Análisis

 Instrumental  
Cromatogra2a  
Historia

1903: usó columnas de adsorción para separar

pigmentos vegetales

Fase
móvil
Pigmentos
vegetales

Fig.1

Tswett (1872-1919) Fase

estacionaria

Chroma: color
Graphein: escribir CROMATOGRAFÍA

3
CROMATOGRAFÍA

Separación de los componentes

de una mezcla (muestra),
disueltos en una fase móvil a
medida que se van desplazando
con diferente velocidad a través
de una fase estacionaria
 Clasificación

• Según la disposición de la fase estacionaria:

– Cromatografía plana:
• Cromatografía en capa fina
• Cromatografía en papel

– Cromatografía en columna
• Cromatografía de líquidos
• Cromatografía de gases
• Cromatografía de fluídos supercríticos
• Según el tipo de fase móvil:

• Cromatografía de líquidos (LC) En columna o en superficie plana

• Cromatografía de gases (GC)

En columna
• Cromatografía de fluidos supercríticos (SFC)

9
 CROMATOGRAFÍA PLANA

Papel Cromatografía en papel

Fase estacionaria
Adsorbente sobre soporte Cromatografía
en capa fina
Gel de sílice, poliamida….
Lámina de vidrio, de plástico o
metálica
Tapadera

METODOLOGÍA DE TRABAJO
Papel
Frente de
fase móvil

Fase
móvil

1 5 Fig.1
2 3 4
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
Muestra
Fase (A+B)
móvil

B
Fase
estacionaria
A B

A B

16
Sistemas cromatográficos
 Clasificación

CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS EN COLUMNA

Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio

LC Reparto Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre líquidos
inmiscibles
Adsorción Sólido Adsorción

Intercambio iónico Resina de Intercambio Iónico Intercambio iónico

Exclusión por polímeros entrecruzados que forman Distribución/Exclusión

tamaños una red tridimensional porosa.

GC Gas-líquido Líquido adsorbido sobre un sólido Distribución entre gas y líquido

Gas-sólido Sólido Adsorción

SFC Especies orgánicas enlazadas a Distribución entre fluido

superficie sólida supercrítico y superficie
enlazada

18
 Los mecanismos de
separación cromatográficos

• Adsorción
• Repartición Las técnicas
cromatográficas se
• Intercambio iónico clasifican en base
• Exclusión dimensional a cual es el
mecanismo
• Afinidad principal de la
separación
• Quelación
(complejos)
El proceso cromatográfico

Muestra
(A+B)
Fase
móvil

B
Fase
estacionaria
A B

B
A
B
Detector
Señal analítica

t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6
A
B

Tiempo, min t0 t1 t2 t3 t4 t5 t6
37
El proceso cromatográfico

ENSANCHAMIENTO DE BANDAS
Columna

Comienzo

Fig.1

Perfil de concentración

Fig.2 Tiempo

38
Parámetros fundamentales

Respuesta del detector

CH4 Octano No
identificado Nonano

Tiempo
Inyección
Tiempo de retención: Tiempo que
transcurre desde el momento de la
inyección de la muestra hasta la
aparición de la máxima concentración del
compuesto eluido
tr´ = tr - tm
la diferencia entre el tiempo de retención
y el tiempo muerto, representa la
interacción del soluto con la fase
estacionaria y tiene el nombre de tiempo
de retención corregido tr’
4. Parámetros fundamentales
describe las velocidades de migración de
los analitos en las columnas
Factor de retención (k)
k << 1: elución demasiado rápida
tr tm k~ 20-30: elución demasiado lenta
t´r
k “ensanchamiento de las bandas”
tm tm 2 < k < 10: elución ideal

relación entre los factores de retención de los dos picos de

Factor de selectividad ( α) interés, apareciendo en el numerador el factor de retención de la
especie más fuertemente retenida y en el denominador el de la
especie que eluye con más rapidez

kB α = 1: Los compuestos no están separados

 α > 1: Los máximos de los picos cromatográficos
kA están separados

Volumen de retención ( Vr)

es el volumen de fase móvil necesario para
eluir a un soluto determinado de la columna
Vr t r ur
ur : velocidad de flujo de la fase móvil
4. Parámetros fundamentales

ANCHURAS CARACTERÍSTICAS
wi
tr

Punto de
Respuesta del detector

inflexión

wh

t=0 Tiempo
Inyección
wb Fig.1

wi = 2σ wb = 2wi
wh = 2,35σ
wb = 1,7wh 41
wb = 4σ
 EFI CACI A DE UNA COLUMNA: H, L
H

L
N
H
«Martin y Synge»
L
wb = 4σ 2
2 tR
H L
N 16
L N wb
H n
Ni
i 1
«n compuestos en el cromatograma»: N
n 42
El
  modelo
  del
  plato
  teórico
  supone
  que
  la
  columna
  cromatográfica
  con6ene
  gran
  número
  de
  capas
 
separadas,
  llamadas
  platos
  teóricos.
  Los
  equilibrios
  para
  la
  separación
  de
  la
  muestra
  entre
  la
  fase
 
estacionaria
  y
  la
  fase
  móvil
  6enen
  lugar
  en
  estos
  supuestos
  platos.
  El
  analito
  se
  mueve
  en
  la
  columna
 
por
  transferencia
  de
  fase
  móvil
  equilibrada
  desde
  un
  plato
  hasta
  otro
  El
  modelo
  proporciona
  una
 
medida
 de
 la
 eficiencia
 de
 la
 columna,
 que
 se
 puede
 expresar
 como
 el
 número
 de
 platos
 teóricos
 de
 
una
 columna
 (N),
 cuántos
 más
 platos
 la
 columna
 será
 más
 eficiente.
 O
 como
 lo
 que
 mide
 cada
 plato
 
(HEPT,
  altura
  equivalente
  del
  plato
  teórico),
  cuánto
  más
  pequeño
  mayor
  eficiencia.
  Siendo
  (L)
  la
 
longitud
  de
  la
  columna,
  estos
  conceptos
  quedan
  relacionados
  de
  la
  siguiente
  forma
  :
  HEPT
  =
  L
  /
  N
 
donde
 L
 es
 el
 largo
 de
 la
 columna
 
 

4. Parámetros fundamentales
Factor de resolución (Rs)
constituye una medida
cuantitativa de su capacidad
para separar dos compuestos
y se calcula como el cociente
entre la distancia de los
máximos de los dos picos
adyacentes y el valor medio
de las anchuras de los picos
en la base Fig.1

Rs ≥ 1,5: separación ideal

Δ
Rs= 1,5 > Rs > 1: separación aceptable
wb,At + wb,B
2 Rs < 1: separación inaceptable
43
5. Aplicaciones de la cromatografía
ANÁLISIS CUALITATIVO

Disolución estándar
Señal analítica

F1

CH4 Nonano
La muestra no contiene
Octano Decano
metano ni octano.
Tiempo Si los contiene será a
concentraciones inferiores
Muestra a los correspondientes
límites de detección
Señal analítica

CH4 Octano ¿Nonano? ¿Decano?

Tiempo

Identificación positiva: - Comparación de datos de retención

- Uso de detectores en línea 45
5. Aplicaciones de la cromatografía
ANÁLISIS CUANTITATIVO

Área

Señal analítica
Altura, h

Fig.1
tm tr Tiempo

MÉTODOS DE ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO CUANTITATIVO

1. Calibración con patrones
0,4
Preparación de disoluciones patrón

Área de pico, s
0,3

0,2
Obtención de sus cromatogramas
0,1

0,0
0 5 10 15 20 25 30
46
Concentración, ng ml-1
 TERMINOLOGÍA

• FASE ESTACIONARIA: (matriz, soporte cromatográfico)

componente estático de la cromatografía

• FASE MÓVIL: (eluyente) solvente que arrastra a través de la

columna los componentes de la mezcla a analizar

• ELUCIÓN: paso de fase móvil a través de una columna hasta

lograr la salida de los solutos

• ELUIDO: fase móvil que se recoge a la salida de una columna

 TERMINOLOGÍA
• CROMATOGRAMA: Perfil cromatográfico, Perfil de elución.
Representación gráfica de la cuantificación de solutos en el
eluído de una columna

• VOLUMEN DE ELUCIÓN: volumen de fase móvil que pasa a

través de la columna hasta que sale cada soluto

• VOLUMEN MUERTO: volumen de elución de una molécula que

viaja a través de la columna con la velocidad de la fase móvil,
que no experimenta ningún retraso. También se llama
VOLUMEN DE EXCLUSIÓN
Cromatografía en capa fina o laminar (TLC)

Revelación
•Directa (por compuestos colorados)
•Absorbimiento UV (254 , 366 nm)
•Fluorescencia
•Oxidación a presión (Ce IV; Cr VI acido sullfúrico)
•Vapores de yodo
•Reactivos específicos cromogénicos (es. ninidrina )

TLC bidimensional Fronte del solvente

Eluente 1
1) Rotazione
90°
2) Eluente 2

TLC preparativa

placas 20x20 cm; espesor adsorbente 0.5, 1.0, 2.0 mm.

Revelación no destructiva
Recuperación de composti separados
Cromatografía en columna

Cromatografía
Flash

Técnica presentada
de Still el 1978
W. C. Still, M. Kahn
and A. Mitra, J.
Org. Chem. 1978,
43, 2923.

Rf>0.2 Rf>0.1
 Qué significa HPLC

H: High
P : Performance (Pressure)
L : Liquid
C : Chromatography
 HPLC
•  Cromatografía líquida de alto rendimiento
es una herramienta poderosa en el
análisis, produce un alto rendimiento y alta
velocidad en comparación con columnas
de cromatografía tradicional debido a la
fase móvil bombeada por la fuerza.
•  P u e d e s e p a r a r u n a m e z c l a d e
compuestos
 Escala de operación
•  1.Analytical HPLC
•  Sin recuperación de los components
individuales de la muestra

•  2.Preparative HPLC
•  Los components individuales de la muestra
pueden ser recuperado
 Tipo de análisis
•  1.Qualitative analysis
•  Análisis de una sustancia para determinar la naturaleza
de sus componentes químicos
•  Podemos separar componentes individuales pero no
podemos evaluar la cantidad en este análisis
•  2.Quantitaive analysis
•  Determinar las cantidades y proporciones de sus
componentes químicos.
•  Evaluar la cantidad de la impureza y los componentes
individuales.
Normal   phase   chromatography   is   a   chromatographic   technique   that   uses   organic  
solvents   for   the   mobile   phase   and   a   polar   sta6onary   phase.   Here,   the   less   polar  
components  elute  faster  than  the  more  polar  components  
Reversed  phase  chromatography,  a  bonded  phase  chromatographic  technique,  uses  water  
as   the   base   solvent.   Separa6on   based   on   solvent   strength   and   selec6vity   also   may   be  
affected   by   column   temperature   and   pH.   In   general,   the   more   polar   components   elute  
faster  than  the  less  polar  components.    
 C. afinidad
•  This is the most selective type of chromatography employed. It
utilizes the specific interaction between one kind of solute
molecule and a second molecule that is immobilized on a
stationary phase.

§  For example, the immobilized molecule may be an antibody to

some specific protein. When solute containing a mixture of
proteins are passed by this molecule, only the specific protein
is reacted to this antibody, binding it to the stationary phase.
This protein is later extracted by changing the ionic strength or
pH.
ESQUEMA EQUIPO
 CROMATOGRAFIA
Modalidades y Clasificación

Cromatografia
FM = Líquido
Líquida

Cromatografia
FM = Gas
Gaseosa (CG)

Cromatografia
Sólida
Gas-Sólido (CGS)
En CG la FE
puede ser:
Cromatografia
Líquida
Gas-Líquido (CGL)
CROMATOGRAFIA GASEOSA
CROMATOGRAFIA   GASEOSA    
Aplicabilidad
Aplicabilidad    
Qué mezclas pueden ser separadas por CG ?

la sustancia debe
poder ser
“arrastrada” por el flujo de un gas en el
que se disuelva - por lo menos parcialmente -

Mezclas cuyos constituyentes sean

VOLÁTILES

DE FORMA GENERAL:
CG es aplicable para separaciones y
análisis de mezclas cuyos constituyentes
tengan PUNTOS DE EBULLICION de hasta
300o y que sean térmicamente estables.
 Cromatógrafo
2
CROMATOGRAFIA  
Gaseoso
G ASEOSA  
1 6

2
4

5
5

33
1 - Reservorio de de
1 - Reservorio GasGasyyControles
Controles dede Presión.
Presión.
2 - Inyector
2 - Inyector (Vaporizador) de
(Vaporizador) demuestra.
muestra.
3 - Columna Cromatográfica y horno.
3 - Columna Cromatográfica y horno.
4 - Detector.
4 - Detector.
5 - Electrónica de Tratamiento (Amplificación) de Señal.
6 - Registrode
5 - Electrónica de Señal (Registrador
Tratamiento del Computador).de Señal.
(Amplificación)
6 - Registro de Señal (Registrador del Computador).
 INSTRUMENTACION
INSTRUMENTACION  
Parámetros de Inyección  
Parámetros  de  Inyección    
TEMPERATURA DEL INYECTOR Debe ser
suficientemente elevada para que la muestra
vaporice inmediatamente sin descomponerse.

Regla Gral: Tiny = 50oC encima de la

temperatura de ebulición del componente
menos volátil
VOLUMEN INYECTADO Depende del tipo de
columna y del estado físico de la muestra

COLUMNA
muestras muestras
líquidas gaseosas

empacada 0,2 µL ... 20 µL 0,1 ml ... 50 mL

∅ = 3,2 mm (1/4”)

capilar 0,01 µL ... 3 µL 0,001 ml ... 0,1 mL

∅ = 0,25 mm

Sólidos: convencionalmente se disuelven en un

solvente adecuado y se inyecta la solución
 INSTRUMENTACION
Microjeringas para Inyección

LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µL

Microjeringa de 10 µ L:

émbolo aguja (inox 316)

cuerpo
(pirex)
 INSTRUMENTACION
Columnas: Definiciones

EMPACADA CAPILAR
∅ = 3 a 6 mm ∅ = 0,1 a 0,5 mm
L = 0,5 m a 5 m L = 5 m a 100 m
Rellena con sólido pul- Paredes internas recubier-
verizado (FE sólida o FE tas con un film fino
líquida depositada sobre (fracción de µ m) de FE
las partículas de relleno) líquida o sólida
 Temperatura de la Columna
INSTRUMENTACIÓN
INSTRUMENTACIÓN    
Temperatura de la Columna
Temperatura  
La interacción con la FE de  
y lela  tiempo
Columna  que  un
analito La demora para
interacción con larecorrer
FE y el la columna
tiempo que un
•  La  interacción  con  la  FE  y  el  6empo  que  un  analito   d0emora  para  
depende de su
analitoddemora
recorrer  la  columna   PRESIÓN
epende  para DE
de  srecorrer VAPOR
la columna
u  PRESIÓN   (p ). (p0).    
DE  VAPOR  
depende de su PRESIÓN DE VAPOR (p0).
Estructura química
del analito
Estructura química
del analito
p =p0f = f
0
Temperatura
Temperatura
dedelalacolumna
columna

Temperatura Presión Velocidad

Temperatura
de Presión
de Velocidad
de
de columna de
vapor de
migración
columna vapor migración

EL ANALITO ELUYE MAS

RAPIDAMENTE (MENOR
EL ANALITO ELUYE MAS
RETENCIÓN)
RAPIDAMENTE (MENOR
 INSTRUMENTACION    
Horno  de  la  Columna    
CaracterísGcas  Deseables  de  un  Horno:    
•  AMPLIO   RANGO   DE   TEMPERATURA   DE   USO   Por   lo   menos   de   Tambiente  
hasta  400oC.  Sistemas  criogénicos  (T  <  Tambiente)  pueden  ser  necesarios  
en  casos  especiales.    
•  TEMPERATURA   INDEPENDIENTE   DE   LOS   DEMAS   MÓDULOS   No   debe   ser  
afectado  por  la  temperatura  del  inyector  y  del  detector.    
•  TEMPERATURA   UNIFORME   EN   SU   INTERIOR   Sistemas   de   venBlación  
interna   muy   eficientes   para   mantener   la   temperatura   homogénea   en   todo  
el  horno    
•  FÁCIL  ACCESO  A  COLUMNA  La  operación  de  cambio  de  columna  puede  ser  
frecuente.    
•  CALENTAMIENTO  Y  ENFRIAMIENTO  RÁPIDO  Importante  tanto  en  análisis  
de   ruBna   como   durante   el   desenvolvimiento   de   metodologias   analíBcas  
nuevas.    
•  TEMPERATURA  ESTABLE  Y  REPRODUCIBLE    
La  temperatura  debe  ser  mantenida  con  exacBtud  y  precisión  de  ±  0,1°C.    
En  cromatógrafos  modernos  (después  de  1980),  el  control  de  temperatura  del  
horno  es  totalmente  operado  por  microprocesadores.    
 Programación Lineal de Temperatura
INSTRUMENTACION    
La temperatura del horno puede
Programación  Lmodificarse
ineal  de  linealmente
Temperatura  
durante la  
separación:

Se consiguen
buenas
separaciones de
La  temperatura  del  horno   los componentes
puede  modificarse   de la muestra en
linealmente  durante  la   menor tiempo
separación:   Parámetros de una programación de temperatura:

TINI Temperatura Inicial

TFIN

TEMPERATURA
TFIN Temperatura Final
R
tINI Tiempo Isotérmico Inicial
TINI
tFIN Tiempo Final del Programa
tINI tFIN
R Velocidad de calentamiento
TIEMPO
 Programación Lineal de Temperatura
INSTRUMENTACION    
Programación   Lineal  problemas
Posibles de  Temperatura  
asociados a   PLT:
 
VARIACIONES DEL CAUDAL DEL GAS DE
ARRASTRE La viscosidad de un gas
aumenta con la temperatura.

Posibles  problemas  
asociados  a  PLT:   viscosidad caudal

DERIVA DE LA LINEA DE BASE Debido al

aumento de volatilización de FE líquida
 INSTRUMENTACION    
Detectores    
INSTRUMENTACION
Detectores
DisposiGvos  que  examinan  conGnuamente  el  material  eluido,  
generando  la  señal   a l  
Dispositivos pasar  
queeexaminan
l   analito  
continuamente el
material eluido, generando la señal al pasar el
analito

Gráfico Señal x Tiempo = CROMATOGRAMA

Gráfico  Señal  xIdealmente:
 Tiempo  cada
=  CROMATOGRAMA   Idealmente:  cada  
sustancia separada aparece
como un PICO en el cromatograma.
sustancia  separada  aparece  como  un  PICO  en  el  cromatograma.  
 INSTRUMENTACION    
Detectores    
Más  Importantes:     TEORIA BÁSICA
•  DETECTOR  POR  CONDUCTIVIDAD  TÉRMICA  Eficiencia (DCT  O  TCD)   deVSistemas
ariación  de  
Cromatográficos
conducBvidad  térmica  del  gas  de  arrastre.    
•  DETECTOR  POR  IONIZACION  EN  LLAMA  (  FID)    Iones  generados  dLa migración
urante   la   de un
analito por la
combusBón  de  los  eluatos  en  una  llama  de  H2  +  aire.    
columna provoca
•  DETECTOR  POR  CAPTURA  DE  ELECTRONES  (DCE  O  ECD)  Supresión   de  corriente   el
inevitablemente
TEORIA
causada   BÁSICA
por  la  absorción   de  electrones  por  eluatos  altamente  electrófilos.  
ensanchamiento   de
su banda:
Eficiencia de Sistemas Cromatográficos TIEMPO

Efectos del ensanchamiento excesivo de picos:

La migración de un Separación deficiente de Picos más largos y
analitos con retenciones menos intensos = menor
analito por la próximas. detectabilidad
columna provoca
inevitablemente el
ensanchamiento de
TIEMPO su banda:

Efectos del ensanchamiento excesivo de picos:

EFICIENCIA  
Separación deficienteCapacidad  
de de  elución  
Picos más clargos
on  el  m EFICIENCIA
y ínimo   Capacidad
de  dispersión   de elución con el
del  analito.  
analitos con retenciones menos intensos = menor mínimo de dispersión del analito.
 ANÁLISIS  CUALITATIVO    
Métodos  de  Detección  Cualita6vos    
Métodos  de  detección  que  aportan  informaciones  cualitaAvas  
sobre  los  analitos  eluídos:    
•  CromatograWa  Gaseosa  con  Detección  Espectrométrica  de  
Masas  (CG-­‐EM)    
•  CromatograWa  Gaseosa  con  Detección  Espectrométrica  por  
Emisión  Atómica  (CG-­‐EA)    
•  CromatograWa  Gaseosa  con  Detección  Espectrométrica  por  
Absorción  en  el  Infra-­‐rojo  (CG-­‐EIR)    
•  IdenAficación  confiable  cuando  se  combinan  a  técnicas  de  
idenAficación  basadas  en  retención    
 COLUMNAS CAPILARES 2 2

ANÁLISIS  CLarge
UALITATIVO    
Volume Injection (LVI)
Separación  de  PAH  con  LVI  Separación
(Viny  =  25  μL,  de PAH con
solución   400  LVI
ppb  (V
en  inyCH=2Cl
252)  µ L, solució
400 ppb en CH2Cl2)

Columna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)

Columna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)
TCOL: 5 min a 50°C / 20°C min-1 / 2 min A 320°C
TCOL: 5 min a 50°C / 20°C min-1 / 2 min A 320°C
Gas de Arrastre: He @ 2 ml.min-1 Detector: FID
Gas de Arrastre: He @ 2 ml.min-1 Detector: FID
Columna: HP-5 (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm)
 ANÁLISIS  CUANTITATIVO    

Los   análisis   cuan6ta6vos   se   u6lizan   para   determinar   la   concentración   de   los  

analitos  a  través  de  una  curva  de  calibración  de  concentración  de  estándar  vs  
Area.   Mediante   interpolación   o   con   el   cálculo   de   la   ecuación   de   la   recta,  
considerando   el   volumen   de   la   muestra   se   determina   la   concentración   del  
analito.