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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CECYT “MIGUEL OTHÓN DE MENDIZÁBAL”

Antibiograma
Bacteriología Clínica
González Ramírez Angelica Guadalupe
Jiménez Mendoza Evelyn Gabriela
Juárez Martínez Héctor Emilio
Ramírez Ensastegui Selene Monserrat
Roldan Roldan Jorge
Pérez Galindo Vanesa
Plata Ortiz Ariana Melissa
Ugalde Femat Aime Abigail
Viloria García Axl Brandon

16/05/2012
ANTIBIOGRAMA
Los antibiogramas son métodos in vitro que determinan la susceptibilidad de los
microrganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de
laboratorio específicas y estandarizadas.

Objetivos del Antibiograma

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa bacteriana


que se sospecha es la responsable de una infección a uno o varios antibióticos. En efecto,
la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la eficacia in vivo de un
tratamiento antibiótico. El antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones
terapéuticas individuales.

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las resistencias


bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a escala de un servicio, un
centro de atención médica, una región o un país, es como puede adaptarse la
antibioterapia empírica, revisarse regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y
adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de
prevención en los hospitales.

La meta principal del estudio de susceptibilidad es proveer al clínico algunas


recomendaciones sobre la terapia que puede ser más apropiada en pacientes con una
infección específica:

Método de Difusión en Disco (Bauer-Kirby)

En la actualidad, la CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) es responsable de


actualizar y modificar el procedimiento original de Kirby-Bauer a través de un proceso de
consenso global. Esto garantiza la uniformidad de la técnica y la reproducibilidad de los
resultados de los patógenos a desarrollar con nuevos mecanismos de resistencia y de
nuevos antimicrobianos que se han desarrollado para luchar contra estos organismos.

La Publicación de la CLSI, Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility


Tests; Approved Standard 11th Edition, representa el estándar para los laboratorios
clínicos que realizan pruebas de sensibilidad.

Propósito

La prueba de susceptibilidad de Kirby-Bauer de difusión del disco es para determinar la


sensibilidad o la resistencia de los patógenos aerobios y bacterias anaerobias facultativas
a los diversos compuestos antimicrobianos con el fin de ayudar a un médico en la
selección de opciones de tratamiento para sus pacientes.

El organismo patógeno se cultiva en agar Mueller-Hinton en presencia de diversos


antimicrobianos impregnados discos de papel de filtro. La presencia o ausencia de
crecimiento alrededor de los discos es una medida indirecta de la capacidad de ese
compuesto para inhibir ese organismo.
Medio de cultivo utilizado

El primordial es el Mueller – Hinton debido a los


siguientes factores:
 Su reproducibilidad es aceptable.
 Baja concentración de inhibidores,
condición crítica para evaluar
sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclina.
 El crecimiento satisfactorio de patógenos
no exigentes.
 Existir ya gran experiencia en estudios de
susceptibilidad.

Para bacterias exigentes se adiciona 5% de sangre:


Agar Mueller-Hinton sangre (Streptococcus,
Bacterodes) y Mueller-Hinton chocolate (Haemophilus,
Neisseria); para ensayos de resistencia a meticilina
(oxacilina) en Staphilococcus se utiliza Mueller-Hinton
salino (5% de NaCl)

Muller-Hinton Sangre Muller-Hinton Chocolate

Factores que influyen en el Agar

pH: El rango de pH va de 7,2 a 7,4.

Variación de cationes divalentes: Ca y Mg: Afectan los halos de inhibición para


aminoglucósidos y tetraciclinas en Pseudomonas aeruginosa.

Profundidad del Agar: La profundidad recomendada de la capa de Agar es de 3 a 5 mm.

Preparación del Inoculo

Se prepara el inoculo con ajuste a la turbidez Mc


Farland 0,5 que corresponde aun diámetro de1.5 x10
UFC/ML, directo en caldo de colonias frescas en agar
no selectivo.
Escala de Mc Farland

La utilidad de la escala es poder realizar suspensiones bacterianas ajustadas a un patrón,


generalmente se suele usar el 0,5 Mc Farland, para esto se toma una muestra de nuestra
bacteria y la inoculamos en un tubo con solución salina, en el momento en que se
produzca un poco de turbidez ya estamos en el 0,5

La finalidad, es establecer una relación entre una precipitación química y una suspensión
bacteriana. Creamos 10 estándares (en la tabla aparece la composición de estos) y por
espectrofotometría, creamos una recta patrón, de forma que vamos a poder detectar la
concentración de nuestras diluciones bacterianas (de manera aproximada, ya que
depende de factores como el tamaño de la bacteria, la formación de agregados,...). La
escala se basa en la capacidad de precipitación del cloruro de bario en presencia de ácido
sulfúrico.

TUBO Cl2Ba 1% SO4H2 1% u.f.c/ml


1 0,1 9,9 3,0x108
2 0,2 9,8 6,0x108
3 0,3 9,7 9,0x108
4 0,4 9,6 1,2x109
5 0,5 9,5 1,5x109
6 0,6 9,4 1,8x109
7 0,7 9,3 2,1x109
8 0,8 9,2 2,4x109
9 0,9 9,1 2.7x109
10 1,0 9,0 3,0x109

Inoculación de la placa

1) Con un hisopo estéril en todas las direcciones inocule toda la placa, (estría
masiva)
2) Sembrar la placa de Muller-Hinton de manera de obtener un crecimiento
confluente, para lo cual se estría con el hisopo en forma paralela y bien compacta
abarcando toda la superficie de la misma. Luego se repite el procedimiento
rotando la placa 60° en dos oportunidades más. Deben extremarse los cuidados
en sembrar las placas de borde a borde, porque de lo contrario puede haber
problemas en la realización de las lecturas.
1)

2)

Aplicación de sensidiscos

La aplicación de los sensidiscos con el antibiótico, serán puestos con pinzas previamente
esterilizadas, evitando así la contaminación del medio.

La aplicación de los sensidiscos es muy importante, ya que si no se tienen ciertos


parámetros, los halos de inhibición pueden sobre ponerse uno sobre otro. Y esto al
momento de la medición de los halo, podría haber una alteración en los datos, y abría un
diagnóstico erróneo.

Y para quitar esos errores técnicos se tienen los siguientes parámetros:

 Entre un sensidisco y otro, deberá haber una distancia mínima de 24 mm, entre
uno y otro.
 En las placas de 150mm de diámetro, se pondrán como máximo 12 sensidiscos.
 En las placas de 100 mm de diámetro se pondrán como máximo 5 sensidiscos.

Siguiendo las siguientes indicaciones, se evitará en menor porcentaje los errores técnicos.

Lectura e interpretación de los resultados:

En la lectura de datos, solo hay tres categorías, los cuáles dependen del antibiótico que
se utilice y, en este caso, las bacterias a trabajar. Entre otros factores.

Sensible: El microorganismo presenta un gran área de inhibición causada por el fármaco.


95% éxito.

Intermedio: Se presenta un halo de inhibición mas reducido.

Resistente: Presenta muy poco o casi nada de halo.

intermedio

resistente

sensible
Medición de los halos

Después de incuba las placas del antibiograma se procederá


a la lectura de este.

Se usa una regla y se mide el diámetro del halo de


inhibición.

La longitud obtenida después se comparará con estándares


que nos dirán si el medicamento será efectivo o no en el
tratamiento.

Clasificación de Antibióticos

Modo de acción de los antibióticos

En general, los antibióticos deben su toxicidad selectiva a las diferencias entre las células
eucariotas y procariotas. Su eficacia tóxica es la consecuencia de su capacidad de inhibir
una reacción bioquímica específica y esencial, bien sea para la célula eucariota o para la
célula procariota. Para que el antibiótico ejerza su acción es necesario que llegue al foco
infeccioso, penetre en las bacterias (por difusión o transporte activo) y alcance
intracelularmente la concentración necesaria. Una vez dentro de la célula el antibiótico
puede ser bacteriostático si inhibe la multiplicación de forma reversible, o bactericida si
tiene un efecto letal. En general, cada grupo de antibióticos actúa preferentemente de una
forma u otra.

Antibióticos bacteriostáticos: macrólidos, tetraciclinas, cloranfenicol.

Antibióticos bactericidas: betalactámicos, aminoglicósidos, polipeptídicos, polienos.

Los antibióticos de uso en clínica pueden ejercer su acción en una de las siguientes
estructuras o funciones:

1.- Inhibición de la síntesis de la pared celular. La pared celular de las bacterias está
compuesta por peptidoglicano. Esta estructura, que es más gruesa en las G+, entre otras
funciones protege a la célula de su destrucción por estallido en un medio normal, no
hiperosmótico puesto que las bacterias tienen una gran presión osmótica interna (G+: 20
atmósferas; G-: 5 atmósferas). Las células, debido a su crecimiento, están contínuamente
sintetizando nuevo peptidoglicano y transportándolo a su sitio adecuado en la pared
celular. Varios antibióticos reaccionan con uno o varios de los enzimas que se requieren
para completar este proceso originando que la célula desarrolle puntos frágiles en su
pared celular debido a la síntesis de peptidoglicano deficiente, lo que origina que sea
osmóticamente. frágil. Los antibióticos que producen este efecto se consideran
bactericidas ya que la célula debilitada está sujeta a lisis. La mayor parte de estos
antibióticos son activos frente a células en crecimiento ya que las células viejas no
sintetizan peptidoglicano. Antibióticos que bloquean la síntesis de la pared celular:
Bacitracina. Bloquea el transporte de las subunidades de peptidoglicano a su posición en
la pared celular. Betalactámicos. Inhiben la síntesis de la pared celular en su última fase
interfiriendo la transpeptidación. Son análogos estructurales de la D-alanil-D-alanina y por
ello se considera que estos fármacos se unen a las transpeptidasas a las que inactivan
irreversiblemente. Algunas penicilinas son menos efectivas frente a bacterias G- debido a
que la membrana externa bloquea su paso al interior, aunque las penicilinas sintéticas y
cefalosporinas tienen efecto también frente a G-.

2.- Alteración sobre la membrana citoplásmica. Una célula con la membrana dañada
muere invariablemente por insufiencia metabólica o lisis incluso cuando no está en
crecimiento debido a que esta estructura es vital para todas las células ya que entre sus
propiedades incluye el actuar como barrera de permeabilidad selectiva. Las sustancias
que alteran esta estructura modifican la permeabilidad, permiten la salida de iones K y
macromoléculas como los ácidos nucleicos y causan un efecto lítico. Desgraciadamente,
debido a la presencia universal de membranas tanto en células microbianas como
animales, la mayor parte de estos antibióticos son tóxicos para los humanos. Antibióticos
que alteran la membrana citoplásmica: Polimixinas. Interaccionan con los fosfolípidos de
las membranas desorganizándolos y aumentando su permeabilidad originando una
pérdida de metabolitos esenciales y la muerte bacteriana como resultado final. Las
bacterias más susceptibles son las que tienen en su membrana un mayor contenido en
fosfolípidos (G-). Polienos. Los antibióticos poliénicos (nistatina, anfotericina B) son
activos frente a hongos ya que forman complejos con los esteroles de las membranas de
las células fúngicas originando poros hidrofílicos, lo que modifica la permeabilidad de la
membrana.

3.- Inhibición de la síntesis proteica. La mayor parte de los inhibidores de la síntesis


proteica reaccionan con el complejo ribosoma-mRNA. Aunque las células humanas
también tienen ribosomas, los ribosomas de los eucariotas son diferentes en tamaño y
estructura de los ribosomas de los procariotas (80S y 70S) por lo que estos
antimicrobianos tienen una acción selectiva frente a bacterias. Antibióticos que inhiben la
síntesis proteica: Aminoglicósidos (estreptomicina, gentamicina). Actúan uniéndose
específicamente y de forma irreversible a un receptor proteico de la subunidad 30S de los
ribosomas (en el caso de la estreptomicina, la proteína P10). Esta unión causa, por un
lado, el bloqueo de la actividad normal del complejo de iniciación, con lo que se detiene la
síntesis proteica y, por otro, distorsiona el codon del locus A, provocando la incorporación
de un aminoácido distinto al codificado. De esta manera se forman proteínas anómalas.
Tetraciclinas. Se unen a la subunidad 30S de los ribosomas bloqueando la fijación del
aminoacil-tRNA al locus A parando la síntesis de proteínas. Cloranfenicol. Se une a la
subunidad 50S de los ribosomas impidiendo la transferencia al inhibir la
peptidiltransferasa y, por ello, la transpeptidación. Macrólidos (eritromicina). También
actúan sobre la subunidad 50S de los ribosomas, impidiendo la translocación, es decir, el
paso del peptidil-tRNA del locus A al locus P, previa liberación del tRNA.
4.- Bloqueo de la síntesis de los ácidos nucléicos. La biosíntesis de moléculas de RNA y
DNA consiste en una larga serie de reacciones catalizadas por enzimas que al igual que
cualquier otro proceso complejo es susceptible de romperse en diferentes puntos. Una
inhibición en un punto de la secuencia puede bloquear las reacciones posteriores. Los
antibióticos que interfieren en la síntesis de ácidos nucléicos esencialmente actúan
bloqueando la síntesis de sus componentes, inhibiendo la replicación o parando la
transcripción. Compuestos que bloquean la síntesis de ácidos nucléicos: Sulfamidas
(quimioterápicos sintéticos). Se denominan antimetabolitos debido a que interfieren un
proceso metabólico esencial en las bacterias. Las sulfamidas son análogos estructurales
de un compuesto metabólico natural, el PABA (ácido para-aminobenzoico) que es
necesario para que las bacterias puedan sintetizar ácido fólico que a su vez es un
componente del coenzima ácido tetrahidrofólico que a su vez participa en la síntesis de
purinas y ciertos aminoácidos. Una molécula de sulfonamida tiene gran afinidad por el
sitio donde se une el PABA al enzima (dihidro-pteroatosintetasa) que sintetiza ácido fólico.
Si esto ocurre se bloquea la síntesis de ácido fólico, lo cual provoca que exista una
cantidad insuficiente de ácido fólico con lo que se bloquea la síntesis de ácidos nucléicos.
Aunque los humanos requieren también ácido fólico en la síntesis de ácidos nucléicos, los
humanos no pueden sintetizar ácido fólico; éste es un nutriente esencial (vitamina) que se
obtiene exógenamente a través de la dieta. Ya que los humanos carecen de este sistema
enzimático especial para incorporar el PABA al ácido fólico, su metabolismo no puede ser
inhibido por las sulfamidas.

Resistencia bacteriana

Cada antibiótico se caracteriza por un espectro natural de actividad antibacteriana. Este


espectro comprende las especies bacterianas que, en su estado natural, sufren una
inhibición de su crecimiento por concentraciones de su antibiótico susceptibles de ser
alcanzadas in vivo. A estas especies bacterianas se les dice naturalmente sensibles a
dicho antibiótico. Las especies bacterianas que no se encuentran incluidas dentro de
dicho espectro se denominan naturalmente resistentes.

El antibiótico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistentes eliminando las
sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presión de selección. El aumento de la
frecuencia de las cepas resistentes va unido casì siempre al uso intensivo del antibiótico
en cuestión.

 La resistencia natural es un carácter constante de todas las cepas de una misma


especie bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales permite prever la
inactivìdad de la molécula frente a bacterias identificadas (después del
crecimiento) o sospechosas (en caso de antiboterapia empírica). En ocasiones,
constituye una ayuda para la identificación, puesto que cìertas especies se
caracterizan por sus resistencias naturales. Ejemplos: Resistencia natural del
Proteus mirabilis a las tetraciclinas y a la colistina. Resistencia natural de la
Klebsiella pneumoniae a las penicilinas (ampicilina, amoxicilina).
 La resistencia adquírida es una característica propia de ciertas cepas, dentro de
una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio genético ha sido
modificado por mutación o adquisición de genes. Contrariamente a las resistencias
naturales, las resistencias adquiridas son evolutivas, y su frecuencia depende a
menudo de la utilización de los antibióticos. En el caso de numerosas especies
bacterianas, y teniendo en cuenta la evolución de las resistencias adquiridas, el
espectro natural de actividad no es ya suficïente para guiar la elección de un
tratamiento antibiótico. En ese caso, se hace indispensable el antibiograma.
 Una resistencia cruzada es cuando se debe a un mismo mecanismo de
resistencia. En general, afecta a varios antibióticos dentro de una misma familia
(Ejemplo: La resistencia a la oxacilina en los estafilococos se cruza con todas los
ß-lactámicos). En ciertos casos, puede afectar a antibióticos de familias diferentes
(Ejemplo: La resistencia por impermeabilidad a las ciclinas se cruza con la
resistencia al coloranfenicol y al trimetoprima).
 Un resistencia asociada es cuando afecta a varios antibióticos de familias
dìferentes. En general, se debe a la. asociación de varios mecanismos de
resistencia (Ejemplo: La resistencia de los estafiolococos a la oxacilina va
frecuentemente asociada a las quinolonas, aminoglicósidos, macrolidos y ciclinas).

Control de calidad

Las cepas control utilizadas para medir la reproducibilidad de la técnica anterior son:

• Staphylococcus aereus - ATCC 25923


• Y Escherichia coli – ATCC 25922

Que deberán incluirse en la prueba diaria.


La FDA también recomienda el uso de las cepas de Pseudomonas aeruginosa – ATCC
27853 susceptible a Gentamicina y Carbenicilina.
Deben emplearse siempre en las mismas condiciones que las cepas problema.