ÁREA SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

QUÍMICA ÁREA TECNOLOGÍA AMBIENTAL

GRUPO
QU-301

Practica 2
Preparación de material para su esterilización y medios de cultivo
MATERIA
Microbiología Ambiental
MAESTRO
Luz Helena Mora Maldonado

Fecha: 11 de Junio de 2018

TITULO: Preparación de material para su esterilización y medios de cultivo
OBJETIVO DE LA ACTIVIDAD:
 Conocer los procedimientos para la preparación del material antes de analizar una
muestra de suelo o agua.
INTRODUCCIÓN
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios de condiciones
ambientales y a medida en que se han podido adaptar a estos cambios, se han distribuidos en
una gran diversidad de hábitat incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de las físicas
y químicas.
Se han desarrollado diversos procesos para la desinfección y esterilización para limitar su
presencia o eliminarlos. La esterilización es un método de eliminación total de todo tipo de
organismo, mientras que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas
vegetativas de los organismos.
Las razones principales para controlar los microorganismos son prevenir la transmisión de la
infección y la enfermedad, prevenir la contaminación o proliferación de microorganismos
perjudiciales y prevenir el deterioro o destrucción de materiales por microorganismos.
La esterilización con calor húmedo (vapor de agua) es mucho más rápida y eficaz que el calor
seco debido a que las moléculas de agua desnaturalizan las proteínas de forma irreversible
mediante la rotura de las uniones H entre los grupos peptídicos a temperaturas relativamente
bajas.
Los microorganismos estudiados en el laboratorio por lo regular son heterótrofos, ya que
requieren de compuestos complejos como fuentes de carbono y nitrógeno.
Los microorganismos como otros seres vivos son susceptibles a los cambios de temperatura a
medida que se han podido a adaptar a estos cambios.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar
su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales paradas en el laboratorio.
El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el
crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son:
temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuado, así como un grado correcto
de acidez o alcalinidad.
El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo.
La materia prima que se utiliza para estos medios son:
PEPTONAS.- son moléculas que se obtienen de la degradación de las proteínas de origen
vegetal o animal las que presentan una fuente de nitrógeno en forma de proteínas digeridas
que son fácilmente asimilables por los microorganismos en crecimiento.
HIDROCARBUROS.- se utilizan como fuente energética y permite ver reacciones del
metabolismo de los microorganismos (bioquímicas).
SALES.- como el cloruro de sodio, mantiene la isotonicidad y forma soluciones amortiguadoras
(mantiene el equilibrio osmótico).
AGAR.- es un polisacárido obtenido de las algas rodofíceas y proporciona un soporte al medio
de cultivo ya que es una agente solidificante.
CALDO NUTRITIVO O BASE.- Es un medio básico a partir del cual se preparan otros muchos
e importantes medios, es un caldo elaborado con extracto de carne, contiene además
substancias extractivas solubles, sales y algo de carbohidratos (dextrosa); pero poca proteína,
la peptona que se agrega satisface la cantidad de proteínas necesarias, la sal que se añade es
para dar al caldo el mismo contenido aproximado que tiene la sangre. A este medio se le puede
agregar sangre entera estéril la que enriquece al medio.
FUNDAMENTO
Al aplicar a un determinado material vapor de agua a una presión de 15 lb (121ºC) por 15
minutos, se produce la destrucción total de los microorganismos viables presentes en el mismo.
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los
microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar,
porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay microorganismos muy
poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy
exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.

MATERIAL (LIMPIO)
Ø Maskin tape y Marcador permanente Sharpe (punto fino)
Ø Cerillos ó encendedor
Ø Papel aluminio
Ø Papel estraza 10 pliegos.
Ø 1 paquete de algodón
Ø 10 gasas
Ø Franela
Ø Cinta testigo (control de esterilización)
Ø 9 Tubos de ensayo de 16 x 150 mm.
Ø 6 Cajas Petri
Ø 2 Vidrios de reloj o charolas para pesar polvos.
Ø 1 Probetas de 100 ml.
Ø 1Probeta de 50 ml
Ø 1 Matraz Erlen-Meyer de 250 ml.
Ø 1 matraz Erlen-Meyer de 100 ml
Ø 1 matraz Erlen-Meyer de 50 ml
Ø 2 Pipetas de vidrio de 1 ml.
Ø 4 Pipeta de vidrio de 10 ml.
Ø 1 Pipeta de 5 ml.
Ø Perilla de succión
Ø 1 Mechero Bunsen.
Ø 1 Tela de asbesto.
Ø 1 Baño María
EQUIPO
Autoclave con agua destilada
INCUBADORA
REACTIVOS
Ø Agar bilis rojo violeta deshidratado (Polvo)
Ø Caldo lactosado deshidratado (Polvo)
Ø Agua destilada
PROCEDIMIENTO
Preparación del material para esterilizar
Tubos de vidrio y matraces:
1. Colocar un tapón de algodón –gasa a los 9 tubos de vidrio de 16 x 150 mm. Envolver dos
paquetes (uno con 5 y otro con 2 tubos) con papel estraza y cubiertos con aluminio. Una vez
envueltos colocar cinta testigo. Etiquetar con nombre, fecha y tipo de material.
2. Preparar un matraz de 250 ml con 75 ml de agua destilada. Colocar un tapón de algodón-
gasa, una capucha de aluminio y cinta testigo. Etiquetar con nombre, fecha y tipo de material.
Pipetas
Colocar en la boca de cada pipeta un filtro de algodón con la ayuda de un clip desdoblado. El
algodón no debe quedar ni muy apretado ni muy flojo, para permitir el paso del aire, pero sin
moverse. Flamear con el mechero el algodón que sobresale de la boquilla de la pipeta. Envolver
cada pipeta con papel envoltura. Colocar cinta testigo. Etiquetar para su identificación.
Esterilización
Colocar el material en los contenedores de la autoclave y esterilizar a 15 libras de Presión (121
°C) por 15 minutos. (Por seguridad supervisar todo el proceso de esterilización hasta su
término).
Preparación de medios de cultivo líquidos.
1. Pesar la cantidad correspondiente para preparar 20 ml de medio Caldo lactosado
deshidratado, de acuerdo las especificaciones del frasco contenedor del medio en polvo.
Cálculos:
2. Colocar el medio en polvo en el matraz de 50 ml y disolverlo con 10 ml de agua, pasar a la
probeta de 50 ml y enjuagar el matraz con los 10 ml restantes y adicionarlos a la probeta para
aforar el medio a 20 ml.
3. Regresar el medio de cultivo al matraz de 50 ml y colocar un tapón algodón- gasa.
4. Esterilizar en autoclave a 15 libras de Presión (121 °C) por 15 minutos. (Por seguridad
supervisar todo el proceso de esterilización hasta su término).
5. Una vez esterilizados los medios, dejar enfriar a temperatura ambiente.
6. En zona estéril (utilizando el mechero o campana de flujo laminar) distribuir el caldo nutritivo
con pipeta de 10 ml estéril (10 ml) en 2 tubos de ensayo estériles y taparlos.
Preparación de medios de cultivo sólidos.
(6 cajas de Petri y 2 tubos con medio sólido)
1. Pesar la cantidad correspondiente para preparar 150 ml de medio sólido Agar de métodos
estándar, de acuerdo a las especificaciones del frasco contenedor del medio en polvo.
Cálculos:
2. Colocar el polvo de Agar de Método estándar en el matraz de 250 ml y agregar 50 ml de
agua destilada. Para disolverlo será necesario calentar a baño María por algún tiempo. El
matraz
RESUMEN
Ya esterilizado el material y la mesa se procedió a pesar 0.026 gramos de Caldo lactosado
deshidratado, se vacío en un matraz Erlenmeyer de 50 mL y se le agrego 10 mL de agua
destilada se mezcló y se colocó un rato en el fuego hasta disolverlo y se aforo con otros 10 ml
de agua destilada para obtener nuestros 20 m, con el Agar bilis rojo violeta deshidratado se
pesó de igual manera 6.225 gramos se colocó de igual manera en un matraz Erlenmeyer pero
de 250 mL se le agrego 50 mL de agua destilada para disolverlo mientras se calentaba un poco
y finalmente se aforo con 100 ml para tener 150 mL, se metió al autoclave para que se terminara
de disolver todo y esterilizar, se sacó se dejó enfriar y se vacío en las cajas Petri y tubos, se
dejaron en la incubadora y se procedió a la siembra de las bacterias, usando la salsa, agua de
riego, agua de beber, agua cruda de la planta de tratamiento para el caldo y para el agar se
usaron las mismas pero añadiendo la saliva de uno de los integrantes del equipo.
RESULTADOS Y ANÁLISIS
 Cálculo de Caldo lactosado deshidratado
𝟐. 𝟔 𝒈/𝒍
𝟏𝟑 𝒈 ∗ 𝟎. 𝟐 𝒍 = = 𝟎. 𝟎𝟐𝟔 𝒈 𝒅𝒆 𝑪𝒂𝒍𝒅𝒐 𝒍𝒂𝒄𝒕𝒐𝒔𝒂𝒅𝒐
𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍
 Cálculo de Agar bilis rojo violeta
𝒈
𝟔𝟐𝟐𝟓
𝟏𝟑 𝒈 ∗ 𝟏𝟓𝟎 𝒎𝒍 = 𝒎𝒍 = 𝟔. 𝟐𝟐𝟓 𝒈 𝒅𝒆 𝑨𝒈𝒂𝒓 𝒃𝒊𝒍𝒊𝒔 𝒓𝒐𝒋𝒐 𝒗𝒊𝒐𝒍𝒆𝒕𝒂
𝟏𝟎𝟎𝟎 𝒎𝒍

Fig. 1.1 Caldo Lactosado calentadose para Fig. 1.2 Caldo Lactosado
disolver grumos.
Fig. 1.3 Agar bilis rojo violeta Fig. 1.4 Material esterilizado

Fig. 1.4 Preparación de tubos de cultivo con

caldo lactosado
CONCLUSIONES
En la práctica realizada se pudo observar el crecimiento y desarrollo de varios microorganismos
de cada una de las muestras obtenidas. Se recomienda el correcto manejo de las soluciones
para la preparación de agar y caldo lactosado ya que puede ocurrir la contaminación del mismo
y afectar los resultados, esto como experiencia obtenida al realizar la práctica. Es importante
tener en cuenta la limpieza en el área de trabajo y en los materiales a utilizar cuando se haga
este tipo de práctica, porque puede haber contaminación en el cultivo.
RECOMENDACIONES
Calcular bien las cantidades ya que la primera vez que se hizo se hicieron mal los cálculos, por
lo tanto tuvimos resultados malos y el agar no se gelifico, se quedó en estado líquido.
OBSERVACIONES
Cuando estábamos elaborando la práctica de esterilización notamos que se tiene que tener
mucho cuidado a la hora de colocar el material en el autoclave ya que debe de estar
perfectamente cubierto con el papel estraza para que quede totalmente estéril y libre de
microorganismos y esporas.
Cuando el material salió del autoclave ya no lo podíamos abrir en cualquier lugar porque se
contaminaría otra vez, es por eso que se preparó un área aséptica para evitar posibles
contactos con microorganismos
Para manejar el material estéril es necesario que cada uno de los integrantes del equipo este
completamente desinfectado, por eso hay que lavarse las manos con agua y jabón, colocarse
los guantes esterilizados para poder manejar el material.

REFERENCIAS
Peña, A. M. (10 de Abril de 2012). Cultivos bacteriologicos. Obtenido de Cultivos bacteriologicos:
http://aline-m-e-p.blogspot.com/2012/04/practica-2-preparacion-y-esterilizacion.html

UNAM. (s.f). UNAM. Obtenido de Esterilización y preparación de medio de cultivo :

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/P2.MediosCultivoEsterilizacion_20891.pdf