UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSE DE CALDAS

LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR PRACTICA Nº 2-3 EXTRACCION DE ADN

SANGRE TOTAL Y MANCHAS

PROFESORA: ADIS AYALA FAJARDO

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OBJETIVOS
1. Aislar ADN de glóbulos blancos a partir de sangre total.
2. Extraer ADN de manchas de sangre mediante método chelex.
3. Establecer el fundamento de extracción de ADN mediante el método de chelex.
4. Cuantificar ADN por medio de espectrofotometría ó por curva de fago lambda en electroforesis en
gel de agarosa.

PREPARACIÓN PREVIA
1. Lea el procedimiento de la guía y el fundamento.
2. Consulte el inserto de la proteínas K e imprima.
3. Lea el fundamento y saque una copia del inserto del chelex que ha sido enviada por su profesor.

PRINCIPIO
La sangre total es separada del plasma y es tratada mediante pasos sucesivos de lisis celular con el fin de
romper los glóbulos rojos, eliminar la hemoglobina y así obtener un botón de células blancas. Los
glóbulos blancos son tratados de forma simultánea con una solución buffer de lisis, un detergente y
una proteasa a fin de digerir las proteínas y romper tanto la membrana celular como nuclear para liberar
los ácidos nucleicos ADN, ADN m y ARN. El ADN extraído presente en el sobrenadante es
solubilizado por una sal y precipitado con un alcohol.

MATERIALES
1 Caja de puntas amarillas y azules de 50 μl, 200 μl 1Pkte Algodón (Estudiantes)
y 1000 μl
1 Caja de puntas azules con barrera. 4 Gradillas para tubos de 1.5 ml.
1 Frasco con tubos Eppendorf de 1.5 ml estériles. 4 Tubos corning de 15 ml estériles.
1 Frasco de alcohol antiséptico (Estudiante) 6 Hojas de papel craff (Grupo)
1 Gradilla para tubos de 15 ml. 2 Batas (Estudiantes)
1 Jeringa de 5 ml (Estudiante) 1 Beaker de 250 ml
1 Par de pinzas estériles 1 Beaker de 50 ml
1 Par de tijeras estériles 1 Frasco lavador y churrusco
1 Pkte gasa 1 Par de guantes (Estudiantes)
1 Pkte Toallas secantes 1 Pipeta de 10 ml estéril
1 Frasco de hipoclorito de sodio. (Estudiante) 1 Pipeta de 5 ml estéril

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REACTIVOS EQUIPOS
1 g EDTA 1 Estufa de calentamiento
10 ml Bbuffer T.E 1 Magneto estéril
10 ml Chelex 5 % estéril. 1 Microcentrifuga refrigerada para tubos de 1.5 ml
10 ml de acetato de sodio saturado 1Centrifuga para tubos de 15 ml..
10 ml SDS 5% 1Plancha de agitación
100 ml agua destilada autoclavada 2 Baños de María.
100 ml Solución de lisis de globulos blancos 2 Cámaras de flujo Laminar
100 ml Solución de lisis de globulos rojos 3 Micropipetas 50 μl, 200 μl y 1000 μl
600 μL Proteinasa K 20 mg/ml
Etanol al 70%
Isopropanol

PROCEDIMIENTO
1. Tome 5 ml de sangre y colóquela en un tubo corning estéril de 15 ml con 7 mg de EDTA,
homogenice suavemente y centrifugue 5 min a 3.000 r.p.m.
2. Separe el plasma de las células y guárdelo a −20 ° C en un tubo de 1.5 ml hasta su uso.
3. Adicione 2 volúmenes de solución de lisis de glóbulo rojos al paquete de células, tape el tubo y
homogenice suavemente durante 15 min, deje en reposo a temperatura ambiente por 15 min. Para
manchas corte 1 cm de está con ayuda de pinzas y tijeras estériles y realice el anterior
procedimiento.
4. Centrifugue a 3.000 r.p.m por 5 min.
5. Descarte el sobrenadante por inversión en una solución de hipoclorito de sodio.
6. Repita los pasos 4 al 6 hasta que obtenga el botón de glóbulos blancos lo más limpio posible.
7. Agregue en el siguiente orden: 2 ml de solución de lisis de glóbulos blancos, 100 μl de SDS 10% , 25
μl de proteinasa K 20 mg/ml ó realice el cálculo para obtener una concentración final de 200 μg/ml
8. Agite suavemente por Vortex.
9. Deje las muestras en incubación a 42 º C toda la noche.
10. Pipetee 200 μl de acetato de sodio saturado 3 M pH 7.0 y de un vortex hasta observar espuma.
11. Centrifugue a 3.000 r.p.m. por 5 min
12. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo con ayuda de una pipeta Pasteur estéril ó con ayuda de
una micropipeta con punta de barrera.
13. Adicione lentamente 200 μl de isopropanol y deje en reposo durante 5 min, en éste punto el ADN se
hace visible, hile el ADN hasta observar una maraña.
14. Transfiera con ayuda de micropipeta de 1000 μL a un tubo eppendorf de 1,5 ml nuevo y estéril.
15. Lave con un volumen igual de etanol al 70%, centrifugue a 6.500 r.p.m por 5 min y asegúrese de
que el pellet de ADN se encuentra adherido para no perderlo, elimine el etanol por inversión del tubo
y repita de nuevo el procedimiento
16. Deje evaporar el etanol hasta sequedad en cámara de flujo laminar.
17. Resuspenda el ADN en buffer T.E y colóquelo a 42 º C hasta que resuspenda (no debe ser visible).
18. Cuantifique el ADN determinando la Abs A 260 y 280 y establezca su pureza.

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 19. Calcule la concentración de ADN en μg/μl, y mg/ml obtenida en los 5 ml de sangre total.

EXTRACCIÓN DE ADN A PARTIR DE MANCHAS DE SANGRE

1. Tome 1 ml de H2OMQ en un tubo estéril de 1.5 ml y adicione un fragmento de 0.5 cm de la mancha
de sangre.
2. Incube a temperatura ambiente por 20 min y mezcle ocasionalmente por inversión.
3. Retire el sobrenadante y adicione a otro tubo nuevo.

4. Centrifugue a 12.000 r.p.m. por 3 min.

5. Remueva y descarte el sobrenadante dejando 30 µl, sin remover el pellet y dejándolo lo más limpio
de células rojas.
6. Adicione chelex 5% -20% para un volumen final de 200 µl.
7. Incube a 65 ° C en baño María durante 30 min.
8. Homogenice mediante Vortex fuerte 10 s.
9. Exponga a ebullición durante 8 min.
10. Agite mediante vortex fuerte por 10 s.
11. Centrifugue 3 min a 5.000 rpm.
12. Cuantifique el ADN extraído mediante espectrofotometría.
13. Sin alterar el pellet tome el volumen necesario para realizar restricción enzimática ó la PCR.

INVESTIGUE
1. ¿Cuales son las diferencias entre plasma y suero respectivamente, elabore un cuadro comparativo
entre células rojas y blancas?
2. ¿Determine a nivel bioquímico la función del EDTA y la heparina y si estos pueden o no inhibir la
PCR?
3. ¿Cuál es la función de cada uno de los reactivos en los buffers de lisis de Rojos, lisis de Blancos y
SDS sobre las células rojas y blancas?
4. ¿Cuál es la función de la proteinasa K sobre los glóbulos blancos y su temperatura óptima de
trabajo, anexe el inserto consultando su referencia en la Web?
5. ¿Por qué la incubación del ADN se realizó a 42 º C?
6. ¿Cuál es la función del chelex sobre el ADN?
7. ¿Cuál protocolo permite obtener ADN ds y ADN ss.
8. ¿Cuales tipos de ADN se obtienen al utilizar los dos protocolos y que clase de ADN extrajo?

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RESULTADOS
1. Los resultados serán presentados una vez realizada la cuantificación del ADN, para lo cual debe
procesar y Anexar la Tabla 1 del Anexo 2 formato de extracción de ADN y el que el equipo
registró.
2. Exprese la concentración de ADN en ng/ L, μg/ μL, ng/ml y calcule la cantidad de ADN en el
volumen total resuspendido.
3. Discuta la eficiencia de los métodos de extracción y las ventajas.

BIBLIOGRAFÍA
1. AYALA FAJARDO, A. (1997). Estudio del Gene que Codifica la Enzima – Acetil – Galactosamina-
6-sulfato-sulfatasa en Personas Normales y Pacientes Colombianos con la Enfermedad de Morquio.
Tesis (Magister en Biología). Universidad de los Andes. Facultad de Ciencias, Departamento de
Biología, 98.

2. AYALA FAJARDO, A. (2004). Determinación de Genotipos ABO por Reacción en Cadena de la

Polimerasa y Restricción Enzimática en 53 Muestras de Sangre. Revista Científica: Ciencias Básicas
y Educación. No. 6 , 211 – 212.

BIBLIOGRAFÍA PARA CONSULTAR

1. DAVIS, L. G., DIBNER, M. D., & BATTEY, J. (1986). Basic Methods in Molecular Biology.
Amsterdam: Elsevier Science Publishing Co.41-50.

2. SAMBROOK, J., & RUSSEL, D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.6.4 -6.32

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ANEXO 2-3. FORMATO DE EXTRACCIÓN DE ADN DE SANGRE TOTAL Y MANCHA DE

FECHA ____________________________

N° de tubo Muestra Protocolo Modificaciones