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FEBRERO, 2006
……dedicada a Dios, a mi madre Inés María, a mi padre Jesús Enrique y a Miguel Russa, por dar fe en
vida de que el amor y la constancia, son y serán siempre la mayor fuerza para plantearme metas, esforzarme
para conseguirlas y disfrutar día a día de los logros alcanzados con tesón …GRACIAS A USTEDES.
AGRADECIMIENTOS
Gracias a la Dra. Marta Mendoza pos sus consejos y sugerencias tanto a nivel
científica como a nivel personal. Gracias a Ti Marta, por ofrecerme tu invaluable
amistad y cariño. Gracias por ofrecer siempre esa alegría y profesionalismo a todo
aquel quien se encuentre en tu camino.
Finalmente, y con mucho cariño, quiero dar las gracias a todos los amigos y
compañeros del laboratorio de Química de Proteínas y del Post grado de Biología
Celular, quienes compartimos día a día los logros alcanzados y las preocupaciones
por los ensayos y evaluaciones, tanto de la tesis como del postgrado. Gracias por
sus contribuciones, consejos, sugerencias y lo más importante, gracias por su valiosa
y constante amistad. Entre tantos debo dirigir estas líneas de agradecimiento a: Juan
Giarritzo, Rocío Camargo, Beatriz Boscan, Carolina Möller, Adriana Izquier, Gladinex
Pérez, Adriana Rodríguez, Joilyneth Ferreira, Isvic Inojosa, Liomary Carrazquel y
Lola del Carmen.
FINANCIAMIENTO
1. NTRODUCCIÓN
Fig. 1.1 Estructura secundaria de la rodopsina bovina. Los residuos de aminoacidos son descritos en
códigos de una letra. La cola amino terminal (N) y el dominio extracelular, se ubican en el tope de la figura. La
cola carboxi-terminal esta en la base. Los segmentos D-helicoídales transmembranales (HI-HVII) y la hélice
catiónica anfipática H8 son mostradas como cilindros. Se muestra el enlace de disulfuro esencial entre la Cys-
110 y la Cys-187 (flecha fucsia). Las Cys-322 y Cys-323 están palmitoiladas (flecha morada). Los dominios
extracelulares E1-E3, los lazos citoplasmáticos C1-C3, y la hélice anfipática H8 son mostrados. Inserto:
estructura del cromóforo 11-cis-retinal. Los átomos de carbono están numerados del 1-20. Las flechas negras
señalan el tripeptido M-N-K enlazador del retinal. Tomado de Sakmar (2002).
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La Rho es el primer GPCR que ha podido ser cristalizado (Okada y col., 2000) y
el primero cuya estructura cristalina fue recientemente obtenida con una resolución
de 2.8 Å (Palczewski y col., 2000), lo cual representa un valor excelente de
resolución, considerando que el proceso de cristalización de proteínas
transmembranales sugiere un grado de dificultad bastante grande. Un diagrama de
cintas para representar la estructura cristalina de la Rho es mostrado en la Figura
1.2.
Fig. 1.2 Diagrama de cintas de la Rho preparado
a partir de estructura de cristalina a 2.8 Å de
resolución. El amino terminal (N) y la superficie
extracelular (o intradiscal), están ubicados en el tope
de la figura. El carboxi-terminal (C) y la superficie
intracelular (o citoplasmática), están en la base de la
figura. Se muestran los siete segmentos
transmembrana (H1-H7), los cuales son
característicos de los receptores acoplados a
proteína G. Los segmentos transmembranales
están coloreados de acuerdo al espectro de un
arcoiris, iniciando con el azul y terminando con el
rojo. El cromóforo 11-cis-retinal es mostrado en
color magenta, y las cadenas laterales de la Lys-296
y Glu-113 son mostradas para resaltar la región de
la base de Schiff del bolsillo de unión al retinal. El
nitrógeno imino de la base de Schiff es mostrado en
azul oscuro. La estructura cristalina de la Rho no
resuelve un pequeño segmento del lazo C3
enlazante de la H5 y la H6 o un segmento mas largo
de la cola carboxi-terminal distal a la H8. Los
segmentos transmembranales están inclinados con
respecto al plano presumido de la membrana. Ellos
son generalmente D-helicoídales, pero contienen
significativas enroscaduras e irregularidades. La
figura fue producida usando el programa
MOLSCRIPT y representa la cadena A de la
estructura cristalina publicada por Palczewski y col.
(2000). Tomado de Menon y col. (2001).
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Fig. 1.3 Representación de un bastón retinal de vertebrado, membrana de los discos y un modelo de
Rho en la membrana. Los segmentos externos de los bastones contienen discos de membranas apilados
con la proteína fotorreceptora Rho empacada en ellos. La representación de sección cruzada expandida de
los discos muestra la bicapa lipídica de la membrana de ambas superficies del disco. Las moléculas de Rho
están densamente empacadas atravesando la bicapa lipídica, como lo muestran las formas ovales. En la
vista expandida a la derecha de la figura se representa la concepción de cómo puede estar dispuesta la
cadena polipeptídica de la Rho en tercera dimensión. La región N-terminal con las dos cadenas de
carbohidratos unidas está expuesta a la superficie intradiscal (extracelular). La cadena de polipéptido
atraviesa la membrana como siete regiones helicoídales empacadas y termina en el final C-terminal, a nivel
de la superficie citoplasmática. La vista de sección cortada transversalmente muestra al retinal unido a la
hélice final, en un bolsillo formado por la superficie interna del penacho helical compacto. Tomado de
webvision.umh.es/webvision/ imageswv/rhodop1.jpeg ; adaptado desde Hargrave (1996).
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Fig. 1.4 Cascada de señalización visual escotópica. La Rho (R) capta un fotón de luz sufriendo un cambio
conformacional por la isomerización del retinal unido (barra en blanco dentro de R), pasando a su forma
fotoactivada (R*). R* interacciona con la T heterotrimérica (TDEJ). TD se une al GTP y se disocia del complejo
TEJ. TD-GTP (subunidad activa se une a la fosfodiestresasa de GMPc (PDE) (panel inferior derecho)
disociandola de sus subunidades reguladoras. La PDE activada lleva a cabo la hidrólisis del GMPc a GMP. Se
reducen los niveles intracelulares de GMPc, lo cual resulta en el cierre de los canales de Na+ y Ca++ de
compuerta dependiente de GMPc. Se reduce el influjo de corriente entrante y el influjo de Ca++ a la celula. Este
evento resulta en una hiperpolarización de la membrana conducente a la generación del impulso nervioso hacia
neuronas retinales secundariaas y finalmente al cerebro (Baylor, 1996). En la fase de apagado (panel izquierdo)
La R* es fosforilada por la rodopsina quinasa (R*-Kinase) favoreciendo el reconocimiento y unión de la arrestina
(A) al receptor fosforilado (R*-P-P). La R*-P-P es posteriormente desfosforidada y libera el todo-trans retinal
unido.www.sinnesphysiologie.de/ photor/pho08al.jpg
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Fig. 1.5 Morfología de los discos nativos intactos absorbidos a mica preparados para MFA en
solución buffer. A) Imagen de altura. Se muestra un disco de membrana con un grosor típico de 16-17
nm. Superficies evidentes: superficie citoplasmática (tipo 1), lípidos co-aislados (tipo 2), mica (tipo 3). B)
Imagen de deflexión. Se muestra el carácter rugoso de la superficie tipo 1 comparado con los lípidos (tipo
2), indicación de proteínas densamente empacadas. Las cabezas de flechas muestran defectos inducidos
por la MFA. Escala de barras (250 nm). Tomado de Liang y col. (2003)
Fig. 1.6 Topografía de los discos abiertos aplanados y esparcidos, absorbidos a mica y preparados
para la MFA. A) Imagen de altura de los discos. Superficies evidentes: superficie citoplasmática (tipo 1 y 4),
lípidos (tipo 2), y mica (tipo 3). Las topografías de las regiones 1 (b) y 4 (c) de alta magnificación revelaron
líneas de dímeros de rodopsina densamente empacadas. Se muestran los paracristales de dímeros simples
de rodopsina (elipses de líneas cortadas) y los monómeros ocasionales de rodopsina (cabezas de flechas),
flotando en la bicapa lipídica. Escala de barras (250 nm) (a) y 15 nm. Tomado de Liang y col. (2003).
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Dado que el trabajo publicado por Fotiadis y col. (2003), fue altamente
controversial por evidenciar la posible existencia de líneas de dímeros de Rho
dispuestos en arreglo paracristalíno en condiciones nativas en membranas de los
discos de los SEB, surgió una interesante polémica por parte de investigadores que
realizaron la caracterización biofísica-estructural de la Rho en dichas membranas, a
favor de la existencia del receptor como una entidad monomérica. Básicamente, el
trabajo de Fotiadis y col. (2003), fue criticado por el hecho de que, tal arreglo
empaquetado de la Rho en las membranas nativas de los SEB, pudiera haber
resultado del efecto de una reorganización artificialmente inducida, por la
segregación de proteínas y lípidos causada por las condiciones de temperatura a las
cuales fue sometida la preparación de los discos de membrana previo a la MFA (15 h
de incubación a 0 °C, en 2 mM Tris-HCl) (Chabre y col., 2003). Este argumento,
lógico por demás, pudiera ser posible, ya que en una preparación de estos discos de
membrana bajo tales condiciones, seria factible la generación de un brote osmótico
en los mismos, alterando su estructura membranosa nativa y por tanto, la
organización de la Rho embebida en estas (Chabre y col., 2003).
Adicionalmente, los resultados de fotoblanqueo y dicroísmo, previamente
comentados aquí, sugirieron que la Rho exhibía constantes de rápida difusión lateral
y rotacional en su medio ambiente de membrana (Liebman y Entine, 1974; Cone,
1972; Poo y Cone, 1974; Wey y col., 1981). Estas rápidas constantes exhibidas por
la Rho en membranas SEB, fueron asumidas como propias de una proteína de
membrana en arreglo monomérico. En sentido contrario, estas proteínas en arreglo
dimérico u oligomérico, no podrían exhibir tales difusiones laterales y rotacionales
rápidas en un modelo de mosaico fluido de membrana (Singer y Nicolson, 1972),
tradicionalmente aceptado para las membranas celulares (Park y col., 2004).
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2004; Liang, y col., 2003), no pudieron ser rebatidas en su totalidad por los datos
argumentados por Chabre y col. (2003) y Chabre y le Maire (2005), pareciera que la
Rho pudiera organizarse en forma dimérica y disponerse en forma de arreglo
paracristalíno de líneas de dímeros, a nivel de las membranas de los discos de los
SEB. Sin embargo, es indudable que se hace necesaria la implementación de
abordajes adicionales que finalmente corroboren tal organización supramolecular,
aun rodeada de un carácter ambiguo.
1.7 HIPÓTESIS
2. OBJETIVOS
3.1 MATERIALES:
Los ojos bovinos fueron comprados en el Matadero Caracas, C. A. Los
reactivos utilizados en el abordaje experimental fueron obtenidos de las siguientes
casas comerciales: [8-3H]GMPpNp (17.9 Ci/mmol), [J-32P]ATP (3000 Ci/mmol), >3H@-
N-etilmaleimida (>3H@-NEM) (60 Ci/mmol – 1 mCi/ml), liquido de centelleo (OptiPhase
Hisafe II), concanavalina A-Sepharose 4B y Sephacryl S-300, Amersham
Biosciences; sulfo-succinimidilo 4-(N-maleidometilo) ciclohexano-1-carboxilato
(sulfo-SMCC), m-maleidobenzoilo-N-hidroxisuccinimido ester (MBS), anti-IgG de
ratón conjugado a fosfatasa alcalina, avidina acoplada a peroxidasa de rabano
(avidina-HRP), estreptavidina acoplada a agarosa (estreptavidina-agarosa), el
sustrato quimioluminiscente para peroxidasa (West pico, Supersignal) y Sulfo-HNS-
biotina, Pierce; 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) y nitro blue tetrazolium
(NBT), Promega; n-dodecil-ȕ-D-maltósido (DM), Anatrace y Sigma; N,N’-1,2-
fenilendimaleimida (o-PDM), N,N’-1,4-fenilendimaleimida (p-PDM), kit de marcadores
de peso molecular para Cromatografía de Exclusión Molecular, sustrato precipitable
para peroxidasa (diaminobenzidina), L-glutation reducido y diamída, N-etilmaleimida
(NEM), Sigma; dietilaminoetil-Sepharose (DEAE-Sepharose), Whatman; membranas
de difluoruro de polivinilideno microporosa (PVDF) y filtros HA (0.45 μm), Millipore;
membranas de nitrocelulosa (0.45 Pm), Advantec; termolisina, Behring
Laboratories, placas médicas para rayos X (X-Omat) Kodak. El anticuerpo
monoclonal 1D4 dirigido en contra de la cola carboxi-terminal de 18 aminoácidos de
la Rho, fue donado por el Dr. Barry Knox (State University of New York). Todos los
otros reactivos no mencionados fueron de grado analítico. El análisis de las
distancias moleculares entre los residuos de Cys140 y Lys245 o Lys248 de la Rho para
la interacción con el agente sulfo SMCC, fue realizado sobre la estructura cristalina
de la Rho bovina depositada en el banco de datos de proteína (BDP) con el
identificador 1U19. Para el ensayo molecular computacional, se hizo uso del
programa de visualización y estudio de macromoléculas Rasmol versión 2.7.1.1.
31
3.2 MÉTODOS:
(Humphries y col., 2002). La sC-PKA (7.5 PM) fue previamente desprovista de E-ME
mediante diálisis en contra del buffer de glutationilación en membranas de diálisis
SpectraPor, con un punto de corte de 3.000 Da de masa molecular.
La muestra conteniendo a la Rho (0.3 mg, Vt = 300 Pl), sirvió para la resuspensión
de los estándares señalados arriba. Las proteínas resuspendidas en conjunto fueron
servidas en el tope del gradiente de sacarosa, en oscuridad. Los gradientes fueron
ultracentrifugados a 200.000 x g, por 18 h, a 4 °C en una centrifuga Beckman, rotor
SW 50Ti. Las fracciones fueron colectadas desde la base del tubo por punción con
una aguja, colectándose un volumen de ~ 170 Pl por fracción. Las alícuotas
colectadas de cada gradiente fueron analizadas por EGPA-SDS, para determinar el
pico de cada uno de los estándares y a partir de esto determinar el respectivo
volumen de migración (Vm). La migración de los complejos Rho:DM fue determinada
por el monitoreo de la absorbancia de cada fracción a las longitudes de onda de 280,
380, y 498.5 nm y por inmunotinción de las proteínas electrotransferidas a
membranas de nitrocelulosa (Towbin y col., 1979), usando el anticuerpo monoclonal
1D4. Posteriormente el Vm de cada proteína estándar fue graficado en contra de su
respectivo coeficiente de sedimentación (S). La curva lineal resultante de esta grafica
fue utilizada para calcular el S del complejo Rho:DM, de acuerdo con lo publicado por
Martin y Ames (1961). La masa molecular entre los complejos de Rho y el DM fue
estimada a partir de una curva de calibración de las masas moleculares de las
proteínas estándares versus sus radios de Stokes multiplicados por sus coeficientes
de sedimentación (Siegel y Monty, 1966). Un procedimiento idéntico fue empleado
para determinar el S y el tamaño del complejo entre la Rho* y el DM, con la única
variación de que la muestra de Rho a ser sedimentada, fue previamente fotolizada
por irradiación intensa durante 1 min con un bombillo de filamento de 150 watt de
potencia y 365nm de emisión.
expuestas a placas de rayos X, hasta que las quimioluminiscencia de las bandas fue
evidente.
3.2.8.2 Marcaje de la Rho en las membranas de los SEB con el fosfato gamma
del ATP ([J-32P]ATP).
A partir de una cantidad de 5.7 mg totales de membranas intactas de los SEB
se procedió a realizar el procedimiento de fosforilación endógena de la Rho. Las
membranas en buffer isotónico fueron sometidas a centrifugación en una
ultracentrífuga Sorvall modelo RC M120, rotor 120AT a 35.000 rpm por 30 min a 4
°C. La reacción fue llevada a cabo con 75 PM [J-32P]ATP (actividad especifica ~
4.500 cpm/pmol), y en presencia de el Buffer de fosforilación [50 mM Tris-HCl (pH
8.0), 5 mM acetato de magnesio, 20 mM fluoruro de potasio]. Las membranas
intactas de los SEB en presencia de la mezcla de fosforilación fueron incubadas por
1 h a temperatura ambiente y en agitación constante. Las reacciones fueron iniciadas
por la iluminación intensa de las membranas. Transcurrido el tiempo de marcaje, se
procedió a centrifugar las membranas nuevamente a 35.000 rpm por 30 min a 4 °C.
El sedimento de membranas marcadas con [J-32P], fue lavado tres veces en buffer
isotónico siguiendo la metodología de resuspensión y centrifugación respectiva. El
sedimento de membranas SEB fue sometido a un lavado con 2 mM EDTA para la
eliminación de las proteínas asociadas a membrana. Las SEBLav fueron
resuspendidas en 320 Pl de buffer isotónico. Una alícuota de 20 Pl fue tomada para
su evaluación en EGPA-SDS y análisis por autorradiografía. El volumen restante de
las membranas fosforiladas fue congelado a – 80 °C.
ultracentrífuga Sorvall RC M120, rotor 120AT, a 35.000 rpm, por 30 min a 4 °C. El
sedimento de membranas fue resuspendido en buffer de blanqueo [10 mM Tris-
Acetato (pH 7.4), 50 mM hidroxilamina]. La mezcla fue agitada vigorosamente en un
vortex e incubada por 2 h a temperatura ambiente y bajo iluminación intensa con un
bombillo de filamento de 150 watt de potencia y 365 nm de emisión, con el fin de
eliminar la totalidad del retinal unido a la Rho. Las membranas así blanqueadas,
fueron nuevamente centrifugadas y el sedimento resultante fue lavado tres veces con
buffer Rho para eliminar el exceso de hidroxilamina y del todo-trans retinal extraído.
Las opsinas marcadas diferencialmente con [J-32P] o con biotína fueron sometidas a
una solubilización y desnaturalización fuerte utilizando el detergente SDS al 0.1 % en
Buffer Rho. Procedimientos idénticos fueron aplicados a membranas SEBLav y
marcadas con [J-32P] o con biotína por separado, las cuales sirvieron como controles
individuales para los intentos de co-precipitación de las rodopsinas marcadas
diferencialmente.
3.2.9.4 Precipitación con acetona de las opsinas marcadas con biotína o con [J-
32
P].
Para una completa eliminación del SDS remanente en la mezcla de las
opsinas marcadas diferencialmente con biotína o [J-32P] y que co-eluyeron en la
columna de Sephadex G-15, se procedió a practicar una precipitación de las mismas
en presencia de acetona fría. Una primera reacción de precipitación fue llevada a
cabo por la adición de acetona a una relación porcentual igual al 80 % con respecto
al volumen total de la solución de proteínas a precipitar. El tiempo de precipitación
fue establecido en 1 h a temperatura ambiente. La reacción de precipitación fue
centrifugada posteriormente a 14.000 x g durante 25 min a temperatura ambiente. El
sobrenadante fue descartado luego de la detección de una muy escasa
radioactividad de [J-32P] mediante el uso de un contador Geiger ( del 10 % de la
radioactividad total medida antes de la precipitación). El precipitado de proteínas
conteniendo entre un 80-90 % de la radioactividad en cpm de la mezcla original de
proteínas, previo a la precipitación inicial, fue resuspendido en 100 % acetona fría y
centrifugado bajo las mismas condiciones descritas arriba.
Las opsinas marcadas con biotína o fosforiladas con [J-32P], las cuales
coeluyeron en la columna de Sephadex G-15 y fueron precipitadas con acetona fría,
fueron resuspendidas en Buffer Rho y posteriormente sometidas a regeneración a su
estado nativo mediante la incubación de las mismas en presencia del cromóforo 11-
cis-retinal. Las condiciones de incubación para la regeneración fueron establecidas
en 48 h a 37 °C, en oscuridad y agitación constante, siguiendo la metodología
descrita por Katre y col. (1981).
3.2.13.2 Filtración molecular en Gel de las Rho marcadas con biotína o [3H]-
NEM.
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Las muestras de partida para este procedimiento fueron las rodopsinas marcadas
diferencialmente con biotína o [3H]-NEM, previamente solubilizadas en presencia de
1 % DM (19.6 mM). Dado que la concentración del DM en la cual esta solubilizada la
Rho, se encuentra por encima de la concentración micelar critica del detergente
(CMC = 0.18 mM), se esperaba la formación de micelas de DM, y por tal razón la
Rho solubilizada y cromatografiada se encontraba insertada en dichas estructuras
micelares, formando complejos de Rho-DM. Las muestras de Rho marcadas (0.8
mgs c/u), fueron aplicadas en corridas por separado en el tope de una columna de
Sephacryl S-300. La columna tenia un volumen total (Vt) = 38.5 ml de resina. La
columna fue equilibrada en Buffer de exclusión [50 mM HEPES (pH 6.6), 150 mM
NaCl, 3mM Cloruro de magnesio, 2 mM Cloruro de calcio, 5 mM E-ME y 0.5 % DM
(10 mM)]. La calibración de la columna y el procedimiento de exclusión molecular fue
realizada de forma idéntica a la descrita en la sección 3.2.6.1 de Procedimientos
experimentales. Las proteínas estándares fueron disueltas en el volumen que
contenía a la Rho marcada y solubilizada en 1 % DM. Las proteínas estándares y la
Rho marcada fueron cromatografiadas en conjunto, en oscuridad y a 4 °C. Las
fracciones eluídas fueron monitoreadas simultáneamente a las absorbancias de 280,
380, y 498.5 nm, para la detección de aminoácidos aromáticos, Rho* y Rho,
respectivamente. Las fracciones contentivas de proteína según los registros de
absorbancia, fueron separadas por EGPA-SDS con la finalidad de determinar los
picos de elusión de las proteínas estándares y calcular los respectivos volúmenes de
elusión (Ve) de las mismas. La elución de la Rho marcada con biotína fue
monitoreada por el procedimiento de detección de proteínas biotiniladas
electrotransferidas a filtros de nitocelulosa desde las EGPA-SDS de cada una de las
fracciones eluídas de la columna. Esto, con la finalidad de poder determinar el Ve de
la Rho-biotína. La elusión de la Rho marcada con [3H]-NEM fue monitoreada por el
rastreo de la radioactividad de tritio [3H] de cada una de las fracciones eluídas de la
columna. Los coeficientes de partición (Kav), así como los pesos moleculares de las
muestras de Rho-biotína y la Rho-[3H]-NEM en condición monomérica, fueron
determinados y calculados de forma idéntica a la descrita en la sección 3.2.6.1.
56
4. RESULTADOS.
En las líneas 5-8 de la Fig. 4.1 A, se muestra el perfil electroforético de cada una de
las fracciones de elución de la resina con el D-metilmanósido. Nótese en las líneas 5-
8, la aparición de la banda con masa molecular aparente de 37 kDa, eluída desde la
matriz de afinidad. Como era de esperarse, cantidades cada vez menores de la
proteína fueron obtenidas a medida que se realizó el recambio del buffer de elución
conteniendo al carbohidrato competidor a una concentración siempre constante de
0.5 %, cada vez. Luego del sometimiento de la resina a un número total de cinco
procedimientos de elusión, ninguna cantidad apreciable de la proteína de 37 kDa, fue
registrada en el último sobrenadante.
Para confirmar que la proteína con masa molecular aparente de 37 kDa
purificada por afinidad a Con A Sepharose, correspondía específicamente a la Rho,
la fracción representada en la línea 8 (Fig. 4.1 A), fue nuevamente sometida a EGPA-
SDS, electrotransferida a filtros de nitrocelulosa y sometida a análisis por
inmunotinción usando el anticuerpo monoclonal anti-Rho (1D4). En la Fig. 4.1 B, se
muestra el resultado de la inmunotinción de la tira de nitrocelulosa con el anticuerpo,
revelada con los sustratos precipitables para la fosfatasa alcalina (NBT/BCIP).
Nótese en la Fig. 4.1 B, la aparición de una banda inmunoteñida con el anticuerpo,
igualmente migrando con una masa molecular aparente de 37 kDa, coincidente con
el peso de la proteína purificada por afinidad. Este resultado indicó que la proteína
purificada en efecto correspondía a la Rho bovina. Los espectros UV/Vis
característicos realizados sobre la Rho solubilizada en 0.1 % DM y purificada (Fig.
4.1, C), revelaron la ocurrencia de un pico máximo de absorción a 498.5 nm (flecha
indicando Rho), especifico para la Rho nativa (en oscuridad). La realización de un
nuevo espectro sobre la misma muestra, previamente sometida a 1 min de
iluminación intensa, resultó en la extinción del pico a 498.5 nm y la aparición de un
nuevo pico absorbiendo a 380 nm (flecha indicando a la Rho*), característico de la
Rho fotoactivada. Estos espectros finalmente confirmaron la purificación de la
proteína fotorreceptora Rho.
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Fig. 4.1 Purificación de la Rodopsina. A) EGPA-SDS mostrando los pasos de la purificación de la Rho
por afinidad através de una columna de Con A Sepharosa 4B. Los SEB intactos fueron solubilizados con
1% DM. El homogenato de membranas fue diluido a una concentración de 0.1 % DM (línea 1). Línea 2,
fracción de proteínas de membrana no unidas a la Con A Sepharosa. Lineas 3 y 4, lavados de la resina
de Con A Sepharosa con buffer Rho. Lineas 5-8, elución de la Rho unida a la Con A Sepharosa con 0.5 M
de D-metil manosido. B) Inmunotinción de una fracción de Rho eluida de la Con A Sepharosa usando el
anticuerpo monoclonal 1D4. La flecha indica la detección inmunoespecifica de la Rho en esa fracción. C)
Espectros UV/Vis caracteristicos de una fracción eluida de la Con A Sepharosa en oscuridad (espectro en
azul oscuro con pico de absorbancia máxima a 498.5 nm), o en presencia de luz (espectro en azul claro,
pico de absorbancia máxima a 380 nm).
Fig. 4.3 Entrecruzamiento de la Rho en membranas de los SEBLav con los reactivos bifuncionales
sulfo-SMCC y MBS. Las membranas SEBLav , fueron incubadas con 5 mM de Sulfo-SMCC (linea 2) o
MBS (linea 3) por 1 h a 37 °C. La linea 1 indica la muestra control conteniendo las membranas de los
SEBLav incubadas con el vehículo. Las reacciones fueron separadas por EGP-SDS y teñidas para
visualizar las proteínas con azul de coomassie. Las cantidad total de Rho cargada en los geles fue de 5
Pg/línea. R1, R2, R3, y Rn, corresponden a monómeros, dímeros, trímeros, y multímeros de R,
respectivamente. M, indica los marcadores de peso molecular.
M 1 2 3
oscuridad.
Fig. 4.5 Entrecruzamiento de la Rho purificada con los reactivos bifuncionales o-PDM y p-PDM. Las
muestras de la Rho purificada fueron incubadas con concentraciones crecientes (2, 4 y 8 mM) de o-PDM o
p-PDM por 1 h a 37 °C, en oscuridad (-) o en presencia de luz (+). C indica los controles conteniendo las
muestras con el vehículo. Las reacciones fueron separadas por EGP-SDS y teñidas con plata para
visualizar las proteínas. La cantidad total de Rho cargada en los geles fue de 3 Pg/línea. R1, R2, R3, y Rn,
corresponden a monómeros, dímeros, trímeros, y multímeros de R, respectivamente.
mM de cada una de las bimaleimídas (Fig. 4.5, A y B). Por otra parte, estos
resultados nuevamente y en concordancia con los obtenidos por el uso de sulfo-
SMCC y MBS, sugieren la posible existencia de la Rho como entidades diméricas o
multiméricas en membranas y en su forma solubilizada.
Fig. 4.6 Reacciones de entrecruzamiento de la Rho purificada en función del tiempo. La Rho purificada
(1.28 PM) fue incubada en oscuridad con 5 mM de sulfo-SMCC (A), MBS (B) o p-PDM (C) a 37 °C. A los
intervalos de tiempo seleccionados, a una alícuota de la mezcla de reacción conteniendo 1.5 Pg de Rho total se
le añadió 20 mM de E-ME para detener la reacción. 60’-Cw y 60’-CDMSO, corresponden al punto de incubación de
60 min de la Rho con los vehículos, los cuales fueron agua (W) o dimetil sulfóxido (DMSO). La cantidad total de
1.5 Pg de Rho a cada tiempo de incubación fue cargada en el gel, sometida a EGPA-SDS y teñidas con plata. R1
y R2 = productos monoméricos y diméricos de la Rho, respectivamente.
Fig. 4.9 Evaluación del efecto de la concentración de la Rho sobre el cociente de dímero a monómero
de la Rho entrecruzada con sulfo-SMCC. Las reacciones de entrecruzamiento a concentraciones
crecientes de la Rho en presencia de 5 mM sulfo-SMCC fueron llevadas a cabo por 1 h a temperatura
ambiente. Cantidades idénticas de la Rho de cada reacción (1.5 Pg) fueron cargadas en el gel, sometidas a
EGPA-SDS y las proteínas fueron teñidas con plata para su visualización. R1 y R2 = productos
monoméricos y diméricos de la Rho, respectivamente.
moléculas de Rho en estado nativo, mas que una interacción accidental por
colisiones aleatorias.
una banda difusa, para cada forma de Rho* o Rho (RGlu flecha en rojo), migrando con
una movilidad mucho mas rápida a aquella presentada por los monómeros R1 no
entrecruzados intramolecularmente (bandas migrando a ~ 35 kDa). Adicionalmente,
el tratamiento de las proteínas con diamida y GSH fue capaz de estabilizar los
dímeros nativos de Rho* y Rho, dado que fueron evidenciadas especies diméricas
R2 de ambas formas del receptor migrando a ~ 75 kDa (Fig. 4.10, líneas 4 y 6, flecha
en negro). Las bandas migrando ~ 75 kDa, correspondieron a dímeros
intermolecularmente entrecruzados de Rho* y Rho, estabilizados por los disulfuros
inducidos en la reacción de glutationilación.
Como se pudo evidenciar en los carriles 1 y 3 de la Fig. 4.10, el intercambio de
disulfuros inducido por la diamida y el GSH en la Rho* y la Rho, fue completamente
revertido en presencia del agente reductor E-ME, el cual es capaz de transformar el
medio oxidado de la reacción a un entorno completamente reducido. Nótese como en
presencia del agente reductor, sólo se evidenció la presencia de monómeros de Rho*
y Rho (Fig. 4.10, líneas 1 y 3). El paso de GSSH a GSH incapacita al gutatión para
la reacción de intercambio de disulfuros, eliminado las especies de migración más
rápida que los monómeros de la Rho* y la Rho, así como también los dímeros
intermolecularmente entrecruzados, migrando a ~ 75 kDa. En la Fig. 4.10 (líneas 2 y
5) se muestra la reacción de glutationilación de la subunidad catalítica de la proteína
quinas A (sC-PKA), utilizada como control interno positivo de la reacción. Nótese la
línea 5 como, de acuerdo a lo publicado por Humphries y col. (2002), esta subunidad
fue intramolecularmente entrecruzada, hecho evidenciado por la detección de
especies borrosas migrando ligeramente por debajo del peso molecular esperado
para esta proteína (~ 40 kDa). De igual manera en la línea 5, se pudo notar la
formación por glutationilación de especies diméricas (sC2), triméricas (sC3) y
oligoméricas (sCn). Estas reacciones fueron igualmente revertidas cuando las
muestras fueron corridas en condiciones reductoras.
73
Fig. 4.10 Ensayos de glutationilación de la Rho y la Rho*. La Rho purificada o la Rho* (7.5 PM) fue incubada
con 150 PM de diamida y 225 PM de GSH-biotína por 1 h a temp. ambiente. Las reacciones en su totalidad
fueron sometidas a EGPA-SDS en presencia de E-ME (líneas 1 y 3) o en ausencia del mismo (4 y 6). Las
electroforesis fueron transferidas a membranas de nitrocelulosa y las proteínas glutationiladas con GSH-biotína
fueron detectadas con avidína-HRP. Las líneas 1 y 4 corresponden con la glutationilación de la Rho*. Las líneas
3 y 6 corresponden con la glutationilación de la Rho nativa. R1 representa a los monómeros de Rho* y Rho. R2
representa a las especies diméricas de Rho* y Rho entrecruzadas y estabilizadas por la glutationilación en
residuos de Cys. Las bandas señaladas con la flecha en rojo (R1Glu) indican la formación de disulfuros
intramoleculares de la Rho* y la Rho con una migración ligeramente más rápida que las especies R1. Las líneas
2 y 5 muestran al control positivo interno de la glutationilación de la subunidad catalítica de la PKA, corridas en
presencia o ausencia de E-ME, respectivamente. *sC1, *sC2, *sC3 y *sCn, representan la distintas especies
monoméricas, diméricas, triméricas y oligoméricas de la subunidad catalítica formadas por el establecimiento de
puentes de disulfuro intermoleculares e intramoleculares por efecto de la glutationilación de la proteína.
74
Fig. 4.11 Filtración en gel de la Rho purificada (A) y la Rho* (B) sobre una columna de Sephacryl S-
300. La absorbancia fue medida a 498.5 nm (i) y 380 nm ( ). Los insertos muestran el perfil de elusión de la
Rho:DM (A) y Rho*:DM (B), seguidos por inmunotinción usando el anticuerpo monoclonal 1D4. La Rho:DM
eluyó entre las fracciones 38-43 y mostró su mayor pico en la fracción 40. La Rho*:DM eluyó entre las
fracciones 38-44 y su mayor pico fue en la fracción 41. Las flechas indican las posiciones de elusión de las
proteínas estándares que fueron usadas: E-amilasa (Am), alcohol deshidrogenasa (ADH), albúmina de suero
bovino dimérica (dBSA), ovoalbúmina (Ovo), quimiotripsinógeno A (Chy), ribonucleasa A (Rb), y citocrómo C
(CC).
En cuanto a la recuperación de las especies Rho:DM o Rho*:DM, posterior a su
filtración a través de la columna, es de interés resaltar que aproximadamente un 85-
90 % de la cantidad de cada complejo inicialmente sembrado en la columna, fue
recuperado en las fracciones colectadas. En efecto, después de la separación de la
Rho:DM en oscuridad, o bien de la Rho*:DM, en la luz, una capa rojiza o amarillenta
fue observada en el tope de la columna, propio de la retención a este nivel de la
columna, de los complejos en oscuridad o en luz, respectivamente. Esta observación
en cuanto a la recuperación de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM, sugirió la
formación de una pequeña proporción de complejos oligoméricos de las Rho y Rho*
76
Fig. 4.12 Curva de calibración para la determinación del peso molecular de los complejos Rho:DM y
Rho*:DM. Se muestra la curva de calibración entre el coeficiente de partición (Kav) de las proteínas estándares
de peso molecular conocido, señaladas en Procedimientos experimentales vs el Log del peso molecular de las
mismas Las posiciones de elución de los complejos de Rho:DM (Rho, ) y Rho*:DM (Rho*, i), fueron
determinados por EGPA-SDS e inmunotinción usando el anticuerpo monoclonal 1D4 y están indicados con
flechas.
su concentración micelar critica (0.18 mM). En este sentido, el peso molecular de una
micela de DM había sido calculado por Rosevear y col. (1980), como un valor de
aproximadamente 50.000. Conociendo el peso molecular de una micela y asumiendo
que la Rho y la Rho* se encontraban insertas en ellas, la masa molecular de la Rho
nativa y la Rho*, fue calculada por la sustracción del peso de la micela, al tamaño
total del complejo de proteína:detergente determinado por exclusión molecular. Esta
sustracción produjo pesos moleculares de 78 kDa y 76 kDa, respectivamente. Los
resultados aquí encontrados predicen que ambas conformaciones de la Rho son
diméricas en su estado nativo y fotoactivado.
Cuando se construyó la curva de calibración de (-log Kav)1/2 versus los radios
de Stokes (a) de cada proteína estándar (Fig. 4.13), la interpolación de los valores de
(-log Kav)1/2 calculados para cada uno de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM,
arrojó radios de Stokes de 4.18 y 4.15 nm, respectivamente (ver Fig. 4.18).
Fig. 4.13 Curva de calibración para la estimación de los radios de Stokes de los complejos de
Rho:DM y Rho*:DM. Se muestra la curva de calibración de los radios de Stokes (nm) de las proteínas
1/2
estándares indicados en Procedimientos experimentales vs el correspondiente (-log Kav) , determinados
por exclusión molecular. a, indica los radios de Stokes (nm).
78
dicha cantidad de Man presente en la proteína contribuía con el valor medido a esa
absorbancia especifica en la fracción pico de elución de la Rho. La interpolación de
los valores de Abs620nm de las muestras control conteniendo un exceso de dos veces
los moles de D-metilmanósido con respecto a los moles de Rho utilizados en la
determinación (20 moles de D-metilmanósido/mol de Rho), permitió conocer que los
residuos de Man presentes en la Rho no exhibieron ninguna contribución sobre la
Abs620nm medida en el pico de elución del complejo Rho:DM. En este sentido, se
garantizó que la Abs620nm medida en el pico de elución del complejo Rho:DM
reflejaba justamente la cantidad de detergente libre y unido a la Rho en la fracción
pico analizada. Cuando se realizó la sustracción de los Pgs de DM libre, y los Pgs de
D-metilmanósido de las muestras control conteniendo un exceso en moles de D-
metilmanósido, a los Pgs de DM totales presentes en el pico de elución del complejo
Rho:DM, se pudo conocer que el valor de G fue de 0.97 g de detergente/gr de
proteína, estando entonces en presencia de 1.97 g del complejo Rho:DM.
Conociendo el valor de G, se pudo calcular la masa molecular del motivo de proteína
contenido en el complejo de proteína-detergente asumiéndose la siguiente relación:
si 1.97 g del complejo Rho:DM, contienen 1 g de proteína, en 128.000 g del complejo
Rho:DM estimado por filtración en gel, se analizó cuantos g de proteína deberían
existir en el complejo. Esta relación resultó en que ~ 65.000 g de Rho/mol del
complejo Rho:DM estuvieron presentes, es decir, se evidenció un motivo dimérico de
Rho. Para el complejo de Rho*:DM un valor de 64.000 g de Rho/mol del complejo
Rho*:DM estuvieron presentes, indicando igualmente la existencia de un motivo
dimerico de Rho* en el complejo. Posteriormente, considerando un peso molecular
para la Rho de ~ 40.000, determinado de su estructura primaria y composición de
carbohidratos, se pudo conocer que el complejo proteína:detergente contenía 1.63
copias de Rho:DM. Un análisis similar estimó que 1.6 copias de Rho* estaban
contenidas por mol del complejo Rho*:DM. Estos resultados se constituyeron como
una prueba adicional y directa de que la Rho nativa o fotoactivada incluida en las
micelas de DM y eluída de una cromatografía en gel, se presenta como un dímero.
Una vez estimados los valores de QP y G, y usando los valores de Qd para el DM de
0.824 cm3/g, previamente publicados por Möller y le Maire (1993), pudo ser calculado
80
Fig. 4.15 Curva de calibración para la determinación de los coeficientes de sedimentación de los complejos
Rho:DM y Rho*:DM. La calibración de los gradientes de sacarosa fue llevada a cabo con las proteínas estándar,
alcohol deshidrogenasa (7.4 S), una glicoproteína variante de superficie de T. evansi (VSG, 5.67 S) (Uzcanga y
col.. 2004), quimiotripsinógeno A (2.6 S) y ribonucleasa A (2.0 S). Como fue mostrado en la Fig. 4.19, las
posiciones de sedimentación de la Rho, ( ) y la (Rho*, (i) fue determinado por inmunotinción de las fracciones
sedimentadas en el gradiente de sacarosa, previamente separadas en EGPA-SDS y transferidas a filtros de
nitrocelulosa. Las fechas indican la interpolación de los volúmenes de migración de cada complejo. S indica el
coeficiente de sedimentación (unidades Svedberg).
la Fig. 4.16, como la interpolación del producto de a X s del complejo Rho:DM (4.18
nm X 5.78 = 24.16) y del complejo Rho*:DM (4.15 nm X 5.78 = 23.99), arrojó valores
de peso molecular de 107.000 y 111.000 para cada complejo de proteína:
detergente, respectivamente. Nuevamente, considerando que las proteínas Rho y
Rho* se encontraban insertas en micelas del detergente, se procedió a realizar la
sustracción del peso molecular de la micela de DM al peso total estimado para cada
complejo.
Fig. 4.16 Curva de calibración para la determinación del peso molecular de la Rho y Rho* sedimentada
por ultracentrifugación. A partir de los valores de coeficiente de sedimentación (S) y el radio de Stokes de
las proteínas estándares, se presenta la curva de calibración del peso molecular (PM) de los estándares vs. el
producto de a X S. La interpolación de los parámetros estimados para los complejos Rho:DM (Rho ) y
Rho*:DM (Rho* i), está señalada con flechas en la grafica.
4.3.5 Determinación del coeficiente friccional (ƒ/ƒo) para los complejos Rho:DM
y Rho*:DM.
El coeficiente friccional de especies de proteínas se presenta como un
parámetro hidrodinámico adicional, el cual permite inferir de manera indirecta,
aspectos referentes a la forma y simetría de dichas entidades proteicas en solución.
Una estimación del coeficiente friccional puede ser obtenida cuando el coeficiente
friccional de las especies en estudio (ƒ), es comparado con aquel correspondiente a
una esfera compacta (ƒo) (Tanford, 1961; Bloomfield y col., 1967).
Cuando las masas moleculares fueron obtenidas por cromatografía de
filtración en gel, se procedió a realizar los cálculos de los cocientes fricciónales de los
complejos de Rho:DM y Rho*:DM, mediante la aplicación de la Ecuación 5:
Fig. 4.17 Espectros de absorción UV/Vis de los complejos Rho:detergente obtenidos por
filtración en gel (FG) y sedimentación por ultracentrifugación (S). Los espectros fueron registrados
en la oscuridad (Rho) o después de 1 min de iluminación con un bombillo de filamento de 150-watt
(Rho*), para cada muestra de Rho obtenida por filtración en gel (FG) o sedimentación (S). Las flechas
indican los picos máximos de absorbancia correspondientes a la Rho en oscuridad, (498.5 nm) y en
presencia de luz, Rho* (380 nm).
86
Fig. 4.18 Ensayo de enlazamiento de [3H]GMPpNp de la T inducida por los complejos de Rho:detergente
obtenidos por filtración en gel (FG) y sedimentación por ultracentrifugación (S). Los complejos de Rho:DM
después de la filtración en gel (Rho-DM (FG)) o de la sedimentación (Rho-DM (S)), fueron incubados con T, bajo
3
iluminación intensa y en presencia de [ H]GMPpNp. La actividad de unión de la T al análogo no hidrolizable de
GTP fue ensayada por filtración en membranas Millipore. Los experimentos con Rho purificada por afinidad a
Con A Sepharosa (Rho-DM (Con A) ) y membranas SEB lavadas (SEBLav), fueron incluidos como controles. La
cantidad de Rho en cada una de las reacciones fue constante y equivalente a 4 Pg.
Fig. 4.20 Ensayos de fosforilación de la Rho en los complejos Rho:detergente por la rodopsina quinasa. Se
muestra la autorradiografía de la fosforilación in vitro inducida por luz de la Rho:DM obtenida por FG o S, por parte
32
de la rodopsina quinasa (RQ). (I) membranas intactas de los SEB incubadas con [J- P]ATP en oscuridad (-) o en
32
presencia de luz (+). (II) fracción enriquecida de RQ incubada con [J- P]ATP en presencia de luz (+), idénticos
resultados fueron obtenidos en oscuridad (datos no incluidos). (III) los complejos de Rho:DM luego la filtración en
32
gel (GF) o sedimentación (S) fueron incubados con la fracción enriquecida de RQ y [J- P]ATP, en oscuridad (-) o
en presencia de luz (+). La flecha indica la migración de la Rho fosforilada.
Nótese como, en esa fracción de membranas intactas de los SEB incubadas con
una mezcla de fosforilación, se pudo notar la existencia de RQ endógena, la cual
pudo fosforilar (solo en presencia de luz) a la Rho embebida en dichas membranas
(banda fosforilada migrando con una masa molecular aparente de ~ 35 kDa). En la
Fig. 4.20 (II), se muestra la fracción enriquecida de RQ incubada con la mezcla de
fosforilación en presencia de luz. Nótese como dicha fracción fue completamente
carente de contaminación con moléculas de Rho. En la Fig. 4.20 (III), se muestran
los resultados de la incubación de los complejos de Rho:DM (FG o S) con la fracción
enriquecida de RQ, en presencia de la mezcla de fosforilación, en luz o en oscuridad.
Los resultados muestran como las muestras de Rho:DM de ambos orígenes fueron
susceptibles a fosforilación en presencia de luz, por parte de la RQ (flecha negra en
la base del panel derecho). Ninguna reacción de fosforilación de la Rho fue
90
4.5.1 Resultados del marcaje diferencial de la Rho con NHS-biotína o con [J-
32
P].
La Rho en las membranas SEBLav fue sometida a marcaje con el reactivo
NHS-biotína, siguiendo las condiciones experimentales definidas en la sección
3.2.8.1 de Procedimientos experimentales. La Rho-biotína inserta en membranas fue
sometida a EGPA-SDS y las electroforesis fueron transferidas a filtros de
nitrocelulosa. Iguales cantidades de membranas SEBLav no tratadas con NHS-biotína
fueron incluidas como control negativo de la reacción de marcaje. En la Fig. 4.21 (A),
se muestra el resultado de la detección por luminometría de las especies de la Rho
marcada con biotína y reveladas con el sustrato quimioluminiscente (Supersignal)
para la avidína-HRP.
Fig. 4.21 Marcaje con biotína
de las membranas SEBLav. A)
muestra la placa de rayos X con
el resultado de la detección por
luminometría de los SEB
biotinilados. La membrana de
nitrocelulosa conteniendo a los
SEBLav marcados con biotína fue
revelada con avidína-HRP y el
sustrato quimioluminiscente para
la peroxidasa. Los SEB
biotinilados (línea 1); SEB no
tratados con biotína (línea 2). B)
La misma membrana utilizada
para la detección de proteínas
biotiladas por luminometría, se
utilizó para la inmunotinción de la
Rho en los SEB biotinilados,
usando en anticuerpo monoclonal
1D4. En B se demuestra la
presencia de la Rho en las
muestras de los SEB tratadas y
no tratadas con biotína
92
32
Fig. 4.22 Marcaje con [J- P]ATP de
las membranas intactas de los
SEB. La autorradiografía muestra el
resultado de la reacción de
fosforilación endógena de las
membranas intactas de los SEB
incubadas con [J-32P]ATP y en
presencia de luz. R1, R2, R3, indican
la aparición de especies
monoméricas, diméricas y trimeritas
fosforiladas, respectivamente.
Fig. 4.23 Filtración molecular en Sephadex G-15 de la mezcla de opsinas desnaturalizadas marcadas
32
diferencialmente con biotína o [J- P]ATP. A) Registro espectrofotométrico a 280 nm de las fracciones eluídas
de la columna de Sephadex G-15 conteniendo la mezcla de opsinas desnaturalizadas y diferencialmente
marcadas. La flecha indica el pico máximo de elusión de la mezcla de proteínas marcadas (fracciones 6 y 7). B)
Las fracciones eluídas fueron sometidas a detección de proteínas biotiniladas en membranas de nitrocelulosa. La
flecha indica la presencia de opsina biotinilada en las fracciones 6 y 7. C) la membrana utilizada para la
detección de proteínas biotiniladas, fue expuesta a una placa de autorradiografía por 12 h a -70 °C, para la
detección del pico máximo de elución de las opsinas fosforiladas, el cual también correspondió a las fracciones 6
y 7.
95
exceso para el proceso de renaturalización. El segundo pico fue detectado a 280 nm,
correspondiente con la presencia de opsinas en la mezcla absorbiendo a esa
longitud de onda. Con estos resultados, fue evidente que la proteína no pudo ser
renaturalizada luego del tratamiento con SDS. Adicionalmente, es oportuno señalar
que la renaturalización de este tipo de proteínas integrales de membrana pudieran
requerir de la presencia de lípidos en el medio de renaturalización.
Dado que no se consiguió la reformación de la Rho nativa a partir de
incubación de sus precursores en oscuridad (opsina + 11-cis-retinal), se descartó la
realización del procedimiento final de co-precipitación del dímero híbrido (Rho-
biotína/Rho-[J-32P]), a partir de la unión por afinidad de su porción Rho-biotína a una
matriz de Steptavidina-agarosa.
Fig. 4.24 Fotoisomerización del retinal unido a la Rho no entrecruzada. La Rho fue solubilizada
desde las membranas SEBLav con el detergente OTG. La proteína purificada fue sometida a periodos
variables y sumativos de iluminación intensa. Tiempo de iluminación cero (Rho nativa) (espectro en azul);
5 seg de iluminación (espectro en negro); 20 seg de iluminación (espectro en verde); 45 seg de
iluminación (espectro en rojo); 60 seg de iluminación (espectro en fucsia). La flecha en azul señala el pico
máximo de absorción de la Rho en oscuridad (498.5 nm). La flecha en rojo indica la formación de
especies de Rho* como producto del cambio conformacional sufrido por luz de la proteína fotorreceptora.
La flecha en el medio de ambos picos máximos de absorbancia representa al punto de inflexión común
para todos los espectros a tiempos variables de isomerización.
4.24, como a medida que se realizaron los periodos sumativos de iluminación intensa
de la muestra de Rho control [20 seg (cabeza de flecha en verde), 45 seg (cabeza de
flecha en rojo), 60 seg (cabeza de flecha en fucsia) y 1 min (rojo)], se evidenció una
desaparición progresiva del pico a 498.5 nm, traduciéndose en un incremento del
pico a 380 nm (formación de las especies de Rho* a expensas de la Rho nativa). Es
importante destacar que para la población de Rho control, la cinética de
fotoisomerización del retinal unido, fue enteramente completada al minuto de
irradiación intensa de la muestra, es decir, se notó una completa desaparición de la
Rho nativa (absorbiendo a 498.5 nm), al minuto de iluminación, correspondiéndose
esto con una completa formación de Rho* (absorbiendo a 380 nm) a ese mismo
tiempo. En la Fig. 4.24, también se pudo notar como la progresión de la Rho a Rho*
fue un proceso casi directo y rápido, en el cual, no se evidenció la aparición visible en
los espectros, de ninguno de los fotointermediarios del fotorreceptor, formados entre
los estados absorbiendo a 498.5 nm y 380 nm. Esto se infiere por la presencia de un
punto de inflexión casi idéntico para todos los espectros en el rango de Abs de ~ 450
– 470 nm (ver Fig. 4.24).
Fig. 4.25 Fotoisomerización del retinal unido a la Rho entrecruzada con sulfo-SMCC. La Rho
embebida en membranas de los SEBLav fue entrecruzada con 5 mM sulfo-SMCC y posteriormente
solubilizada y purificada en presencia del detergente OTG. La Rho-sulfoSMCC fue sometida a un espectro
UV/Vis a tiempo cero de iluminación. La flecha en negro muestra el pico máximo de absorción a 498.5
(Rho-sulfo-SMCC). El espectro identificado como Rho*-sulfo-SMCC, corresponde a la fotoisomerización del
retinal unido a la Rho-sulfoSMCC luego de un periodo de 1 min de iluminación intensa y posterior
centrifugación de la fracción de Rho solubilizada e iluminada. La flecha en rojo indica el bloqueo del
cambio conformacional de la Rho iluminada con la aparición de un pico máximo de absorbancia a 470 nm,
correspondiente al fotointermediario (BSI o a la Meta I ), estabilizado por la reacción de la Rho con el
sulfo-SMCC.
Fig. 4.27 Modificaciones químicas de residuos de Cys y Lys involucrados en las reacciones de
entrecruzamiento con el sulfo-SMCC. La Rho purificada en OTG (1.28 PM), fue pre-incubada con los
modificadores N-etilmaleimida (NEM) para la modificación de residuos de Cys, o con fenil-isotiocianato (Pit C) o
anhídrido acetico (AA), para la modificación de residuos de Lys, por 1 h a 37 °C. Los modificadores estuvieron a
una concentración de 5 mM. Las Rho modificadas fueron incubadas con 5 mM sulfo-SMCC, por 1 h a 37 °C. Las
reacciones fueron cargadas en su totalidad para la EGPA-SDS. Las proteínas separadas fueron visualizadas por
tinción con plata. La Rho pre-incubada con NEM, Pit C, y AA y posteriormente sometidas a entrecruzamiento con
sulfo-SMCC (líneas 5, 8 y 9), respectivamente. Rho pre-incubada simultáneamente con NEM y AA o NEM y Pit
C, y posteriormente incubadas con sulfo-SMCC (líneas 10 y 11), respectivamente. Como controles de migración
de la Rho no tratada, se muestra a la Rho purificada en OTG (línea 1) y la Rho en buffer de reacción (línea 2).
Como controles de la reacción de modificación, se presenta a la Rho incubada con NEM, Pit C o AA (líneas 4, 6
y 7, respectivamente). Control de entrecruzamiento, Rho incubada con el sulfo- SMCC (línea 3). M, estándares
de peso molecular. R1 y R2 = productos monoméricos y diméricos de la Rho entrecruzada, respectivamente. Las
cabezas de flecha en negro, representan dímeros entrecruzados. Las cabezas de flecha en rojo, representan la
presencia de dímeros en los controles.
3
Fig. 4.28 Activación dependiente de la luz de la actividad de unión de [ H]GMPpNp de la T por la Rho
entrecruzada con sulfo-SMCC. La Rho control y la Rho-sulfoSMCC, fueron incubadas con la T, bajo
3
iluminación y en presencia de [ H]GMPpNp. La actividad de unión del análogo no hidrolizable fue ensayada
por filtración en membranas Millipore de acuerdo a lo descrito en Procedimientos experimentales. Los
experimentos realizados con la Rho no entrecruzada purificada en OTG representan el control de 100 % de
3
actividad de unión de [ H]GMPpNP a la T. Rho-sulfo-SMCC, representa la actividad de unión de la Rho
entrecruzada con el sulfo-SMCC.
107
3
Fig. 4.29 Cromatograma de la filtración en gel de las Rho-biotína y Rho-[ H]NEM. Rho-biotína y
3
Rho-[ H]NEM, fueron solubilizadas en 20 mM DM y cromatografiadas por separado en una columna de
Sephacryl S-300 en presencia de 10 mM DM. El seguimiento de la elución desde la Sephacryl S-300 de
3
la Rho-biotína y la Rho-[ H]NEM, fue realizado a 498.5 nm (A y B, respectivamente).Las flechas indican
3
el pico máximo de elución de la Rho-biotína (A, fracciones 41-43) y para la Rho-[ H]NEM (B, fracciones
57-59).
109
Fig. 4.30 Detección de la Rho-biotína eluída de la Sephacryl S-300 en presencia de 10 mM DM. Las
fracciones que registraron el pico de absorbancia a 498.5 nm (36-46), fueron sometidas a EGPA-SDS,
transferidas a filtros de nitrocelulosa y reveladas con avidína-HRP y diaminobenzidína. La flecha indica la
detección de la Rho-biotína migrando con masa molecular aparente de 35 kDa. El circulo en negro señala
las fracciones con mayor detección de Rho biotinilada (pico de elución en fracciones 41-43).
3
Fig. 4.31 Registro de la radioactividad de [ H]NEM (cpm) incorporada a la Rho eluída de la Sephacryl
S-300 en presencia de 10 mM DM. Una alícuota de 30 PL de las fracciones que registraron el pico de
absorbancia a 498.5 nm (50-63), fueron mezcladas con liquido de centelleo y analizadas en un contador de
3
centelleo liquido. La gráfica muestra la incorporación de [ H]NEM a la Rho en cpm vs. el numero de fracción.
La flecha indica el pico máximo de radioactividad de tritio correspondiente con el pico de elución de la Rho-
3
[ H]NEM (fracciones 57-59).
Como se pudo ser notar, la solubilización y separación por filtración en gel de las
Rho marcadas diferencialmente, a altas concentraciones de DM, se constituyeron en
condiciones experimentales capaces de forzar la separación in vitro de los arreglos
diméricos nativos de la Rho, obteniéndose especies que exhibieron pesos
moleculares promedios en el rango de 40.000. Estos pesos de Rho monomérica,
coincidieron con el peso molecular estimado para este fotorreceptor calculado a partir
de su secuencia primaria y considerando la composición de carbohidratos
adicionados post-trasduccionalmente al extremo N-terminal.
Fig. 4.32 Curva de calibración para la determinación del peso molecular de los complejos Rho-
3
biotína:DM- y Rho-[ H]NEM:DM eludios de la Sephacryl S-300 en presencia de 10 mM DM. Se
muestra la curva de calibración entre el coeficiente de partición (Kav) de las proteínas estándares de peso
molecular conocido, señaladas en Procedimientos experimentales vs el Log del peso molecular de las
mismas, separadas en presencia de 10 mM DM. Las posiciones de elución de los complejos de Rho-
3
biotína:DM ( ) (A) y Rho-[ H]NEM:DM (i) (B), fueron determinados como se muestra en las Fig. 4.30 y
4.31.
112
La Rho nativa puede ser cortada en dos fragmentos grandes por efecto de la acción
endoproteolítica de la termolisina (Saari, 1974). Los fragmentos termolíticos
resultantes de la digestión del fotorreceptor fueron descritos como dos péptidos
denominados: F1, el cual comprende comprendiendo la extensión desde la Met1 a la
Ser240 (~ 26 kDa) y el F2 desde la Ala241 a la Pro327 (~12 kDa) (Hargrave, 1982). En
función de conocer si dicho patrón termolítico variaba cuando la Rho era disociada a
una condición monomérica por efecto de su aislamiento por filtración molecular en
gel en presencia de 10 mM DM, se procedió a realizar las reacciones de proteolisis
con termolisina de la Rho monomérica. Para la reacción de proteolisis se uso un
cociente de Rho:termolisina de 20:1, a temperatura ambiente por 16 h. Como
control, se realizó en paralelo la reacción de proteolisis con termolisina de la Rho
dimérica nativa (aislada por filtración molecular en gel en presencia de 2 mM DM). La
Rho en su condición nativa debería generar los fragmentos termolíticos esperados
tipo F1 y F2 publicados por Hargrave (1982). En la Fig. 4.33 se muestra el gel de
poliacrilamida-SDS al 15 % teñido con plata, resultante de la electroforesis de las
reacciones de proteolisis. En las líneas 1 y 2, se muestra el perfil electroforético de
las fracciones de la Rho monomérica y la Rho dimérica aisladas por filtración en gel
usando una resina de Sephacryl S-300, en presencia de 10 mM o 2 mM DM,
respectivamente. Nótese como en concordancia con lo descrito en la sección 4.7.1,
la cromatografía de exclusión molecular de la Rho en presencia de 10 mM DM,
efectivamente logró disociar la condición oligomérica del receptor a un estado
monomérico artificial. Esto fue visualizado por la ausencia en la fracción de Rho
monomérica (línea 1) de especies de tipo dimérica (R2) o triméricas (R3) señaladas
con las flechas respectivas, las cuales estuvieron presentes en la fracción de Rho
dimérica (línea 2). Cuando la Rho monomérica o dimérica fue sometida a proteolisis
con termolisina (líneas 3 y 4, respectivamente), se pudo notar como la Rho
monomérica a diferencia de la Rho dimérica, fue solo parcialmente digerida por la
termolisina, generando un polipéptido de ~ 25 kDa. Este fragmento es coincidente
113
con el fragmento termolítico F1 publicado por Hargrave (1982) (ver Fig. 4.33, F1
señalado con la flecha roja). Sin embargo, nótese como una importante cantidad de
Rho monomérica fue resistente a la proteolisis. Contrariamente, la banda de 35 kDa
(R1) de la fracción dimérica fue completamente digerida durante la reacción. Este
hecho fue evidente al comparar la banda R1 de la línea 2 (Rho dimérica sin
termolisina), con la banda R1 de la línea 4 (Rho dimérica proteolisada). Por otra
parte, el arreglo oligomérico nativo de la Rho presente en la fracción dimérica,
protegió a los monómeros que conformaban tales arreglos, ya que ninguna variación
en dichas bandas (R2 y R3) fue evidenciada después de la reacción (ver líneas 2 y
4). Finalmente, a pesar de no haberse visualizado el fragmento termolítico F2 (~ 12
kDa), ni en la proteolisis de la Rho monomérica ni en la de la Rho dimérica, se infiere
que dicho fragmento fue evidentemente formado ya que en ambas fracciones ocurrió
la reacción de proteolisis, generándose el fragmento F1 de ~ 25 kDa. Este hecho
podría ser explicado por la escasa cantidad formada del fragmento F2 luego de la
proteolisis, o bien por la digestión secundaria del mismo vez generado en la reacción
del primer corte.
Fig. 4.33. Proteolisis con
termolisina de la Rho
monomérica o dimérica.
Gel de poliacrilamida-SDS
al 15 % teñido con plata
de las reacciones de
proteolisis con
termonilsina de la Rho (2
Pgs). Las líneas 1 y 2
representan a la Rho
monomérica y dimérica en
ausencia de termolisisma,
respectivamente. Las
líneas 3 y 4, representan a
la Rho monomérica y
dimérica incubadas por 16
h a temperatura ambiente,
con la termolisina a una
proporción de 20:1
Rho:termolisina. R1, R2
y R3 = monómeros,
dímeros y trímeros. F1 =
fragmento termolítico. M =
marcadores de peso
molecular.
114
5. DISCUSIÓN
resultados son consistentes con la forma asimétrica deducida aquí para la proteína
fotorreceptora.
Los resultados encontrados y publicados de esta investigación, fueron
criticados por Chabre y le Maire, (2005), específicamente por la estrategia de
sustracción del peso molecular de la micela de DM (50.000) (Rosesevear y col.,
1980), al peso molecular total de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM, para obtener
un peso molecular de 78.000 y 76.000 para la Rho y Rho* diméricas aisladas por
exclusión molecular, respectivamente. Estos autores criticaron el uso de esta
estrategia para determinar el tamaño de una proteína de membrana como lo es Rho,
indicando que la masa de detergente unido a la proteína no es necesariamente
equivalente a la masa estimada para la micela de detergente. En este sentido se
adujo que, para proteínas con uno o pocos segmentos transmembranales D-
helicoídales, el tamaño de la micela de detergente puede ser equivalente a la
cantidad de detergente unido (Robinson y Tanford, 1975; le Maire y col., 2000), pero
para proteínas mas grandes conteniendo 7-11 segmentos transmembrana, el peso
molecular de la micela pudiera ser distinto al peso estándar publicado para la misma,
estimado por Rosevear y col. (1980), siendo entonces mayor la cantidad de
detergente unido a estas proteínas grandes (le Maire y col., 2000). Esto permite
inferir que la unión de detergente a una proteína de membrana estaría
proporcionalmente relacionada con el tamaño de sus sectores hidrofóbicos. Sin
embargo, resultados contradictorios en este sentido fueron encontrados cuando se
revisó por ejemplo, la unión del detergente DM a la proteína de membrana Ca+2-
ATPasa, por procedimientos de exclusión molecular en condiciones ligeramente por
encima o por debajo de la concentración micelar critica del DM. Möller y le Maire
(1993), reportaron una unión de detergente de 0.9 g/g de la proteína Ca+2-ATPasa,
en su forma monomérica, bajo condiciones ligeramente por encima de la CMC del
detergente. No obstante, cuando el procedimiento se llevó a cabo a concentraciones
ligeramente por debajo de la CMC y solo existían formas oligoméricas de la Ca+2-
ATPasa, a penas 0.4-0.5 g de detergente se unieron por g de la proteína oligomérica.
Es decir, cuando la proteína se encontraba en su forma oligomérica, unió menor
cantidad de detergente en comparación con la cantidad de detergente unido a la
120
indicaron que el valor del coeficiente de sedimentación de 5.78 S para los complejos
de Rho:DM y Rho:DM son “sin sentido” y falsos ya que “la utilización de
ultracentrifugaciones en gradientes de sacarosa para la medición de coeficientes de
sedimentación de proteínas de membrana, debe ser aplicada con gran precaución”.
Sin embargo, pareciera que este comentario surgió a raíz de la incredulidad de que
la interpolación del producto de los radios de Stokes y el coeficiente de
sedimentación de los complejos de Rho en detergente, en una curva de calibración
estándar de masa (M) versus el radio de Stokes (a) multiplicado por en coeficiente de
sedimentación (S) (a : 5resultara en los pesos diméricos indicados para la Rho
en DM. En efecto, dicha calibración y los resultados de la misma fueron realizados, y
son mostrados en la Fig. 4.16 de este trabajo. Con base en tal calibración, se
obtuvieron pesos para los complejos Rho:DM y Rho*:DM iguales a 107.000 y
111.000, respectivamente. Al sustraer el peso molecular de la micela (50.000), se
obtuvieron pesos moleculares de 57.000 y 61.000 para la Rho y la Rho*,
respectivamente. Al relacionar los valores de radios de Stokes de 4.18 nm (Rho) y
4.15 nm (Rho*), con el coeficiente de sedimentación de 5.78 S para ambos
complejos (Siegel y Monty, 1966), y encontrar valores de peso molecular
equivalentes a dímeros de Rho, se aportó credibilidad per se, a los resultados
encontrados en este trabajo, dejando sin efecto la critica realizada por Chabre y le
Maire (2005). Los críticos a los resultados presentados aquí, sugirieron la invalidez
de los mismos ya que en el presente trabajo, no se hizo referencia al trabajos previos
realizados por Le Maire y col. (1986), en los cuales, se argumentó la existencia de
Rho monomérica con un radio de Stokes de 4.8 nm. En respuesta a esta critica, se
argumenta la no-inclusión de dicho trabajo, dado que estos autores usaron un
detergente inadecuado para la solubilización y caracterización hidrodinámica de la
Rho, como lo fue el C12E8. Como se indicó arriba, este detergente afecta fuertemente
la estructura y conformación nativa de la proteína, razón por la cual, los resultados
obtenidos referentes a la existencia de la Rho como un monomérica, no pueden
reflejar la condición nativa de la proteína inserta en las membranas.
Finalmente y para complementar la defensa de los resultados de la
caracterización hidrodinámica de la Rho realizada aquí, curiosamente en el trabajo
124
desde el mismo monómero en el dímero adyacente. Los contactos entre las líneas de
dímeros son mantenidos a través de residuos hidrofóbicos desde la hélice H-I, en el
lado extracelular. Por estos argumentos, la formación de trímeros y oligómeros
entrecruzados puede ser fácilmente explicada por la existencia de estas varias
interfases de interacción entre los dímeros y entre las líneas de dímeros.
Interesantemente, una pequeña proporción de los complejos de Rho:DM y Rho*:DM
fueron fuertemente absorbidos en el tope de la resina de Sephacril S-300.
Adicionalmente, una facción mínima cantidad de los complejos Rho:DM y Rho*:DM
(~ 10 %), sedimentaron en la base de los tubos de centrifuga durante la
ultracentrifugación isopícnica sobre los gradientes de sacarosa del 10-30 %. Estos
resultados sugirieron la existencia de algunos oligómeros de la Rho aún en presencia
de DM, lo cual probablemente contó para la aparición de productos con altos pesos
moleculares obtenidos desde el entrecruzamiento de los complejos Rho:DM y
Rho*:DM. En el caso de la Rho* solubilizada, un aumento de las especies diméricas,
trimeritas y multiméricas de la Rho fue aparente, lo cual fue consistente con la
reactividad adicional de los grupos sulfidrílos previamente reportada para la Rho*
(Fung y Hubbell, 1978) y con los cambios conformacionales producidos en la Rho
luego de su iluminación (Farrens y col., 1996; Sheik y col., 1996; Fritze y col., 2003;
Abdulaev y col., 1998).
Chabre y le Maire (2005), hicieron una critica no sustentada en los datos
resultantes de los ensayos de entrecruzamiento químico de la Rho en membranas
SEB o solubilizada en DM; publicados aquí. Estos investigadores, sugirieron que la
formación de productos entrecruzados diméricos, triméricos y oligoméricos de la
Rho solubilizada en DM, obedecían a que estos ensayos fueron realizados cuando la
Rho había sido supuestamente solubilizada a una concentración de DM por debajo
de la CMC, o incluso en ausencia de detergente. Es decir, supuestamente, las bajas
concentraciones del detergente favorecieron la agregación inespecífica de la proteína
en solución, y como consecuencia, los dímeros, trímeros y oligómeros encontrados
en este trabajo, habrían sido artificialmente inducidos. En este sentido, es oportuno
señalar que, la CMC del detergente ha sido medida en 0.18 mM. Los ensayos de
entrecruzamiento de la Rho presentados aquí fueron realizados cuando esta proteína
128
fue solubilizada en 1.96 mM DM (10.8 veces por encima de la CMC del detergente).
En consecuencia, en esta investigación se garantizó que los productos de
entrecruzamiento estuvieron muy lejos de representar agregaciones tipo inespecífica
de la Rho incompletamente solubilizada. Más complejo aún, la solubilización del
receptor en detergente y la ejecución de los ensayos de entrecruzamiento a
concentraciones inferiores a 10 PM (1.28 PM), sirvió para reducir la probabilidad de
que los productos entrecruzados resultarán de colisiones accidentales y aleatorias
entre monómeros, flotando libremente en solución.
Adicionalmente, Chabre y le Maire (2005), argumentaron que los productos del
entrecruzamientos de la Rho en membrana presentados aquí, serían de esperarse
dado que la Rho en su medio ambiente de membranas presenta una concentración y
un empaquetamiento muy alto. En este sentido, la simple difusión en dos
dimensiones de la proteína dentro del plano de la membrana durante los 30 min
incubación con el entrecruzador, podría conducir a un entrecruzamiento por colisión
aleatoria de los monómeros”. Esta afirmación, extraída del articulo de Chabre y le
Maire (2005), es indudablemente cierta. Sin embargo, y basado en todo lo expuesto
en esta discusión referente a los entrecruzamientos y las densidades de la Rho, la
afirmación de que la Rho pudiera existir como una proteína dimérica/oligomérica no
surgió de los ensayos de entrecruzamiento en membranas. Por lo contrario, en este
trabajo se dio énfasis a los resultados de entrecruzamiento de la Rho solubilizada y a
concentraciones a las cuales las probabilidades de colisión aleatoria y accidental
entre monómeros en solución serían improbables (Davies y Stark, 1970). En un
análisis aun más profundo y como fue indicado arríba, la posibilidad de que los
productos entrecruzados de Rho correspondieran a la estabilización de interacciones
aleatorias e inespecíficas del fotorreceptor, fue excluida con las reacciones de
entrecruzamiento de la Rho en función del tiempo y de la concentración del receptor.
En estos abordajes, no se evidenció variación alguna de la proporción dímero:
monómero, aún a altas concentraciones de la proteína fotorreceptora. Este hallazgo
indicó que las interacciones Rho-Rho eran estables y naturales y que no
incrementaban por el hecho de existir mayor densidad de proteínas en el medio.
129
Estos argumentos nuevamente dejan sin efecto las criticas realizadas por los
defensores de una disposición monomérica para la Rho.
La formación de dímeros entrecruzados intermolecularmente de la Rho fue
siempre incompleta más que estequiométrica. Sin embargo, diversos factores
pueden haber influenciado la formación de productos entrecruzados. Estos incluyen
la disponibilidad de los residuos de aminoácidos apropiados en las proteínas, la
especificidad química de los entrecruzadores bifuncionales, y las condiciones de la
reacción. Los resultados negativos en los experimentos de entrecruzamiento
químico, no demuestran conclusivamente que dos componentes proteicos no estén
en cerrada interacción uno con el otro. Una falta de productos entrecruzados puede
ser el resultado de la inadecuada disposición de los grupos reactivos en las cadenas
de polipéptido adyacentes. En adición a lo anterior, la reacción de cada uno de los
grupos funcionales de los reactivos entrecruzadores con los aminoácidos blanco de
la proteína, es una competencia entre la formación de los productos deseados y la
posibilidad de hidrólisis de los reactivos. Por ejemplo, ha sido publicado que los dos
anillos reactivos de la maleimída de las bismaleimídas tales como o-PDM y p-PDM,
son hidrolizados mucho mas rápido que el anillo simple de maleimída del análogo
monofuncional N-etilmaleimída. La rápida hidrólisis de un anillo de la bismaleimída
puede reflejarse en una baja reactividad de este reactivo hacia las Cys y Lys. Por
tanto esta hidrólisis puede limitar la extensión del entrecruzamiento de la proteína por
la bismaleimída. En consecuencia, cualquiera de estos factores individualmente o en
combinación podría generar una incompleta formación de productos entrecruzados
de la Rho en la unidad dimérica.
La modificación de Cys con el reactivo N-etilmaleimída o de Lys con fenil-
isotiocianato, por separado o en conjunto desde las interfases de interacción entre
las dos rodopsinas de un dímero o entre cadenas polipeptídicas constantes dentro de
los monómeros del mismo dímero, evidenció la incapacidad del entrecruzador de
intercalarse en la estructura de la proteína. Este hecho sería fácil de explicar ya que
la ocupación previa de estos residuos por los modificadores químico-específicos,
inhabilitaría a los mismos como blanco para las reacciones de entrecruzamiento. En
este sentido, las reacciones de protección de residuos de Cys y Lys, fueron
130
empleadas en este estudio como una herramienta para demostrar que efectivamente
los productos de entrecruzamiento de la Rho, fueron formados por la interacción
especifica de Cys y Lys, accesibles al entrecruzador sulfo-SMCC. En efecto este
comportamiento fue el evidenciado en los resultaos de modificación química
presentados y analizados en este trabajo. Estos resultados sugirieron que los
reactivos N-etilmaleimída y fenil-isotiocinato fueron específicos para modificar
justamente aquellos residuos involucrados en las reacciones de entrecruzamiento, lo
cual no fue el caso del modificador de Lys, anhídrido acético, el cual a pesar de
modificar estos residuos, no modificó aquellos residuos de Lys directamente
involucrados en la reacción con el sulfo-SMCC. Las pre-incubaciones en presencia
de NEM y el AA, no lograron prevenir la reacción de entrecruzamiento.
En este trabajo se evidenció que las reacciones de entrecruzamiento
intermolecular con sulfo-SMCC fueron no estequiométricas y, que los monómeros
que forman a los dímeros nativos de la Rho incubada con el entrecruzador sulfo-
SMCC, fueron incapaces de activar el intercambio de nucleótidos de G de la T en
presencia de la luz. De acuerdo con esto, el entrecruzador pudiera estar ejerciendo
un efecto de modificación monofuncional o bien una reacción de entrecruzamiento
intramolecular. Sin embargo, las modificaciones químicas de la Rho con reactivos
sulfidrílo-específicos (Ortiz y Bubis, 2001) o con reactivos modificadores de Lys
(Bubis y col., 1995), no afectan la funcionalidad de la proteína fotorreceptora en
cuanto a su reconocimiento y unión a la proteína G, T o bien sobre su capacidad de
inducir la unión de nucleótidos de guanina de la T, ambas dependientes de la luz. Si
el entrecruzador hubiera ejercido únicamente un efecto de modificación
monofuncional de los residuos de Cys y Lys, la proteína incubada con el
entrecruzador debería haber presentado una funcionalidad intacta, lo cual no fu el
caso. Los resultados presentados aquí indirectamente sugieren que los monómeros
conformando tales arreglos supramoleculares de la Rho, son susceptibles a
reacciones de entrecruzamiento intramolecular, dado que, si el entrecruzador hubiera
ejercido únicamente un efecto de modificación monofuncional de los residuos de Cys
y Lys, la proteína incubada con el entrecruzador debería haber presentado una
funcionalidad intacta, lo cual no fu el caso, ya que la Rho dimérica no estabilizada por
131
entrecruzador entre las hélices H-III y H-IV en un mismo monómero, o bien entre las
hélices de la interfase de interacción H-IV y H-V entre monómeros de un mismo
dímero, se traduciría en efectos equivalentes a una inmovilización de dichas regiones
o regiones vecinas mediado por el entrecruzador bifuncional. El proceso de
isomerización del retinal ha sido ampliamente estudiado y caracterizado. En este
sentido, los diversos picos de absorción de la Rho desde su estado basal (Rho Ȝ max
500 nm) hasta su estado fotolizado Rho* (MII Ȝ max 380 nm ), representa una
colección de estados de energía solapados. A este respecto, la estructura de polieno
extendida de este cromóforo, determina las propiedades de absorción en el visible,
fundamentando la existencia de todos los fotointermediarios identificados en la
transición desde Rho a Rho*. Los fotointermediarios no son más que el producto de
las estructuras de resonancia del retinal unido a la opsina (Rando, 1996). El
fotointermediario de 470 nm que se logró estabilizar pudiera corresponder al
fotointermediario desplazado hacia el azul, comúnmente conocido como el Blue
Shifted Intermediary (BSI) o a la metarodopsina I (Meta I), ambos señalados con un
circulo amarillo en la Fig. 5.1 (Menon y col., 2001). El “congelamiento” por
entrecruzamiento con sulfo-SMCC del fotointermediario BSI o de la Meta I, hace un
gran aporte para futuras caracterizaciones de este fotointermediario, haciéndolo
permanentemente disponible para estudios estructurales, los cuales no serian
posibles sin su estabilización, ya que estos intermediarios se caracterizan por
presentar vidas medias extremadamente pequeñas. Nótese en la figura 5.1, como los
tiempos estimados de vida media de ambos fotointermediarios a sido medida en
nanosegundos (BSI) o microsegundos (Meta I). Estas cortas vidas medias en
fracciones de segundos requeridos para la progresión de un fotointermediario al
sigueinte, estarían en concordancia con la velocidad requerida para la activación del
receptor y ocurrencia de la cascada de señalización visual. En cuanto a lo poco que
se ha podido conocer de estos fotointermediarios, ambos se caracterizan por
presentar su base de Schiff imina en su forma protonada, a pesar del evento de
tautomerización del 11-cis-retinal unido hacia su forma todo-trans. Este hecho se ha
propuesto es debido a la estabilización de la base de Schiff imina por su contraión, el
residuo Glu113 (Sakmar y col., 1989). El entrecruzador sulfo-SMCC, detuvo el cambio
133
conformacional de la proteína justo antes del del evento que promueve la formación
de la metarodopsina II (meta II), en la cual ocurre la desprotonación de la base de
Schiff imina y la consecuente protonación del Glu113 (Lewis y Kliger, 2000).
Fig.5.1. Fotociclo de la Rodopsina. La fotoisomerización ocurre en una escala de tiempo ultra rápida formándose
en primer lugar la fotorodopsina (570 nm) a los fentosegundos (fs) de la absorción del foton de luz. El pigmento
fotolizado progresa hacia los intermediarios espectrales Batho, BSI, lumi, metaI, meta II, meta III, cada uno
caracterizado por registrar las absorbancias máximas a las longitudes de onda indicadas en la Fig.Cada valor de
longitud de onda máxima a la cual absorben los fotointermediarios esquematizados surge de la relajación gradual
de la proteína alrededor del 11-trans-retinal. Los cambios en las interacciones cromoforo-proteín generan los
distintos picos de absorbancia máxima a una longitud de onda especifica. La base de Schiff imina protonada
permanece hasta el fotointermediario Meta I. Esta condición cambia cuando se forma la meta II, el único
fotointermediario capaz de catalizar el intercambio de nucleótidos de guanina de la T. Tomado de Menom y col.
(2001).
DM), publicado por Jastrzebska y col. (2004). Como fue evidenciado, en este trabajo
se logró el aislamiento de monómeros de Rho, a partir de la solubilización con 20 mM
DM de las membranas SEBLav previamente marcadas con NHS-biotína o [3H]-NEM, y
cromatografiadas en Sephacril S-300 a 10 mM DM. En efecto, con este
procedimiento se pudo evidenciar la obtención monómeros de Rho-biotína con masa
molecular de 34.6 kDa y monómeros de Rho-[3H]-NEM con una masa equivalente a
45.5 kDa. Estos resultados son completamente coincidentes con lo publicado por
Jastrzebska y col. (2004). La obtención de estos monómeros de Rho marcados
diferencialmente pudiera representar el comienzo de una estrategia basada en la
reversión de tal condición monomérica a altas concentraciones de DM, a una
condición dimérica nativa por dilución de la cantidad de detergente en la mezcla de
las rodopsinas marcadas diferencialmente y en proporción molar 1:1. La reducción
de la concentración del detergente a ~ 2 mM, en una mezcla equimolar de ambas
especies de Rho marcadas, podría favorecer la re-formación de dimeros híbridos de
Rho (heterodímeros de Rho-biotína/Rho-[3H]-NEM). Sobre estos heterodímeros sería
factible realizar los ensayos de co-precipitación con stevtavidina-agarosa de la Rho-
[3H]-NEM que se encuentre interactuando con la Rho-biotína. Estos resultados
servirían como una prueba adicional de tipo bioquímico para complementar los
resultados obtenidos aquí, que señalaron la estructura cuaternaria dimérica de la
Rho nativa. Las opciones presentadas anteriormente resultan en abordajes
interesantes a futuro para evaluar el estado oligomérico nativo de la Rho solubilizada
en detergente.
Las reacciones de proteolisis con termolisina de la Rho monomérica
entrecruzada con sulfo-SMCC, permitieron sugerir de forma indirecta la
susceptibilidad de esta proteína para sufrir reacciones de entrecruzamiento
intramolecular. Esto fue inferido por la ausencia de fragmentos termolíticos F1 luego
de la incubación de la Rho-sulfo-SMCC con la termolisina. Sin embargo, luego del
entrecruzamiento intramolecular o intermolecular de la Rho, fueron evidentes los
problemas para la tinción con plata de la Rho entrecruzada. En este sentido, la no-
visualización de fragmentos termolíticos F1 en la Fig. 4.34 (línea 3), podría ser
debida a una resistencia de los monómeros de Rho a la reacción de proteolisis, como
138
fue referido en los resultados. Sin embargo, con los resultados presentados aquí, no
se puede descartar que la reacción de proteolisis haya tenido lugar, pero
considerando el problema evidente de tinción de las Rho entrecruzadas, quizás no
fue posible o evidente la aparición de los mismos en el gel teñido con plata a pesar
de que pudieran haberse formado >Fig. 4.34 (línea 3)@. En tal caso, se requiere de la
repetición de estos ensayos de proteolisis de la Rho monomérica entrecruzada con
sulfo-SMCC y visualizar las reacciones en una EGPA-SDS teñido con plata.
Paralelamente debe realizarse una inmunotinción de las mismas reacciones con el
monoclonal 1D4. Esto permitiría descartar si realmente la Rho monomérica
entrecruzada siguió intacta posterior a la proteolisis, o si por el contrario, la reacción
de digestión fue productiva. Esto podría servir para descartar los referidos problemas
evidentes de la tinción con plata de la Rho entrecruzada.
La presencia del entrecruzador intercalado intramolecularmente en la estructura de la
Rho monomérica, pudiera de alguna manera resultar en una posible estabilización
covalente de los fragmentos termolíticos de la Rho. Esta hipotesis sería factible en el
caso de que el entrecruzador se encuentre interactuando en residuos de Cys y Lys a
cada lado del sitio de digestión de la proteína con la termolisina. Esto se traduciría en
una limitante para el reconocimiento de los fragmentos termolíticos en EGPA-SDS ya
que a pesar de haberse producido los mismo, el entrecruzador pudiera estar
enlazándolos covalentemente de forma tal que antes y después de la digestión, solo
se observaría la banda de 35 kDa, similar al peso aparente de un monómero. Dado
que esto fue lo observado en los resultados reportados en la Fig. 4.34, fue de interés
encontrar una explicación a estos resultados. A partir de un análisis computacional
usando el software Rasmol (versión 2.7.1.1), realizado sobre la estructura cristalina
de la Rho bovina depositada en el banco de datos de proteína, bajo el identificador
1U19, se analizaron las distancias moleculares entre las 10 Cys y 10 Lys existentes
en la estructura primaria de la Rho bovina, con la finalidad de identificar aquellos
residuos que se ubicaran a las distancias apropiadas para permitir la intercalación del
sulfo-SMCC a nivel intramolecular. A nivel de la asa citoplasmática IC-III,
específicamente en el final citoplasmático de la hélice H-VI, existen dos residuos de
lisina (Lys245 y Lys 248). Adicionalmente, en el final citoplasmático de la H-III existe un
139
residuo de cisteína (Cys140). Los finales citoplasmáticos de las hélices H-III y H-VI se
encuentran interaccionando cuando la Rho esta en su estado nativo (oscuridad), lo
cual fue demostrado por Sheick y col. (1986 y Farrens y col. (1986). Considerando tal
proximidad entre los finales citoplasmáticos de estas hélices y que el agente sulfo-
SMCC tiene grupos reactivos para Cys y Lys, ubicados a distancias no mayores de
11.6 Å, es importante destacar que la existencia de una Cys140 en el final
citoplasmático de la H-III y de las Lys245 y Lys248 en el final citoplasmático de la H-VI,
pudieran hacerlos blancos reactivos para el entrecruzador. El sitio de corte de la Rho
por la termolisina fue identificado por Saari (1974) al nivel de la Ser240. La Ser240 se
encuentra entre los residuos blanco tentativos para la reacción de entrecruzamiento
con el sulfo-SMCC (Cys140, Lys245 y Lys248). En este punto era importante determinar
cuales de los residuos señalados como blancos tentativos de entrecruzamiento para
el sulfo-SMCC, presentaban la disposición espacial mas apropiada. En la Fig. 5.2
(A), se muestra la estructura cristalina de la Rho bovina procesada con el Software
Rasmol) (estructura en diagrama de cintas presentado en color gris). En esta
representación tridimensional de la Rho se resaltan los residuos de Cys140 (rojo),
Lys245 (verde) y Lys248 (amarillo), todos mostrados en diagrama de bolas y barras.
Cuando se analizó la distancia molecular entre la Cys140 (en la hélice H-III) y la Lys245
(en la hélice H-VI), usando el comando específico en Rasmol, se pudo conocer que
ambos residuos están separados a una distancia de 15.2 Å (ver Fig. 5.2, B). Dado
que el entrecruzador sulfo-SMCC enlaza residuos a distancias de 11.6 Å, sería
probable que el agente estuviera intercalándose entre estos residuos, ya que la
disposición de las hélices transmembranales no es rígida y permitirían la
intercalación del entrecruzador. Adicionalmente, cuando se analizó la distancia
molecular entre la Cys140 y la Lys248, se pudo conocer que dichos residuos están
separados por una distancia de 11.98 Å (ver Fig. 5.2, C). A esta distancia, también
sería factible que el sulfo-SMCC estuviera intercalándose entre los mismos. En
ambos casos, la intercalación del sulfo-SMCC y la posterior reacción de proteolisis
con termolisina de la proteína entrecruzada, pudiera haber favorecido que: aunque
la proteolisis haya tenido lugar en la Ser240, los fragmentos no hayan podido ser
liberados, dado que el entrecruzador estaría manteniéndolos unidos. Este análisis
140
Fig. 5.2 Análisis de las distancias moleculares de residuos de Cys y Lys de la Rho propuestos como
blancos de acción para el entrecruzador sulfo-SMCC. A) Diagrama de cintas de la Rho bovina presentando los
residuos de Cys140 (rojo), Lys245 (verde) y Lys248 (amarillo), resaltados en diagrama bolas y barras utilizando el
Software para análisis y visualización de macromoléculas Rasmol. B) Análisis en Rasmol, de la distancia
molecular entre la Cys140 y la Lys245. La línea amarilla uniendo los átomos de azufre (S) de la cisteína y el
nitrógeno amino (N) de la lisina, representa la distancia molecular entre ambos aminoácidos (15.2 Å). C) Análisis de
la distancias molecular entre la Cys140 y la Lys248. La línea amarilla representa la distancia molecular entre ambos
aminoácidos (11.98 Å).
141
Fig. 5.3 Análisis de disponibilidad espacial de los residuos de Lys245 o la Lys248 para la reacción en
conjunto con el sulfo-SMCC interaccionando con la Cys140. A) Diagrama de bolas y barras representando la
zona molecular circundante a los residuos de Cys140 (rojo) y Lys245 (verde) o Lys248 (amarillo), tentativamente
comprometidos en la reacción de entrecruzamiento de la Rho con el sulfo-SMCC. B) Diagrama de espacios llenos
representando la zona molecular circundante a los residuos de Cys140 (rojo) y Lys245 (verde) o Lys248 (amarillo) y
la disposición más apropiada y accesible de la Lys248 con respecto a la Cys140 para la interacción con el sulfo-
SMCC. La Lys245 (verde), se encuentra insertada muy profundo en la estructura de la proteína de forma que se
encuentra limitada estéricamente para la interacción con el sulfo-SMCC unido covalentemente a la Cys140.
relacionada con la siguiente por una rotación en tornillo de dos pliegues que
posicionarían al NH2 terminal desde el dominio similar a ras o dominio de GTPasa de
una subunidad, dentro del dominio D-helical de la subunidad adyacente (Mixon y col.
(1995). En un medio ambiente de membranas donde la concentración de
macromoléculas es alta, las cinéticas de interacción entre el receptor y la proteína G
es probablemente de tipo difusión-limitada. Evidentemente, la formación de dímeros
y oligómeros de Rho solventaría estas limitaciones permitiendo que las moléculas de
T interactúen con cúmulos localmente concentrados de dímeros de Rho. Por otra
parte, la formación de complejos multiméricos de T, podría también permitir la
interacción de los dímeros de Rho con los cúmulos de subunidades TD. Ambos
fenómenos facilitarían y explicarían la amplificación de la respuesta a la luz.
Este trabajo doctoral presentó evidencias bioquímicas claras e in ambiguas de
la existencia de la Rho y la Rho* arregladas en una organización supramolecular
nativa de tipo dimérica, en su estado solubilizado en n-dodecil E-D-maltósido.
Similarmente, en este trabajo se sugirió la existencia del fotorreceptor visual
embebido en membranas de los discos de los SEB, con un arreglo nativo de tipo
dimérico/oligomérico. La Rho y la Rho* presentaron pesos moleculares de 78.000 y
76.000 medidos por técnicas de filtración molecular en gel, respectivamente para
cada especie. Pesos de 57.000 y 61.000 fueron estimados para la Rho y la Rho* por
procedimientos de sedimentación por ultracentrifugación. Estos pesos
correspondieron con aproximadamente el doble del peso molecular estimado para la
proteína fotorreceptora, deducido a partir de su estructura aminoacídica primaria y
sus respectivas modificaciones post-trasduccionales de tipo glicosilación N-terminal.
148
6. CONCLUSIONES.
7. BIBLIOGRAFÍA.
x Angers, S., Salahpour, A., Joly, E., Hilairet, S., Chelsky, D., Dennis, M., y
Bouvier, M. (2000). Detection of ȕ2-adrenergic receptor dimerization in living
cells using bioluminescence resonance energy transfer (BRET). Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. (97) 3684-3689.
x Barrett, W. C., DeGnore, J. P., Konig, S., Fales, H. M., Keng, Y. F., Zhang, Z. Y.,
Yim, M. B., y Chock, P. B. (1999) Regulation of PTP1B via glutathionylation of
the active site cysteine 215. Biochemistry (38), 6699-6705.
152
x Baylor, D. (1996). How photons start vision Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (93):
560-565.
x Bubis, J., Ortiz, J. O., Moller, C., y Millan, E. J. (1995) in Methods in Protein
Structure Análisis (Atssi, M. Z., y Appella, E., eds) pp. 227-250, Plenum
Publishing Corp., New York.
x Bubis, J., Ortiz, J., Möller, C., y Millan, E. J. (1995) Identification and
characterization of transducin functional cysteines, lysines, and acidic residues
by group-specific labeling and chemical cross-linking. In: ATASSIMZ,
153
x Bubis, J., y Taylor, S. S. (1985) Covalent modiication of both cAMP binding sites
in cAMP-dependent protein kinase I by 8-azidoadenosine 3’, 5’-
monophosphate. Biochemistry (24), 2163-2170.
x Chabre, M. (1975). X-ray diffraction studies of retinal rods structure of the disc
membranes, effect of illumination. Biochim. Biophys. Acta (382) 322-335.
x Chabre, M., Cone, R., y Saibil, H. (2003). Is rhodopsin dimeric in native retinal
rods? Nature. (426) 30-31.
x Champeil, P., Menguy, T., Tribet, C., Popot, J. L., y le Maire, M. (2000)
Interactions of amphipols with sarcoplasmic reticulum Ca+2-ATPase. J. Biol.
Chem. (275), 18623-18637.
x Dean, M. K., Higgs, C., Smith, R. E., Bywater, R. P., Snell, C. R., Scott, P. D.,
Upton, G. J., Howe, T. J., y Reynolds, C. A. (2001) Dimerization of G-protein-
coupled receptors. J. Med. Chem. (44), 4595-4614.
x Eaton, P., Byers, H. L., Leeds, N., Ward, M. A., y Shattock, M. J. (2002). J. Biol.
Chem. (277), 9806-9811.
155
x Ernst, O. P., Meyer, C. K., Marin, E. P., Henklein, P., Fu, W. Y., sakmar, T. P., y
Hofmann, K. P. (2000). Mutation of de fourth cytoplasmic loop of rodopsina
affects binding of transducin and peptides derivated from the carboxyl-terminal
sequences of transducin and D y J subunits. J. Biol. Chem. (275), 1937-1943.
x Farrens, D. L., Altenbach, Ch., Yang, K., Hubbell, W. L., y Khorana, G. (1996).
Requirement of rigid-body motion of transmembrane helices for light activation
of rhodopsin. Science. (274): 768-770.
x Feron, O., Smith, T. W., Michel, T., y Kelly, R. A. Dynamic targeting of the
agonist-stimulated m2 muscarinic acetylcholine receptor to caveolae in cardiac
myocytes. J. Biol. Chem. (272) 17744-17748.
x Filipek, S., Krzysko, K. A., Fotiadis, D., Liang, Y., Saperstein, D. A., Engel, A., y
palczewski, K. (2004). A concept for G protein activation by G protein-coupled
receptor dimmers: the transducin/rhodopsin interface. Photochem. Photobiol.
Sci. (3) 628-638.
x Fotiadis, D., Liang, Y., Filipek, S., Saperstein, D. A., Engel, A., y Palczewski, K.
(2003). Atomic-force microscopy: Rhodopsin dimers in native disc membranes
Nature. (421) 127-128.
x Fotiadis, D., Liang, Y., Filipek, S., Saperstein, D. A., Engel, A., y Palczewski, K.
(2004). The G protein-coupled receptor rhodopsin in the native membrane.
FEBS Lett. (564) 281-288.
x Franco, R., Canals, M., Marcellino, D., Ferre, S., Agnati, L., Mallol, J., Casado,
V., Ciruela, F., Fuxe, K., Lluis, C., y Canela, E. I., (2003) Regulation of
heptaspanning-membrane-receptor function by dimerization and clustering.
Trenes Biochem. Sci. (28), 238-243.
156
x Fratelli, M., Demol, H., Puype, M., Casagrande, S., Eberini, I., Salmona, M.,
Bonetto, V., Mengozzi, M., Duffieux, F., Miclet, E., Bachi, A., Vandekerckhove,
J., Gianazza, E., y Ghezzi, P. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (99) 3505-
3510.
x Fritze, O., Filipek, S., Kuksa, V., Palczweski, K., Hofmann, K. P. y Ernst, O. P.,
(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (100), 2290-2295.
x Fung, B. K.-K., Hurley, J. B., y Stryer, L. (1981). Flow of information in the light-
triggered cyclic nucleotide cascade of vision.. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
(78): 152-156.
x Ghezzi, P., Romines, B., Fratelli, M., Eberini, I., Gianazza, E., Casagrande, S.,
Laragione, T., Mengozzi, M., y Herzenberg, L. A. (2002) Mol. Immunol. (38),
773-780.
157
x Granzin, J., Tilden, U., Choe, H. W., Labahn, J., Krafft, B., y Buldt, G. (1998) X-
ray crystal structure of arrestin from bovine rod outer segments. Nature (391),
918-921.
x Guo, W., Shi, L., y Javitch, J. A. (2003). The fourth transmembrane segment
forms the interface of the dopamine D2 receptor homodimer. J. Biol. Chem.
(278) 4385-4388.
x Hang, C., Hepler, J. R., Chen, L. T., Gilman, A. G., Anderson, R. G., Y Mumby,
S. M. (1997). Organization of G proteins and adenylyl cyclase at the plasma
membrane. Mol. Biol. Cell. (8) 2365-2378.
x Hargrave, P. A., McDowell, J. H., Curtis, D. R., Wang, J. K., Juszczak, E., Fong,
S-L., Mohana Rao, J. K., y Argos, P. (1983). The structure of bovine
rhodopsin. Biophys Struct Mech. 9 (4): 235-244.
158
x Hingorani, V. N., Tobias, D. T., Henderson, J. T., y Ho, Y.-K. (1988) Chemical
cross-linking of bovine retinal transducin and cGMP phosphodiesterase. J.
Biol. Chem. (263), 6916-6929.
x Jastrzebska, B., Maeda, T., Zhu, L., Fotiadis, D., Filipek, S., Engel, A.,
Stenkamp, R. E., y Palczewski, K. (2004) Functional characterization of
rhodopsin monomers and dimmers in detergents. J. Biol. Chem. (279), 54663-
54675.
x Kühn (1980) Light- and GTP-regulated interaction of GTPase and other proteins
with bovine photoreceptor membranes. Nature 283, 587-589.
x Kühn, H. (1981). Interactions of cell protein with the disk membrane: Influence
of light, ionic strength, and nucleotides. Curr. Top.Membr. Transp. (15): 171-
201.
x le Maire, M., y Möller, J. V. (1981) Size and shape of membrane proteins: some
improved procedures. Biochie (Paris) (63), 863-866.
x Lee, S. P., O’Dowd, B. F., Rajaram, R. D., Nguyen, T., y George, S. R. (2003).
D2 dopamine receptor homodimerization is mediated by multiple sites of
160
x Liang, C. J., Yamashita, K., Muellenberg, C. G., Shichi, H., y Kobata, A. (1979)
Structure of the carbohydrate moieties of bovine rhodopsin. J. Biol. Chem.
(254), 6414-6418.
x Liang, Y., Fotiadis, D., Filipek, S., Saperstein, D. A., Palczewski, K., y Engel, A.
(2003). Organization of the G protein-coupled receptors rhodopsin and opsin in
native membranes. J. Biol. Chem. (278) 21655-21662.
x Marin, E. P., Krishna, A. G., Zvyaga, T. A., Isele, J., Siebert, F., y Sakmar, T. P.
(2000). The amino terminus of the fourth cytoplasmic loop of rhodpsin
modulates rhodopsin-transducin interaction. J. Biol. Chem. (275): 1930-1936.
x Mixon, M. B., Lee, E., Coleman, D. E., Berghuis, A. M., Gilman, A. G., y Sprang,
S. R. (1995) Tertiary and quaternary structural changes in Gi alpha 1 induced
by GTP hydrolysis. Science (270), 954-960.
x Okada, T., Fujiyoshi, Y., Silow, M., Navarro, J., Landau, E. M., y Shichida, Y.
(2002). Functional role of internal water molecules in rhodopsin revealed by X-
ray crystallography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (99) 5982-5987.
x Okada, T., Le Trong, I., Fox, B. A., Behnke, C. A., Stenkamp, R. E., y
Palczewski, K. (2000). X-ray diffraction analysis of three-dimensional crystals
163
of bovine rhodopsin obtained from mixed micelles. J. Struct. Biol. (130): 73-
80.
x Oliveira , L., Hulsen, D., Lutje Hulsik, D., Paiva , A. C. M., y Vriend, G. (2002).
Modeling G protein-coupled receptors. http://www.gpcr.org/articles/2001
4/index.html
x Palczewski, K., Kumasaca, T., Hori, T., Behnke, C. A., Motoshima, H., Fox, B.
A., Letrong, I., Teller, D. C., Okada, T., Stenkamp, R. E., Yamamoto, M., y
Millano, M. (2000). Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled
receptor. Science. (289) 739-745.
x Schubert, C., Hirsch, J. A., Gurevich, V. V., Engelman, D. M., Sigler, P. B., y
Fleming, K. G (1999) Visual arrestin activity may be regulated by self-
association. J. Biol. Chem. (274), 21186-21190.
x Seno, K., Kishimoto, M., Abe, M., Higuchi, Y., Mieda, M., Owada, Y.,
Yoshiyama, W, Liu, H., Hayashi, F. (2001). Light- and guanosine 5'-3-O-
(thio)triphosphate-sensitive localization of a G protein and its effector on
detergent-resistant membrane rafts in rod photoreceptor outer segments J.
Biol. Chem. (276) 20813-20813.
x Singer, S. J., y Nicolson, G. L. (1972). The fluid mosaic model of the structure of
cell membranes. Science. (175) 720-731.
x Sullivan, D. M., Wehr, N. B., Fergusson, M. M., Levine, R. L., y Finkel, T. (2000)
Identification of oxidant-sensitive proteins: TNF-alpha induces protein
glutathiolation. Biochemistry (39), 11121-11128.
167
x Uzcanga, G. L., Perrone, T., Noda, J. A., Perez-Pasos, J., Medina, R., Hoebeke,
J., u Bubis, J. (2004) Variant surface glycoprotein from Trypanosoma evansi is
partially responsible for the cross-reaction between Trypanosoma evansi and
Trypanosoma vivax. Biochemistry (43), 595-606.
x Wang, J., Boja, E. S., Tan, W., Tekle, E., Fales, H. M., English, S., Mieyal, J. J.,
y Chock, P. B. (2001) Reversible glutathionylation regulates actin
polymerization in A431 cells. J. Biol. Chem. (276), 47763-47766.
x webvision.umh.es/webvision/ imageswv/rhodop1.jpeg
x White, J. H., Wise, A., Main, M. J., Green, A., Fraser, N. J., Graham, H. D.,
Barnes, A. A., Emson, P., Foord, S. M., y Marshall, F. H. (1998).
Heterodimerization is required for the formation of a functional GABA (B)
receptor Nature. (396) 679-682.
x Wu, C., Butz, S., Ying, Y., y Anderson, R. G. (1977). Tyrosine kinase receptors
concentrated in caveolae-like domains from neuronal plasma membrane. J.
Biol. Chem. (272) 3554-3559.
x www.sinnesphysiologie.de/ photor/pho08al.jpg
x Yee, R., y Liebman, P.A. (1978). Light-activated phosphodiesterase off the rod
outer segment. Kinetics and parameters of activation end deactivation. J. Biol.
Chem. (253): 8902-8909.
8. ANEXO I