Medios de cultivo

Un gran desarrollo en la microbiología se ha logrado luego del aislamiento y cultivo de los

microorganismos en el laboratorio. Esto se logró a partir de su siembra en los llamados medios
de cultivo: conjunto de nutrientes que permiten el desarrollo de microorganismos particulares.
Todos contienen agua y fuentes de energía, C, N, S, Fe, P, etc., micronutrientes, factores de
crecimiento y aditivos como colorantes, antibióticos, sales, etc. Para el desarrollo microbiano
es necesario tener en cuenta además de los nutrientes, las llamadas condiciones de cultivo: el
pH, presión osmótica, temperatura de incubación, nivel de oxígeno, etc. a niveles adecuados,
sin las cuales el microorganismo no se desarrollará o lo hará mal.

MEDIOS DE CULTIVO QUÍMICAMENTE DEFINIDOS

Para favorecer el crecimiento microbiano un medio debe proporcionar una fuente de energía,
así como fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y cualquier otro factor de crecimiento
que el organismo no pueda sintetizar. Un medio químicamente definido es uno del que se
conoce la composición química exacta. En el caso de un organismo quimioheterótro- fo, el
medio químicamente definido debe contener factores de crecimiento orgánicos que actúen
como fuente de carbono y energía se incluye glucosa en el medio para favorecer el crecimiento
de la bacteria quimioeterógrafa E. cali. para cultivar especies de Neisseria deben agregarse
muchos factores de crecimiento orgánicos al medio químicamente definido utilizado. Los
organismos que requieren varios factores de crecimiento se describen como “microorganismos
con requerimientos especiales de crecimiento”. Los organismos de este tipo, como
Lactobacillus, algunas veces se utilizan en pruebas que determinan la concentración de una
vitamina en una sustancia particular. Para llevar a cabo este ensayo microbiológico se prepara
un medio de crecimiento que contenga todos los requerimientos necesarios para el desarrollo
de la bacteria excepto la vitamina que se va a evaluar. Luego se combinan el medio, la
sustancia de prueba y la bacteria y se mide el crecimiento de bacterias. Este crecimiento
bacteriano, que se refleja en la cantidad de ácido láctico producido, será proporcional a la
cantidad de vitamina presente en la sustancia de prueba. Cuanto más ácido láctico se haya
producido más células de Lactobacillus habrán podido crecer, de modo que la cantidad de
vitamina será mayor.

MEDIOS COMPLEJOS

Los medios químicamente definidos suelen reservarse para el trabajo experimental del
laboratorio o para el crecimiento de bacterias autótrofas. Casi todas las bacterias heterótrofas
y los hongos, como aquellos con los que se trabaja en un curso de introducción al laboratorio,
se cultivan de modo sistemático en medios complejos, compuestos por nutrientes como
extractos de levaduras, carne o plantas o digeridos de proteínas de estas y otras fuentes. Entre
los diferentes lotes del medio puede haber leves variaciones de la composición química. En los
medios complejos los requerimientos de energía, carbono, nitrógeno y azufre de los
microorganismos son aportados sobre todo por las proteínas. Las proteínas son moléculas
grandes y relativamente insolubles que sólo la minoría de los microorganismos pueden utilizar
de forma directa, si bien una digestión parcial por ácidos o enzimas las reducen a cadenas más
cortas de aminoácidos denominadas peptonas. La mayoría de las bacterias pueden digerir
estos fragmentos pequeños y solubles. Los extractos de carne o de levadura le proporcionan al
medio las vitaminas y otros factores de crecimiento orgánicos. Las vitaminas y los minerales
solubles provenientes de los carnés o las levaduras se disuelven en el agua de extracción, que
luego se evapora de modo que se produce una concentración de estos factores; estos
extractos también proporcionan nitrógeno orgánico y compuestos de carbono. Los extractos
de levadura tienen contenidos particularmente elevados de vita- minas del complejo B. Si un
medio complejo se halla en una forma líquida se denomina caldo nutritivo. Cuando se agrega
agar se denomina agar nutritivo. (Esta terminología puede generar confusiones; recuérdese
que el agar propiamente dicho no es un nutriente.)

CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO

En ocasiones es necesario utilizar un cultivo de enriquecimiento porque las bacterias presentes

en pequeña cantidad pueden no detectarse, en especial si hay otras bacterias presentes en
cantidades mucho mayores. Esto sucede con frecuencia en muestras de suelo o materia fecal.
El medio (medio de enriquecimiento) para un cultivo de enriquecimiento suele ser líquido y
proporciona nutrientes y condiciones ambientales que favorecen el desarrollo de un microbio
particular pero no de otros. En este sentido también es un medio selectivo, pero está
destinado a aumentar las cantidades muy pequeñas del microorganismo deseado hasta niveles
detectables. Supóngase que se desea aislar de una muestra de suelo un microorganismo que
puede crecer en presencia de fenol y que se encuentra presente en cantidades mucho más
pequeñas que otras especies. Si la muestra de suelo se coloca en un medio de enriquecimiento
líquido en el que el fenol es la única fuente de carbono y energía, los microorganismos que no
puedan metabolizar el fenol no se desarrollarán. El medio de cultivo se incuba durante algunos
días y luego se transfiere una alícuota pequeña a otro recipiente con el mismo medio. Tras una
serie de pasajes la población sobreviviente estará constituida por bacterias capaces de
metabolizar el fenol. Entre estos pasajes se deja transcurrir cierto tiempo para que las
bacterias se desarrollen en el medio; este es el estadio de enriquecimiento. Los nutrientes del
inoculo original se diluyen rápidamente con los sucesivos pasajes. Cuando la última dilución se
siembre en un medio sólido de la misma composición sólo se desarrollarán colonias de
microorganismos capaces de utilizar el fenol. Un aspecto destacable de esta técnica particular
es que el fenol resulta letal para la mayoría de las bacterias.

OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

La mayoría de los materiales infecciosos, como por ejemplo pus, esputo y orina, contienen
varias clases diferentes de bacterias, lo que también sucede con las muestras de suelo, agua o
alimento. Si estos materiales se siembran en una placa en la superficie de un medio sólido se
formarán colonias que serán copias exactas del microorganismo original. En teoría una colonia
visible se origina en una única espora o célula vegetativa o en un grupo de los mismos
microorganismos adherí- dos entre sí en agregados o cadenas. Las colonias microbianas a
menudo tienen un aspecto distintivo que distingue los microorganismos entre sí. Las bacterias
deben distribuirse de un modo lo bastante amplio como para que las colonias estén
visiblemente separadas entre sí. La mayor parte de los trabajos bacteriológicos requieren
cultivos puros, o clones, de bacterias. El método de aislamiento empleado con más frecuencia
para obtener cultivos puros es el método de siembra por estría en placa. Se introduce un ansa
de inoculación estéril en un cultivo mixto que contenga más de un tipo de microbio y se lo
distribuye en forma estriada sobre la superficie del medio nutritivo; las bacterias se
desprenden del ansa y pasan al medio. Las últimas células que se desprenden del ansa están
bastante separadas como para crecer en colonias aisladas. Estas colonias pueden tomarse con
un arisa de inoculación y sembrarse en un tubo de ensayo que contenga el medio nutritivo
para formar un cultivo puro de un solo tipo de bacteria. El método de siembra por estría en
placa funciona bien cuando el microorganismo que se desea aislar está presente en grandes
cantidades en relación con la población total. En cambio, cuando el microorganismo que se
desea aislar está presente sólo en cantidades muy pequeñas estas deben incrementarse
mediante el empleo de un enriquecimiento selectivo antes de que se lo pueda aislar con el
método de siembra por estría en placa. Los microorganismos pueden reconstituirse en
cualquier momento mediante la hidratación con un medio nutritivo líquido adecuado.

CONSERVACIÓN DE CULTIVOS BACTERIANOS

La refrigeración puede utilizarse para la conservación de los cultivos bacterianos durante un

corto plazo. Dos métodos comunes para preservar los cultivos microbianos durante períodos
prolongados son la ultra congelación y la liofilización. La ultra congelación es un proceso por el
cual se coloca un cultivo puro de microbios suspendido en un líquido y se congela rápidamente
a temperaturas que varían de -50 a “95 °C. El cultivo puede descongelarse y cultivarse incluso
varios años después. Durante la liofilización (congelación- desecación), la suspensión de
microbios se congela rápidamente a temperaturas que varían de -54 a -12 °C y el agua, se
elimina por vacío elevado (sublimación). Mientras se produce el vacío el recipiente se sella
fundiendo el vidrio con un soplete a alta temperatura. El residuo pulverulento que contiene los
microbios sobrevivientes puede guardarse durante años.

Crecimiento DE Cultivos BACTERIANOS

La capacidad de representar de modo gráfico las poblaciones enormes que se producen como
resultado del crecimiento de los cultivos bacterianos es una parte esencial de la microbiología.
También es necesario ser capaz de determinar las cantidades de microorganismos, sea de
modo directo, mediante su recuento o de modo indirecto, mediante la medición de su
actividad metabólica.

Coger el asa por el cabo, en forma similar, a cuando tomamos el lápiz para escribir.

Introduzca el asa de alambre de platino o nicrón directamente en la zona de color azul de la

llama del mechero, hasta que se ponga al rojo vivo. Seguidamente, proceda a introducir
lentamente el resto del alambre para lograr el mismo efecto.

Retire el instrumento de la llama y espere de 4 a 5 segundos con el objetivo de que el asa se

enfríe.

Con el asa estéril y fría tome el volumen o fragmento de la muestra que será sembrado y
trasládelo de inmediato para el medio del cultivo seleccionado.
Si la siembra se fuera a producir en un medio solidificado en forma de cuña en tubo de ensayo,
proceda del siguiente modo:

Con la mano opuesta a la que sujeta el asa, tome el tubo por l porción inferior.

Con el dedo meñique de la mano que sostiene el asa, retire del tubo el tapón de algodón o la
tapa de rosca y reténgala(no colocar el tapón o la tapa sobre la mesa de trabajo)

Flamee de inmediato la boca del tubo de ensayo, pasándola una o dos veces por la llama del
mechero, con el objetivo de eliminar por incineración, los microorganismos contaminantes que
se encuentran en esa zona, por la parte externa del tubo. Esta acción calórica, provoca además
una convección del movimiento del oxígeno presente en el interior del tubo hacia afuera,
debido a la desigualdad de calor, lo cual favorece que decrezca el riesgo de contaminación.

Introduzca el asa con el volumen o fracción de la muestra en el tubo, hasta el fondo de la cuña.
A partir de este momento, la siembra puede realizarse de diferentes maneras, en dependencia
del tipo de microorganismo que pretendemos que se desarrolle en ese medio de cultivo:

Deslizando el asa, desde el fondo hacia arriba, por toda la superficie de la cuña, trazando una
línea longitudinal.
Deslizando el asa por la superficie de la cuña desde el fondo hacia arriba, imprimiéndole un
movimiento de zigzag.

Motiando toda la superficie de la cuña con hisopo.

Efectuando cualquiera de las tres variantes explicadas pero adicionalmente roturando el

medio con el asa, haciendo un pequeño corte longitudinal.

Al concluir la siembra se flamea la boca y se taponea nuevamente el tubo procediendo a

esterilizar el asa en las llama del mechero.