CUESTIONARIO: Cinética enzimática de la fosfatasa alcalina

1. Curva patrón
¿Por qué se hace una curva patrón de p-nitofenol?
Se realizar para poder tener un rango de cantidades de p-nitrofenol, en la cual se
podrá interpolar valores de absorbancia y por lo tanto obtener cantidades del
anterior compuesto. [1]

2. Progreso de la reacción enzimática

¿Por qué se utiliza sosa?
Tiene dos funciones, la primera transforma el nitrofenilfosfato a p-nitrofenolato la
cual tiene una coloración amarillenta, principalmente para la curva patrón y la
segunda acción es detener la reacción enzimática [2]
¿Qué utilidad tiene este ensayo?
La actividad de una enzima se determina conociendo la velocidad de la reacción
que cataliza, La velocidad de reacción se define como la cantidad de sustrato
consumido o de producto formado por unidad de tiempo. Por lo que a apartir de
esta curva se puede obtener este parámetro. [1]
¿Qué graficaría usted con estos datos?
Se graficaría tiempo en el eje de las abscisas y la concentración de p-nitro fenol
(producto de la reacción).[3]
¿Cómo se calcula la velocidad?
El cálculo de la concentración de producto (p-nitrofenol) se basa en la ley de
Lambert-Beer: A = ε.C.; en donde ε es 18,5 mM-1 cm-1. A partir de la Curva que
𝑑𝐶
tiene una ecuación de la curva 𝑑𝑡 = v*t + b por lo que solo se despejaría la
velocidad. [3]
Cinéticamente como explicaría el comportamiento observado
La cinética que se presenta seria de orden 0 en los tiempos utilizados, la velocidad
es dependiente de la concentración de sustrato.
En base a sus resultados ¿qué tiempo escogerá para realizar sus ensayos?
El tiempo de 30 minutos, ya que presenta la mayor absorbancia y por ende la mayor
cantidad de p-nitrofenol producido, por lo que nos indicaría que se ha catalizado
todo el reactivo agregado [1]

3. Efecto del pH
¿Cuál es el propósito de este experimento?
Conocer el pH óptimo a la cual se realiza de la forma más cuantitativa la catálisis,
con lo que podremos ajustar los parámetros para posteriores experimentos.
¿Por qué se utilizan diferentes blancos? ¿Qué tubos deben leerse con los
diferentes blancos?
Porque se comparan la velocidad de la enzima con diferentes buffers que tienen
distinto pH con lo que se observa a que pH es el mejor para catalizar la reacción de
la enzima, los tubos a medir son los que contienen: glicina pH 9, Tris pH 7,
carbonatos pH 10.4.
¿Cuál es el valor de pH del ensayo al cual la enzima presenta la mayor
velocidad?
A un pH de 10.4, se observan los puntos máximos en 2 buffers.
¿Hay diferencia entre los distintos amortiguadores con respecto a su efecto
en la velocidad de esta enzima?
Si, respecto a los buffers al mismo pH 10.4 (glicina y Carbonatos) ambos presentan
una variación grande en sus valores.

4. Efecto de la temperatura
¿Por qué se pre incuba la mezcla de reacción?
Con el buffer de glicina se observa que sin la pre incubación, la glicina puede inhibir
a la enzima.[3]

5. Efecto de un inhibidor
¿Qué tipo de inhibición presenta?
Inhibición Competitiva, la KM cambia, pero la velocidad de la reacción se mantiene
constante.

Referencias:
[1] Barcena-Ruiz J.A et al. Caracterización cinética de la fosfatasa alcalina, Departamento
de Bioquimica y Biologia Molecular, Universidad de Cordova, España.
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-bio-
mol/pdfs/30%20FOSFATASA%20ALCALINA.pdf [Consultado: 04/10/15]

[2] Quantitative Determination of Phosphatase Activity from Biological

Experimentation Laboratory of Columbia University.
http://www.columbia.edu/itc/barnard/biology/biobc2004/edit/experiments/Experiment7-
Enz.pdf Consultado: 04/10/15
[3] DeChatelet, L. R. Cooper, M. A modified procedure for the determination of loukocyte
alkaline phosphatase. 1970. Biochemical Medicine, vol. 4- 1 pp 61- 68