Modulo 04 - VAlidaç o de Métodos PDF

Precisão e Exatidão
O que vamos ver?
•Conceito de distribuição normal

•População e amostragem
•Média e desvio padrão
•Intervalo de confiança
•Teste estatísticos de comparação
•Precisão e precisão intermediária
•Critérios de aceitação
•Exatidão
Definição de Estatística
“Conjunto de métodos especialmente apropriados à coleta, à apresentação (organização, resumo e
descrição), à análise e á interpretação de dados de observação, tendo como objetivo a compreensão de
uma realidade específica para a tomada de decisão”

Análise de Dados – Escala de Medição
Menor número de Observações
Dados qualitativos Dados qualitativos Dados quantitativos Dados quantitativos

nominal ordinal discretos contínuos
Sexo, raça Estatura: Baixo, médio, Contagem: nº filhos, Temperatura

alto peças defeituosas
Dados que não podem Os dados podem ser O número de valores é Resultam de infinitos
sem ordenados e arranjados em alguma um número finito ou valores possíveis que
consistem em nome, ordem: Avaliação de uma quantidade correspondem a alguma
número e categoria: desempenho, grau de “enumerável”: contagem escala contínua: Pressão,
Nome, cliente, turno, instrução, escolaridade, de defeitos, nº clientes temperatura, tempo,
tipo de plano, sexo, classe social, atendidos, nº de filhos altura, custo
reclamação, raça procedência.
Variáveis atributos Variáveis Contínuas

Melhor
Conceito de distribuição normal
Dados brutos não organizados: Não foram numericamente organizados
Analista 1 Analista 1 Analista 1 Analista 2 Analista 2 Analista 2

Repetições
Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3 Pesagem 1 Pesagem 2 Pesagem 3
1 98,51 99,01 98,99 98,97 98,56 98,89

2 98,62 99,02 99,23 99,01 99,02 99,03
3 98,85 99,11 98,86 99,12 99,34 99,14
4 98,23 98,81 99,02 98,95 99,01 98,79
5 98,54 98,99 99,02 98,15 98,65 98,45
6 98,74 99,12 99,05 99,24 98,89 98,54
Conceito de distribuição normal
98,0 a 98,2 98,2 a 98,4 98,4 a 98,6 98,6 a 98,8 98,8 a 99,0 99,0 a 99,2 99,2 a 99,4
98,15 98,56 98,85 98,99 99,02 99,12 98,15 98,23 98,45 98,62 98,81 99,01 99,23
98,51 98,65 98,85 99,01 99,24
98,23 98,62 98,86 98,99 99,02 99,12 98,54 98,74 98,86 99,01 99,34
98,54 98,79 98,89 99,02
98,56 98,95 99,02
98,45 98,65 98,89 99,01 99,02 99,14
98,97 99,02
98,99 99,02
98,51 98,74 98,95 99,01 99,03 99,23 98,99 99,03
98,99 99,05
98,54 98,79 98,97 99,91 99,05 99,24 99,11
99,12
99,12
98,54 98,81 98,99 99,02 99,11 99,34
99,14
Conceito
Conceito de
de distribuição
distribuição normal
normal
99,14 99,38
99,12 99,19 99,37 99,57
99,12
99,19 99,37 99,57
99,11
98,99
98,99
99,05
99,03
Aumento 99,19 99,36 99,56
98,94 99,18 99,35 99,56 99,76
98,99 99,02 de n 98,93 99,18 99,24 99,55 99,75
98,97 99,02
98,56 98,95 99,02 98,78 98,9 99,16 99,23 99,5 99,7 99,9
98,54 98,79 98,89 99,02 98,78 98,87 99,15 99,22 99,42 99,62 99,82
98,54 98,74 98,86 99,01 99,34
98,57 98,63 98,86 99,12 99,22 99,42 99,61 99,82 100
98,51 98,65 98,85 99,01 99,24
98,15 98,23 98,45 98,62 98,81 99,01 99,23 98,45 98,63 98,84 99,12 99, 21 99,41 99,61 99,81 100
98,0 a 98,2 98,2 a 98,4 98,4 a 98,6 98,6 a 98,8 98,8 a 99,0 99,0 a 99,2 99,2 a 99,4 98,2 98,4 98,6 98,8 99 99,2 99,4 99,6 99,8 100 100,2
EXEMPLOS
Porque gostamos da distribuição normal?
3 2 D D 2 3
D D D D
Medidas resumo para análise de dados:
Tamanho da amostra (n), média (y) e desvio padrão (s)

Inferências do sistema a partir da amostra
Amostr
a
( , S)
Inferência sobre o todo a partir dos

dados da amostra
Descrição de medidas resumo
Medida de Tendência Central
Média: y
A média dos primeiros cinco valores da tabela
y= (y1+y2+ ... + yn)/n = (103,08+100,96+104,13+100,8+98,2)/5 = 101,59
Mediana: Me
É calculada ordenando as observações de menor a maior (ou vice-versa) e escolhendo o valor que está no
meio.
98,2 100,8 100,96 103,8 104,13

Qual seria o valor da Me se o máximo valor mudar para 1100? E o valor da média?
98,2 100,8 100,96 103,8 1100
Me= ?
y = ?
A média seria igual a 300,75 enquanto a mediana não mudaria:
98,2 100,8 100,96 103,8 1100
Me
y= 300,75
Observação: A mediana é uma medida robusta, não influenciada pela presença de

outliers (valores extremos)
Variância: S2
Na amostra com 5 valores
S2= [(98,2 – 101,59) + (100,8 – 101,59) + (103,8- 101,59) + (104,13 – 101,59) + (100,96 – 101,59] / (5-1)= 5,96 mg2/comp2
104
103
Teor (mg/comp)
102 101,96
101
100
99
98
1 2 3 4 5
Amostra
Desvio Padrão: S
S = (S2)1/2
Coeficiente de Variação: CV ou CV%, ou RSD
Medida de variação relativa, calculada como:
CV= S/Média
Determinar a variabilidade em relação a média, utilizada para comparar variabilidade RELATIVA de dois
produtos ou métodos. Por exemplos métodos analíticos com médias muito diferentes.
A1 A2
Rep 1 1.075 107.5
Rep 2 1.023 102.3
Rep 3 1.044 104.4
Rep 4 1.003 100.3
Rep 5 1.088 108.75
s 0.0352 3.5157
CV 3.4 3.4
Intervalo de Confiança
= 10
=8
Qual a proximidade dessa média com

a verdadeira?
Variabilidade da média
µ= 8±3
A média populacional está entre
Média é igual a um valor especificado
11 e 5
Comparar se duas médias são iguais
Comparação de Médias
Comparação por Intervalo de Confiança

Descrição de Medida Resumo
Histograma de15000 registros de absorbância

de uma amostra (Elmer, J.; 2005)
Fatos e observações
Objetivos Teoria, Hipóteses

Verificar se o método produz resultados H0: média no dia 1 = média no dia 2
iguais quando executado em dias Ha: média no dia 1 ≠ média no dia 2
diferentes
Método estatístico
Teste t para amostras com variâncias iguais
Amostragem
Plano balanceado (n1 = n2)
Análise de dados
Recomendações Software estatístico, excel
Os resultados gerados nos dois dias são
diferentes, descrever melhor o preparo de Conclusão
amostra Se p-valor < α, rejeita H0
Comparação de Variâncias

Verificar se a variabilidade da análise em H0: variância o dia 1 = variância no dia 2
dias diferentes é igual Ha: variância no dia 1 ≠ variância no dia 2
Teste F
Amostragem
Análise de dados
diferentes, descrever melhor o preparo de Conclusão
amostra Se p-valor < α, rejeita H0
Qual teste escolher?
https://www.midomenech.com.br
BoxPlot
Histograma e Boxplot de Teor de Pirulo
O extremo da barra é determinado pelo O extremo da barra é determinado pelo

valor mais próximo maior que Q1-1,5(Q3- Q1Me Q3
valor mais próximo maior que Q3+1,5(Q3-
Q1) Q1)
Possíveis valores
extremos
20
15
Frequência
10
0
Teor Pirulo
Interpretação de BoxPlot
Precisão e Exatidão
Teste de Avaliação
Precisão
Desvio Padrão ou Coeficiente de Variância
Grau de variação de resultados de

uma medição
Precisão
Precisão
•Nove determinações no intervalo linear
•Seis réplicas a 100% da concentração do teste individualmente preparadas
•Avaliado o DPR
•Critério de aceitação: ???
Precisão Intermediária
• Igual precisão, mas com outro operador e dia diferente;
•Proximidade dos resultados = ????

Precisão do Sistema
RSD de mais de mil injeções de precisão de

sistema obtidos a partir de 5 injeção da
solução padrão.
Porque aceita RSD de 2% para

adequabilidade do sistema?
Precisão
Estudo de Caso
Um método de doseamento para o produto Pirulo está sendo validado. Trata-se de um
comprimido revestido com dosagem de 100 mg/comp do principio ativo Pirulo.
O método é preciso para a quantificação de pirulo?
Analista 01
99,84 Média analista 1= 100,47
99,93
Desvio padrão analista 1= 0,97
99,50
100,24
101,30
102,00
Precisão – Critério de Aceitação para DPR
Exemplo 01. Teor de comprimido: Alvo= 100% e limites de especificação de liberação entre 95% e 105%
Sistema de medição com RSD = 2%
Histograma de Teor com RSD de 2

Normal
95 105
Média 99,99
100 DesvPad 2,028 Histograma de Teor com DPR de 0,8%
N 1000 95 105
100 Média 99,99
DesvPad 0,8224
80 N 1000
80
Frequência
Frequência
60 60
40
40
20
20 0
91,0 93,6 96,2 98,8 101,4 104,0 106,6 109,2
DPRTeor
0
94 96 98 100 102 104 106
Teor
Exemplo 02. Dissolução IR de comprimido: Alvo= 100% e limites de especificação de liberação de
estágio 01 = 85%
70% Reprovação em S2 80 85% Reprovação em S1

90 Média 99,79
DesvPad 10,30
80 N 1000
70
60
Frequência
50
40
30
20
10
0
48 64 80 96 112 128 144
DPR10
Exemplo 03. Produto de degradação: Alvo= 0,5% e limites de especificação de no máximo 1,0%
Histograma de Produtos de Degradação (DPR 5%)

Especificação de no máximo 1,0%
90 Média 0,5015
DesvPad 0,02463
80 N 1000
70
60
Frequência
50
40
30
20
10
0
-0,000 0,195 0,390 0,585 0,780 0,975 1,170 1,365
% Impureza
Medidas de capacidade da medição
O método tem capacidade apropriada? (Quando a variabilidade da medição é comparada com a

largura da especificação)
• Precisão sobre tolerância:
Se %P/T < 10% e %RR < 10% Ótimo!
Se 10%< %P/T < 30% e/ou 10% < %RR < 30% Aceitável
Se %P/T > 30% ou %RR > 30% Não Ok

Média analista 1= 100,47 Desvio padrão analista 1= 0,97
% P/T= 6 x 0,97 x 100/ (105-95)= 58%
Não Ok
% P/T= 6 x 0,97 x 100/ (110-90)= 29%
Nunca ajustar especificação para

melhorar %P/T
Relação entre Exatidão e Precisão
Estudo de Caso
E a precisão intermediária? Pode-se dizer que o método tem boa precisão intermediária?
Resultados Estatística descritiva
Analista 01 Analista 02
Média analista 1= 100,5
99,84 98,61
99,93 98,92 Média analista 2= 99,2
99,50 99,61
100,24 99,73 Desvio padrão analista 1= 0,97
101,30 99,45
Desvio padrão analista 2= 0,46
102,00 98,8
Estudo de Caso

Verificar se a variabilidade do método H0: sanalista 1 = sanalista 2
analisado por analistas diferentes é igual Ha: sanalista 1 ≠ sanalista 2
Comparar as variâncias: Teste F Teste f para comparar variâncias
Nível de confiança de 95% Amostragem

Análise de dados
Excel
Recomendações
Conclusão
Os resultados gerados nos dois dias
p-valor= 0,63 > 0,05, não rejeita H0
apresentam variabilidade equivalente
Estudo de Caso
As médias obtidas nas duas análises são iguais?
???????

Verificar se o método produz resultados H0: média no dia 1 = média no dia 2
iguais quando executado em dias Ha: média no dia 1 ≠ média no dia 2
diferentes
Teste t para amostras com variâncias iguais
Amostragem
Análise de dados
diferentes. Conclusão
p-valor= 0,02 < 0,05 - rejeita H0
Então qual critério de aceitação adotar?
Avaliar a diferença absoluta entre as médias
Relevância prática
A diferença tem impacto na avaliação da qualidade do produto em estudo?

TOST – Teste de equivalência
Teste t x Teste de equivalência

TOST – Teste de equivalência
Caso 01 Caso 02
Amostra P1 P2 Amostra P1 P2
1 100.0 99.8 1 82 77
2 99.9 99.8 2 92 78
3 100.0 99.7 3 87 87
4 99.9 99.7 4 85 79
5 99.9 99.8 5 85 89
6 100.1 99.8 6 86 80
Média 100.0 99.8 Média 86.2 81.7
Desvio padrão 0.08 0.05 Desvio padrão 3.31 5.05
Outras Fontes de Precisão Intermediária
Estudo de Estabilidade
EXATIDÃO
A exatidão é uma medida do erro sistemático

em uma análise
• Para um valor verdadeiro de 100% (ex.

Erro precisão de 1% para uma
probabilidade de 95% de aprovação em
uma especificação de teor 98 – 102%.
• No caso de um erro de 1%, seria

necessário uma precisão de 0,6% para
aprovação na mesma especificação
• Para um valor verdadeiro de 100% (ex.

Erro precisão de 1% para uma
probabilidade de 95% de aprovação em
uma especificação de teor 98 – 102%.
• No caso de um erro de 1%, seria

necessário uma precisão de 0,6% para
aprovação na mesma especificação
Exatidão
• No minímo nove determinações contemplando o intervalo linear do

método (baixo, médio e alto)
• Usar três réplicas em cada nível
Critério de Aceitação
Os critérios de aceitação devem ser definidos e justificados
de acordo com os seguintes aspectos:
I- objetivos do método;
II- Variabilidade intrínseca do método;
III- concentração de trabalho; e
IV – concentração do analito na amostra
Exatidão
Exatidão de IFA
Comparar resultado com resultante de um segundo método validado
Na inexistência de um método absoluto,
X comparação entre dois métodos analíticos

independentes pode ser utilizado.
(Ermer J, 2015)
Titulação
HPLC
Método absoluto
Exatidão
Exatidão do produto terminado
• Adição de quantidade conhecida de SQR a matriz

• Comparar com resultados de um segundo método validado
Linearidade
Linearidade - Faixa
Abranger toda a faixa estabelecida para o método
“Art. 24 Uma relação linear deve ser avaliada em toda a faixa estabelecida para o método”
Menor Maior
Teor 80% 120%
Uniformidade de conteúdo 70% 130%
Dissolução [Esperada] - 20% [Esperada]+ 20%
Impurezas LQ 120% limite especificação impureza individual
Linearidade - Faixa
Caso 01: Método de dissolução com Q= 80 % Caso 02: Método de dissolução com Q= 80 %
em 45 minutos em 45 minutos
Menor ponto observado no perfil Menor ponto observado no perfil
30% em 10 minutos 95% em 10 minutos
Faixa: 10% a 120% Faixa: 75% a 120%
Q-20 % - Faixa : 60% a 120 %

Linearidade - Faixa
“Art. 25 Para o estabelecimento da linearidade, deve-se utilizar, no mínimo, 5 (cinco)

concentrações diferentes da SQR para as soluções preparadas em, no mínimo, triplicata.”
Preparo independente, podendo soluções diluídas de uma mesma solução mãe para SQR
Linearidade - Faixa
880% 880% 880%
90% 90% 90%
100% 100% 100%
110% 110% 110%

Solução Solução Solução
estoque A 120% estoque B 120% estoque C 120%
Regressão Linear
Regressão = técnica de ajuste de modelos
Estudo de relação entre duas ou mais variáveis contínuas
• Aumento de peso com idade

• Cosumo e renda
• Dureza do comprimido com força de compressão
• Resposta do detector com concentração
Regressão Linear
• O aumento da concentração gera um aumento na resposta do detector?
1000
900
Concentração Resposta
800
9 190 700
600
15 318
Área
500
23 518 400
300
29 600 200
35 768 100
0
44 921 0 10 20 30 40 50
Concentração (ppm)
Regressão Linear
1000 1000
900 1000 900
800 800
700 900 700
600 600
Área
Área
500 800 500
400 400
300 700 300
200 200
100 600 100
0 0
0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50
ÁreaÁrea
500
Concentração (ppm) Concentração (ppm)
400
1000
900
300
800
700
200 600
Área
500
100 400
300
0 200
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
100
0
0 10 20 30 40 50
Regressão Linear
Método dos Minímos Quadrados (MMQ)
Otimização matemática para encontrar o melhor ajuste
Minimizando a soma dos quadrados das diferenças do estimado e observado
Observado diferença
Estimado Minimizam a soma dos quadrados dos desvios

entre os valores observados e estimados de y
Regressão Linear
Regressão Linear
• Como é essa relação de aumento da concentração e resposta do detector? É uma relação forte?
Positiva ou negativa?
Coeficiente de correlação: grau de relação linear entre duas variáveis

Varia entre -1 e +1
• r= +1: correlação perfeita e positiva: as variáveis aumentam juntas
• r= -1: correlação perfeita negativa: um aumenta a outra diminui
• r= 0: ausência de correlação
r=0
Regressão Linear
Avaliação gráfica em conjunto com o parâmetro estimado
Todos apresentam coeficiente de correlação igual a

0,87
Regressão Linear
Coeficiente de Determinação
• Coeficiente de correlação não ajuda a enteder a força de associação entre duas ou mais variáveis
• Coeficiente de determinação = R2: porcentagem da variação total da resposta que é explicada pelos
fatores do modelo
• Varia entre 0 e 1
• R2= 1 significa que conhecendo x posso predizer 100% da variação de y

Regressão Linear
Essa relação é linear?

3.5
3 y = 3902x - 11,20
R² = 0,999
2.5
2
Área
1.5
1
0.5
0
0.0029 0.0031 0.0033 0.0035 0.0037 0.0039
Concentração (mg/mL)
Regressão Linear
R2 = 0.99
OS RESÍDUOS
Regressão Linear - Resíduos
Análise de Resíduos
A diferença entre resposta experimental e a calculada pelo modelo de regressão

Gráfico de Resíduos
30
Concentração Resposta Calculado Resíduo
20
9 190 198 -8
15 318 324 -6 10
23 518 493 25 0
29 600 619 -19
0 1 2 3 4 5 6 7
-10
35 768 746 22
44 921 935 -14
-20
-30
Essa relação é linear? Gráfico de Resíduos
3.5
3 y = 3902x - 11,20
R² = 0,999
2.5
2
Área
1.5
1
0.5
0
0.0029 0.0031 0.0033 0.0035 0.0037 0.0039
Concentração (mg/mL)
NÃO
Homocedasticidade
“A homocedasticidade dos dados deve ser investigada para a utilização do modelo adequado”
Os resíduos não podem ser heterocedásticos
Resíduos heterocedásticos= Inferência estatística não é válida

Concentração
(mg/mL) Área
0,24 8597,85
0,24 8597,26 Avaliação do gráfico de resíduos
0,24 8596,78
0,24 8596,91
0,24 8597,3
0,24 8597,5
0,27 9607,39 0.00002
0,27 9607,71
0,27 9607,44 0.000015
0,27 9608,13
0,27 9607,18 14000
0.00001
0,27 9607,25
12000
0,3 10617,7
0.000005
0,3 10618 10000
Resíduos
0,3 10618
8000 y = 33,675.673x + 515.121 0
0,3 10618
Área
R² = 1.000 8000 9000 10000 11000 12000 13000

0,3 10617,8 6000
0,3 10617,8 -0.000005
0,33 11627,8 4000
0,33 11628,4 -0.00001
2000
0,33 11628
0,33 11628,3 0
-0.000015
0,33 11628,3 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
0,33 11628,1 Concentração (mg/mL)
-0.00002
0,36 12637,9 Variável X 1
0,36 12638,1
0,36 12638,5
0,36 12638,2
0,36 12638,6
0,36 12638,3
Concentração (mg/mL) Área
0,0004072 3,6483
0,0004016 3,6851 Avaliação do gráfico de resíduos
0,0004024 3,5807
0,0020359 18,9696
0,0020080 18,2131
6
0,0020120 18,505
0,0050898 45,6184
0,0050199 45,6559 4
0,0050299 45,702 600
0,0101796 90,9817
0,0100399 91,0047 500
y = 9015.6x + 0.5439 2
0,0100598 92,1442 400 R² = 0.9998
0,0152694 136,4309
0,0150598 136,286 300 0
Resíduos
Área
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070

0,0150898 137,9159
200
0,0203592 182,105
-2
0,0200798 182,6685 100
0,0201197 183,1695
0,0254490 227,1351 0 -4
0,0250997 227,3105 0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070
0,0251496 229,4629 Concentração (mg/mL)
0,0305388 279,4746 -6
0,0301196 273,4298
0,0301795 273,5531
-8
0,0407184 363,667 Variável X 1
0,0401595 364,0453
0,0402394 368,2416
0,0610776 544,5581
0,0602393 544,5138
ORDEM DE GRANDEZA
0,0603590 546,3766
Testes para avaliação da homocedasticidade
Teste F: Teste bastante exigente – Comparação por teste F da maior variância com a menor
variância dos níveis
Teste de Cochran: Indicado pela ANVISA
Teste de Breusch Pagan, Bartlett, Levene-Brown-Forsythe: Todos comparam variância
Um teste estatístico precisa ser aplicado em conjunto com avaliação gráfica

Teste F
Hipótese nula: σ2nível 8 = σ 2nível 3

6
4
Nível Variância (s2)
1 0,003 Hipótese alternativa: σ 2nível 8 > σ 2nível 3
2
2 0,146
0 3 0,002
Resíduos
0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 4 0,442

-2
5 0,814 Fcalc= 11,936/0,002= 6807,6
-4 6 0,284
7 1,680
-6
8 11,936 Ftab= 19
-8 9 6,447
Variável X 1
10 1,130
Fcalc > Ftab – Rejeita-se a hipótese
nula e aceita-se a alternativa
Teste de Cochran
Hipótese nula: σ2 1 = σ 22 = σ 23 = σ 2k
6
Nível Variância (s2)

4
1 0,003 Hipótese alternativa: Pelo menos uma
2 0,146
2
σ 2i é diferente.
3 0,002
0 4 0,442
Resíduos
0.000 0.010 0.020 0.030 0.040 0.050 0.060 0.070

5 0,814
-2
Ccalc= 11,936/22,882= 0,52
6 0,284
7 1,680 Ctab= 0,445
-4
8 11,936
-6 9 6,447
10 1,130 Ccalc > Ctab: Rejeita-se a nula e aceita-
-8
Variável X 1 Soma 22,882 se a alternativa
Normalidade dos Resíduos
Avaliação gráfica: Gráfico de probabilidade normal

Histograma: Cuidado com o número de dados
Testes estatísticos: Kolmogorov-Smirnov, Anderson-Darling, Shapiro-Wilk ...
Probabilidade Normal Histograma Teste estatístico
Como p_valor é maior do que 0,05,

existe forte evidência pelo teste de
Anderson-Darling de que os resíduos
são normalmente distribuídos.
Normalidade dos Resíduos – Avaliação gráfica
NORMAL NÃO NORMAL

Avaliação de Outliers
Os resíduos seguem uma distribuição normal?
95% dos resíduos no intervalo de + ou – 2 desvios padrões

99,9% dos resíduos no intervalo de + ou – 2 desvios padrões
Análise gráfica: Boxplot dos resíduos
Teste estatístico: Cochran, Teste Q...

2 ã = 0,00001652
3 ã = 0,00002478
Gráfico de Resíduos
0.00003
3xs
0.00002
2xs
0.00001
Resíduos 0
8000 9000 10000 11000 12000 13000
-0.00001
-0.00002
-0.00003
Variável X 1
Teoria, Hipóteses
Objetivos
H0: é uma observação considerada um valor
Verificar se o maior ou menor valor
extremo
observado pode ser considerado um valor
Ha: Não é uma observação considerada um valor
extremo
extremo
Teste de Grubbs
Amostragem
N = 30
Análise de dados
Recomendações Software estatístico
Transformação dos dados
Conclusão
Se p-valor < α, rejeita H0
Regressão Linear – Autocorrelação dos Resíduos
O resíduos devem ser independentes
Diagnóstico:
• Gráfico de resíduos vs Ordem de coleta (Análise de série temporal)
• Teste de Durbin Watson

Regressão Linear – Autocorrelação dos Resíduos
Regressão Linear – Auto correlação dos Resíduos
Teste de Durbin Watson
Calculo de dw
• se 0 ≤ dw < dL então rejeitamos H0 (dependência);

• se dL ≤ dw ≤ dU então o teste é inconclusivo;
• se dU < dw < 4-dU então não rejeitamos H0
(independência);
• se 4-dU ≤ dw ≤ 4-dL então o teste é inconclusivo;
• se 4-dL < dw ≤ 4 então rejeitamos H0 (dependência).
Check list dos resíduos
• Há evidências de heterocedasticidade?
• Há indícios de ausência de normalidade na distribuição dos erros?
• Identificado algum outlier?
• Verificada a independência dos resíduos?

Regressão Linear
O que mais falta avaliar?
Avaliação visual – ok
Coeficiente de determinação – ok
Análise dos resíduo: Normalidade; Homocedasticidade, outlier, tendência – ok
Inclinação da reta – X
Intercepto – X
Regressão Linear
A inclinação da reta é significativa?
Teste F para avaliar a significância do modelo – Análise de Variância (ANOVA)
Avaliar se a inclinação da reta é significativa
H0: β1 = 0
Ha: β1 ≠ 0
β ≠0
Comparação do Fcalculado com Ftabelado β =0
Avaliação do p-valor
Regressão Linear
Intercepto
Qual é o método de calibração?
Calibração de ponto único Curva de calibração
Intervalo de confiança do intercepto

Diferença em relação ao 100%
Efeito Matriz - Paralelismo
• Matrizes complexas
• Comparação curva em solvente e em matriz fortificada
• Avaliar o paralelismo pelo teste t
Inicio MMQP RI=aw+bwxi
Estimação do intercepto aw, da inclinação
bw, dos desvios padrão saw e spw, da
covariâncoia cov(aw,bw) e do coef. Cor.
Dados da curva de caliberação: Lin. rw
Resp. Int. vs. Conc
Não
MMQO RI=a + bx Inspeção visual dos

Estimação do intercepto a, da inclinação dados e dos gráficos Homoced
b, dos desvios padrão sa e sb , da (Curva de calibração e asticidade
covariância cov(a,b) e do coef. Cor. Lin de resíduos) (α=0,05)
Sim
Exclusão de dados
(máximo 22,2% do Sim
Outliers
número original de
(α=0,05)
dados sem excluir nível
de concentração)
MMQO ou MMQP Não

RI=a + bxi + cx2 + ...
Estimação de a, b, c, ... Das
variâncias as, sb, sc, ... Das Sim Sim
covariâncias cov (a,b), cov (a,c), cov Ajuste de Falta de
(b,c), ... E do coef. Cor do ajuste ou polinômio ajuste
coef. de determinação R= r(yi,
ycalc).
Não
Reduzir faixa de calibração ou alterar Não

condições de detecção ou o procedimento
analítico
2
2
Verificar se o modelo é Não Sim Verificar se a inclinação é

Reta
significativa significativa
P-valor P-valor
menor que menor
0,05 que 0,05
Não Reduzir a faixa de calibração ou Não
Sim alterar condições de detecção ou o
procedimento analítico Sim
Ajuste da curva de
calibração adequado
Fim
Estudo de caso 1
Concentração (mg/mL) Área
0.00048 2452.77
0.00048 2463.47
0.00048 2444.32
0.00064 3260.63
0.00064 3269.67
0.00064 3262.58
0.00080 4098.96
0.00080 4102.23
0.00080 4101.75
0.00096 4917.93
0.00096 4916.95
0.00096 4915.54
0.00112 5743.12
0.00112 5731.16
0.00112 5752.46
0.00128 6567.06
0.00128 6544.66
0.00128 6573.82
0.00144 7377.22
0.00144 7375.06
0.00144 7368.58
Estudo de caso 2
Xi yi
0.0004072 3.6483
0.0004016 3.6851
0.0004024 3.5807
0.0020359 18.9696
0.0020080 18.2131
0.0020120 18.505
0.0050898 45.6184
0.0050199 45.6559
0.0050299 45.702
0.0101796 90.9817
0.0100399 91.0047
0.0100598 92.1442
0.0152694 136.4309
0.0150598 136.286
0.0150898 137.9159
0.0203592 182.105
0.0200798 182.6685
0.0201197 183.1695
Regressão Linear
Os meus resíduos são heterocedásticos, e agora?
MÉTODO DOS MINÍMOS QUADRADOS PONDERADOS

Regressão Linear Ponderada
“ In practice the weighted and unweighted regression lines derived

from a set of calibration data have similar slopes and intercepts
even if the scatter of the points about the line is substancial... But
we do not employ regression calculations simply to determine the
slope and intercept of the calibration plot and the concetrations of
the samples. There is also a need to obtain estimates, and it is here
that the weighted regression method provides much more realistic
results.”
Regressão Linear Ponderada
Ordinário 200
Ponderado
200 180
160
150 140
120
100
100
80
y = 9038.7x + 0.1202 60 y= 9048,6x - 0,00701
50
R² = 0.9998 40 R2= 0,9998
20
0 0
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025
2.00 2.00
1.50 1.50
1.00 1.00
0.50 0.50
0.00
0.00
-0.50 0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03
-0.50 0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03
-1.00
-1.00
-1.50
-1.50 -2.00
-2.00 -2.50
-2.50 -3.00
Variável X 1
-3.50
Seletividade
Seletividade e Especificidade
Habilidade em avaliar de forma inequívoca o analito (substância em exame) na presença de componentes

que podem estar presentes na amostra.
• Outros ingredientes ativos

• Impurezas
• Produtos de degradação
• Componentes da matriz
Parâmetro critico de qualquer método

Alguns procedimentos analíticos não são suficientemente específicos para a finalidade a que se destinam
Teor por titulação

Teor de enantiômero por método aquiral
Identificação por absorbância no UV
Combinação de dois ou mais procedimentos analíticos é recomendada para se conseguir a

especificidade apropriada.
Na seletividade é avaliada a ausência de evidência de interferentes
Avaliação dos cromatogramas;
Resolução;
Pureza de pico
Rs= Resolução A = Comparação de áreas

No caso de separação incompleta, é aconselhável o cálculo da razão entre o pico e o vale:
20 ,0
mAU
15 ,0
a
10 ,0
b
5 ,0
m in
0 ,0
24,00 25,00 26,00 27,00 28,00
(p/v = a/b)
• Teste de pureza de pico
– Mostrar que o pico cromatográfico da substância em análise não é atribuído a mais de um

componente.
– Analíses subsequentes utilizando outras técnicas: diode array, espectrometria de massa,

sistema cromatográfico diferente,etc.
Pureza de Pico - DAD
Dependente de uma diferença significativa entre os espectros das substâncias;
Boa ferramenta para o desenvolvimento do método, limitada para a avaliação de coeluições.

Pureza de Pico - DAD
Coeluição de uma Coeluição de uma

Espectro do ativo e mistura contendo mistura contendo
da impureza. cerca de 10% da cerca de 0,5% da
impureza impureza
Coeluição por LC-MS
Relative Abundance
275.8
100
Relative Abundance
275.8 95
100
95 90
90 85
85 80
80 75
75 70
70 65
65 60
60 55
55 50
50 45
45 40
40 35
30
295.6
35
295.6 25
30
25 20
20 15
15 10
276.5
10 5 246.3 266.4 374.3
m/z
276.8 325.0 0
5 246.5 266.4 374.2 m/z 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
0
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
Relative Abundance
Relative Abundance
324.9 275.9
100
100
95
95
90
90
85
85
80
80
75
75
70
70
65
65
60
60
55
55
50
50
45
45
40
40
35
35
30
30 295.6
25
25
297.0 20
20
275.6 15
15
278.8 10
10
252.1259.6 291.6 316.9 5 246.4 m/z
5 213.9 m/z 266.1 374.3
0
0 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
UV chromatogram 240 nm
Mass chromatogram m/z 325

106
15.2 15.4 15.6 15.8 16.0 16.2 16.4 16.6 16.8 17.0 17.2 17.4 17.6 17.8 18.0
Para Impurezas
Contaminação do produto em análise ou ingrediente ativo com níveis apropriados das impurezas
(conforme limite máximo da especificação ou níveis normalmente encontrados);
No caso de impurezas ou produtos de degradação desconhecidos ou não disponíveis, deve-se

analisar uma amostra do produto com as impurezas ou produtos de degradação e compará-la com
um segundo método bem caracterizado (farmacopêico ou outro método validado);
Realizar estudo de degradação forçada.

Recomendações Gerais
O estudo deve ser realizado nas seguintes amostras:
• Placebo
• Produto
• Fármaco isolado
• Em associações em dose fixa, nos fármacos associados e na formulação
O alvo de degradação deve ser de 10 a 20%;
Isentos
Métodos de desempenho
Métodos não cromatográficos

Critérios de Aceitação
Diluente não deve apresentar nenhum pico detectável nos tempos de retenção das impurezas
Impurezas conhecidas devem estar separadas entre si e do pico principal (Resolução ≥ 1,5)
Produtos de degradação devem estar separados do pico principal (Resolução ≥ 1,5)
Pureza de pico do pico principal, impurezas e produtos de degradação deve ser atendida.
Robustez
Robustez
“A ROBUSTEZ DE UM PROCEDIMENTO ANALITICO É UMA MEDIDA DA CAPACIDADE DO

MÉTODO NÃO SER AFETADO POR PEQUENAS, MAS DELIBERADAS VARIAÇÕES NOS
PARÂMETROS DE UM MÉTODO E FORNECER UMA INDICAÇÃO DA SUA CONFIABILIDADE
DURANTE O USO DE ROTINA”
Robustez
Evitar problemas de estudos entre laboratórios;

Identificar fatores responsáveis
ROBUSTEZ
Robustez
Desenvolvimento do método Robustez Validação

Robustez
Qual método é robusto?
MÉTODO 02
MÉTODO 01 •Analisar preferencialmente no período da manhã no
•Fase móvel A: Tampão fosfato pH 3,0 sistema 7
•Fluxo: 1,0 mL/min •Fase móvel A: Tampão fosfato pH 3,0 ± 0,001
•Temperatura coluna: 30ºC •Fluxo: 1,0 ± 0,001 mL/min
•Temperatura coluna: 30ºC
Robustez
Desenvolvendo um método robusto
Conceitos de Quality by Design

Condição de análise
Identificação dos fatores Definição do level Definição das respostas
Seleção do desenho experimental
Execução dos experimentos
Determinação das respostas
Aspectos quantitativos Paramêtros de SST
Calcular os efeitos
Tirar as conclusões+ adotar medidas
preventivas e determinar limites SST
Interpretação gráfica ou estatística

Robustez na Verificação do Método
Seleção de Fatores
Continuo Qualitativo (discreto) Fatores de mistura

• Estabilidade da solução • Compatibilidade de filtros • Composição da fase móvel
• Tempo de extração • Diferentes lotes ou fabricantes
• Variação do pH da solução de solventes
• pH da fase móvel • Diferentes lotes ou fabricantes
• Composição da fase móvel de coluna
•Temperatura
• Fluxo
•Velocidade do gás de arraste
Robustez na Verificação do Método
Seleção dos níveis dos fatores
• Normalmente simetricamente em torno do nível nominal
• O intervalo representa os limites que se espera variar quando um método é transferido
Desenvolvimento: Limites maiores Validação: Limites mais restritos

ROTINA
• Precisão e incerteza
pH ± 0,02
Variações entre
instrumentos e laboratório
pH±k x 0,02
Multiplicar a incerteza pelo quociente k

>= 3, normalmente 5
Robustez
Seleção do Desenho Experimental
Vantagens do DoE
• Tempo e recursos
• Habilidade de detectar interações
Dificuldade
• Interpretação comparado ao OFAT
Planejamento
Plackett-
OFAT Youden Fatorial completo
Burman
ou fracionado
Robustez
Numero de fatores (n)= 5, avaliados em dois níveis
OFAT Fatorial completo Fatorial fracionado
3 X n = 15 2n = 32 2n-1 ≥ 8
• OFAT
•Screening
•Otimização
• Robustez
Robustez
Execução dos Experimentos
• Consome tempo
• Fazer certo na primeira vez
• Atenção para ajuste dos parâmetros corretamente

Robustez
Análise e Interpretação dos Resultados
Escolher a resposta mais adequada

•Quantitativo: Critérios de Exatidão
•Qualitativo: Interferência na resposta
•Atender SST
Análise estatística e gráfica pode ser usada para

auxiliar na interpretação
Estudo de Caso de Avaliação de Robustez
Desenvolvimento de Método de Perfil de Dissolução
Surfactant Heated
Wavelenght Plastic vs Glass
pH testing time calibration
Analyst Time for sampling
Buffer prep
Standard Stability
Ionic strengh
Timer
Buffer Capacity Day Standard Prep
pH Temperature for
pH testing Sodium Lauril Sulfate Vendor
pH drift during test pH electrode
Lighting
Surfactant Conc design
pH meter Sodium Lauril Sulfate Quality
HCl vs Phosphoric calibration
Dissolution
Amt HCl Remaining on Basket vs Paddle (Aparatus)
Corrections for aliquot Vessel position
Lot Filter Type Disso Unit Vendor
Sampling time RPM
Filter compatibility
Basket Mesh Size
Strenght Sample prep Time
Temperature
Filter absorption
Filtrate clarity Basket Vendor
Age Sample location & depth Bubbles on Basket
Manual vs autosampling Basket Connection
Staggering Sampling Standard Prep
Objective Potencial
Material Equipament Failure mode Potential effect Control S P
P D
D RPN
RPN
/Function cause
High variability Evaluation

Compariss
dissolution of diferent
on
Criteria
Notused Wrong conclusions
Hidrodinamic
Removal ofand data
data; rotation
between
Dissolution toevaluated
select the Wrong
and selection
conclusion
of a
homogenization
dissolved gase inof Reduction
Change inof speed
aerated
Rotation
mediaspeed Dissolutor bestduring caused by aparattus
rotation dissolution condition 33 31 21 18
3
release
the dissolution stagnant layer during
and
deaeration speed
methodnot that do artefact
not predict the
medium
media kinetics and
wich affect method
deaerated
adequate in vivo hidrodinamic
development
mechanism
dissolution developme
dissolution
kinetic nt
condition
20
15
Threshold (RPN = 12)

RPN
10
0
Factors
pH ee
d us e
io
n
l te
r
es
h i ty
ti o
n
gh
t
tch ts
r at lu
m
at Fi ac n a oin
sp a o r tm p er
a e b p
n p v
ep
a
ske rc
a
ea str pl
e g
at
io Ap ia pr a e d ic l in
t ed d B ff
ia Io
n
sa
m p
Ro n
m ar Bu ed ce Sa
m
tio a nd m e n
ol
u St tio
n
fe
r
i ss olu Re
D ss
Di
In vivo data Deconvolution
kel = 0,264
= !
Model Equation Parameters R2

) α = 1.8365
Weibull = "#$ % &1 ' (
* + 0.9080
β = 1.1987
First Order (-. ∙ k1= 1.3519 0.9214

= 100 % ,1 ' 0
Higuchi .3 kH= 47.2892 0.7846

= 1 ∙
*45∙678 9 : α = 0.1066
Logistic = % 0.9710
"#$
1 *45∙678 9 : β = 4.2910
α = 0.2828
Gompetz (*∙ ;)∙<=> 9?: 0.9553
= "#$ ∙
β = 5.6344
Screening study – Factorial Design
Level
Factors
-1 1
RotationSpeed( @) 50 rpm 100 rpm
pH ( A) 2.0 6.8
Media volume( B) 500 mL 900 mL
Apparatus( C) Paddle Basket

Factorial Screen Design
Total of 16 experiments with 3 repetitions
Rotation speed Volume 0.25 h 4h R2 α β
Apparatus, x1 pH, x3
(rpm), x2 (mL), x4 @ A B D 3
Paddle 100 2.0 900 51.02 87.64 0.969 0.78 1.99

Basket 100 2.0 500 51.81 96.03 0.975 0.92 2.25
Paddle 100 6.8 500 47.13 80.66 0.951 0.53 1.84
Basket 100 6.8 500 49.38 89.78 0.959 0.61 2.03
Paddle 50 2.0 900 47.08 86.57 0.957 0.53 2.00
Paddle 50 2.0 500 47.07 92.49 0.965 0.63 2.15
Basket 50 2.0 900 43.02 90.69 0.975 0.69 2.30
Basket 50 6.8 900 37.72 82.08 0.962 0.40 2.19
Basket 50 2.0 500 44.38 97.16 0.979 0.65 2.31
Paddle 50 6.8 500 42.80 76.63 0.962 0.54 1.89
Paddle 100 2.0 500 52.58 89.77 0.970 0.81 1.95
Paddle 100 6.8 900 56.64 94.09 0.952 0.72 1.95
Basket 50 6.8 500 32.80 84.29 0.964 0.25 2.35
Basket 100 2.0 900 52.13 94.99 0.973 0.98 2.26
Paddle 50 6.8 900 43.65 80.13 0.962 0.63 1.97
Basket 100 6.8 900 54.35 97.88 0.960 0.79 2.19
Optimization Study – Response Surface Model
FCC
• + 8 experiments with 3 repetitions

• Model the factors
• Find the best dissolution condition based on desiribility criteria
Factors Level
-1 0 1
Rotationspeed ( @ ) 50 75 100
pH ( A ) 2.0 4.4 6.8
Volume ( B ) 500 700 900
Response y4 (α parameter of logistic model)
= 0.76 0.14 ' 0.15 0.066 0.031 ' 0.076 A
D @ A B @ A B
Normal Plot of Residuals
99
95
90
80
70
50
1.020
30
20
10 0.873
5
1 0.725
Alfa
0.578
-2.67 -1.49 -0.31 0.86 2.04
0.430
Residuals vs. Predicted
3.00
6.80
100
5.60
1.50 88
4.40 75
0.00
pH 3.20 63
Rotation Speed (rpm)
2.00 50
-1.50
-3.00
0.29 0.47 0.65 0.83 1.00

Selection of Dissolution Condition
• Second approach: Maximum Difference Accepted
• Acceptable difference of +/- 5% at each sampling time
• Only the extended release phase – Overlay Plot
120
100
Fraction Absorbed(%)
80 Lower Acceptable
Difference
60
Higher Acceptable
40 Difference
Mean Deconvoluted
20 data
0
0 1 2 3 4 5 6
Time (h)
Volume of 500 mL Volume of 700 mL Volume of 900 mL
6.80
1: 58
1: 58
5.60
1: 68.3
4.40 1,5: 71 4: 95
1,5: 71
2: 78.6 2: 78.6
2: 78.6
3.20
4: 95 1,5: 71
4: 95 1,5: 71 3: 90
3: 90 3: 90
2.00
50 63 75 88 10050 63 75 88 100
50 63 75 88 100
X1: A: Rotation Speed (rpm) X1: A: Rotation Speed (rpm) X1: A: Rotation Speed (rpm)
X2: B: pH X2: B: pH X2: B: pH
Dissolution condition
Apparatus: Basket
Rotation speed: 50 rpm
Volume: 500 mL
Medium: HCl 0,01 M
Optimization and Model Validity
Response Predicted Response Observed Response Residual (absolute error)
y1 42.80 (± 3.11) 44.38 3.6
y2 98.79 (2.52) 97.16 1.7
y3 0.977 (0.004) 0.979 -0.2
y4 0.650 (0.067) 0.653 -0.6
y5 2.420 (± 0.076) 2.31 4.8
DÚVIDAS?
Email: renato.souza@brainfarma.ind.br ou renatosou@gmail.com

Modulo 04 - VAlidaç o de Métodos PDF

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Precisão e Exatidão

O que vamos ver?

•Conceito de distribuição normal

“Conjunto de métodos especialmente apropriados à coleta, à apresentação (organização, resumo e

descrição), à análise e á interpretação de dados de observação, tendo como objetivo a compreensão de

uma realidade específica para a tomada de decisão”

Dados qualitativos Dados qualitativos Dados quantitativos Dados quantitativos

Sexo, raça Estatura: Baixo, médio, Contagem: nº filhos, Temperatura

Variáveis atributos Variáveis Contínuas

Dados brutos não organizados: Não foram numericamente organizados

Analista 1 Analista 1 Analista 1 Analista 2 Analista 2 Analista 2

1 98,51 99,01 98,99 98,97 98,56 98,89

Medidas resumo para análise de dados:

Tamanho da amostra (n), média (y) e desvio padrão (s)

Inferência sobre o todo a partir dos

Medida de Tendência Central

A média dos primeiros cinco valores da tabela

y= (y1+y2+ ... + yn)/n = (103,08+100,96+104,13+100,8+98,2)/5 = 101,59

98,2 100,8 100,96 103,8 104,13

98,2 100,8 100,96 103,8 1100

A média seria igual a 300,75 enquanto a mediana não mudaria:

98,2 100,8 100,96 103,8 1100

Observação: A mediana é uma medida robusta, não influenciada pela presença de

Na amostra com 5 valores

Medida de variação relativa, calculada como:

Qual a proximidade dessa média com

Comparação por Intervalo de Confiança

Histograma de15000 registros de absorbância

Objetivos Teoria, Hipóteses

Objetivos Teoria, Hipóteses

Histograma e Boxplot de Teor de Pirulo

O extremo da barra é determinado pelo O extremo da barra é determinado pelo

Desvio Padrão ou Coeficiente de Variância

Grau de variação de resultados de

•Nove determinações no intervalo linear

•Seis réplicas a 100% da concentração do teste individualmente preparadas

•Critério de aceitação: ???

• Igual precisão, mas com outro operador e dia diferente;

•Proximidade dos resultados = ????

RSD de mais de mil injeções de precisão de

Porque aceita RSD de 2% para

O método é preciso para a quantificação de pirulo?

Sistema de medição com RSD = 2%

Histograma de Teor com RSD de 2

Sistema de medição com RSD = 10%

70% Reprovação em S2 80 85% Reprovação em S1

Sistema de medição com RSD = 5%

Histograma de Produtos de Degradação (DPR 5%)

O método tem capacidade apropriada? (Quando a variabilidade da medição é comparada com a

• Precisão sobre tolerância:

Se %P/T < 10% e %RR < 10% Ótimo!

Se %P/T > 30% ou %RR > 30% Não Ok

Média analista 1= 100,47 Desvio padrão analista 1= 0,97

% P/T= 6 x 0,97 x 100/ (105-95)= 58%

% P/T= 6 x 0,97 x 100/ (110-90)= 29%

Nunca ajustar especificação para

Resultados Estatística descritiva

Objetivos Teoria, Hipóteses

Nível de confiança de 95% Amostragem

Objetivos Teoria, Hipóteses

Então qual critério de aceitação adotar?

Avaliar a diferença absoluta entre as médias

A diferença tem impacto na avaliação da qualidade do produto em estudo?