1. LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS.

2. Práctica: SEPARACION DE GRUPOS USANDO

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSION

3. Alumno: CHAVEZ GARCIA BRANDON AXEL

4. Colaboradores: CRUZ RICO ADRIANA

5. Grupo: 5QV1

6. Sección: l
7. Profesor: ARTURO RIVAS FARIAS

8. Fechas de realización: 16 y 18 de mayo de 2018.

9. Fecha de entrega: 28 de mayo de 2018.

10. Situación escolar: INSCRITO

Nombre de la Práctica:
Separación de grupos usando cromatografía por exclusión
Objetivos extra: no hay
DATOS EXPERIMENTALES

TABLA 1. Determinación del volumen vacío (Vo) de la columna

Volumen de elución A615 A615
(mL) corregida
3 0 0.004
6 -0.001 0.003
9 -0.002 0.002
12 -0.003 0.001
15 -0.004 0
18 0.496 0.5
21 0.89 0.894
24 0.16 0.164
27 0.032 0.036
30 0.011 0.015
33 0.006 0.01
36 0.001 0.005
39 0 0.004
42 -0.001 0.003
45 -0.001 0.003

1
0.9
0.8
0.7
0.6
A 615

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 10 20 30 40 50
Volumen de elución (mL)
 Figura 1. Perfil de elución de la dextrana azul 2000 que presenta a una absorbancia de
615nm

Tabla 2. Separación del sulfato de amonio y la albumina

Volumen de elucion A280 A280 Masa del Masa del tubo con (NH4)2SO4
(mL) (corregida) tubo vacio pp seco (g)
3 0.017 0
6 0.005 -0.012
9 0 -0.017
12 0.003 -0.014
15 0.002 -0.015
18 0.235 0.218
21 0.345 0.328
24 0.209 0.192
27 0.089 0.072
30 0.04 0.023
33 0.034 0.017
36 0.04 0.023 7.7943 7.817 17.4
39 0.033 0.016 9.8277 9.855 27.3
42 0.038 0.021 6.2893 6.341 51.7
45 0.037 0.02 8.6087 8.654 45.3
48 0.026 0.009 8.5531 8.579 25.9
51 0.016 -0.001 8.642 8.6515 9.5
54 0.014 -0.003
57 0.011 -0.006
60 0.01 -0.007
63 0.009 -0.008
66 0.008 -0.009
69 0.007 -0.01
72 0.006 -0.011
75 0.011 -0.006
 60 0.4

0.35
50
0.3
40
0.25
A 280

A 280
30 0.2
(NH4)2SO4"
0.15 Albúmina"
20
0.1
10
0.05

0 0
0 5 10 15 20 25 30
Volumen de elución (mL)

Figura 2 Perfil de elución correspondiente a la albumina y sulfato de amonio donde la

albumina esta graficada a 280 nm y por el otro lado los mg de sulfato de amonio.
Cálculos
DISCUSIÓN DE RESULTADOS EXPERIMENTALES
Se efectuó la separación de sulfato de amonio de la proteína de albúmina, se empleó la
cromatografía por exclusión molecular. Para esto se calculo el volumen total de la
columna haciendo uso de la ecuación 𝑉𝑡 = 𝑉𝑜 + 𝑉𝑔 + 𝑉𝑖 lo que nos dio un valor 66.16
ml y teniendo este permite conocer todos los demás que ayudan a visualizar el tamaño de
moléculas que se pueden separar. Vo es el volumen intersticial entre las esferas del gel y
se obtuvo un valor de 21mL ya que es volumen que tarda en eluir la muestra sin
interaccionar con la fase estacionaria. Vg es el volumen del gel hinchado y se obtuvo
12.08 mL y por último Vi que es el ocupado por el regulador en el interior de la estructura
El volumen vacío será el volumen de elución de la fracción que presentó mayor
absorbancia en la que, el cual fue de 21 mL, que tiene una absorbancia de 0.894 a una
longitud de onda de 615 nm, éste dato es de suma importancia ya que marca cuánto
tardan en eluír las moléculas de mayor tamaño al intervalo de fraccionamiento del gel
Ahora bien la razón por la que la Albumina no se retuvo en la fase estacionaria es por su
alto peso molecular, por lo que no va a interaccionar con esta, en caso contrario la sal si
lo hará debido a que tiene un bajo peso molecular por lo que quedara “atrapada” en los
poros de la dextrana haciendo su tiempo de retención más prolongado
Es importante resaltar que la separación por exclusión molecular difiere de los demás
procedimientos cromatográficos por el hecho de que no ocurren interacciones físicas o
químicas entre los analitos y la fase estacionaria. De hecho, estas interacciones se evitan
dado que se obtienen eficiencias menores. También a diferencia de las demás, hay un
limite superior en el tiempo de retención debido a que ninguna especie de analito se
retiene mas que las moléculas pequeñas que son totalmente permeables en la fase
estacionaria que en este caso es nuestra sal.
Conclusiones
1. La albumina fue la primera en ser eluida debido a su alto peso molecular, después
fue eluida la sal que era el sulfato de amonio.

2. Se obtuvo un volumen total es de 66.16 mL.

3. El valor del volumen vacío es de 21 mL.

4. El volumen total es de 66.16 mL.

5. EL volumen interno es 33.08 mL.

6. El volumen del gel es de 12.08 mL.

Bibliografía consultada

 Skoog D.A. et. al. (2015). Principios de análisis instrumental. 5ª edición. Ed. Mc
Grall Hill. España. pp 731, 1028.