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Evaluation de l'activité antifongique in vitro des huile


essentielles de Laurus Nobilis L. sur la croissance
mycélienne de Fusarium Sporotrichoide

Article · December 2015

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5 authors, including:

Nasrine Salhi Mouna Mehani


Université Kasdi Merbah Ouargla university of ghardaia
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Valeria Terzi
Council for Agricultural Research and Agricult…
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ElWahat pour les Recherches et les Etudes Vol.8 n°2 (2015) : 34 – 44

Revue ElWahat pour les Recherches et les Etudes


ISSN : 1112 -7163
http://elwahat.univ-ghardaia.dz

Evaluation de l’activité antifongique in vitro des huile


essentielles de Laurus Nobilis L. sur la croissance mycélienne
de Fusarium Sporotrichoide
Salhi Nasrine1, Goumni Zahira2 Salhi asma2 Mehani Mouna3 et Terzi
Valeria4

1. Université Kasdi Merbah Ouargla Laboratoire de Bio-ressources sahariennes :


préservation et valorisation, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie Ouargla
30 000 Algérie (salhi.ne@univ-ouargla.dz ) (nesrinemed@yahoo.fr).
2. Université de Ghardaïa, Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie, Département
d’agronomie
3. Université Kasdi Merbah Ouargla Faculté des Sciences de la Nature et de la Vie
Ouargla 30 000 Algérie.
4. CRA-GPG, Centro di ricerca per la Genomica, Via San Protaso 302, 29017-
Fiorenzuola d’Arda (PC), Italy,

Résumé-
Notre travail porte sur l’étude de l’activité antifongique d’huile essentielle
de la plante Laurus nobilis.L sur les souches de Fusarium sporotrichoide .
L'extraction d’huile essentielle (HE) de la partie arienne de Laurus nobilis L,
a été réalisée par la méthode d’hydrodistillation. Le test est réalisé par la
méthode de contacte directe sur le Fusarium sporotrichoide dans des
différentes concentrations d`huile (0.05, 0.25 et 0.5% de HE). Les résultats
montrent que l’huile essentielle de Laurus nobilis possède une importante
activité antifongique sur cette souche ; un indice d’inhibition de 100 % avec
la concentration de 0,5% qu’il représente le CMI est observé.
Mots clés: Laurus nobilis L, huile essentielle, Fusarium sporotrichoide,
activité antifongique, inhibition.

In vitro evaluation of antifungal activity of essential oils of Laurus


Nobilis L. on mycelial growth of Fusarium Sporotrichoid

Abstract-
Our work focuses on the study of the antifungal activity of essential oil of
the plant Laurus nobilis.L on the Fusarium sporotrichoide . The extraction
of essential oil (EO) of the Arian party of Laurus nobilis L. was obtained by
hydrodistillation .The test was realized with direct contact methods on the
Fusarium sporotrichoide at different concentration of essential oil (0.05,
0.25 and 0, 5% of EO). The results indicate that the essential oil of Laurus

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nobilis has an important antifungal activity that reached a value of 100%


inhibition with 0.5% who represents the MIC.

Key words: Laurus nobilis L., essential oil, antibacterial activity, antifungal
activity, Fusarium sporotrichoide, Inhibition.

Introduction

Le genre Fusarium est très important parce qu’il regroupe beaucoup


d’espèces phytopathogènes, susceptibles d’induire des maladies (fusarioses)
chez de nombreuses plantes ( Pittj et al.,2000). Les espèces du genre
Fusarium peuvent ainsi attaquer les céréales (maïs, blé, orge, avoine), des
légumes, les plantes ornementales et beaucoup d’arbres fruitiers.
(Nicholson,2009) Le genre Fusarium comprend des espèces (Fusarium
poae, F. sporotrichioides, F. crookwellense, F. culmorum, F. graminearum)
capables de produire de nombreuses mycotoxines : les trichothécènes, la
zéaralénone et les fumonisines (Nicholson,2009).
Laurel (Laurus nobilis L.) Est un arbre à feuilles persistantes pouvant
atteindre 20 m de haut, originaire de la région méditerranéenne (
Guenter,1949). Il est le seul représentant européen de la famille Lauraceae (
Barla et al., 2007). Il est aussi connu sous le laurier, grec laurier, baie vrai et
moi baie diterranean ( Guenter,1949). Les feuilles séchées sont largement
utilisés dans la cuisine maison (Kivcak et Mert, 2002) , et l'huile essentielle
est utilisée principalement dans l'industrie des arômes. Huile essentielle de
laurier ladite huile de feuilles de laurier, a été signalé à être utilisés dans la
préparation de lotion capillaire antipelliculaire pour son activité y et pour le
traitement externe du psoriasis (Kivcak et Mert, 2002 et Simic et al., 2003).
Les huiles essentielles sont des mélanges de différents composés
aromatiques volatiles, extraits par flux ou hydrodistillation à partir des
plantes. Depuis la découverte de leur antifongique et antimicrobien
propriétés, les huiles essentielles ont été appliquées dans pharmacologie, la
microbiologie médicale, de phytopathologie et pour préservé la nourriture (
Chami,2005).
L'objectif de ce travail est de mettre en évidence le pouvoir
antifongique d'huile essentielle extraire de la plante Laurus nobilis L vis-à-
vis de Fusarium sporotrichoide.

Salhi Nasrine, Goumni Zahira Salhi asma Mehani Mouna et Terzi Valeria
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1. Matériel et méthodes

1.1 Matériel végétal

La plante utilisée dans ce travail a été acheté au marché local de Ouargla.


Elle été introduite de la wilaya de Annaba à l’état frais. Parmi les critères du
choix de cette espèce : son leur importance majeure en médicine et dans
l’usage quotidien dans la cuisine Algérienne d’une part, et le manque de
travaux de recherche sur ces propriétés biologiques, en particulier le pouvoir
antifongique de leurs huiles essentielles d’autre part.

1.2 Matériel fongique

Le Fusarium sporotrichoide est une souche fongique de la famille


Hypocreaceae productrice des mycotoxines ( Simic et al., 2003). Le
Fusarium sporotrichoide est très répandu sur les plantes et dans le sol (Pittj
et al., 2000)., peuvent infecter les épis, les tiges et les racines du maïs du
semis à la récolte. Il entraîne des pertes du rendement et contaminent la
récolte avec des substances toxiques (Anonyme., 2008)

1.3 Extraction des huiles essentielles

L’extraction d’huile essentielle à été effectué par hydrodistillation. La partie


aérienne de Laurus nobilis est immergée directement dans un ballon rempli
d’eau, placé sur une source de chaleur (Chauffe-ballon), le tout est en suite
porté à l’ébullition. Les vapeurs sont condensées dans un réfrigérant puis elle
récupérées dans une ampoule à décanter et l’huile essentielle se séparé de
l’hydrolat par simple différence de densité (Dorn et al .,2009).

1.4 Préparation de la différente concentration

Pour préparer les différentes concentrations on prélève des quantités d’huile


essentielle du Laurus nobilis L de 25, 125 et 250 µL et ajuster a 50 mL par
PDA puis on agite pendant 5 min pour homogénéiser le milieu de PDA avec
l’huile essentielle. Ces valeurs sont corresponds 0.05%, 0.25% et 0.5%
respectivement.

1.5 Essai d’activité antifongique


La méthode de contacte direct est utilisée. Elle consiste à verser sur des
concentrations différentes d’huile essentielle du Laurus nobilis une quantité
appropriées du milieu PDA est coulé dans des boites de Pétri à raison de 15
ml pour chaque boite. Des disques mycélien issue de la marge d’une culture
âgée de Fusarium sporotrichoides et prélevée et ensuite inoculé au centre de

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chaque boite (1 disque/boite).Chaque concentration est répété trois fois. Les


boites sont incubées 144 h a l'étuve à température de 20 ± 2oC, cette période
a été retenue car il correspond à la date à laquelle le témoin rempli très
nettement la boîte de Pétri. Le témoin est réalisé dans les mêmes conditions
sans huile essentielle et les mesures sont prélavées après 72 h d’incubation.

1.6 Evaluation de la croissance mycélienne

La croissance mycélienne a été évaluée toutes les 24 heures en mesurant la


moyenne de trois diamètres perpendiculaires passant par le milieu de la
rondelle. Trois répétitions ont été effectuées pour chaque concentration.
Cette lecture est toujours réalisée en comparaison avec les cultures témoins
qu’ils sont démarrés le même jour et dans les mêmes conditions.

1.7 Détermination de l’indice antifongique

A prés l’incubation 144 h en tenant compte de la croissance de témoin,


on calcule l’indice antifongique qui est déterminé par la formule (Chang et
al ., 1999):
IA = (1-Da/Db) ×100
Da: diamètre de la zone de croissance de l’essai.
Db: diamètre de la zone de croissance du témoin.

1.8 Détermination des concentrations minimale inhibitrices (CMI)

Il s’agit en parallèle d’évaluer la plus petite concentration pour laquelle


aucun développement n’est visible à l’œil nu.

1.9 Détermination de la vitesse de croissance mycélienne (VCM)

La vitesse de la croissance mycélienne de chaque concentration est


déterminée par la formule:
VCM = [D1/Te1] + [(D2-D1)/Te2] + [(D3-D2)/Te3] +… + [(Dn-Dn-1)/Ten]
D: diamètre de la zone de croissance du D
Di: diamètre de la zone de croissance chaque jour (i).
Te: temps d’incubation.

1.10 Observation microscopique

Dans des conditions aseptiques et à l’aide d’une anse stérile on prélève un


échantillon mince de la marge des Fusarium sporotrichoides obtenu pour

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chaque concentration et mis dans un goute d’eau distillée entre lame et


lamelle et l’on observe a l’aide de microscope optique.

1.11 Analyse statistique

L’analyse statistique (tableaux, histogrammes, courbe) des donnés sont


traitées par un logiciel Excel stat 2007 pour la détermination de la
signification des résultats.

2. Résultats et discussion

2.1 Evaluation de la croissance mycélienne

L’activité antifongique est révélée par l’absence ou la présence de la


croissance mycélienne. Nos résultats indiquent que l’huile essentielle du
Laurus nobilis a une capacité inhibitrice de la croissance mycélienne de la
souche testée (Fusarium sporotrichoides). Les résultats de diamètre de
l’activité antifongique d’huile essentielle de laurus nobilis sont présentent
dans le tableau 1. Elles varient entre 0 et 85 mm (y compris le diamètre de
disque).

Tableau 1- Croissance mycélienne (mm) de Fusarium sporotrichoides en


fonction du temps et de la concentration en huile essentielle du Laurus
nobilis

T (h) 72 96 120 144


C (%)

Témoin 55 68 84 85
0.05 19 24 31 39
0.25 0 4 13 18
0.5 0 0 0 0

T: tempe par heure. C: concentration en % HE.

Avec les différentes concentrations d’huile essentielle extraite, on observe


que la croissance mycélienne est remarquable après 72 h pour le témoin et la
concentration 0.05% et il est démarre après les 96 heures pour la
concentration de 0.25%, au-delà de cette concentration on n’observe aucune
croissance. En montrant qu’il y a une augmentation de la croissance
mycélienne avec le temps d’incubation a l’exception de la concentration
0.5% qu’il ne présent aucun croissance mycélienne. L’analyse statistique

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montre que le témoin présent une différence de croissance mycélienne du le


72 h à 144 h.

Figure1 : Diamètre moyenne de la croissance mycélienne

D’après la figure 1 on peut noter qu’il ya un changement morphologique de


la couleur des mycéliums qu’il est variée de jaune, blanc, rouge. Par
comparaison au témoin (0% HE) qu’il présent un couleur de base des
colonies de couleur jaune ayant micelles gonflées et un aspect poudreux,
comme du coton, tourné du rouge après 96 h. A la fin de cette période, la
taille de la colonie atteint 85mm, dans la concentration 0.05% la couleur de
base des colonies de couleur blanc tourné du rouge après 96 heure, la
concentration 0.25% présente seulement un couleur de base des colonies de
couleur blanc, tandis que dans la concentration 0.5% où on a aucun
croissance mycélienne mais la couleur de disque lui même est transformer en
jaune. Présente seulement un couleur de base des colonies de couleur blanc,
tandis que dans la concentration 0.5% où on a aucun croissance mycélienne
mais la couleur de disque lui même est transformer en jaune. A est réduite
par l’augmentation de la concentration d’huile essentielle jusqu'à 0.5% où
aucune croissance n’est observée. Le plus grand diamètre de croissance
mycélienne a été registré à la concentration qu’il correspond l’absence
d’huile essentielle (témoin) avec un diamètre de croissance de 85mm ensuit
la concentration 0.05% avec un diamètre de croissance de 39 mm puis la
concentration 0.25% avec un diamètre de croissance de 18 mm et en fin la
concentration 0.5% qu’il non présent aucun croissance mycélienne.
Salhi Nasrine, Goumni Zahira Salhi asma Mehani Mouna et Terzi Valeria
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La technique de contact direct consiste à mettre en contact l’huile essentielle


et les micro-organismes, puis à observer la croissance de ces derniers.
L’huile essentielle du Laurus nobilis a exercé une importante activité
inhibitrice vis-à-vis du champignon Fusarium sporotrichoides, les diamètres,
la vitesse et l’indice antifongique de la croissance de mycélium sont
diminue sa chaque fois qu’on augmente la concentration d’huile essentielle
jusqu’à la non germination du disque atteinte au CMI (0.5%) ce la est
confirmer par les travaux de Gacem (2011) sur l’extraits méthanolique et
aqueux appliquer sur Aspergillus fumigatus. L’étude de l’effet inhibiteur
d’huile essentiel d’Artimesia herba alba sur deux souches de Fusarium
oxysporum et F.sp par Kolai et al (2012) montré que l’activité antifongique
est due uniquement aux substances renfermées dans les extrais de l’huile
essentiel d’Artimesia herba alba. La difficulté de développer une molécule
antifongique est liée, d’une part à l’ultrastructure de la cellule fongique qui
présente trois barrières: la paroi cellulaire chitineuse, les ergostérols
membranaires et le noyau eucaryote (Kolai et al .,2012) et d’autre part, les
molécules antifongiques elles-mêmes qui peuvent engendrer des résistances
( Prasad et Kapoor,2004) .

2.2 Indice antifongique

L’indice antifongique est la concentration qui inhibe 50% la croissance


mycélienne, à l’aide de l’analyse de la Variance, on peut constater que
l’indice antifongique est très hautement significatif (P≤0.001) pour les
différent concentrations. En remarquant que toutes les concentrations d’huile
essentielle du Laurus nobilis appliquées ont empêché, partiellement
(0.05%,0.25%) ou complètement (0.5%), la croissance des souches
fongiques testées. Les indices sont récapitulés dans le tableau 2.
Tableau 2: indice antifongique (IA)

T (h) 72 96 120 144 Analyse statistique


C (%)

0.05 65.3 64.3 62.6 54.4 Effet de C :

Effet de T:
0.25 100 93.8 84.1 79.1

0.5 100100 100 100 Effet de C x T:


T: tempe par heure. C: concentration en % HE
Les indices antifongique est augmenté avec l’augmentation de la
concentration d’huile essentielle, il dépasse 50% dans toutes les
concentrations et variée entre 54.4% et 100% qu’il a été remarquée par
l’application d’une concentration 0,5%de d’huile essentielle de 0.5%. Le
tableau 2 montre que la concentration minimale inhibitrice est de l’ordre de
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quelque pourcent avec une bonne efficacité antifongique manifestée par


l’huile essentielle du Laurus nobilis. En effet, pour cette dernière la CMI est
de 0.5%. Le pouvoir antifongique d’huile essentielle du Laurus nobilis
pourrait être attribué à la présence de composants antifongique classé dans la
liste des constituants à activité antifongique tels que: le myristicine, le
curcumène, le caryophyllene, l’élemicine, le pinène, le terpinène et le
terpinolène à différentes proportions (Duke, 2009). De même Chu et Kemper
(2001), signalent que le pouvoir antifongique d’huile essentielle du
Lavandula stoechas est lié aux: β-pinène, p-cimène, 1,8 cinèole et α-pinène.
Les composés majoritaires ou mineurs peuvent augmenter l’activité
antifongique. L’activité antifongique d’huile essentielle, peut être expliquée
par l’effet synergique entre les différents composés d’huile essentielle. En
effet, les composés majoritaires sont souvent responsables de l’activité
antifongique de cette huile essentielle ( Giordani et al .,2008). Ils ont
supposé que la nature lipophile d’huile essentielle les rend plus observables
par les mycéliums fongiques que par la gélose de nature hydrophile (
Celimene et al ., 1999).Le mécanisme d’action des composés phénoliques
d’huile essentielle sur les champignons est fondé principalement sur
l'inhibition des enzymes fongiques contenant le groupement SH dans leur
site actif ( Soylu et al., 2005).

2.3 Vitesse de la croissance mycélienne

Les résultats sont vérifiés par le test statistique à l’aide de l’analyse de la


Vitesse de la croissance mycélienne de Fusarium sporotrichioides, qui
révèlent que les traitements est un effet très hautement significatif
(P≤0.001).sur la vitesse de la croissance mycélienne Les résultats de figure
3 montré que la vitesse de la croissance mycélienne est décroitre par
l’augmentation de la concentration d’huile essentielle du Laurus nobilis .

La plus haut vitesse de croissance mycélienne est registrer a 0% en absence


d’huile essentielle avec une vitesse de 0.26 mm/h puis la vitesse est décroitre
jusqu’à l’inhibition totale (0mm/h) dans la concentration 0.5% d’huile
essentielle. Les concentrations d’huile essentielle du laurus nobilis
appliquées ont empêché, partiellement (0.05%,0.25%) ou complètement
(0.5%), la croissance de souche, cet résultat est comparable à celle de Uribe
et al ( 1985), qui ont énoncé que les faibles concentrations en huile
essentielle de certains Citrus ont un effet inhibiteur partiel du fait que la
respiration est inhibée et la perméabilité des cellules altérée tandis que des
fortes concentrations en huile essentielle provoquent des dommages
membranaires sévères et une perte d’homéostasie d’où la mort cellulaire ou
l’inhibition totale.

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0,30

0,25 0,26

0,20

0,15

0,10 0,11

0,05
v 0,00

Figure3: La vitesse
sporotrichoides.
0

2.4 Observation microscopique


de
0,2

la
0,04

croissance
0,4
concentration d'huile essentielle (%)

>0.05%>0.25%>0.5%), déchirure (0.5%) ou commencement d’une


0

mycélienne

L’observation microscopique est par comparaison au témoin montre une

déchirure (0.05% et 0.25%) de mycélium ainsi que la couleur (figure 5).

Figure 5: Aspect microscopique de Fusarium sporotrichoides avant


0,6

du

diminution dans les diamètres, les tailles et le nombre de mycélium (Témoin

(témoin) et après le traitement par l’huile essentielle du Laurus nobilis a


différent concentration.
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Fusarium
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Les mycéliums ayant une apparence d'aiguille, structures transparentes avec


des endroits rouges et jaunes pour le témoin et la concentration 0.05% et
jaune pour la concentration 0.25%, la concentration 0.5% non présentant
aucun couleur (transparente). Les modifications morphologiques (couleur de
mycélium, déchirures mycéliennes,…) ont été observés sur déférents
concentrations étaient confirmées par les travaux de Billerbeck et al.(2002)
sur le mycélium d’A Niger sous l’effet des vapeurs d’huile essentielle de
Cymhopogon nordus. La perte ou le changement de la couleur peut être
corréler avec la perte de la production de mycotoxines. L’action antifongique
d’huile essentielle vis-à-vis C. albicans est due à une augmentation de la
perméabilité de la membrane plasmique suivie d’une rupture de celle-ci
entrainant une fuite du contenu cytoplasmique et donc la mort de la levure
(Cox et al 2000).L’huile essentielle du Laurus nobilis montre une activité
très important contre le Fusarium sporotrichioides qu’il attendre à une
activité d’inhibition de 100%.

Conclusion

La méthode de contact direct nous a permis de mettre en évidence le pouvoir


antifongique d’huile essentielle du Laurus nobilis vis-à-vis de la souche
Fusarium sporotrichioides. L’activité antifongique d’huile essentielle du
laurus nobilis L. s’est avéré un agent antifongique efficace contre le
Fusarium sporotrichioides à une dose de 0.5% d’huile essentielle de Laurus
nobilis qu’il correspond le CMI avec un indice d’inhibition de
100%.L’activité antifongique croit au fur et à mesure qu’augmente la
concentration en huile essentielle ce la est induit à la régression de vitesse de
la croissance mycélienne qu’ils sont appariât sous microscope avec des
déchirures, des petits diamètres, nombres et avec des couleurs différents. Il
ressort que Laurus nobilis pourrait être valorisée d’avantage particulièrement
dans la lutte contre de nombreuses espèces fongique responsables des
différentes formes phytopathogènes. L’efficacité in vitro pourrait être
expliquée par la richesse de cette plante en composés aromatique. Cette
étude permet encore une fois la mise en valeur de l’exploitation des huiles
essentielles dans des autres domaines, pharmaceutiques et cosmétiques. Par
la même occasion, elle confirme leur utilisation comme conservateur dans le
domaine de l’industrie agroalimentaire. L’ensemble de ces résultats obtenus
in vitro ne constitue qu’une première étape dans la recherche des substances
de source naturelle biologiquement active. Ces résultats préliminaires
peuvent être complétés par d’autres études plus approfondies : essai sur
d’autres souches fongique et d’exploiter les propriétés antifongiques ainsi
que le teste d’activité fongistatique/fongicide. Et des autres essais in vivo et
in situ.

Salhi Nasrine, Goumni Zahira Salhi asma Mehani Mouna et Terzi Valeria
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