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Taller

1. Que es la PCR, quien la inventó y que elementos tuvo encuenta para su


invento.

La PCR es una técnica enzimática in vitro utilizada para amplificar exponencialmente una
región determinada de ADN, situada entre dos regiones de ADN cuya secuencia se conoce
a partir de una mezcla compleja de ácidos nucleicos.

Fue concebida por Dr Kary Mullis a principios de la década de los 80.

2. ¿Qué principios/propiedades básicas del ADN y de la enzima ADN

El elemento principal en la pcr es el ADN cuya naturaleza química ofrece ventajas para su
manipulación.

ADN formado por: azúcar, un grupo fosfato, bases nitrogenados.

ADN polimerasa: se encargan de la cataliisi de la reacción sintetizando las nuevas


cadenas de ADN, que llevan la secuencia blanco de interés. Taq polimerasa.

El ADN polimerasa son enzimas que intervienen en la replicación del ADN, son capaces de
adicionar dNTps a partir de la región 3´de un cebador y copiar una secuencia molde.

Las polimerasas sintetizan el ADN, en l dirección 5´-3´ningun ADN polimerasa conocida es


capaz de comenzar una nueva cadena ella solo puede añadir un nucleótido de un grupo 3-
OH por esta razón la enzima precisa de un cebador que presenta un grupo OH.

La enzima dependerá de factores como:

La fidelidad de la enzima o tasa de erro la velocidad de nucleótidos incorporados por


segundo en la cadena naciente de ADN, la procetividad, la actividad exonucleasa, extremo
del ARN resultante.

3. ¿Qué elementos se requieren para hacer una PCR?

- Polimerasa de un ADN polimerasa resistente al calor (taq polimerasa)


- Un DNA de doble cadena que va hacer amplificado
- Dos oligonucleótidos o primer
- Dexorribonucleotidos ( dmp, dttp, deGtp, dctp)
- Un buffer o amortiguador con mg
- Sales (mgcl2)
- Termociclador
4. Describa las etapas de la PCR

- Fase lag: en los 5-10 primeros ciclos dependiendo de la cantidad de molde inicial
presente en la reacción.
-
- Fase exponencial: en la cual en cada ciclo se duplican los fragmentos producidos
en el ciclo anterior.

- Fase pletau: en la cual no se produce mas amplificación.

5. Que características debe tener un cebador?... haga el diseño de uno de ellos

Cebador: es una secuencia corta de 20 nucleótidos

- Debe tener un grupo hidroxilo en el extremo 3´


- Debe tener una guanina o citosina en el extremo 3
- 18-30 nucleótidos
- Se une al ADN molde de acuerdo a la regla de complementariedad
- El contenido guanina-citosina debe de ser mayor a 45% en los primers es decir
ricos en contenido guanina – citosina.

6. Explique que es el cebador forward y reverse

- Forward: tiene la misma secuencia que se encuentra en las cadenas del AND que
se encuentra en las cadenas del ADN hacia la derecha. Iniciador 5´-3´

- Reverse: lleva la secuencia complementaria que estará al final del fragmento que
se quiera amplificar, hacia la izquierda 3´-5´.
7. Describa lo que le puede suceder a una PCR si hay poco Mg++ en la mezcla de
reacción.

- el mg++ es un cofactor de la DNA polimerasa el cual contribuye a aumentar la T° de


hibridación.

- Cuando hay poro mg++ la polimerasa no funciona correctamente, afectando el


rendimiento de la reacción.

- Por esta parte encontramos que cuando el mg++ se disminuye se aumenta la


especificidad.

- No habrá estímulos para la enzima taq polimerasa para que incorporen dntp por lo
tanto no se podría copiar la cadena del ADN complementaria, se pararía a reacción.

8. Nombre al menos tres enzimas que pueden ser utilizadas para PCR

- Taq polimerasa (thermus aquaticos) 94 KDA EXC 5


- Accu Taq compuesto /exo 3´-5´
- T4 DNA polimerasa
- Klen taq productos grandes /exD 3´-5´ (>5kb)
- Fragmento denow DNA polimerasa ( E. coli) 37° C
- Ampli taq gold
- Pyrococcus fariosus (pfu)/ crece > 100°C

9. Las etapas (ciclos) de la PCR son:

- Iniciación: 94-96°C / 1-9 min / activa proteasas y nucleasas de destrucción.


Iniciación 94°C, 7-10 min, destrucción de algunas enzimas DNasas nucleasas

- Desnaturalización: se desnaturaliza el DNA se reparan las 2 hebras de las cuales


esta constituido para ello se realiza una incubación de la muestra a altas T°.

- Hibridación: de los cebadores a la zona 3´específica de cada una de las hebras,


en este paso se producirá la hibridación del cebador es decir el cebador, se unirá a
su secuencia complementaria en el ADN, molde para esto es necesario que la T°
descienda 45°C - 65°C.

- Extensión de la cadena: del cebador por actuación del ADN polimerasa, por ultimo
actúa la ADN, polimerasa tomando, el DNA molde para sintetizar la cadena
complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial, necesario para la
síntesis de nuevo ADN.

- Elongación final: se terminan de amplificar las cadenas cuando terminan los 30


ciclos, hasta el agotamiento de la enzima.

- Conservación: 4°C, tiempo indefinido / volumen 15-100 ul para observar la


muestra.
10. ¿Qué es el termociclador?

Es un aparato que realiza los ciclos en los tiempos y T° programadas de forma exacta, es
un aparato usado en biología molecular que permite realizar los ciclos de T° necesarios
para una PCR, de amplificación de ADN.

11. En que consiste el control negativo de una PCR, y cuál es su importancia.

Se utiliza un tubo extra al que se le agregaran todos los reactivos utilizados en PCR,
excepto ADN, si en esta muestra hay amplificación significa que en algún reactivo
hay restos de ADN a de productos de la PCR, que está contaminada.

12. Enuncie tres aplicaciones de la PCR

- Muta génesis dirigido


- Diagnóstico de enfermedades genéticas
- Detección de microorganismos infecciosos
- Medicina forense
- Secuenciación del AN
- Estudios evolutivos

13. Ejercicio: si se inicia una PCR con dos hebras dobles, diga cuantas moléculas
de ADN se obtendrán al cabo del quinto ciclo.
10
2 x 10 = 1024 x 2 = 2048 moleculas de ADN
10
2X 2 = 2048 HEBRAS

14. Busque un artículo o una noticia reciente en la que se emplee la PCR y haga
un resumen del mismo.

La PCR nos ha hecho la vida más fácil y segura.


Gracias a ella podemos saber si el agua que sale por
el grifo está contaminada, si la hamburguesa lleva
carne de caballo, quién fue el culpable de un
asesinato, qué antibiótico será más efectivo para
tratar una infección, si una enfermedad es vírica o
bacteriana o si la verdura que vende tal
supermercado no es apta para el consumo por la
presencia de microorganismos patógenos.

Toda esta batería de aplicaciones se derivan de lo


único que hace una PCR: hacer copias de una
secuencia de ADN que, simplificando, es la molécula
que codifica todas las instrucciones para fabricar un
organismo. Gracias a la PCR podemos aumentar a
voluntad un fragmento concreto del ADN que
contiene una muestra.