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2- Les molécules d’ADN constituent le génome

2-1 La séquence d’ADN représente l’information génétique

Lettres: A, T, G, C

Mots: à 3 lettres (codons)

Phrase: gène (information pour synthétiser une protéine). Ponctuation

Livre: le génome (ensemble des gènes)


2-2 L’ADN peut se répliquer et se transmettre de génération en génération

Principe de la réplication de l’ADN. Dans ce processus chaque brin d’ADN est séparé (non montré) puis chaque brin
sert de matrice pour la synthèse d’un nouveau brin en orientation inverse et de séquence complémentaire. On obtient
donc deux molécules double brin strictement identiques.
DNA polymerase

La réplication de l’ADN est assurée par une ADN polymérase.


Les nucléotides du néobrin se positionnent en un ordre correspondant à la séquence inverse complémentaire de celle du
brin parental en s’appariant aux nucléotides du brin parental. L’ADN polymérase établit au fur et à mesure les liaisons
covalentes entre nucléotides, dans le sens 5’ vers 3’.
L’ADN polymérase ne sait synthétiser un nouveau brin d’ADN qu’à partir d’une amorce, qui est un petit ARN. Ce petit ARN
est synthétisé par une enzyme particulière appelée primase. Chez les bactéries, la primase synthétise uniquement l’amorce
ARN. Chez les eucaryotes, la primase est capable de synthétiser l’amorce ARN, puis une petite longueur d’ADN, puis elle
est relayée par l’ADN polymérase.
Ouverture de la double hélice par une hélicase (non représentée) au niveau d’une origine de réplication ou ORC (une
séquence particulière reconnue par l’hélicase), puis réplication bidirectionnelle par deux ADN polymérase.
Au niveau d’une fourche de réplication, la synthèse des
deux brins se fait un peu différemment.
(a) L’ADN polymérase synthétise l’ADN dans le sens 5’ vers
3’ uniquement. Donc un brin est synthétisé de façon
continue dans un sens au fur et à mesure de l’ouverture
de la double, tandis que l’autre brin est synthétisé dans
l’autre sens et donc obligatoirement de façon
discontinue et décalée après l’ouverture de la double
hélice.
(b) Détails de la synthèse du brin discontinu.
2-3 L’ADN peut-être manipulé
2-3-1 On peut couper l’ADN en des sites précis à l’aide d’enzymes
de restriction

Les enzymes de restriction sont extraites des bactéries. L’enzyme prise en exemple, EcoRI, reconnaît une séquence précise
(un palindrome de 6 paires de bases) puis coupe deux liaisons phosphodiester, de façon dissymétrique. Ce clivage génère
deux fragments d’ADN terminés par deux séquences simple brin. Ces deux séquences simple brin étant de séquence inverse
complémentaires, elles peuvent se réapparier. On appelle donc ces bouts des bouts collants.
Quelques sites de restriction.
-Les enzymes de restriction reconnaissent des sites
palindromiques à 6 ou 4 paires de bases.
-Les enzymes de restriction génèrent des bouts collants ou
des bouts francs
2-3-2 Des fragments d’ADN de taille différente peuvent être séparés
par électrophorèse

Digestion d’ADN par EcoRI puis séparation des fragments de restriction par électrophorèse EcoRI clive l’ADN
représenté en 5 sites (flèches), générant six fragments de tailles différentes. Ces fragments sont séparés en fonction de leur
taille par électrophorèse en gel d’agarose. L’ADN, fortement chargé négativement (sur les groupes phosphate), migre vers l’
électrode positive, dans l’agarose poreux. L’ADN passe dans les pores du gel d’autant plus facilement qu’il est de petite taille.
Après électrophorèse, l’ADN est révélé par un colorant fluorescent et le gel est photographié.
2-3-3 On peut hybrider des acides nucléiques

Dénaturation et renaturation de molécules d’ADN double hélice. Les deux brins d’une double hélice d’ADN peuvent être
désappariés par chauffage à 100°C. On appelle ce phénomène la dénaturation. En ramenant doucement la température à
37°C, les deux brins peuvent se réapparier. Ainsi, dans un mélange de molécules d’ADN, les deux brins de séquence
complémentaire peuvent se reconnaître.
A
*A
*T T
G
C sonde

De façon générale, peuvent s’hybrider tous fragments d’acides nucléiques de séquence complémentaire:
- Deux brins d’ADN
- Deux brins d’ARN
- Un brin d’ADN et un brin d’ARN
Donc l’objet d’intérêt peut être un fragment d’ADN et la sonde peut être une sonde ADN ou ARN, ou un ARN et la sonde
peut être de l’ADN ou de l’ARN
2-3-4 Une séquence d’ADN particulière peut être mise en évidence
par la technique de Southern-blot

La technique de Southern blot permet de détecter la présence de séquences particulières d’ADN.


L’ADN chromosomique, très long, est découpé par incubation en présence d’une enzyme de restriction. Les fragments,
appelés fragments de restriction, sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose en fonction de leur taille. Dans l’exemple
du schéma, la digestion a généré trois fragments de restriction, mais la technique permet de repérer une séquence parmi des
milliers d’autres. Ces fragments sont ensuite transférés sur un papier de nitrocellulose, par capillarité. Les fragments d’ADN
sont dénaturés par chauffage du papier. La présence d’une séquence particulière est mise en évidence en incubant le papier
dans une solution contenant des sondes de la séquence recherchée, elles aussi dénaturées, et marquées radioactivement.
La sonde s’hybride avec la séquence sur le filtre. La présence de la radioactivité est révélée par autoradiographie
2-3-5 On peut coller deux fragments d’ADN

Ligation de fragments de restriction à bouts collants.


Dans cet exemple, les fragments de restriction de l’ADN I
obtenus par digestion par l’enzyme EcoRI (a’) sont mélangés
avec différents fragments de restriction de l’ADN II obtenus
par digestion par EcoRI (a), TaqI (b) et HindIII (c). Les bouts
collants a’ peuvent s’apparier avec a, mais pas avec b ou c.
On ajoute dans la solution une ligase, une enzyme capable
de créer une liaison covalente entre deux nucléotides, pour
coller les deux fragments d’ADN. Cette technique permet
donc de coller deux fragments d’ADN de façon orientée. La
ligase peut aussi coller des extrémités franches, mais de
façon moins efficace, et non orientée.
2-3-6 Une séquence d’ADN particulière peut être amplifiée
2-3-6-1 par la technique du clonage

Principe général de clonage d’un fragment d’ADN dans un vecteur


plasmidique.
Un plasmide est un petit chromosome bactérien, autonome, qui contient
des gènes de résistance aux antibiotiques (non montré). On sait extraire
les plasmides des bactéries et les purifier. On y insère in vitro le
fragment d’ADN à cloner. On réintroduit le plasmide recombinant dans
des bactéries dépourvues de plasmide par transfection. Les bactéries
effectivement transfectées sont sélectionnées grâce à leur résistance
aux antibiotiques. Les bactéries transfectées sont ensuite mise en
culture de façon individuelle. Chaque bactérie se multiplie sous forme
d’un clone. Le fragment d’ADN inséré a donc été amplifié.
Propriétés des vecteurs plasmidiques et
exemple de construction d’un
plasmide recombinant.
(a) Des plasmides ont été modifiés de façon
à faciliter l’insertion des fragments
d’ADN à cloner. Une des modifications
consiste à introduire une séquence dite
polylinker qui contient plusieurs sites de
restriction. Les plasmides contiennent
aussi une origine de réplication (ORI) et
un gène de résistance à un antibiotique.
(b) Insertion d’un fragment de restriction
d’ADN génomique dans un vecteur
plamsidique. On choisit une enzyme de
restriction dont le site est présent dans
le polylinker ainsi qu’aux deux
extrémités du fragment d’ADN
génomique d’intérêt. Plasmide et ADN
génomique sont digérés par cette
enzyme ce qui génère des bouts collants
compatibles. L’incubation du plasmide
ouvert et de l’ADN génomique morcelé
en présence d’un ligase permet d’obtenir
le plasmide recombinant.
2-3-6-2 par PCR (polymerase chain reaction)

L’ADN d’intérêt sera amplifié


à l’aide de primers de
séquence inverse
complémentaire de celles
des extrémités de la région à
amplifier, d’une ADN
polymérase thermostable (la
Taq) extraite de bactéries
vivant dans des sources
chaudes et de nucléotides.
Les différentes réactions de
dénaturation, hybridation des
primers et de synthèse par la
Taq nécessitant des
températures différentes, les
tubes réactionnels sont
placés dans des blocs
chauffants changeant la
température
automatiquement. Le fait que
la Taq soit extraite de
bactéries thermophiles la
rend résistante à 95°C, ce
qui évite de devoir en
rajouter dans le tube
réactionnel à chaque cycle.
La PCR permet une
amplification exponentielle
de l’ADN, à partir de
quantités de départ très
petites
2-4 L’ADN peut être séquencé
2-4-1 Principe du séquençage

Méthode de Chain termination.


(A) Cette méthode implique la synthèse d’un
brin d’ADN complémentaire du brin à
séquencer. Elle est réalisée à l’aide d’un
primer et d’une polymérase.
(B) Le milieu réactionnel contient, en plus des
primers et de la polymérase, des
nucléotides dont une petite fraction sont
des didésoxynucléotides. Les
didésoxynucléotides sont incorporés dans
l’ADN mais bloquent l’élongation. Les
didésoxynucléotides sont marqués
radioactivement.
(C) Si l’on met dans le tube réactionnel par
exemple des ddA, la réaction de synthèse
s’arrêtera à chaque T, générant des
fragments d’ADN de différentes tailles se
terminant tous par un A. La longueur des
ces fragments donne donc la position des
A dans la séquence. La même réaction
est faite avec des ddC, ddG et ddT.
(D) Les produits des 4 réactions de séquence
sont séparés par électrophorèse en gel de
polyacrylamide, dont la résolution permet
de séparer les fragments de longueur
différant par un seul nucléotide. Les
fragments d’ADN sont ensuite révélés par
autoradiographie. La séquence se lit de
bas en haut.
Séquençage automatique basé sur l’utilisation de didésoxynucléotides fluorescents.
(A) Une seule réaction de séquence est réalisée en mélangeant les 4 ddNTP, chacun marqué par un fluorochrome de
couleur différente. Les fragments d’ADN sont séparés par électrophorèse en gel de polyacrylamide. La fluorescence de
chaque bande sur le gel est détectée automatiquement par un lecteur optique.
(B) Le résultat de cette lecture est imprimé sous forme de pics dont la couleur représente le ddNTP.
2-4-2 Stratégies de séquençage des génomes

Tailles comparées de différents génomes. Les tailles des génomes sont données en paire de nucléotides par
génomes haploïdes.
La méthode du shotgun. L’ADN est fragmenté au hasard. Chaque fragment est amplifié puis séquençé. La
séquence totale est reconstituée grâce aux chevauchements recherchés par bioinformatique.
Limites de la méthode du shotgun.
(A) Problèmes dus à la présence de séquences répétées en tandem (exemple: séquence GATTA). En appliquant
simplement la reconstitution par chevauchements les séquences répétées internes risquent d’être omises.
(B) Problèmes dûs à la présence de séquences répétées réparties dans le génome. De la même manière, en appliquant
le principe du chevauchement, les séquences situées entre les deux séquences répétées risquent d’être omises.
Séquençage des grands génomes. Un génome constitué d’une molécule linéaire d’ADN de 2.5 Mb doit être séquencé.
On connaît dans ce génome la position de 8 marqueur (A-H).
La méthode du shotgun « génome entier » séquence d’abord des fragments au hasard, puis utilise la position connue des
marqueurs, en plus des chevauchements, pour l’assemblage final.
La méthode des « contigs » est basée sur une fragmentation ordonnée, puis sur le séquençage par la méthode du
shotgun de chaque fragment.
Exemple du séquençage du génome
d’Haemophilus influenzae.
H. influenzae est la bactérie responsable de la
méningite. Son génome a été séquené en 1995.
L’ADN a été séquencé au hasard )par sonication,
ce qui génère des fragments de 1.6 and 2.0 kb.
Ces fragments ont été séparés par
électrophorèse en gel d’agarose. Chaque
fragment est extrait du gel et amplifié par
clonage. 19 687 clones ont été générés. Certains
ont été séquencés plusieurs fois, ce qui a généré
28 643 séquences. L’assemblage de ces
séquences par bioinformatique a pris 30 h. et a
généré 140 contigs, c’est-à-dire 140 séquences
continues. Restaient donc 139 trous!
Etablissement du génome
complet d’Haemophilus
influenzae par recherche
des séquences manquantes
entre les contigs.
Deux méthodes sont possibles:
(à droite): Les fragments d’ADN
manquant vont être générés
par PCR à l’aide de primers
correspondant aux séquences
des extrémités de chaque
contig. Toutes les
combinaisons de primers
seront essayées. Les
combinaisons donnant un
produit de PCR indiquent
quels sont les contigs voisins.
Les produits de PCR sont
ensuite extraits du gel et
séquencés.
(à gauche) On génère une
deuxième banque de clones.
Pour repérer et séquencer
uniquement les clones
correspondant aux trous, on
hydride la banque avec des
sondes correspondant aux
extrémités de chaque contig.
Seuls les clones s’hybridant
avec deux sondes
correspondant à une
séquence entre deux contigs;
ils seront séquencés
Bilan: 5 personnes, 2 mois pour un génome bactérien
Séquençage du génome humain

-Décidé en 1980, initié en 1987 avec 400 marqueurs connus, soit 1/10 Mb
Méthode du shotgun applicable?
. il faudrait 70 106 séquences pour chevauchements suffisants
. Soit 70 séquenceurs automatiques, 1000 séquences par jour, 3 ans.
. Mais assemblage trop complexe

-En 1998: 1 marqueur/100 kb


. Fragments plus grands que séquences répétées
. Deux banques de clones, d’emblée: 300 000 clones avec au moins
un marqueur
. Chromosome par chromosome
- chromosome 22 publié en 1999
- chromosome 21 publié en 2000
- séquence complète en 2001
. Consortium international académique
. Société de Biotechnologie