Universidade Salgado de Oliveira – UNIVERSO

Matéria: Seminários de Pesquisa em biomedicina VI

Professora Sônia Souza
Curso de biomedicina

RELATÓRIO DAS AULAS PRÁTICAS - TÉCNICA DE ESTRIAMENTO E

AVALIAÇÃO DE TESTE DE ANTIBIOGRAMA

Discente: Marcos Evandro Teixeira Pinto

Matricula: 600790420

Niterói

2º Semestre, 2018
Introdução

Este trabalho tem por objetivo demonstrar o relatório de atividades

prática de bancada da Técnica de Estriamento e Avaliação de Teste de
Antibiograma.

Nossos encontros em “práticas laboratoriais” vem acontecendo no 2º

Semestre de 2018, e tem sido de grande importância para o nosso
aprimoramento educacional e também para o nosso desenvolvimento na
formação em Biomedicina, especialmente no que tange aos conhecimentos em
microbiologia.

Para alcançar os resultados aqui apresentado, foram respeitados os

princípios e as orientações técnicas em:
 Biossegurança; Vidrarias e suas aplicações;

 Estriamento (semeadura por esgotamento);

 Meios de cultura (Macconkey, manitol salgado, Müeller Hinton); e,

 Análise de da placa com teste de sensibilidade aos antimicrobianos.

Semeadura para Isolamento

Identificar um dado organismo como espécie baseia-se no

preenchimento das características atribuídas àquela espécie. O
reconhecimento da fonte ou origem do espécime (ambiente, espécie animal,
tipo de patologia e localização) do organismo é às vezes fundamental para
identificação e a correta caracterização cultural do organismo em meios de
isolamento primário, assim como a execução e interpretação da coloração e
reação ao Gram são vitais para o sistema de identificação.

Para isolar o microrganismo efetua-se a inoculação ou semeadura,

utilizando a técnica do esgotamento do inóculo por estrias, tendo-se o cuidado
de usar inteiramente toda a área do meio para garantir a separação das
bactérias, de modo que após a incubação cada célula separada origine uma
colônia.

O processo de identificação propriamente dito começa com a

observação das características das colônias isoladas (a olho nu, com lupa ou
microscópio, usando a objetiva de menor aumento). Os seguintes critérios são
utilizados para a caracterização colonial:
  Forma;

 Tamanho (mm);

 Elevação - achatada (alta, baixa), espraiada, convexa;

 Bordos - inteiros, ondulados, lobados, denticulados, franjados, etc.;

 Superfície - lisa, rugosa;

 Estrutura - amorfa, granulosa, filamentosa;

 Caracteres ópticos - opaca, translúcida e transparente;

 Cromogenia ou Pigmentação - amarela, branca, preta, rósea, etc.;

 Odor – ausente, presente, semelhante a algum outro.

Após a observação dessas características devem ser feitos esfregaços

para colorações especiais, e, cuidadosa observação da morfologia
microscópica (forma, arranjos, tamanho e reação ao Gram), presença ou
ausência de esporos, flagelos, cápsulas, granulações e coloração bipolar
(freqüente nas pasteurelas e yersinias). Os procedimentos seguintes envolvem
a caracterização metabólica, tolerância a agentes químicos e físicos, a
antimicrobianos e fagos (fagotipagem), bem como propriedades antigênicas ou
sorológicas e patogenicidade através da inoculação em espécies animais
susceptíveis (apropriadas).

Meios de culturas

Meios de cultura consistem da associação qualitativa e quantitativa de

substâncias que fornecem os nutrientes necessários ao desenvolvimento
(cultivo) de microrganismos fora do seu meio natural. Tendo em vista a ampla
diversidade metabólica dos microrganismos, existem vários tipos de meios de
cultura para satisfazerem as variadas exigências nutricionais.

Quanto à composição química podem ser simples ou básicos (que

permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer, contudo nenhuma
exigência em especial) e complexos ou especiais (quando cumprem com as
exigências vitais de determinados microrganismos).

De acordo com a finalidade bacteriológica ou micológica os meios

especiais podem ser classificados em vários tipos, por exemplo:
Diferenciais - Permitem separar grupos de microorganismos através da sua
aparência no meio (características morfológicas ou bioquímicas) e contêm
indicadores, que assinalam as alterações na aparência do crescimento
bacteriano (colônias) ou no meio (mudança de cor).

Seletivos e diferenciais– Além de nutrientes necessários para o crescimento

de todos os microorganismo, contém 1 ou mais compostos que são essenciais
devido à sua especificidade funcional de isolar grupos específicos, permitindo o
seu crescimento em detrimento de outro, pois são formulados para inibir o
crescimento de microorganismos que não interessam ao fim em vista. Os
agentes de seleção podem ser produtos químicos, corantes, antimicrobianos. A
maioria deles é também diferencial, permitindo diferenciar as colônias (sólidos)
dos microorganismos.

Ágar Manitol
É um meio seletivo, pois contém uma concentração de sal (7,5%) muito
elevada, que inibe a maior parte dos microorganismos, permitindo o
crescimento principalmente de cocos Gram+. Também é um meio diferencial,
pois contém o álcool manitol e 1 indicador de pH, o vermelho de fenol, que
passa de amarelo a vermelho, se o manitol for fermentado. É um meio de
cultura, muito usado para o isolamento de Staphylococcus aureus de amostras
biológicas como urina, secreções, feridas e exudatos. Também usado na
indústria alimentícia para o isolamento e identificação de estafilococos em
líquidos e produtos lácteos, carnes e derivados, incluindo conservas e
pescados. A degradação do manitol com a produção de ácido muda a cor do
meio de rosado a amarelo. Devido ao seu alto conteúdo de cloreto de sódio,
pode-se fazer uma inoculação maciça da amostra em estudo. Geralmente se
incubadas as placas por mais ou menos 36 horas, aparecendo as colônias de
estafilococos não-patogênicos de tamanho pequeno e rodeadas de uma zona
vermelha. As colônias de Staphylococcus aureus fermentadores do manitol são
maiores e rodeadas de uma zona amarela.

Ágar Macconkey
É um meio seletivo permitindo o crescimento de bactérias Gram
negativas e inibindo o crescimento de Gram positivas (especialmente
estafilococos e enterococos) principalmente pela presença de corante cristal
violeta e sais biliares e é diferencial, pois indica a fermentação de lactose (o
meio fica amarelado quando isso ocorre, por causa mudança de pH). Os
organismos que fermentam lactose, produzem pH localizado, o qual, seguido
pela absorção do vermelho neutro contido no meio, confere uma coloração
vermelha ou rósea à colônia, enquanto que colônias não fermentadoras de
lactose permanecem incolores ou transparentes.
Ágar Müeller Hinton
É um meio de cultura recomendado para a realização de antibiograma
(teste de sensibilidade), pela técnica de difusão de discos segundo o
CLSI.Possui uma substancial fonte de proteínas e carboidratos que
proporcionam o desenvolvimento e crescimento de cepas bacterianas de
interesse clínico. Além disso, a baixa concentração de timina e timidina e níveis
adequados de cálcio e magnésio, evitam falsos resultados de sensibilidade ou
resistência.

Teste de sensibilidade
Na aula prática analisamos uma placa de Antibiograma ou Teste de
Sensibilidade aos Antimicrobianos (T.S.A.)que é uma prova utilizada para
alguns grupos de bactérias, principalmente as que adquirem resistência
facilmente, entre elas as Enterobactérias.Os testes para a detecção de
resistência são realizados em bactérias isoladas de amostras representativas
de um processo infeccioso, no qual a sensibilidade aos antimicrobianos não é
previsível ou quando existem problemas de resistência à antibióticos. Não é
indicada a realização do T.S.A. em microorganismos da microbiota normal dos
sítios anatômicos analisados. Por estes fatores o antibiograma é uma das
principais funções do laboratório de microbiologia clínica.

Objetivos da técnica de esgotamento:

A técnica de semeadura por esgotamento é utilizada para obtenção de

colônias isoladas em meio sólido. O material a ser processado pode ser o
micro-organismo em caldo ou em ágar ou amostras clínicas tais como
secreções. A técnica visa obter colônias isoladas de bactérias ou leveduras
presentes em materiais biológicos, permitindo a diferenciação de diferentes
tipos morfológicos.

Materiais Utilizados:

 Solução salina;

 Alça bacteriológica estéril descartável

 Câmara de fluxo laminar

 Amostra de bactérias (colônias);

 Placa de petri

 Becker e outras vidrarias

  Ágar MacConkey

 Ágar manitol salgado

 Ágar Müeller Hinton

Métodos

Com a alça bacteriológica estéril descartável, coletou-se amostras de

bactérias;

Utilizando a técnica do esgotamento do inóculo por estrias, foi semeado a

amostra de bactérias na placa de petri. Conforme a imagem

Incubou-se os meios de cultivo sólidos. Posteriormente observou-se as

características das colônias que cresceram

Resultados

Como observamos na imagem, apareceram colônias de Staphylococcus

aureus, pois, fermentaram manitol ficando rodeadas de uma zona em tom
amarelado; Em outras placas cresceram fungos com bactérias; E, em outras
cresceram apenas fungos.
 Placa contaminada por fungos.

Conclusão

Um isolamento bem feito é fundamental no processo de identificação

das bactérias.

O melhor resultado no processo da semeadura está em obter bom

número de estrias; não agredir (perfurar) o meio; não voltar a alça sobre a
estria; Colher pequena quantidade de material para semear e manipular em
campo estéril.

Tais cuidados são necessário para não ocorrer a contaminação,

ocasionada em parte das placas observadas. Nestas cresceram fungos
juntamente com as bactérias.

Fontes e referencias bibliográficas:

MEIOS DE CULTURA. Disponivel em http://www.microbiologia.ufba.br/aulas/MEIOS%20DE%

20CULTURA.doc. Acessado em 30/09/2018 as 22h45min.

TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOS (TSA). Disponivel em

http://users.med.up.pt/cc04-10/micropratica/micro_p_5.doc. Acessado em 30/09/208
as 18h17min.