85 ppm, 20.26
ppm, 296.8 ppm y 313.05 ppm respectivamente) se concluye que estas bebidas
están dentro de lo establecido por la normativa, sin embargo, la bebida Aquarius
(526.1ppm) no está dentro de lo establecido, ya que según Reglamento técnico
para bebidas energizantes para consumo humano (RESOLUCIÓN 4150 DE 2009)
debe contener 320 ppm.
 SUGERENCIAS

 La verificación del comportamiento de un analito mediante una curva de

calibración requiere un mínimo de cinco puntos para un intervalo de confianza del
95 % y de ocho puntos para uno del 99 %.
 BIBLIOGRAFÍA

 Ayesta, F., & Camí, J. (2003). Farmacodependencias. Farmacologia Humana.

Barcelona: Masson.
 Carral Mahía, E. (2011). Determinación analítica de la cafeína en diferentes
productos comerciales [Ebook] (pp. 17-28). Cataluña, España. Retrieved from
https://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2099.1/11148/PFC1.pdf
 Consumaseguridad. (30 de 06 de 2003). Consumaseguridad. Recuperado el 16
de Octubre de 2013, de Normativa legal:
http://www.consumaseguridad.com/web/es/normativa_legal/2003/06/30/7147.ph
p#bibliografia
 Dosal, M., & Villanueva Marzo, M. (2008). Curvas De Calibración En Los Métodos
Analíticos [Ebook]. Retrieved from
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CURVASDECALIBRACION_23498.p
df
 Estudio de niveles de cafeína y taurina en comparación con la norma técnica
ecuatoriana inen 2411:2008, para una muestra de la población de bebidas
energéticas comerciales del país. (2014). [Ebook]. Quito, Ecuador. Retrieved from
http://www.dspace.uce.edu.ec/bitstream/25000/6420/1/T-UCE-0008-097.pdf
 Mandel, H. (2002). Food and Chemical Toxicology. Washington: Food Science.
 Underm, B. (2006). The Pharmacological Basis of Therapeutics. New York:
McGrawHill.