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PREPARACIÓN DE MUESTRAS, DILUCIONES Y RECUENTO MICROBIANO

INTRODUCCIÓN

BREVE DESCRIPCIÓN SOBRE EL MUESTREO DE ALIMENTOS. La finalidad del muestreo


en microbiología de alimentos, principalmente, es obtener una muestra representativa del
alimento para su análisis inmediato y conseguir resultados confiables sobre su estado higiénico
sanitario.

NUMERO DE MUESTRAS. El número sugerido de muestras es el igual a la raíz cuadrada del


número total de unidades que conforman el lote o tomando el 1% del total cuando este es
grande y el 10% cuando el lote es pequeño. Este tipo de muestreo es aplicado a lotes
procedentes de industrias cuyo control se desconoce; si se trata de productos sometidos a
controles regulares, es suficiente analizar de 5 a 10 muestras de cada lote. Este número de
muestras recogidas en el muestreo constituye la muestra de campo o población.

PARÁMETROS DEL PROGRAMA DE MUESTREO: La selección del lote que constituye la


muestra está sujeta al criterio de aceptación o rechazo de lotes buenos o malos,
respectivamente. Los parámetros de calidad a tener en cuenta:

-Inspección: proceso al que se recurre para examinar una muestra en relación con unos
requisitos prescritos.
-Tamaño del lote: número de unidades de muestra que forman parte de un lote.
-Muestra: número de unidades que se utilizan en la inspección.
-Muestra defectuosa: Toda unidad de muestra que no satisface un requisito específico.
-Riesgo del comprador: probabilidad de aceptar un lote malo.
-Riesgo del vendedor: probabilidad de rechazar un lote bueno en el plan de muestreo.
-Nivel de calidad aceptable (NCA): Porcentaje máximo de unidades defectuosas, que se
considera satisfactorio o que se admite en un lote. Para que un plan de muestreo sea bueno, el
riesgo del vendedor ha de ser menor o igual que el NCA. Por ejemplo, si un plan de toma de
muestras tiene un NCA de 6.5, esto significa que en un lote o una producción que contenga un
6.5 % de unidades defectuosas se aceptará en el 95% de los casos.
-Número de aceptación: Número de defectos admitidos. Es el número que en un plan de toma
de muestras, indica la cantidad máxima de unidades defectuosas que puede contener la
muestra para considerar que el lote satisface los requisitos de alguna norma.

CONDICIONES PARA EL MUESTREO: es necesario que el producto, en el momento de su


análisis, reúna las mismas condiciones microbiológicas que tenía al ser muestreado.

Material y condiciones del muestreo:

-Envases para toma de muestras: perfectamente limpios, secos, herméticos y estériles; el


tamaño debe guardar proporción con la muestra que se vaya a tomar; pueden ser de vidrio,
plásticos esterilizables, metálicos.
-Instrumentos: tijeras, cuchillos, taladros, cucharas, espátulas, sierras, debidamente
esterilizados.
-Etiquetas y material para marcar.
-Refrigeración: neveras portátiles, cajas de plástico. Control de temperatura con termómetro.
-Líquidos desinfectantes

CONDICIONES PARA EL MUESTREO

-De ser posible, tomar la muestra en su envase original para ser enviada al laboratorio.
-El muestreo sobre lotes, se puede hacer siguiendo la técnica de muestreo aleatorio.
-Si son cajas grandes con paquetes pequeños, se escogen al azar dichas cajas y se preparan
paquetes pequeños.
-Para envases muy grandes, se toman asépticamente, muestras representativas y se pasan a
envases estériles más pequeños.
-Los alimentos a granel se muestrean tomando porciones de distintas zonas, con material
estéril y pasándolas asépticamente a envases esterilizados.
-Si el producto por muestrear tiene salida por un conducto, se desechan las primeras porciones
antes de tomar la muestra. Si son productos líquidos, se agitarán en su envase y se pasarán a
los recipientes estériles. Si es agua del grifo, se desinfecta este con alcohol, luego se abre y se
desecha el agua que sale al principio. Se cierra el grifo y se flamea la gota que queda
pendiente, hasta que emita vapores, a continuación se vuelve a abrir el grifo, dejando fluir agua
durante 1-2 minutos, antes de recogerla en el recipiente estéril.
-Para productos sólidos, se toman las muestras en diferentes zonas y se introducirá la muestra
asépticamente en los recipientes.
-Es conveniente apuntar a la temperatura de almacenamiento del producto e incluso su propia
temperatura, remitiendo estos datos al laboratorio.

DILUCIONES Y DILUYENTES - HOMOGENIZACIÓN DE LA MUESTRA

Las muestras de alimentos que son remitidas para análisis microbiológicos, requieren de un
tratamiento previo que permita la fácil recuperación de los microorganismos contenidos en la
muestra. Esto se logra utilizando una solución acuosa que permita la disolución del alimento,
combinado con el uso de aparatos de trituración o mezcla que faciliten el proceso de disolución
total.

La fracción del alimento destinada al análisis microbiológico debe ser representativo de toda la
muestra y constituida normalmente por 200 g o ml. Para la puesta en marcha, se utilizan 100 g
o ml. El resto se almacena como reserva, por si se hace necesario repetir el análisis. Si el
alimento está constituido por distintos componentes, se tomarán fracciones representativas de
cada uno de ellos en la superficie y en profundidad.

Casi todos los análisis se realizan a partir de una suspensión líquida de concentración
conocida, que se denomina suspensión madre y que tiene una dilución 1:10. Para conseguir
este factor de dilución, se pesa una cantidad de muestra y la pesada que resulte, se multiplica
por 9. Este nuevo resultado serán los mililitros de diluyente que se debe añadir a la muestra
pesada. A partir de esta dilución se preparan las siguientes (1:100; 1:1000, etc) hasta el factor
requerido.

En el caso de realizar la investigación de patógenos como Salmonella spp o Listeria spp., la


cantidad de muestra debe ser del orden de 25 o 50 g. Para realizar diluciones con diferentes
cantidades o pesos de las muestras y obtener diferentes factores de dilución, se puede hacer
uso de la siguiente fórmula:

Factor de dilución = Soluto /(solvente + soluto)

RECUENTO E INFORME DE RESULTADOS

Los microorganismos son generalmente enumerados en el laboratorio de microbiología de


alimentos usando métodos de recuento en placa basados en la viabilidad. Es decir, que se
cuenta el número de células viables presentes en un alimento y esto se realiza facilitando su
crecimiento en un medio de cultivo. Es importante que el recuento de microorganismos de un
alimento se haga de manera adecuada para poder expresar e informar los resultados de la
calidad microbiológica del alimento analizado. Para ello existen distintos métodos de recuento
basados en modelos estadísticos pero es importante que se use siempre el mismo método
para asegurar la normalidad y homogeneidad en la expresión de resultados de análisis de
alimentos.

OBJETIVOS

-Conocer los métodos de dilución utilizados para lograr una adecuada homogenización de la
muestra para análisis microbiológico de alimentos.
-Aprender a cuantificar microorganismos en el laboratorio de microbiología de alimentos
usando métodos de recuento de microorganismos viables.
-Expresar e informar correctamente los resultados de los recuentos de los análisis de
microbiología de alimentos.
-Interpretar los resultados de los métodos de recuento usados para el control de calidad en
microbiología de alimentos.

PROCEDIMIENTO

PARTE A: DILUCIONES, DILUYENTES Y HOMOGENIZACIÓN DE LA MUESTRA

-Mezclar muy bien la muestra para asegurar la homogenización de la misma.


-Desinfectar con alcohol al 70%, el sitio por donde se va a extraer la muestra.
-Abrir asépticamente la muestra utilizando elementos estériles como tijeras o cuchillo.
-Preparar la dilución inicial pesando o midiendo 10 g o 10 ml, según la naturaleza física del
alimento, y de forma representativa (incluyendo todas las partes del alimento), en 90 ml de
diluyente.
-Realizar la homogenización, llevando a un aparato de mezcla como el “stomacher”, el “shaker”
o una licuadora. El tiempo de homogenización debe ser estandarizado en cada laboratorio y
según la muestra que se está trabajando, pero se recomienda que sea como máximo 3
minutos, el necesario para que el alimento se diluya, pero sin alterar la flora microbiana
presente.
-Preparar las diluciones consecutivas necesarias para el análisis, transfiriendo 1 ml de la
dilución previa en 9 ml de diluyente.
-Los diluyentes más utilizados en los laboratorios de microbiología de alimentos son solución
salina al 0.85 %, agua de peptona 0.1% tamponada y el buffer fosfato.
-Para alimentos con alto contenido de grasa, se recomienda adicionar Tween al 1%, para diluir
los glóbulos de grasa y facilitar la homogenización.

1 ml 1 ml 1 ml

90 ml ss 9ml ss 9 ml ss 9 ml ss
10-1 10-2 10-3 10-4

PARTE B: RECUENTO E INFORME DE RESULTADOS

-Después del periodo de incubación, verificar que las diluciones sean coherentes. En caso
contrario, no es posible continuar con el recuento.
-Se seleccionan las dos cajas correspondientes a la misma dilución que presenten entre 30 y
300 colonias. En este intervalo el número contado es suficientemente alto para conservar la
precisión estadística y lo suficientemente bajo para evitar la competencia de nutrientes que
afecte el desarrollo de las colonias.
-Se asume que cada una de las colonias que crece sobre el medio de cultivo proviene de una
célula viable, aunque esto no puede ser totalmente cierto debido a que las colonias pueden
provenir de pares, cadenas o grupos de células que no están completamente aisladas.
-Realizar el cálculo de número de células por ml o g sobre la muestra original no es muy
recomendado. Por esto es necesario realizar diluciones de la muestra. Las diluciones más
-1 -2 -3
comunes son 10 , 10 y 10 que es lo mismo que decir 1/10, 1/100 y 1/1000.
-Cuando las diluciones están hechas, se siembra una alícuota en e medio de cultivo. Hay que
tener en cuenta la forma que se siembra; si es siembra en fondo o si es una siembra en
superficie. La diferencia radica en el volumen que se siembra. PARA SUPERFICIE SE
SIEMBRA 0.1 ml de la dilución y PARA FONDO SE SIEMBRA 1 ml de la dilución. Por lo tanto,
-3
si se ha hecho una serie de diluciones hasta 10 a partir de una muestra de alimento y estas
diluciones se siembran en fondo se conserva la dilución así:
Alimento (10ml o g)

1 ml 1 ml

90 ml ss 9ml ss 9 ml ss
10-1 10-2 10-3

1 ml 1 ml 1 ml

siembra en
fondo
10-1 10-2 10-3

Cuando la siembra es en superficie, se tiene la serie de diluciones y el volumen que se siembra


en superficie es 0.1 ml. Se debe tener en cuenta la corrección de la dilución, tal como se indica:

Alimento (10ml o g)

1 ml 1 ml

90 ml ss 9ml ss 9 ml ss
10-1 10-2 10-3

900 cel/ml 90 cel/ml 9 cel/ml

0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml

siembra en
superficie
10-2 10-3 10-4

90 cel./ml 9 cel/ml 0.9-1 cel/ml

Normas para informar el recuento

-Con las dos cajas que han sido escogidas se cuentan todas las colonias de las dos cajas.
-Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución.
-Se reporta como unidades formadoras de colonia (UFC) /g ó ml.
-El informe se expresa con dos cifras únicamente. Los decimales se aproximan.
-Si las cajas de las diluciones consecutivas presentan recuentos menores de 30 y mayores de
300 colonias, contar las cuatro cajas, calcular el recuento para cada una de las diluciones y
sacar el promedio entre las dos.
-Si no hay colonias en las cajas correspondientes a la dilución de mayor concentración,
informar el recuento como menor de 1 multiplicado por el factor de dilución mas concentrado.
-En el caso de que dos diluciones consecutivas de la misma serie estén dentro del rango de 30
a 300 colonias, se hace el recuento para cada una de las diluciones y se reporta la media
aritmética de los dos valores obtenidos, a menos que el recuento mayor contenga dos veces al
menos, en este caso se reporta el recuento menor.
-Hay que tener en cuenta que para cada informe se debe especificar el análisis microbiológico.
Por ejemplo si se realiza el análisis de recuento en placa de aerobios mesófilos el informe se
realiza de la siguiente manera:

Informe: recuento de aerobios mesófilos

2
20 ufc/g o ml x 10

Siempre se debe especificar el análisis realizado.

Preguntas para el informe

1. Mencione al menos tres metodologías de biología molecular que sean utilizadas en el


análisis de calidad microbiológica. Explique brevemente cada una de ellas.
2. 1 ml de muestra es mezclado con 990 ml de agua peptonada. 1 ml de esta dilución fue
sembrada en superficie en medio SPC. Después de la incubación, 235 colonias están
presentes en el medio de cultivo. Cuantas unidades formadoras de colonias están
presentes por ml?
3. 50 g de muestra es mezclado con 950 ml de agua peptonada. 1 ml de esta dilución se
pasan a 99 ml de agua peptonada. De esta última dilución se toma 1 ml y fue
sembrado en fondo en medio VRBA. Después de la incubación 208 colonias están
presentes en el medio de cultivo. Cuántas unidades formadoras de colonia están
presentes en la muestra?
4. A partir de un cultivo líquido de microorganismos se toma 1 ml que es añadido a una
botella que contiene 99 ml de solución salina 0.85% y mezclado. 1 ml de esta mezcla
es mezclado en 9 ml de solución salina 0.85%. Esta segunda dilución es nuevamente
diluida 3 veces sucesivamente guardando la proporción 1/10. La última dilución es
usada para sembrarla y se toman 0.1 ml de esta dilución y es sembrada en agar Mc
Conkey. Después de la incubación, 47 y 53 colonias son contadas. Cuántas unidades
formadoras de colonia están presentes en la muestra?

Bibliografía

Guías para el laboratorio de microbiología de alimentos. Vanegas, C., Rojas, J. Y Molina, J.


Universidad de los Andes. 2004

Guías para el laboratorio de microbiología de alimentos. Rojas, A. Universidad de Pamplona.


2003

García, T., Holguín, M., Higuera, I., Rubio, L., Vargas, M., Muñoz, A. Manual de técnicas de
análisis para el control de calidad microbiológico de alimentos para consumo humano. INVIMA-
Bogotá. 1998.
Materiales por grupo:

1 gradilla con cuatro tubos que contengan 9 ml agua peptonada 0.1% estéril.
1 erlenmeyer conteniendo 90 ml de agua peptonada 0.1% estéril.
1 pipeta de 10 ml estéril.
4 pipetas de 1 ml estériles.
1 pipeteador.
1 vortex.
6 cajas de Petri con agar recuento (o SPC).
1 rastrillo o palito de Hopkin estéril.
Cinta de enmascarar.
Incubadora de 37 °C.