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MARZO 2003
in questo numero
Le tecniche
molecolari:
Roche Diagnostics
Viale G.B. Stucchi, 110
dalla ricerca
20052 Monza (MI)
www.roche-diagnostics.it alla diagnostica
SOMMARIO
MONOGRAFIA - ”LE TECNICHE MOLECOLARI: DALLA RICERCA ALLA DIAGNOSTICA”
La PCR da ricerca avanzata a routine Pag. 4
Evoluzione delle metodiche molecolari nella diagnostica di HBV Pag. 12
Proteomica e medicina di laboratorio Pag. 20
Sviluppo ed applicazioni del sequenziamento genico
nella diagnostica microbiologica Pag. 28
La PCR Real Time: metodologia di analisi nella diagnostica
delle malattie infettive Pag. 33
PCR Real-Time per la determinazione dell’Antibiogramma
Molecolare in Mycobacterium tuberculosis Pag. 39
Applicazioni della tecnologia dei DNA microarray nella
ricerca di base e nella diagnostica clinica Pag. 44
Metodiche estrattive per la preparazione dei campioni Pag. 50
La metodica Taqman (Cobas Taqman) nella valutazione
dinamica della carica virale Pag. 54
INTRODUZIONE
Tecniche Molecolari dalla Ricerca alla Diagnostica
Il compito d’introdurre un insieme di reports su aspetti biomedici applicativi delle tecniche molecolari e di disegnare il profilo del loro passaggio
dalla ricerca di base e applicata alla diagnostica medica è, al tempo stesso, facile e complesso. Facile, perché si tratta di strumenti che la maggior
parte di noi conoscono e applicano e dei quali hanno vissuto le tappe di perfezionamento. Difficile, perché il notevole numero di settori coinvolti
e di applicazioni in atto o potenziali apre un universo complesso e articolato che è virtualmente impossibile tradurre in poche righe. È un viaggio
iniziato da poco che ci ha già portato lontano e che sta proseguendo con vigore.
Ogni tecnica molecolare trova i sui campi applicativi in settori biomedici anche apparentemente lontani; ciò prova che la biologia molecolare si
colloca nella diagnostica, al pari della ricerca, come strumento trasversale. Il risultato è stato anche quello di avvicinare specialità biomediche ap-
parentemente lontane in virtù dell’omogeneità delle procedure. Oggi tutto questo ci può sembrare quasi scontato, ma fino a pochi anni fa non
lo era affatto. Ma altre considerazioni di carattere generale, alcune delle quali possono guidare o modificare le nostre scelte tecniche e il nostro
approccio metodologico, possono essere fatte. Infatti, proprio perché la caratteristica della finalizzazione alla risoluzione di un quesito biologico è
connaturata nell’approccio molecolare, il passaggio dalla ricerca all’applicazione diagnostica (o, più in generale, all’applicazione biomedica) è stato
in genere rapidissimo, quando non immediato. Si potrebbe banalizzare questo concetto affermando che la biologia molecolare è pragmatica per
sua stessa natura. Ciò ha ridotto enormemente le distanze tra mondo della ricerca e mondo applicativo biomedico, portando a sinergie che
prima non potevano neppure essere immaginate. L’esempio più evidente è lo studio dell’infezione da virus dell’immunodeficienza umana (HIV),
dove tecniche molecolari sono state applicate allo studio delle caratteristiche biologiche, del potere patogeno e dei rapporti virus-ospite con risul-
tati eccellenti e rapidi e, nello stesso tempo (e in diretto rapporto con i dati ottenuti), sono state sviluppate strategie diagnostiche e si sono aper-
te le porte ad un’efficace terapia dell’infezione. La maggioranza delle strategie molecolari applicate con successo nello studio dell’infezione da HIV
ha poi mostrato una diretta trasferibilità ad altri settori biomedici.
Le tecniche molecolari hanno consentito una via diretta alla diagnosi in tutti quei casi dove era possibile solo una valutazione indiretta, talora
equivoca. Gli esempi di questo aspetto sono numerosi in virologia, ma non mancano applicazioni nella diagnostica batteriologica e parassitolo-
gia di estremo interesse. Sempre nel settore microbiologico, è stato sostanzialmente modificata la metodologia di classificazione e tipizzazione
(prima basata sul fenotipo o su caratteri antigenici), spesso fondamentale per valutare il potenziale patogeno di un microrganismo o per valuta-
zioni epidemiologiche e forensi. In alcuni casi, non vi erano (e non vi sono) alternative serie alla diagnosi molecolare; un esempio principe è quel-
lo dell’infezione da papillomavirus umani, dove rilevamento e tipizzazione (indispensabili entrambi) possono essere eseguiti soltanto su base mo-
lecolare. Metodologie più recenti, come le applicazioni della proteomica o l’analisi del profilo trascrizionale mediante tecniche avanzate, ci consen-
tono un avvicinamento allo studio diretto delle relazioni tra microrganismo e ospite a livello molecolare e, più in generale, di verificare la presen-
za di patterns d’espressione genica che evidenzino, già a livello preclinico, patologie gravi.
Infine, trattando delle applicazioni diagnostiche di tecniche molecolari, non può non essere sottolineato il profondo e rapido cambiamento che è
stato portato dalla biologia molecolare nel monitoraggio delle terapie delle malattie infettive, neoplastiche, genetiche e metaboliche. Nelle infe-
zioni persistenti da HIV, da virus dell’epatite B e C (HBV; HCV) si è compresa l’importanza di monitorare quantitativamente l’attività replicativa vi-
rale, ma si è subito anche capito che occorreva disporre di altri strumenti. Ricordo che, solo pochi anni fa, in un meeting dove avevo mostrato,
nella sequenza genica di un virus, mutazioni selezionate dalla terapia e caratterizzanti le varianti resistenti, un collega mi chiese se davvero rite-
nessi che, per arrivare ad una diagnosi di sensibilità o resistenza di virus ai farmaci antivirali, fosse necessario il sequenziamento del genoma. Ri-
sposi che, sulla base dei dati che s’iniziava ad avere, sembrava proprio che la strada dovesse essere quella. Non vinsi, al momento, lo scetticismo
del collega, ma qualcosa deve averlo fatto ritornare sulle sue decisioni essendo diventato una deciso sostenitore (e applicatore) di quella che allo-
ra fu la mia tesi. In realtà, ora le cose si sono spinte, anche sul fronte diagnostico, molto oltre e si arriva ad auspicare un’applicazione di tipo
post-genomico allo studio delle resistenze ai farmaci antivirali, come nel caso delle applicazioni finalizzate allo studio del fenotipo ricombinante e
della fitness virale in presenza ed assenza di composti inibitori.
I notevoli successi registrati non possono allontanare la considerazione che molta strada ci aspetta ancora nel perfezionamento delle applicazioni,
della standardizzazione delle procedure e dei controlli di qualità dei processi. È esperienza comune che i controlli inter-laboratorio di molte tecni-
che molecolari forniscano frequentemente risultati non entusiasmanti. Il felice superamento di alcuni problemi dipenderà anche da come le di-
verse competenze che agiscono nel settore (ricercatori di istituzioni o industriali e personale delle strutture diagnostiche) opereranno nel continuo
perfezionamento di uno strumento potente e delicato.
Massimo Clementi
Università Vita-Salute San Raffaele, e Laboratorio di Microbiologia, Diagnostica e Ricerca San Raffaele, Milano
La PCR da ricerca
avanzata a routine
G. Portella - G. Vecchio
Dipartimento di Biologia e
Patologia cellulare e Molecolare
“L. Califano”
Università Federico II Napoli
Dai primordi della biologia molecolare alla PCR è essenziale per monitorare il decorso della patologia e
La definizione di diagnostica molecolare è ormai da la terapia. Si può quindi ritenere che le applicazioni della
tempo entrata nell’uso comune per descrivere tutte le biologia molecolare siano ormai parte integrante della
metodologie necessarie per l’effettuazione di diagnosi di tecnologie diagnostiche di laboratorio.
laboratorio, sia di tipo qualitativo che quantitativo sugli Grandi cambiamenti sono avvenuti dalla fine degli anni
acidi nucleici. ‘70 ed inizio degli anni ‘80 quando le tecnologie di clo-
Queste tecnologie sono ormai essenziali per individuare naggio, di sequenza di acidi nucleici e di identificazione
la causa di malattia, in particolar modo nel caso di di sequenze specifiche del DNA genomico umano o di se-
agenti infettivi o nel caso di alterazioni genetiche. Inol- quenze di RNA erano appannaggio esclusivo di alcuni la-
tre, in alcuni tipi di patologie, la diagnostica molecolare boratori particolarmente attrezzati e naturalmente quei
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Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
laboratori erano impegnati in progetti di ricerca di base. ne, il sequenziamento di frammenti di DNA, ecc. Per
In quel periodo pur cominciandosi ad intravedere le quanto riguarda il “Southern blot” questa tecnica è in
enormi potenzialità di queste nuove tecnologie e pur grado di consentire l’ individuazione di alcune alterazioni
ipotizzandosi una sicura utilizzazione pratica della biolo- genetiche come le grosse delezioni che si riscontrano in
gia molecolare, l’opinione corrente era che le biotecnolo- malattie quali la α e la β talassemia. Tuttavia con que-
gie sarebbero state di grande rilevanza per alcuni tipi di sta tecnica non è possibile individuare alterazioni geneti-
applicazioni, come ad esempio ottenere a costi bassi che caratterizzate dalla perdita o dalla sostituzione di
grosse quantità di ormoni umani o di altre proteine pochi o di singoli nucleotidi (le cosiddette “point muta-
umane ricombinanti che avrebbero potuto essere utiliz- tions”) che pure possono comportare un fenotipo patolo-
zate a scopi terapeutici. Non si era ancora affermato il gico molto rilevante, come nel caso dell’anemia falci-
concetto secondo il quale l’utilizzazione delle tecnologie forme.
della biologia molecolare potesse avere importanti appli- La metodica del “Southern blot” messa a punto da Ed
cazioni in ambito diagnostico. Molte delle tecniche utiliz- Southern (2) per la caratterizzazione sia di DNA genomico
zate in quegli anni, infatti, erano poco standardizzate, che di DNA clonato richiede l’estrazione del DNA da un
presentavano grandi variabilità di efficienza tra i vari la- campione biologico (cellule eucariotiche o procariotiche,
boratori e, spesso anche i risultati ottenuti mostravano tessuti, fluidi biologici). Il quantitativo di DNA necessario
delle difformità. Inoltre, l’esecuzione di queste tecniche per l’ esecuzione di questa tecnica è di circa 10-20 micro-
richiedeva attrezzature e competenze non facilmente di- grammi e il DNA ottenuto non deve essere degradato,
sponibili nei laboratori diagnostici. Pertanto, per molti vale a dire deve conservare la struttura complessa del
anni l’utilizzazione di queste potenti tecnologie in nume- DNA di partenza. Successivamente é necessaria una fase
rose aree delle biologia è rimasta confinata ai laboratori di digestione del DNA che si ottiene con enzimi capaci di
di ricerca dove, però ha avuto una vastissima diffusione. tagliare il DNA all’altezza di sequenze nucleotidiche ben
L’ esigenza di apprendere queste tecniche e di applicarle definite: gli enzimi di restrizione. Il DNA così modificato
alle singole aree di ricerca biologica era così diffusa che viene quindi sottoposto a separazione mediante migra-
agli inizi degli anni ‘80 fu pubblicato ad opera di Tom zione in campo elettroforetico e poi trasferito per capilla-
Maniatis, docente di Biologia Molecolare presso la Ha- rità (“blotting”), su una membrana di nylon o di nitro-
vard Medical School di Boston Ma U.S.A. un manuale di cellulosa. Il DNA viene, quindi, fissato su questa mem-
laboratorio interamente dedicato alle tecnologie di clo- brana e fatto reagire con una sequenza complementare
naggio molecolare ed alla manipolazione degli acidi nu- di DNA denominata “probe” marcata, in genere con un
cleici (1). Questo manuale descriveva dettagliatamente le isotopo radioattivo o chimicamente con biotina. Dopo
più importanti metodologie e le sue possibili applicazio- aver fatto ibridare il DNA, in condizioni opportune che
ni nei più svariati campi della biologia. Esso ha rappre- facilitano un’alta specificità di ibridazione (“annealing”),
sentato e rappresenta tuttora nelle numerose edizioni si effettua una rivelazione della eventuale reazione di
che si sono succedute, una preziosa fonte di informazioni ibridazione mediante autogradiografia. Da quanto appe-
per tutti coloro che intendevano e intendono avvalersi na descritto si comprende come questa tecnologia, pur
delle tecniche di biologia molecolare per le loro attività rappresentando un potente metodo di indagine moleco-
di ricerca. La sempre maggiore diffusione e la maggiore lare presenta numerosi svantaggi, quali la necessità di
affidabilità e riproducibilità delle tecniche di biologia ricorrere ad una digestione con enzimi di restrizione ap-
molecolare, associate alla possibilità di indagare in det- propriati e diversi a seconda del tipo di alterazione mole-
taglio la sequenza nucleotidica degli acidi nucleici, non- colare che si cerca di individuare, il frequente utilizzo di
ché le loro alterazioni molecolari, ha aperto la possibilità sonde radioattive per la loro maggiore sensibilità rispet-
di applicazione di queste tecnologie alla diagnostica di to a quelle biotinilate, ecc. Inoltre bisogna includere tra
malattie genetiche, neoplastiche ecc. gli svantaggi di questa metodica i costi elevati ed i
Le tecnologie disponibili agli inizi degli anni ‘80 per tempi di esecuzione molto lunghi e non compatibili con
analizzare possibili alterazioni molecolari di acidi nucleici attività di tipo routinario.
associate a patologie umane erano rappresentate soprat- Nonostante la complessità di questa e delle altre tecni-
tutto da tecniche quali il “Southern blot” e il “Northern che di biologia molecolare disponibili in quegli anni,
blot”, rispettivamente per l’analisi del DNA e dell’RNA, la esse sono state tuttavia utilizzate per l’analisi a livello
digestione enzimatica del DNA con gli enzimi di restrizio- molecolare di alterazioni di alcuni geni come quelli glo-
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La PCR da ricerca avanzata a routine
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Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
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La PCR da ricerca avanzata a routine
e cioé l’epidemiologia molecolare. La PCR infatti ha con- stati naturalmente superati con il tempo e ormai questa
sentito di valutare la presenza di alterazioni molecolari tecnologia e le sue diverse varianti svolgono un ruolo
con grande rapidità, in un numero elevato di campioni decisivo nella diagnostica molecolare. Tra le varianti più
raccolto nel corso di decenni. importanti vi è la RT-PCR, ossia una amplificazione a
Negli ultimi anni è stata poi sviluppata una nuova tecni- partire da un segmento di RNA che viene sottoposto a
ca, definita in situ PCR, che consente di effettuare un’am- retro-trascrizione e quindi convertito in cDNA (DNA com-
plificazione di acidi nucleici direttamente su una sezione plementare all’RNA).
di tessuto e di identificare i tipi cellulari in cui l’amplifi- I primi metodi di indagine diagnostica basati sulla tecni-
cazione è avvenuta (6). ca della PCR e sulla sua variante principale, la RT-PCR,
Sempre basandosi sulla tecnica della PCR è stata svilup- sono stati utilizzati per la diagnosi di infezione da virus
pata la tecnologia detta SSCP (single strand conformational della immunodeficienza umana acquisita, HIV-1 (8). Si
polymorphism) (6), che è una tecnica semplice ed efficace può ritenere che questa metodica abbia fornito un con-
per identificare variazioni nella sequenza del DNA ampli- tributo essenziale per la prevenzione della infezione da
ficato. HIV e per la messa a punto di protocolli diagnostici vali-
Questa tecnica si basa sull’osservazione secondo la quale di. Infatti fino al momento dell’introduzione della meto-
la mobilità di un filamento di DNA a singola elica in un dica della PCR, la diagnosi di infezione da HIV era basata
gel di poliacrilammide risente molto di variazioni nella se- su metodi sierologici, ossia su un tipo di diagnostica “in-
quenza primaria di esso, probabilmente perché alterazioni diretta” volta ad identificare i soggetti infetti che aveva-
anche molto modeste (es. di un singolo nucleotide) provo- no sviluppato anticorpi anti-HIV-1 (individui cosiddetti
cano una variazione importante della conformazione del sieropositivi). Pertanto molti individui infetti sfuggivano
DNA e della sua mobilità elettroforetica. Questa metodica alla diagnosi durante il cosidetto “periodo finestra”, (pe-
è stata utilizzata in maniera intensiva per lo “screening” riodo durante il quale il virus si replica ed è presente nel
di mutazioni ereditarie o per identificare mutazioni soma- siero del soggetto infetto, ma non si è ancora sviluppata Fig. 3
tiche in neoplasie. La tecnica del SSCP può anche essere una reazione immunologica significativa). Curva caratteristica
utilizzata per identificare alleli diversi in individui eterozi- Tali individui infetti non venivano identificati come siero- di una reazione di
goti, con importanti risvolti per la comprensione dei mec- positivi non avendo ancora sviluppato anticorpi (siero- amplificazione
canismi di ereditarietà di alcune patologie. conversione) e potevano consentire un’ulteriore trasmis- tramite PCR: si
E’ importante aggiungere che numerose tecnologie di sione della infezione. osserva una fase di
clonaggio, ossia di isolamento, di geni sono basate sulla Inoltre la diagnosi sierologica comporta con una certa amplificazione
PCR, tra cui la tecnica definita RACE (Rapid amplification frequenza dei risultati falso-positivi dovuti a fenomeni di logaritmica o
of cDNA ends). Anche tecniche di identificazione di geni cross-reattività; pertanto, per ottenere una diagnosi defi- esponenziale ed una
differenzialmente espressi sono state sviluppate a partire nitiva di positività al virus HIV-1 si rendeva spesso neces- fase di plateau
dalla PCR, come la tecnica del differential display (6), oggi
però quasi del tutto abbandonata perché superata dalla
tecnologia dei microarrays (7).
1 plateau
Recentemente la tecnica della PCR è sta utilizzata non
solo per identificare ed amplificare specifiche sequenze di
DNA, ma è anche utilizzata come metodo per modificare
sequenze di DNA, ossia per introdurre mutazioni specifi- 0.1
che e studiarne gli effetti, “site specific mutagenesis” (6). pmoli di
prodotto
Dal laboratorio di ricerca alla diagnostica FASE
La PCR presenta anche diversi svantaggi, quali le diffi- 0.01 ESPONENZIALE
coltà di standardizzazione e di quantizzazione del DNA
stampo di partenza, effetto plateau (Fig. 3). A causa
della sua sensibilità, è molto elevata la possibilità di
false positività dovute alle contaminazioni dei campioni 10 20 30 40 50
con pochissime molecole di DNA stampo provenienti da numero di cicli
precedenti amplificazioni. Alcuni degli svantaggi sono
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Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
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La PCR da ricerca avanzata a routine
rappresenta per infettivologi ed epatologi un valido si- 2) di monitorare l’ andamento della malattia attraverso
stema per monitorare la terapia antivirale e valutarne la quantizzazione delle copie di DNA-RNA virale pre-
l’efficacia. Inoltre la ricerca del genotipo virale, sempre sente nel siero di pazienti affetti, anche ai fini dell’uti-
basata sulla metodica di amplificazione genica, ha con- lizzazione della scelta della terapia più efficace da uti-
sentito di chiarire le diverse capacità patogene dei vari lizzare (es. monitoraggio della carica virale dell’HIV)
genotipi e di poter impostare una terapia differenziata a 3) di valutare la presenza di genotipi virali differenti, ov-
seconda dei genotipi. vero di mutazioni che avvengono nel genoma virale e
E’ infatti noto che l’infezione da parte del genotipo 1 che necessitano di variazioni dei farmaci da sommini-
dell’HCV richiede un trattamento antivirale prolungato stare in seguito a sopravvenuti fenomeni di resistenza.
nel tempo e comporta una frequente ripresa di malattia. Sempre nel caso di patologie infettive la PCR può essere
Sempre nel caso delle infezioni da virus epatitici è stata utilizzata per la diagnosi della infezione da Citomegalo-
sviluppata anche una metodica per il monitoraggio della virus (CMV) (10). Questo herpesvirus infetta la totalità dei
carica virale da HBV che ha consentito di valutare l’effica- soggetti nei paesi con bassi standard igienici e tra il 50 e
cia della terapia che si utilizza nella epatite causata da l’80% dei soggetti nei paesi sviluppati.
questo agente virale. Inoltre altre tecniche diagnostiche, L’infezione da CMV in gravidanza causa malformazioni,
sempre basate sull’amplificazione genica, hanno consen- mentre l’infezione o la sua riattivazione in soggetti im-
tito di mettere in evidenza lo sviluppo di ceppi di HBV munodepressi può essere letale per le sue complicanze.
mutanti resistenti alla terapia con la lamivudina un far- Nel caso di individui sottoposti a trapianto ed a terapia
maco capace di inibire la replicazione virale. In tal modo immunosoppressiva è previsto un follow up con ricerca
è naturalmente possibile variare la terapia evitando peri- di un antigene virale: la fosfo-proteina p65, che viene fa-
colose riprese dell’attività replicativa virale. gocitata dai polimorfonucleati e che, essendo dotata di
E’ molto interessante che la PCR non ha sostituito la ri- segnali di trasporto intranucleare, viene trasferita nei
cerca dell’antigene di superficie del virus dell’epatite B nuclei dove viene identificata.
(HbsAg), essendo questa indagine sufficientemente sensi- Questa tecnica, basata sulla metodica dell’immunofluore-
bile e poco costosa. Ciò indica chiaramente che le meto- scenza, presenta diversi svantaggi tra cui la necessità del-
diche di amplificazione genica non devono sostituire si- l’utilizzazione di campioni freschi, nonché quella di una
stemi di diagnosi consolidati, efficaci, e magari a basso Fig. 4 difficile standardizzazione. Non è stato possibile, infatti
costo, ma costituiscono un importante sistema diagnosti- Amplificazione di un individuare un valore soglia, espresso come numero di
co più sofisticato in grado: frammento di β-glo- cellule positive/200 000, al di sopra del quale è necessa-
1) di valutare patologie virali o di altra natura altrimenti bina con dimensioni rio iniziare il trattamento anche in assenza di una sinto-
non diagnosticabili (es. periodo finestra dell’infezione variabili tra 150 bp matologia definita.
da HIV) fino a 2950 bp Per questo motivo è stata sviluppata una metodica di ri-
cerca del DNA del CMV attraverso PCR quantitativa basa-
ta sull’ amplificazione genica che presenta alcuni vantag-
gi, quali una maggiore sensibilità e la possibilità di lavo-
rare con campioni precedentemente conservati.
105 Oltre al campo virologico l’introduzione delle tecnica di
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amplificazione genica ha consentito di definire, mediante
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lo studio degli elementi genici alterati, nuovi parametri
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diagnostici e prognostici in campo oncologico.
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Un esempio è rappresentato dalla leucemia mieloide cro-
747
989 nica caratterizzata da una traslocazione cromosomica
1327 9:22 che determina la formazione di un gene di fusione
1924 BCR/abl.
2425 Il trascritto di questo gene ibrido è presente nelle sole
2951 cellule neoplastiche e la sua identificazione viene consi-
derata come metodo di elezione per il follow up dopo
chemioterapia.
Infatti, data l’elevata sensibilità della PCR, è possibile
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Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
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Evoluzione delle metodiche molecolari
nella diagnostica di HBV
V. Ghisetti - A. Marzano*
U.O. Microbiologia, Dipartimento
di Patologia Clinica,
* Divisione di Gastroenterologia,
Azienda Ospedaliera
S.Giovanni Battista di Torino -
Ospedale Molinette, Torino
L’applicazione delle tecniche di biologia molecolare allo patologici multiformi che sono gravati dalla possibile
studio dell’epatite da virus B (HBV) ha contribuito in evoluzione in cirrosi e da qui allo scompenso epatico ter-
modo determinante al processo di conoscenza delle inte- minale, che può rendere necessario il trapianto epatico.
razioni tra il virus e l’ospite e dei quadri patologici che Inoltre la cirrosi da HBV si può accompagnare allo svi-
ne derivano. La possibilità di studiare la dinamica della luppo del carcinoma epatocellulare a seguito di comples-
replicazione virale attraverso metodi molto sensibili che se interazioni tra il virus e le componenti cellulari.
consentono di valutare dove e quanto il virus si replica, Molteplici sono gli sforzi tesi a migliorare l’approccio te-
ha contribuito a migliorare i processi diagnostici e tera- rapeutico all’epatite cronica da HBV e risultati incorag-
peutici. gianti stanno emergendo dalle recenti terapie con antivi-
Mentre la forma acuta di epatite da HBV è sufficiente- rali a base di analoghi nucleosidici come la lamivudina,
mente definita, la forma cronica ha quadri clinici e isto- l’entecavir e l’adefovir-dipivoxil. Il successo della terapia
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Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
antivirale ha trovato nella quantizzazione sierica del DNA plicazione di HBV è temporaneamente soppressa o conte-
di HBV uno strumento fondamentale per valutare la ri- nuta a livelli modesti. Generalmente i valori di HBV DNA
sposta terapeutica e individuare precocemente lo svilup- fluttuano tra 104 e 108 copie/ml. Nelle situazioni di atti-
po di profili di resistenza. vità vengono in aiuto altri indicatori sierologici e biochi-
mici, quali la presenza di IgM anti-HBcAg e l’innalza-
HBV DNA e replicazione di HBV mento degli indici di citolisi epatica. Il danno necro-in-
Recentemente, diverse Consensus Conference sull’infezio- fiammatorio, in queste epatiti, varia da moderato ad im-
ne da HBV (1-2) hanno cercato di sistematizzare le defini- portante.
zioni cliniche, sierologiche e istopatologiche dell’epatite ■ Epatite cronica con completa o parziale soppres-
cronica da HBV, alla luce delle conoscenze derivanti dallo sione della replicazione di HBV. Si tratta di una con-
studio del DNA virale nel siero come indicatore di replica- dizione che si delinea per lo più nell’ambito dell’epatite
zione. Inoltre hanno ribadito che il danno epatitico è HBeAg-negativa/antiHBe-positiva, in cui i livelli di HBV
correlato ad un insieme di parametri, di natura clinica, DNA sono molto bassi o al di sotto dei limiti di sensibi-
istologica, biochimica e virologica, alla cui definizione lità delle metodiche molecolari più sensibili, presumibil-
partecipa l’entità replicativa del virus B. L’epatite cronica mente perchè la replicazione è contenuta a livelli minimi
da HBV presenta profili diversi dal punto di vista sierolo- da fattori quali la risposta cellulo-mediata del soggetto,
gico che esprimono una differente attività replicativa del la presenza di varianti virali “escape”o la coinfezione con
virus. In particolare si distinguono due forme, in base altri virus epatotropici. Queste situazioni si possono ri-
allo presenza o meno dell’antigene e (HBeAg) e del rela- condurre ai seguenti quadri:
tivo anticorpo, caratterizzate da livelli di replicazione ● Stato di portatore inattivo, precedentemente descritto
strain di HBV che recano mutazioni responsabili dell’epa- potente inibitore del virus B. La compresenza dei
tite HBeAg-negativa prevalgono, in particolare, nell’area due virus è caratterizzata da viremie HBV molto
mediterranea per cui questa è la forma più frequente basse, di regola inferiori a 103 genomi/ml.
nella nostra area geografica. Accanto a queste condizioni ● Coinfezione con il virus dell’epatite C (HCV). La coinfezio-
esistono, inoltre, situazioni in cui la replicazione di HBV è ne HBV e HCV può essere associata a forme severe di
parzialmente o del tutto soppressa. epatite cronica, ad alto rischio di evoluzione in cirro-
Riassumendo, in base ai livelli di replicazione di HBV, si si e carcinoma epatocellulare. Il profilo virologico, in
distinguono i seguenti quadri di epatite cronica: questo caso, è ancora poco delineato; l’interazione
■ Epatite cronica HBeAg-positiva: attività replicativa tra le due dinamiche virali è complessa e, pur preva-
elevata e persistente. Questo quadro è generalmente as- lendo quadri in cui la viremia da HBV è bassa, ve ne
sociato ad alti livelli di HBV DNA nel siero (tra 107 e 1010 sono altri in cui i livelli di HBV DNA sono superiori a
copie/ml), ad indici di citolisi epatica elevati ed a danno 105 genomi/ml.
necro-infiammatorio importante. ● Infezione occulta da HBV. Modelli animali hanno di-
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Evoluzione delle metodiche molecolari
nella diagnostica di HBV
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Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
Fig. 3
Test di ibridazione e di PCR per HBV DNA a
confronto in una popolazione di 88 soggetti
con epatite cronica da HBV di cui 17 HBeAg
positivi/antiHBeAg negativi e 71 HBeAg nega-
tivi/antiHBeAg positivi
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Evoluzione delle metodiche molecolari
nella diagnostica di HBV
Evoluzione della tecnologia di PCR per la ricerca di discordanti con i due metodi, rappresentato da una rea-
HBV DNA zione di nested-PCR disponibile commercialmente (Am-
Le potenzialità diagnostiche della tecnica di PCR per la plimedical, Buttigliera Alta, Torino), che amplifica una se-
ricerca e quantizzazione di HBV DNA hanno contribuito quenza della regione del core di HBV. Il livello di sensibi-
alla diffusione su scala sempre più vasta di tale metodi- lità della nested-PCR è stato precedentemento definito
ca. Più recentemente abbiamo assistito alla automazione nel nostro laboratorio pari a 10 copie/reazione sulla base
della reazione di PCR nell’ambito di un necessario proces- di un plasmide a concentrazione nota. Per la reazione di
so di maggiore standardizzazione delle procedure mole- nested-PCR sono stati utilizzati 5 ul di DNA estratto e
colari ai fini dell’uso clinico e diagnostico del risultato. purificato dal siero dei pazienti secondo la procedura di
Attualmente è disponibile una automazione parziale rap- estrazione su colonnine di gel di silica (Qiagen GmbH,
presentata dal sistema Cobas Amplicor Monitor (Roche), Germania). La seconda amplificazione con primers interni
in cui è automatizzata la fase della rivelazione dell’ampli- è stata allestita su 2 ul di amplificato del primo step ot-
ficato mentre per il momento la fase critica dell’estrazio- temperando a tutte le procedure previste per il controllo
ne del DNA è ancora manuale. delle contaminazioni da carry-over.
Nel nostro Laboratorio abbiamo effettuato una valutata- I valori ottenuti con il sistema Cobas presentavano un
zione del sistema di PCR automatizzata Cobas Amplicor range compreso tra 2.3 e 6.17 log10/ml (un campione con
Monitor confrontandolo con un sistema di PCR manuale valore superiore a 200.000 genomi/ml è stato ritestato
(Amplicor Monitor, Roche) precedentemente in uso per il con diluizioni da 1/10 a 1/100) mentre con il sistema ma-
dosaggio di HBV DNA. La valutazione è stata effettuata nuale gli stessi sieri presentavano valori compresi tra 2.6
su 113 sieri provenienti da 113 pazienti HBeAg negativi e 7 log10/ml. Il grado di concordanza è stato dell’78.7%
avviati al trapianto di fegato, prelevati al momento del (54 campioni concordanti negativi e 35 concordanti posi-
trapianto e con viremie medio-basse. I valori ottenuti tivi per un totale di 89/113). La correlazione esistente tra
con entrambi i sistemi sono stati normalizzati attraverso la quantizzazione con i due metodi è stata soddisfacente
la trasformazione logaritmica. (R2 = 0.763). La scala di valori più critici è stata quella
I due sistemi di PCR quantitativa differiscono per i se- compresa tra 2 e 4 logs, per i quali comunque la correla-
guenti aspetti: zione scende di poco (R2=0.760). Il grado di correlazione
● automazione della fase di rivelazione dell’amplificato invece aumenta considerando i valori al sopra di 4 logs
con il sistema Cobas mentre il test Amplicor Monitor (R2= 0.798). I campioni discordanti sono stati 24 di cui 21
ha una fase di rivelazione dell’amplificato interamente positivi con Cobas e negativi con Amplicor e 3 positivi
manuale con sviluppo colorimetrico su micropiastra, in con Amplicor e negativi con Cobas. La reazione di nested-
agitazione e a temperatura ambiente; PCR ha confermato come positivi tutti i campioni positivi
● il volume di siero di partenza: 100 ul per Cobas contro con Cobas e negativi con Amplicor, mentre ha identifica-
50 ul per Amplicor; to come falsi positivi i 3 campioni positivi con Amplicor e
● il sistema Cobas prevede uno standard interno di negativi con Cobas, probabilmente per via di contamina-
quantizzazione che è anche un controllo delle fasi di zioni verificatesi durante la delicata fase di rivelazione su
estrazione, amplificazione e rivelazione finale, mentre il micropiastra del sistema manuale. Quindi la sensibilità e
metodo manuale prevede solo un controllo interno di specificità del metodo semi-automatizzato Cobas Ampli-
amplificazione. cor rispetto alla nested-PCR di riferimento sono risultate
● il range dinamico. Il range dinamico per il sistema del 100% mentre per il metodo Amplicor Monitor ma-
Cobas va da 200 a 200.000 genomi/ml, corrispondente nuale la sensibilità è risulta del 62.5% e la specificità del
a 3 logs con la necessità di ritestare diluiti i campioni 94.7%. Nella definizione della sensibilità dei due metodi
positivi oltre la soglia di 200.000 perchè viene supera- ha certamente influito in modo importante la differente
ta la fase lineare della reazione di PCR. Il range dina- quota di siero di partenza da cui procedere all’estrazione
mico di Amplicor va da 400 a 4x107 genomi/ml, pari del DNA, doppia nel sistema semi-automatizzato rispetto
quindi a 5 logs, quindi più ampio di 2 logs rispetto al a quella del sistema manuale.
sistema automatizzato. Anche in questo caso è prevista I campioni inibiti con il sistema Cobas sono stati 4 su 113
la possibilità di ritestare diluiti i campioni superiori al- (3.5%) e l’inibizione è stata eliminata ripetendo l’estra-
l’ultimo punto della curva. zione del DNA mediante purificazione su colonnine di gel
Abbiamo allestito un sistema di controllo dei campioni di silica, mentre con Amplicor il fenomeno si è verificato
16
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
17
Evoluzione delle metodiche molecolari
nella diagnostica di HBV
la maggiore rapidità di esecuzione (circa 6 ore) rispetto profili di resistenza. Gli end-points per la definizione
ai sistemi manuali con la possibilità di processare un nu- della risposta terapeutica sono rappresentati da quello
mero consistente di campioni garantendo nel contempo sierologico (conversione da HBeAg ad anti-HBe), biochi-
una elevata qualità di risultato. mico (normalizzazione degli indici di citolisi epatica),
Il sistema Cobas offre, inoltre, la possibilità di adattare istologico (riduzione, in particolare, dello score di fibro-
18
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
si) e virologico, con il quale si intende la scomparsa soggetti che, sino alla metà degli anni ‘90, venivano
della replicazione di HBV. I livelli di HBV DNA per defi- considerati non operabili in relazione a viremie molto
nire la risposta terapeutica, l’entità della caduta loga- elevate. Lo studio quantitativo di HBV-DNA può con-
ritmica e l’interpretazione prognostica in relazione alla sentire, infine, di individuare gruppi ad alto e basso
fase del trattamento rimangono un campo aperto, da rischio di recidiva e di impostare procedure differenzia-
definire attraverso studi clinici mirati. E’ di recente te di profilassi della recidiva post-trapianto. In tal
emerso un generale consenso sulla definizione della ri- modo è possibile ottimizzare le strategie di manage-
sposta virologica alla terapia come la presenza di HBV ment dei pazienti con malattia da HBV, con un impat-
DNA al di sotto dei livelli di sensibilità dei test di PCR to importante anche dal punto di vista economico-sa-
(102 - 103 copie/ml) (1). Tale definizione si applica, in nitario.
particolare, nel caso terapia con lamivudina a sei mesi
(risposta iniziale), a fine terapia e a 6-12 mesi dalla ces-
sazione del farmaco per definire la risposta a lungo
termine. Lo studio della replicazione di HBV ha, inoltre,
Bibliografia
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un ruolo chiave nel determinare la non risposta alla te- virus, Ginevra, settembre 2002. www.easl.ch
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bre 2002. www.aasld.org
ai farmaci. Quest’ultimo aspetto è particolarmente im-
3. Michalak TI, Pardoe IU, Coffin CS, Churchill ND,
portante nel corso degli schemi prolungati di terapia a Freake DS, Smith P, Trelegan CL. Occult lifelong per-
base di lamivudina, dal momento che lo sviluppo di sistence of infectious hepadnavirus and residual liver
inflammation in woodchucks convalescent from acute
resistenza è un evento molto frequente (circa il 20-25% viral hepatitis. Hepatology 1999 Mar;29(3):928-38
dei pazienti sviluppa mutanti nel locus YMDD resistenti 4. Michalak TI Occult persistence and lymphotropism
of hepadnaviral infection: insights from the wood-
alla lamivudina, dopo un anno di terapia). Sono at- chuck viral hepatitis model. Immunol Rev 2000 Apr;174:98-
tualmente disponibili altri antivirali come l’adefovir-di- 111
5. Cacciola I, Pollicino T, Squadrito G, Cerenzia G, Or-
pivoxil ed l’entecavir che si sono dimostrati efficaci nei lando ME, Raimondo G. Occult hepatitis B virus infection in
confronti di ceppi di HBV resistenti a lamivudina. Que- patients with chronic hepatitis C liver disease. N Engl J Med
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importante individuare precocemente fenomeni di resi- Dis 2002 Aug;2(8):479-86
stenza attraverso lo studio della cinetica virale durante 7. Brechot C, Thiers V, Kremsdorf D, Nalpas B, Pol S, Pa-
terlini-Brechot P. Persistent hepatitis B virus infection in
il trattamento. subjects without hepatitis B surface antigen: clinically signi-
■ Management del paziente candidato al trapianto di fegato ficant or purely “occult”? Hepatology 2001 Jul;34(1):194-203
8. Samuel D, Bismuth A, Serres C, Arulnaden JL, Reynes
per malattia HBV correlata. Si tratta di una categoria di M, Benhamou JP, Brechot C, Bismuth H. HBV infection
pazienti molto critica, in cui il rischio di recidiva di HBV after liver transplantation in HBsAg positive patients: expe-
rience with long-term immunoprophylaxis. Transplant Proc
deve esssere contenuto a livelli minimi e questo può 1991 Feb;23(1 Pt 2):1492-4
esssere ottenuto mediante l’abbattimento dei livelli di 9. Samuel D, Bismuth A, Mathieu D, Arulnaden JL, Reynes
M, Benhamou JP, Brechot C, Bismuth H. Passive immuno-
HBV DNA al di sotto della soglia di sensibilità della
prophylaxis after liver transplantation in HBsAg-positive pa-
reazione di PCR prima del trapianto e con il monito- tients Lancet 1991 Apr 6; 337(8745):813-5.
raggio della viremia dopo il trapianto per individuare 10. Van Thiel DH, Wright HI, Fagiuoli S. Liver transplanta-
tion for hepatitis B virus-associated cirrhosis: a progress re-
precocemente le recidive e lo sviluppo di resistenza. port. Hepatology 1994 Jul;20(1 Pt 2):20S-23S
Questa strategia è in grado di contenere la recidiva 11. Marcellin P, Samuel D, Areias J, Loriot MA, Arulna-
den JL, Gigou M, David MF, Bismuth A, Reynes M, Brechot
epatitica di HBV a livelli complessivamente molto bassi C, et al . Pretransplantation interferon treatment and recur-
(<10% dei pazienti). Nella nostra esperienza, la deter- rence of hepatitis B virus infection after liver transplantation
for hepatitis B-related end-stage liver disease. Hepatology
minazione dell’HBV DNA al momento del trapianto si 1994 Jan;19(1):6-12
conferma come il principale indicatore prognostico di 12. Marzano A, Debernardi-Venon W, Condreay L, Rizzet-
to M. Efficacy of lamivudine re-treatment in a patient with
recidiva virale nel post-trapianto. I nostri dati, inoltre,
hepatitis B virus (HBV) recurrence after liver transplantation
fanno emergere chiaramente la necessità di monitoriz- and HBV-DNA breakthrough during the first treatment. Tran-
zare il livello di HBV DNA durante la terapia con meto- splantation 1998 Jun 15;65(11):1499-500
13. Rizzetto M, Marzano A. Posttransplantation prevention
di che arrivino al di sotto delle soglia di sensibilità dei and treatment of recurrent hepatitis B. Liver Transpl 2000
test di ibridizzazione (105 genomi/ml). Questo significa Nov;6(6 Suppl 2):S47-51
19
Proteomica e medicina
di laboratorio
S. Mangraviti - B. Morandi
G. Cangemi - G. Melioli
Laboratorio di Analisi,
IRCCS Giannina Gaslini, Genova
La proteomica è una nuova scienza post-genomica che cazioni in seguito a stimoli esogeni. Naturalmente, il
ha l’obiettivo di identificare e caratterizzare tutte le pro- vero salto di qualità della proteomica avverrà nel mo-
teine codificate dal genoma di un organismo (15). mento in cui sarà possibile identificare le proteine coin-
Ha quindi prospettive di estremo interesse in molti diffe- volte in processi fisiologici e patologici mediante tecniche
renti campi della medicina, della biologia e della farma- relativamente semplici e poco costose. Ad oggi, sono
cologia. La proteomica, infatti, nasce come scienza di note molte di queste proteine, anche se non tutte. Quan-
base ma già ora è possibile identificare sviluppi significa- do, ad ogni proteina, potrà essere associato non solo un
tivi con elevata ricaduta pratica. La proteomica consente nome, una serie di caratteristiche biochimiche ed una
di avere un quadro completo relativo a tutte le proteine funzione, ma soprattutto una posizione definita all’inter-
presenti in un determinato sistema biologico. A regime, no di una cascata di eventi cellulari, la proteomica con-
consentirà di verificarne l’identità e le eventuali modifi- sentirà di analizzare, nella loro complessità, sia situazioni
20
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
fisiologiche sia patologiche, effetti tossici da farmaci, in- di studiare. Per queste caratteristiche, la proteomica esi-
terazione tra stimoli ecc. in materiali biologici complessi ste “per se” come tecnica analitica, fatto salvo un siste-
quali il liquor, il siero, l’urina e tutti i materiali patologi- ma di analisi statistica delle modificazioni di migliaia di
ci di origine infiammatoria o neoplastica (liquido pleuri- elementi, ma anche come potente mezzo di screening per
co, liquido ascitico). l’identificazione di proteine (già note o ignote, anche se
La proteomica, come tecnica, procede speditamente, prevedibili in base alla conoscenza del genoma della spe-
mentre la proteomica come scienza procede alla velocità cie (10)) potenzialmente rilevanti in fisiopatologia.
della ricerca scientifica di base ed applicata. È però anche Con queste tecniche, sono stati descritti numerosi quadri
chiaro che tutti i vantaggi che possono essere tratti da rappresentativi di una specifica patologia e, dall’analisi
un significativo miglioramento delle tecniche analitiche ad hoc di una proteina altamente significativa, si è arri-
si rifletteranno su una migliore e più completa caratte- vati a definire il meccanismo patogenetico o un marcato-
rizzazione dell’evento in studio e delle basi molecolari e re di elevata sensibilità in termini diagnostici o prognostici.
genetiche che lo hanno determinato o condizionato. Su queste basi, l’integrazione tra genomica e proteomica
Il carattere distintivo della proteomica, rispetto ad altri è cruciale per il futuro della diagnostica in medicina. In-
approcci scientifici, è proprio quello di consentire di ricer- fatti, la conoscenza di modificazioni a carico degli acidi
care modificazioni (qualitative o quantitative) a carico di nucleici, consentirà, con la proteomica di stabilire quali è
strutture ancora sconosciute che in altri sistemi speri- la cascata di eventi indotta; la proteomica, osservando
mentali non verrebbero altrimenti osservate. modificazioni a carico di specifiche strutture peptidiche,
Per questo motivo, la proteomica è estremamente inte- consentirà, ove possibile, di risalire a proprietà non an-
ressante, sperimentalmente, ed altamente formativa, da cora identificate degli acidi nucleici.
un punto di vista culturale. Descriveremo quindi quali E’ però necessario ricordare che, se per gli acidi nucleici
sono le caratteristiche generali di questa scienza e le tec- esiste una tecnica (Polymerase Chain Reaction, PCR) che
niche analitiche che la caratterizzano, in maniera da defi- consente di amplificare una determinata sequenza anche
nirne criticamente le funzionalità, analizzarne i risultati se questa è virtualmente unica in un determinata cam-
ottenuti fino ad ora e valutare se esiste già una proteo- pione biologico, per le proteine non abbiamo ancora
mica clinica e quali possono essere gli sviluppi futuri alcun metodi di espansione selettiva. Questo comporta
che se le tecniche di analisi della proteomica non saran-
Le caratteristiche della Proteomica no perfezionate fino ad una sensibilità attualmente im-
La proteomica, come detto, è nata come rappresentazio- pensabile, proteine o peptidi poco rappresentati e scono-
ne completa del corredo proteico di una cellula, un tes- sciuti, ma rilevanti da un punto di vista della fisiopato-
suto o un materiale biologico. Le modificazioni qualitati- logia del distretto in studio, non potranno essere rilevati
ve o quantitative, di uno o più elementi di questa rap- in quanto “coperti” da altre proteine abbondantemente
presentazione (per esempio, una trasformazione di tipo rappresentate.
neoplastico) erano verosimilmente correlate alla noxa In questo secondo caso, la genomica può consentire di
esogena che interferiva con la situazione originale. identificare un messaggero a cui non corrisponde una
Ma un uso più sofisticato della proteomica consente di proteina “detectabile”. Questa può però essere sintetizza-
studiare le proteine che in un determinato sistema pos- ta artificialmente e possono essere preparati un pannello
sono essere modificate, sempre in termini quantitativi e di anticorpi monoclonali specifici, che ne consentiranno
qualitativi, da fattori endogeni quali modulazione della la purificazione e la successiva analisi con tecniche di
trascrizione, modificazioni post-traslazionali, splicing al- proteomica anche in campioni dove il materiale è estre-
ternativi, interazioni con altre proteine o con acidi nu- mamente scarso. Quanto riportato sopra consente di im-
cleici. Tutti questi fattori, non sempre correlati solamente maginare un futuro “proteomico” del laboratorio di pa-
con la fisiologia o la patologia di un determinato di- tologia clinica, soprattutto se gli strumenti analitici po-
stretto, modificano caratteristiche delle proteine (per tranno essere altamente automatizzati e la standardizza-
esempio, l’emivita) che non sono direttamente prevedibi- zione delle metodiche consentirà un adeguato confronto
li in base alla struttura dell’acido nucleico o del messag- dei risultati ottenuti. I materiali patologici più comuni
gero ad esso correlato. In questo modo, da uno stesso (siero, plasma, urine, liquido ascitico, pleurico, liquor ecc)
gene, possono essere derivate numerose proteine che possono essere analizzati e, almeno nelle situazioni più
solo un approccio sistematico della proteomica consente significative (infiammazione, infezione, trasformazione
21
Proteomica e medicina di laboratorio
neoplastica), potranno essere identificati i marcatori pep- o elettroforesi su gel di poliacrilammide) è quello di con-
tidici più rappresentativi. Se a queste tecniche si assoce- ferire una carica negativa omogenea alle proteine in
ranno strategie di separazione ben consolidate (cell sor- modo da ottenere una migrazione esclusivamente in
ting mediante citometria a flusso, laser microdissection base al peso molecolare.
(5)), l’analisi proteomica delle popolazioni cellulari sarà In questo modo, la velocità di migrazione nel gel dipen-
una realtà. Questo approccio ci porta sempre più vicino a de dalle dimensioni della proteina. Modificando la con-
quello che è il goal del laboratorio di patologia clinica centrazione del polimero, è possibile privilegiare la sepa-
orientato all’analisi della fisiopatologia del metabolismo: razione di specifici range di pesi molecolari. Le proteine
infatti, la proteomica consentirà di analizzare, a livello di così separate possono essere ulteriormente analizzate.
biopsie, le modificazioni causate dalla malattia in atto Una tecnica classica è l’immunoblotting ossia il trasferi-
nell’organo bersaglio. In questo modo potremo sostitui- mento delle proteine su un supporto adsorbente (nitro-
re l’analisi di elementi indiretti (per esempio, enzimi cellulosa o nylon) e la successiva incubazione con anticor-
epatici nel plasma circolante) con l’analisi di quanto suc- pi monoclonali, siero umano o antisieri animali, allo
cede dove la malattia è localizzata. Questo sarebbe un scopo di verificare quali proteine hanno specifiche carat-
salto di qualità veramente impensabile fino a pochi anni teristiche immunologiche. Alternativamente, la proteina
orsono. separata mediante elettroforesi può essere eluita dal gel
e successivamente analizzata mediante HPLC (high
I materiali della proteomica performance liquid cromatography) spettrometria di
La possibilità di analizzare molte centinaia di proteine massa, e MALDI-TOF (matrix assisted laser desorption io-
utilizzando uno o alcuni degli approcci descritti ai punti nization-time of flight).
successivi, consente di sottoporre ad analisi materiali In questo caso, la proteina può essere analizzata diretta-
estremamente complessi. E’ peraltro chiaro che, special- mente o dopo digestione triptica. È evidente che la tecni-
mente in una fase iniziale di questi studi, i risultati mi- ca elettroforetica ha un’ottima risoluzione se la miscela
gliori vengono ottenuti analizzando miscele relativamen- di proteine da analizzare non è estremamente eteroge-
te semplici. Tra queste, un ruolo particolare hanno le nea. In questo caso, la tecnica è scarsamente selettiva e
proteine isolate mediante tecniche di immunoprecitazio- un’analisi corretta dovrà prevedere passaggi di pre-puri-
ne e successivamente digerite con tripsina. Le mappe ficazione allo scopo di ridurre la complessità della misce-
peptidiche ottenute con questo approccio sono relativa- la stessa.
mente semplici ma estremamente rappresentative della Un caso di proto-proteomica è rappresentato dall’elet-
proteina in studio. In questo caso, può essere evidenzia- troforesi delle proteine seriche. Utilizzando tamponi ade-
ta in maniera ottimale. anche la sola sostituzione di un guati, è possibile separare le proteine del siero in alcune
singolo aminoacido. Le tecniche di proteomica sono state frazioni ben definite (pre-albumina, albumina, Alfa1,
recentemente utilizzate per studiare i batteri. Questo è Alfa2, Beta e Gamma-globuline). Le modificazioni di una
un approccio di grande interesse ma, in questa fase, ha o più frazioni sono spesso indicative di eventi fisiologici
un’applicazione esclusivamente nel campo della ricerca e o, più frequentemente, patologici.
della tassonomia. Un simile approccio utilizza la proteo- Nell’elettroforesi delle sieroproteine è importante correla-
mica per lo studio di cellule (per esempio linee monoclo- re le varie frazioni tra di loro: per esempio, è essenziale
nali) sottoposte a stimoli esogeni di vario genere. In distinguere una ipo-albuminemia assoluta da un au-
campo clinico, sono stati tentati approcci di proteomica mento primario (o secondario a noxae patogene) delle
utilizzando materiali biologici complessi (per esempio, frazioni globuliniche. A questo scopo, è possibile ap-
tessuto nervoso), proteine del sangue e proteine urina- profondire l’indagine analizzando le singole proteine
rie. In entrambi i casi sono stati riportati risultati di specifiche che compongono una specifica frazione. Per
grande interesse, anche se, in questa fase, preliminari. esempio, della frazione alfa 1 conosciamo numerosi costi-
tuenti (α1-Antitripsina, α1 Glicoproteina acida, α1 Lipo-
Tecniche analitiche proteina, Tiroxin-binding protein, Antichimotripsina, Pro-
Elettroforesi. trombina) e della frazione α2 conosciamo altri costituen-
L’elettroforesi consente di separare una miscela di protei- ti (α2 Macroglobulina, α2 Lipoproteina, Aptoglobina,
ne in soluzione che migrano in risposta ad un campo Colinesterasi, fattore IX, Antiplasmina ecc.). E’ quindi pos-
elettrico. Il principio dell’elettroforesi classica (SDS-PAGE sibile, mediante tecniche di immunometria, scendere nel
22
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
23
Proteomica e medicina di laboratorio
Un simile approccio può essere ottenuto con spettrometri Immunoradiometric assay: si basa sullo stesso principio
di massa accoppiati a tandem (massa-massa). L’accura- dell’Enzyme-immunoassay ma il tracciante del secondo
tezza e la sensibilità di questi metodi e la possibilità di anticorpo sarà una sostanza radioattiva. In questo caso,
accoppiamento con la 2D elettroforesi e di automatizza- la radioattività finale sarà proporzionale alla quantità
zione di queste metodiche li stanno rendendo i metodi di antigene del campione biologico.
elettivi per gli studi di proteomica (4). Mediante un simi- Immunofluorescence assay: anche in questo caso, la
le approccio, abbiamo potuto recentemente dimostrare reazione procede a sandwich, con la variante della pre-
che il numero di peptidi che possono essere presentati senza di un fluorocromo coniugato al secondo anticor-
da HLA di classe I è molto limitato, in termini qualitativi po. La fluorescenza misurata sarà proporzionale, anche
e una modifica dell’espressione dell’elemento di restrizio- in questo caso, all’antigene da dosare (fig. 2C).
ne comporta che i peptidi presentati siano modificati Turbidimetria e nefelometria: si basa sul principio che
solo quantitativamente e non qualitativamente (3). in condizioni altamente standardizzate, la reazione an-
tigene-anticorpo comporta la formazione di agglutina-
Immunochimica ti, dovuti alla capacità dell’antisiero di riconoscere epi-
Un approccio del tutto differente della proteomica è topi multipli sulla molecola. La opacità della “rete mo-
stato sviluppato negli anni ‘80, con l’introduzione degli lecolare” causata dalle reazioni multiple antigene-anti-
anticorpi monoclonali nella ricerca di base. Infatti è pos- corpo sarà proporzionale (entro certi limiti) alla concen-
sibile purificare una determinata molecola mediante tec- trazione dell’antigene da misurare (fig. 2D). Fig. 2A/2B
niche di cromatografia di affinità, dopo averla fatta rea-
gire con un anticorpo monoclonale. Se questa molecola è
“vicina” ad altre molecole, utilizzando tecniche di cross-
linking, è possibile precipitare un complesso proteico.
Questo può essere analizzato mediante le tecniche de-
scritte nei punti precedenti. Al contrario, l’utilizzazione di
pannelli di anticorpi monoclonali, specifici per un grup-
po di proteine correlate funzionalmente tra di loro, con-
sente di trattare, con tecniche di proteomica clinica, dif-
ferenti situazioni fisiopatologiche.
Le tecniche immunochimiche utilizzano differenti approc-
ci, sulla base del sistema di rivelazione utilizzato.
24
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
25
Proteomica e medicina di laboratorio
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Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
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Infettive “L. Spallanzani” IRCCS
28
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
gergo reazione di sequenza, un arresto della polimeriz- è caricato elettrocineticamente sul supporto elettroforeti-
zazione. Anche in questo caso la reazione viene eseguita co, sfruttando la carica negativa del DNA e l’applicazione
in 4 provette separate, ognuna corrispondente ad uno di una differenza di potenziale alle estremità del suppor-
dei 4 nucleotidi che agiscono da terminatori di catena. to. In entrambi i casi la migrazione dei vari frammenti è
Con entrambi i metodi si ottengono dunque dei fram- seguita rilevando le emissioni in fluorescenza a diverse
menti di DNA di lunghezza diversa, marcati alla estre- lunghezze d’onda dei diversi fluorocromi dopo l’eccitazio-
mità 5’, che vengono poi separati elettroforeticamente ne provocata dal laser. Le emissioni vengono raccolte ed
su un gel di poliacrilamide ad alta risoluzione. Il ricono- analizzate da una camera CCD (charge coupled device),
scimento dei frammenti separati viene effettuato me- che elabora i diversi segnali di fluorescenza con elevata
diante autoradiografia. La lettura della sequenza viene sensibilità. La sequenza delle bande di DNA marcato dai
eseguita manualmente sulla lastra in direzione 5’-3’ e quattro fluorocromi viene visualizzata in un grafico deno-
cioè dal basso verso l’alto, mediante l’identificazione del minato elettroferogramma, caratterizzato da una succes-
nucleotide presente all’estremità 3’, considerando in pa- sione di picchi di quattro colori diversi, che corrispondono
rallelo le 4 corsie corrispondenti ai 4 nucleotidi modificati. alle emissioni fluorescenti dei diversi fluorocromi, man
Nel corso degli anni il metodo di Sanger prese il soprav- mano che i vari frammenti di diversa lunghezza nucleoti-
vento poichè risultava più semplice e rapido rispetto a dica raggiungono, lungo la corsa elettroforetica, la posi-
quello di Maxam e Gilbert. zione del rilevatore (“detector”). L’introduzione dell’elet-
Negli anni 1986-87 la marcatura con isotopi radioattivi troforesi capillare per la separazione dei frammenti mar-
venne sostituita da quella con molecole fluorescenti (3). In cati ha consentito un notevole aumento della processi-
un primo tempo la marcatura era basata su di un unico vità. Infatti, poichè la dispersione del calore in un capilla-
fluorocromo che veniva legato al primer. Tale metodo re risulta più rapida rispetto a quella di una lastra, grazie
quindi richiedeva, come nel caso della marcatura con ra- alla maggiore superficie di scambio, si possono applicare
dioisotopi, 4 reazioni di sequenza diverse con 4 nucleotidi campi elettrici di potenziale più elevato, il che riduce di
terminatori di catena, e 4 corse elettroforetiche per ogni circa dieci volte i tempi di esecuzione dell’elettroforesi.
campione, implicando un rischio di variabilità elettrofore- Nonostante gli avanzamenti tecnologici descritti, inizial-
tica tra una corsia e l’altra. Successivamente, si pervenne mente con i sequenziatori automatici poteva essere ana-
allo sviluppo di terminatori di catena marcati con 4 fluo- lizzato soltanto un campione alla volta durante la corsa
rocromi diversi per le 4 basi azotate. I fluorocomi, oppor- elettroforetica. Successivamente vennero sviluppati nuovi
tunamente eccitati da un laser, emettono fluorescenza con modelli di sequenziatori automatici, basati sulla possi-
spettri di lunghezza d’onda non sovrapposti, consentendo blità di eseguire corse elettroforetiche multiple su appa-
l’impiego simultaneo di più marcatori diversi in un’unica recchi multicapillare. Questo ulteriore avanzamento diede
provetta. Questa importante innovazione apportò il van- una notevole accelerazione allo sviluppo delle attività di
taggio di rendere ancora più agevole l’esecuzione della sequenziamento genico, e rese possibile la realizzazione
reazione di sequenza ed il monitoraggio della separazione di progetti ambiziosi come il sequenziamento dell’intero
dei frammenti marcati durante l’elettroforesi (4 fluorocro- genoma umano (5).
mi/una sola reazione di sequenza, una sola corsa elet- La tecnologia del sequenziamento genico, resa sempre
troforetica, minor variabilità). La marcatura più utilizzata più accessibile, automatizzata e di facile utilizzo, ha avuto
attualmente è quella basata sull’utilizzo di terminatori di notevoli risvolti, non solo per lo studio del genoma
catena denominati “big-dye terminator”, che consistono in umano, ma anche per la conoscenza e lo studio dei geno-
didesossinucleotidi marcati con molecole con sistema di mi microbici, batterici e virali. Siamo entrati nell’epoca
trasferimento di energia da un donatore ad un accettore. della “farmacogenomica”, in cui si cerca di personalizzare
Contemporaneamente all’introduzione della marcatura l’applicazione dei farmaci secondo la sequenza nucleotidi-
fluorescente si passò dal sequenziamento manuale a ca di determinati geni e della “post-genomica”, in cui si
quello automatico che, come il precedente, prevede una studia l’espressione dei geni e si cerca di individuarne la
corsa elettroforetica dopo la reazione di sequenza, che funzione dopo averne identificato la sequenza.
può avvenire utilizzando gel di acrilamide o simili, su
supporto a lastra oppure a capillare (4). Nel caso del gel Applicazioni microbiologiche
su supporto a lastra, il caricamento del campione avviene I campi di applicazione di questa metodologia in un la-
manualmente, mentre nell’elettroforesi su capillare il DNA boratorio di Microbiologia e Virologia sono i più vari:
29
Sviluppo ed applicazioni del sequenziamento genico
nella diagnostica microbiologica
diagnosi di malattie infettive, epidemiologia molecolare, bunità 23S e la regione intergenica compresa tra le due
monitoraggio delle resistenze ai farmaci antibatterici e, (ITS, internal transcribed spacer) viene utilizzata per inda-
soprattutto, antivirali. gini in cui è richiesto un livello di discriminazione più
Isolati virali e batterici possono essere oggi agevolmente elevato. La caratteristica di questo operon è l’alternanza
tipizzati mediante sequenziamento genetico e successive di regioni costanti ad altre variabili. Le prime permetto-
ricerche in database disponibili per l’accesso pubblico, no l’utilizzo di primer universali di regno, che amplifica-
quali quello del National Institute for Biotechnology no le regioni variabili nelle diverse specie tassonomiche.
Information (NCBI). La corretta determinazone del geno- Esiste un sito web specifico del Ribosomal Database
tipo per alcuni virus è di primaria importanza in quanto Project II (www.cme.msu.edu/rdp) che raccoglie le se-
può caratterizzare la prognosi di una infezione come quenze del DNA ribosomiale batterico, che viene conti-
anche la scelta di un regime terapeutico. E’ ormai noto nuamente aggiornato. Esistono anche kit commerciali
da tempo che solo l’infezione con alcuni genotipi del (MicroSeq, Applied Biosystems), che permettono l’amplifi-
virus del papilloma umano (HPV) è associata allo svilup- cazione dell’rDNA16S, il sequenziamento e l’identificazio-
po del carcinoma della cervice uterina (HPV-16 e 18), ne batterica, mediante confronto con database costruiti
mentre l’infezione sostenuta da altri genotipi, quali amplificando l’rDNA16S di ceppi di riferimento presi dal-
HPV-6 ed 11, è considerata a basso rischio per quanto ri- l’ATCC e da altre banche di riferimento internazionali.
guarda l’insorgenza di questo tumore (6). Questi sistemi, ad esempio, consentono di identificare in
La determinazione del genotipo del virus dell’epatite C maniera differenziale fino ad una settantina di specie di-
(HCV), secondo linee guida internazionali, indirizza la du- verse di Micobatteri.
rata e l’intensità della terapia con IFN (eventualmente in
combinazione con la ribavirina), dal momento che alcuni Analisi filogenetica
genotipi (1 e 4) mostrano una minore risposta alla tera- Il sequenziamento genico inoltre può anche essere alla
pia rispetto ai genotipi 2 e 3 (7). base di indagini di epidemiologia molecolare. E’ noto
Il sequenziamento genico rappresenta un approccio utile che i virus a RNA sono dotati di elevata variabilità in
anche nell’identificazione e nella tipizzazione batterica.
La tassonomia microbica descritta nel più autorevole
testo di sitematica batterica, il Bergeys’ Manual, si basa Paz.1
sulla sequenza del DNA codificante l’RNA ribosomiale 16S.
In genere tutto l’operon dell’RNA ribosomiale (rrn) conte-
100
nente la sequenza codificante per la subunità 16S, la su-
99 Paz.2
Fig. 1
Paz.3
Albero filogenetico basato sulla sequenza 92
nucleotidica della regione gag, eseguita sulla
quasispecie virale presente in pazienti con
infezione da HIV-1, sottotipo B. La sequenza del 93 HXB2
ceppo HXB2 è stata inclusa nell’albero come
riferimento per il sottotipo B.
Si riconosce chiaramente che i cloni derivati da
ogni dato paziente (circondati da un ovale) 100
segregano indistinti cluster monofiletici.
Paz.5
Ciò indica che la quasi specie virale presente in
ciascun paziente rappresenta una 100
popolazione distinta, con omologia di sequenza
intra-paziente più elevata rispetto a quella
Paz.4
inter-paziente. I numeri sulle diramazioni
dell’albero filogenetico derivano dall’analisi di
bootstrap, e indicano la verosimiglianza (in %) di
tali biforcazioni. Generalmente sono considerati 0.1
molto probabili diramazioni con valori di
bootstrap superiori a 75.
30
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
quanto posseggono una replicasi senza correzione di ral therapy). Con la diffusione delle terapie e l’allunga-
bozze. Per quanto riguarda virus ad altissima variabilità, mento della loro durata si sta verificando l’insorgenza di
quali l’HIV-1 e l’HCV, si parla più propriamente di quasi- ceppi resistenti, con il conseguente sviluppo di fallimenti
specie virale presente nell’organismo infetto, e cioè di alla terapia antiretrovirale, e la necessità di impostare
uno sciame di varianti genetiche strettamente correlate regimi farmacologici non compromessi dalla presenza di
(diverse per meno dell’1%), derivanti tutte dalla evolu- mutazioni legate alla resistenza virale. Si rende pertanto
zione replicativa del ceppo iniziale con cui si è infettato necessario testare, in alcuni casi, quale farmaco risulta
il soggetto. La maggiore o minore eterogeneità genetica più efficace nell’ambito dei diversi farmaci disponibili per
della quasispecie virale in alcuni casi può caratterizzare le ogni classe farmaceutica, per evitare nuovi fallimenti te-
varie fasi della storia naturale dell’infezione, e in alcuni rapeutici o, in caso di AIDS pediatrico, per scegliere il re-
casi il grado di variabilità iniziale può predire una suc- gime terapeutico presumibilmente meglio tollerato dal
cessiva cronicizzazione rispetto ad una eradicazione del piccolo paziente. Anche se la determinazione del fenoti-
virus dall’ospite (8). Tale eterogeneità genetica dei virus po, ossia la valutazione dell’effettiva capacità del farma-
permette inoltre di stabilire le relazioni filogenetiche tra co di inibire la replicazione virale in vitro, risulta il meto-
diversi ceppi virali, che è alla base dell’epidemiologia do d’elezione, la sua esecuzione risulta indaginosa e di
molecolare. L’analisi filogenetica ha come obiettivo di lunga realizzazione. La lista delle mutazioni descritte in
convertire l’informazione, presente nelle sequenze nu- letteratura nei geni della polimerasi e della proteasi vira-
cleotidiche, in un albero che ricostruisca la storia evoluti- le associate a resistenza fenotipica di HIV-1 alle varie clas-
va delle stesse a partire da un comune progenitore; ciò si di farmaci ed a fallimento terapeutico è ben nota, e
rende possibile individuare con una certa precisione gli nuove mutazioni vengono tuttora segnalate. Sulla base
eventi di trasmissione in un episodio epidemico. Il punto di questi dati, l’utilizzo dei test genotipici per la indivi-
di partenza della costruzione di un albero filogenetico è duazione di mutazioni associate a farmacoresistenza si
l’allineamento multiplo delle sequenze che si vuole ana- sta diffondendo, suffragato ormai da numerosi studi che
lizzare; successivamente, attraverso algoritmi matematici, paragonano la concordanza e l’efficacia dei vari metodi
che possono prevedere o meno il calcolo di matrici di di- per la determinazione delle resistenze di HIV ai farmaci.
stanza genica, si ottiene l’albero, in cui i nodi rappresen- Sono stati sviluppati anche kit diagnostici, nei quali ven-
tano le diverse specie molecolari, e la topologia rappre- gono forniti primer sia per l’amplificazione selettiva della
senta le relazioni tra le stesse. E’ di questi ultimi mesi il regione genica di pol, sia per l’esecuzione delle reazioni
primo riconoscimento dell’analisi filogenetica come prova di sequenza, così come software che assemblano le se-
giuridica di un evento criminale di trasmissione delibera- quenze dei vari frammenti e forniscono un algoritmo
ta dell’infezione da HIV-1 (9). Questo episodio è l’ultimo diagnostico interpretativo (ViroSeq; Trugene, ecc.).
e più eclatante di una serie di casi in cui l’analisi filoge- Per la determinazione delle resistenze genotipiche a far-
netica aveva consentito di individuare la fonte di infezio- maci antivirali di altri virus che non siano l’HIV-1, un
ne: si può citare ad esempio il caso famoso di un denti- noto esempio riguarda la determinazione della sequenza
sta della Florida che aveva infettato sei suoi pazienti, e il nucleotidica codificante il motivo aminoacidico YMDD
caso di violenza sessuale seguita da trasmissione del della polimerasi del virus dell’epatite B. Negli ultimi
virus HIV-1 in Svezia (10-11). anni, numerosi pazienti con epatite cronica B sono stati
trattati con un analogo nucleosidico, la lamivudina o
Resistenze agli antivirali 3TC, con il risultato che lentamente ma abbastanza ine-
Altre applicazioni del sequenziamento genico in un labo- sorabilmente (nel 67% dei casi in 4 anni di terapia) ven-
ratorio di Microbiologia e Virologia riguardano la deter- gono selezionate varianti resistenti che possiedono mu-
minazione delle resistenze genotipiche a farmaci antivi- tazioni nel motivo YMDD (12). Parallelamente, anche per
rali o antibatterici. Un notevole sviluppo di questo setto- quanto riguarda il virus dell’epatite C sono state eviden-
re si è realizzato a seguito della diffusione dell’uso dei ziate mutazioni nel genoma virale che possono essere
farmaci antivirali nei soggetti con infezione da HIV-1. At- predittive dell’esito terapeutico. In particolare, autori
tualmente i soggetti infetti con HIV-1 sono trattati con Giapponesi classificarono i pazienti potenziali candidati
una combinazione di farmaci che prevede l’utilizzo com- alla terapia in base alla presenza di mutazioni nella re-
binato di inibitori della replicazione del genoma e della gione ISDR (Interferon Sentivity Determinig Region) del
infettività virale (terapia HAART: highly active antiretrovi- gene NS5A in wild type (WT, nessuna mutazione), inter-
31
Sviluppo ed applicazioni del sequenziamento genico
nella diagnostica microbiologica
Bibliografia
mediate type (IT, fino a 3 mutazioni) e mutant type (MT,
1. Maxam AM and Gilbert W. A new method for se-
più di tre mutazioni) ed osservarono che la categoria MT quencing DNA. Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74:560-
era la più suscettibile al trattamento con Interferon, ri- 564.
2. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequen-
sultando in questa categoria il maggior numero di pa- cing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad
zienti con risposta sostenuta alla terapia (13). Anche se Sci USA 1977, 74: 5463-5467.
3. Smith LM, Sanders JZ, Kaiser RJ, Hughes P, Dodd
nei paesi non orientali tale associazione non è stata suf- C, Cornell CR, Heiner C, Kent SBH, Hood LE. Fluore-
ficientemente evidenziata o confermata, attualmente la scence detection in automated DNA sequence analy-
sis. Nature 1986, 321:674-679.
comunità scientifica giapponese ha incluso questa carat-
4. Swerlow H, Gestaland R. Capillary gel elec-
teristica del virus nell’algoritmo in base al quale vengo- trophoresis for rapid, high resolution DNA sequencing. Nucl
no eseguite le scelte terapeutiche da applicare ai pazienti Acids Res 1990, 62: 137-141.
5. Venter JC, et al. The sequence of the human genome.
infetti con il genotipo 1b. Pertanto, la determinazione Science 2001, 291:1304-1351.
della sequenza della regione ISDR è indicata come uno 6. Schiffman MH, Burk RD. Human Papillomaviruses. Chap-
ter 33: pp 983-1023 in: “Viral Infections of Humans”. 1997
dei test di laboratorio utili per decidere il regime tera- Plenum Publishing Corporation, New York, N.Y.
peutico a base di interferon da somministrare a tali pa- 7. European Association for the Study of the Liver.
EASL International Consensus Conference on Hepatitis C.
zienti (14). Consensus Statement. J Hepatology 1999, 30:956-961.
In conclusione, la tecnologia del sequenziamento genico, 8. Farci P, Shimoda A, Colana A, Diaz G, Peddis G, Melpol-
der JC, Strazzera A, et al. The outcome of acute hepatitis C
in 15 anni di applicazione ha contribuito a determinare
predicted by the evolution of the viral quasispecies. Science
quella che è considerata una vera e propria rivoluzione 2000; 288:399-344.
epocale. In un recente libro, The Terrible Gift, edito in 9. Metzker ML, Mindell DP, Liu X, Ptak RG, Gibbs RA, Hil-
lis DM. Molecular evidence of HIV-1 transmission in a crimi-
maggio 2002, Rick. J. Carlson e Gary Stimeling hanno nal case. Proc Natl Acad Sci 2002, 99: 14292-14297.
tracciato una iperbolica ed alquanto cupa esplorazione 10. Ou CY, Ciesielski CA, Myers G, Bandea CI, Luo CC, Kor-
ber BT, Mullins JI, Schochetman G, Berkelman RL, Eco-
degli effetti delle biotecnologie sulle scienze mediche nomou AN, et al. Molecular epidemiology of HIV transmis-
nell’immediato futuro. A dispetto dei più cupi scenari, è sion in a dental practice. Science 1992, 256:1165-1171.
11. Albert J, Wahlberg J, Leitner T, Escanilla D, Uhlen M.
innegabile tuttavia che i progressi biotecnologici, cui lo Analysis of a rape case by direct sequencing of the human
sviluppo delle tecniche del sequenziamento genico ha immunodeficiency virus type 1 pol and gag genes.J Virol
1994, 68:5918-5924.
contribuito in maniera determinante, hanno aperto ed
12. Liu X, Schinazi RF. Hepatitis B virus resistance to lami-
aprono nuove e promettenti frontiere, in campi che spa- vudine and its clinical implications. Antivir Chem Chemother
ziano dalla diagnostica di laboratorio alla epidemiologia 2002, 13:143-155.
13. Enomoto N, Sakuma I, Asahina Y, Kurosaki M, Mu-
molecolare, alla medicina forense, alla farmacogenomica, rakami T, Yamamoto C, Ogura Y, Izumi N, Marumo F, Sato
alla terapia genica e ad altri ancora. C. Mutations in the nonstructural protein 5A gene and re-
sponse to interferon in patients with chronic hepatitis C virus
1b infection. The New England Journal of Medicine 1996;
334:77-81.
14. Moriguchi H, Uemura T, Kobayashi M, Chung RT, Sato
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patology 2002 ; 36:177-185.
32
La PCR Real Time: metodologia
di analisi nella diagnostica
delle malattie infettive
M. Crovatto - G. Gava - M. Da Re
S.O.S Immunologia Clinica e
Virologia
Dip. di Medicina di Laboratorio
Azienda Ospedaliera
Santa Maria degli Angeli
Pordenone
L’introduzione della reazione di amplificazione degli acidi Le tecniche tradizionali di amplificazione richiedono, fra
nucleici mediante reazione polimerasica a catena (PCR) l’altro, operazioni post-amplificazione piuttosto laboriose
nella diagnostica di laboratorio, ha indubbiamente por- per l’analisi dell’amplificato (elettroforesi, ELISA ecc.) ed il
tato dei vantaggi quali l’elevata sensibilità e la rapidità risultato è ottenibile solo alla fine dell’intera procedura.
di esecuzione, con il conseguente ottenimento di risultati La PCR Real-Time permettendo di visualizzare l’amplifica-
in tempi assai più ridotti rispetto alle metodiche classi- to man mano che si forma, rappresenta uno strumento
che. I problemi notoriamente emersi sono quelli della prezioso per migliorare la diagnostica e fornire al clinico
difficoltà di standardizzazione e delle contaminazioni, ai risultati attendibili e soprattutto in tempi utili.
quali si aggiunge la difficoltà di ottenere risultati quan- Con la PCR Real-Time non sono richieste manipolazioni
titativi sia per le caratteristiche intrinseche della PCR sia post amplificazione e questo comporta una diminuzione
per la scarsa disponibilità di standards internazionali a dei tempi di ottenimento dei risultati, nella eliminazione
cui riferirsi, sia per i problemi che insorgono quando il di problemi di carry-over e nella possibilità di monitora-
dato ottenuto deve essere calato nella realtà clinica. re costantemente l’andamento della reazione.
33
La PCR Real Time: metodologia di analisi nella diagnostica
delle malattie infettive
34
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
sponibili per la PCR Real-Time (Tab. 1), anche se, al mo- relazione ad una specifica unità (es. copie/ml. o U.I./ml.)
mento, alcune trovano applicazione preferenziale a se- e che sono prevalentemente utilizzate nella diagnostica
conda del tipo di strumentazione. E’ anche possibile rile- delle malattie infettive (1). Schema A/B/C/D/E
vare in modo non specifico gli ampliconi e uno degli ap-
procci più semplici in tal senso è l’utilizzo di fluorofori
che legano il DNA. Il più comunemente impiegato è il
SYBR® green 1 che si lega al DNA a doppia elica ed
emette fluorescenza se esposto a fonte luminosa di op-
portuna lunghezza d’onda. Non richiede la sintesi di oli-
gonucleotidi o primers con sequenze specifiche (conteni-
mento dei costi) e non è condizionato da cambi di se-
quenza ma può legarsi a prodotti aspecifici di amplifica-
zione (es. dimer-primer) soprattutto nel caso di basse
concentrazioni del target di partenza. Le sensibilità di ri-
levamento degli amplificati del SYBR® green 1, di oligo-
probes sensibili alla 5’ nucleasi (TaqMan) o di probes
adiacenti, secondo gli studi fino ad ora condotti sono es-
senzialmente sovrapponibili.
Utilizzando sonde oligonucleotidiche diverse, marcate con
fluorofori diversi e “quencers” non fluorescenti, è possibi-
le il rilevamento di più ampliconi contemporaneamente
(PCR Real-Time Multiplex). Attualmente la gamma dei
fluorofori disponibili è limitata ma indubbiamente au-
menterà nell’immediato futuro (3,5,18,22,29,30,36).
Le possibilità di applicazione della PCR Real-Time nella
diagnostica infettivologica, viste le peculiarità, sono teori-
camente illimitate: nella realtà attuale di una diagnostica
di routine è urgente disporre di un sistema completa-
mente automatizzato dall’estrazione dei campioni all’ot-
tenimento del risultato e soprattutto di kit standardizzati
che consentano di disporre di risultati riproducibili e qua-
litativamente ottimali. La rapidità con cui si ottiene il ri-
sultato e la possibilità di evidenziare ampliconi diversi in
contemporanea rendono questa tecnica ormai indispensa-
bile per la diagnosi rapida delle infezioni a carico del si-
stema nervoso centrale: dare in poche ore al clinico un ri-
sultato può evitare di somministrare terapie antibiotiche
inutili (es. encefaliti erpetiche o da enterovirus) e di som-
ministrare terapie antivirali adeguate. Questo può anche
portare ad una diminuzione dell’ospedalizzazione dei pa-
zienti (es. encefaliti da Enterovirus) e quindi tutto som-
mato avere una ricaduta sui costi complessivi della sanità.
Uno dei campi di applicazione più immediati e più stu-
diati è comunque quello della quantificazione degli acidi
nucleici virali. Con la PCR Real-Time sono possibili deter-
minazioni quantitative relative che evidenziano variazio-
ni del target in rapporto ad un target correlato (utilizza-
te soprattutto in genetica) o assolute che permettono di
calcolare il numero di target presente nel campione in
35
La PCR Real Time: metodologia di analisi nella diagnostica
delle malattie infettive
36
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
37
La PCR Real Time: metodologia di analisi nella diagnostica
delle malattie infettive
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38
PCR Real-Time per la Determinazione
dell’Antibiogramma Molecolare in
Mycobacterium tuberculosis
F. Meacci - G. Orrù - S. Vicidomini
M.R. Oggioni - G. Pozzi
Laboratorio di Microbiologia
Molecolare e Biotecnologia
(LAMMB)
Dipartimento di Biologia
Molecolare, Università di Siena
39
PCR Real-Time per la Determinazione dell’Antibiogramma
Molecolare in Mycobacterium tuberculosis
Antibiogramma colturale
I metodi tradizionali per l’effettuazione dell’antimico-
gramma sono basati sull’analisi fenotipica dell’isolato cli-
nico e prevedono quindi la coltura del ceppo in esame in
presenza dei singoli farmaci. I due sistemi più frequente-
mente impiegati nei laboratori di micobatteriologia sono
il metodo delle proporzioni su piastra e il sistema radio-
metrico Bactec (Becton Dickinson), entrambi basati sul-
l’osservazione sperimentale che se più dell’1% dei bacilli
tubercolari di un determinato paziente è resistente ad
un certo farmaco in vitro, il trattamento con quel farma-
co non sarà terapeuticamente utile. Il metodo delle pro-
porzioni su piastra prevede la semina di una sospensione
del ceppo in esame su piastre di Petri suddivise in qua-
dranti. Un quadrante della piastra contiene il terreno
senza farmaco e gli altri tre contengono terreno con i
singoli antibiotici da saggiare. L’osservazione di una cre- Questo percorso diagnostico può portare a dei ritardi ec- Fig. 1
scita nei settori antibiotati è indice di resistenza al far- cessivi nella rilevazione della farmaco-resistenza e quindi
maco corrispondente ed il confronto del numero di colo- nella scelta di un regime farmacologico adeguato.
nie rilevate rispetto al quadrante di controllo senza far-
maco e inoculato con una sospensione 100 volte più di- Antibiogramma molecolare
luita, permette di valutare se la percentuale di batteri Nella diagnosi microbiologica dell’infezione tubercolare i
resistenti è maggiore o minore dell’1% (3, 4). metodi molecolari hanno rappresentato un notevole
Il sistema Bactec si basa sul rilevamento di CO2 radio- progresso. L’introduzione delle tecniche di analisi geno-
marcata liberata dall’attività metabolica del micobatterio tipica, insieme alla conoscenza delle basi genetiche della
che cresce in un terreno liquido contenente come unica farmaco-resistenza, hanno consentito lo sviluppo di me-
fonte di carbonio acido palmitico marcato con 14C (3, 4). todi basati sull’analisi del DNA per rilevare la resistenza
Il rilevamento di CO2 radioattiva nell’aria contenuta nel ai farmaci di M. tuberculosis. L’impiego delle tecniche di
flacone di coltura è indice di moltiplicazione batterica. Il amplificazione genica per la diagnostica delle infezioni
valore della radioattività misurata viene espresso come da M. tuberculosis e in particolare per l’effettuazione di
Indice di Crescita (GI). Per l’effettuazione dell’antimico- un antibiogramma, consente di ridurre notevolmente i
gramma si inocula il ceppo in esame in una serie di fla- tempi di risposta. Come descritto in Figura 1, l’analisi
coni contenenti i singoli antibiotici e in un flacone di molecolare per la determinazione della sensibilità ai far-
controllo, senza farmaco. L’inoculo del controllo viene maci può essere eseguita sia direttamente sul campione
eseguito con una sospensione 100 volte più diluita di clinico, purchè questo sia idoneo all’amplificazione e po-
quella impiegata per i terreni antibiotati, per il principio sitivo per M. tuberculosis, sia sulla coltura primaria del
delle proporzioni sopra descritto. I metodi colturali sono campione. Tanto i sistemi commerciali che quelli fatti in
universalmente considerati il sistema di riferimento per casa si basano sull’amplificazione mediante PCR di re-
la determinazione dell’antimicogramma. Il loro limite gioni geniche specifiche, su cui viene ricercata, con vari
principale tuttavia è rappresentato dal lungo tempo ne- sistemi, la presenza di mutazioni. Uno dei sistemi com-
cessario per la refertazione. Essendo infatti il M. tubercu- merciali più ampiamente utilizzati nei laboratori di mi-
losis un microrganismo a crescita lenta, che richiede di- cobatteriologia clinica è l’INNO-LiPA Rif. TB che consente
verse settimane per dare una crescita rilevabile, i tempi di saggiare la sensibilità alla RFM. In questo kit una
di effettuazione di tali saggi di sensibilità variano dalle porzione del gene rpoB, amplificato in PCR e denatura-
tre alle cinque settimane. Tenuto conto del tempo neces- to, viene ibridato in condizioni stringenti su una mem-
sario ad ottenere l’isolamento primario (4-5 settimane), brana di nylon su cui sono immobilizzati oligonucleotidi
il risultato finale dell’antimicogramma può non essere specifici e gli ibridi formatisi vengono rivelati con una
disponibile prima di 8-10 settimane dall’invio del cam- reazione colorimetrica (5).
pione al laboratorio (Fig.1). L’analisi del segnale di ibridazione informa sulla presenza
40
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
o assenza di mutazioni e quindi sulla sensibilità alla In questa tecnica possono essere impiegati diversi rea-
RFM. Il metodo ha il vantaggio di essere rapido e stan- genti fluorescenti che legano in modo specifico o aspeci-
dardizzato, tuttavia la sua applicabilità è limitata, dato fico il DNA, e permettono di seguire l’accumulo del pro-
che rileva solo la resistenza alla RFM. dotto di PCR mediante la misurazione del segnale fluore-
Tra i sistemi fatti in casa, il sequenziamento nucleotidico scente. Se si utilizzano delle sonde a DNA, il segnale
dei geni implicati nel meccanismo d’azione di un antibio- emesso in seguito all’ibridazione della sonda sulla sua
tico è certamente il metodo più informativo per studiare sequenza omologa, corrisponde in modo specifico all’am-
il genotipo di un isolato clinico di M. tuberculosis. Consen- plificazione del target. Per distinguere le varianti mutate
te infatti di identificare tutte le mutazioni presenti nel o wild type di una sequenza di DNA, si possono disegna-
gene d’interesse, non solo quelle note e sicuramente as- re diversi tipi di sonde. Nel nostro sistema di rilevamento
sociate alla resistenza, ma anche mutazioni non ancora delle mutazioni abbiamo usato delle sonde FRET. Le
descritte. Con questa tecnica sono stati condotti gli studi sonde FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)
di epidemiologia molecolare che hanno portato all’iden- sono una coppia di oligonucleotidi progettati per ibrida-
tificazione delle mutazioni più frequentemente associate re adiacenti l’uno all’altro quando trovano la sequenza a
alle resistenze e allo studio della loro distribuzione geo- cui sono omologi. L’estremità 3’ di una sonda è marcata
grafica (6, 7, 8, 9). Tuttavia questo tipo di analisi presup- con fluoresceina, mentre l’adiacente estremità 5’ della se-
pone la disponibilità di strumentazioni costose, di cui conda sonda è marcata con un altro fluorocromo (Red
non tutti i laboratori di micobatteriologia clinica dispon- 640 o Red 705). L’eccitazione luminosa della fluoresceina
gono e di personale specializzato. Inoltre determinare la determina il trasferimento di un elettrone al colorante
sequenza nucleotidica di diversi geni, allo scopo di sag- della seconda sonda, il quale emette un segnale fluore-
giare la sensibilità a più farmaci, richiede dei tempi di scente a una caratteristica lunghezza d’onda (705 o 640
esecuzione lunghi e dei costi elevati, rendendo questo nm). Lo stimolo luminoso che eccita la fluoresceina è
tipo di approccio non ideale per la routine diagnostica. prodotto dallo strumento di real time PCR, nel nostro
La recente diffusione della real-time PCR, ha permesso lo caso il LightCycler (Roche Diagnostics) e l’emissione del
sviluppo di sistemi rapidi per l’identificazione delle mu- segnale fluorescente avviene soltanto se le sonde sono
tazioni che conferiscono farmaco-resistenza negli isolati legate al loro specifico target, perché solo in questo caso
clinici di M. tuberculosis. i fluorocromi sono abbastanza vicini da consentire il tra-
sferimento dell’elettrone e la generazione del segnale
PCR real-time e rilevamento fluorimetrico delle (Fig. 2). Il legame delle sonde sull’amplicone avviene du-
mutazioni rante la fase di annealing della PCR, ed è quindi in que-
La PCR real-time consente di seguire l’accumulo del pro- sta fase che il segnale fluorescente viene prodotto dalle
dotto di PCR continuamente durante la reazione di am- sonde e registrato dallo strumento di real-time PCR.
plificazione. Fig. 2A/2B Per rilevare la presenza di differenti genotipi, al termine
della reazione di amplificazione viene effettuata un’anali-
si della curva di melting delle sonde. Durante questa
fase la temperatura all’interno dei capillari di reazione
viene aumentata gradualmente e il segnale fluorescente,
misurato continuamente, permette di valutare il com-
portamento delle sonde ibridate all’amplificato. All’au-
mentare della temperatura si raggiunge un valore criti-
co, in corrispondenza del quale la sonda inizia a staccarsi
dalla sua sequenza omologa, detto temperatura di mel-
ting (Tm) e definito come la temperatura alla quale il
50% della sonda è ancora ibridata al target. La Tm di un
ibrido sonda-target dipende dalla lunghezza, dal conte-
nuto in GC della sonda e dal grado di omologia con il
target. La rilevazione di mutazioni all’interno di regioni
di DNA coperte da sonde FRET si basa appunto sul profilo
differenziale di denaturazione delle sonde, quando que-
41
PCR Real-Time per la Determinazione dell’Antibiogramma
Molecolare in Mycobacterium tuberculosis
ste sono legate a sequenze a loro omologhe o a sequen- Antibiogramma molecolare mediante PCR
ze con una mutazione. real-time
La presenza di una mutazione nel target determina la L’impiego della real-time PCR per l’effettuazione di un
formazione di un mismatch nell’ibrido sonda-target, che antibiogramma molecolare presuppone la conoscenza
ne diminuisce la stabilità termica. Quindi la diminuzione delle mutazioni responsabili della resistenza.
della Tm di una sonda rispetto a quando questa è ibri- La resistenza alla RFM in M. tuberculosis è ben caratteriz-
data su una sequenza wild type, indica la presenza di zata e più del 95% degli isolati clinici resistenti ha muta-
una mutazione nella regione di DNA riconosciuta dalla zioni specifiche all’interno di una regione di 81 paia di
sonda. basi del gene rpoB, che codifica per la subunità (della
RNA polimerasi (6, 8, 10). Le due più frequenti alterazio-
Sonde FRET per la resistenza a Rifampicina e ni genetiche, responsabili di circa il 92% dei casi di resi-
Isoniazide stenza, sono delle sostituzioni nucleotidiche che coinvol-
Uno dei criteri consigliati per la progettazione di sonde gono i codoni 526 e 531 e provocano una sostituzione
FRET per l’analisi di mutazioni, prevede che i due oligo- amminoacidica nella proteina risultante.
nucleotidi abbiano due Tm diverse di circa 3-5°C. In parti- Il disegno di sonde FRET sulla porzione del gene rpoB che
colare la sonda “sensor” cioè quella complementare alla comprende i codoni 526, 531, e 533, pur avendo quest’ul-
regione che porta la mutazione, dovrebbe avere una Tm timo una rilevanza molto minore rispetto ai due prece-
inferiore a quella della sonda “anchor”, che si ibrida in- denti, permette di riconoscere più del 95% degli isolati
vece in una zona non soggetta a mutazioni. Questo ac- RFM-resistenti (7). L’analisi della Tm dei prodotti dell’am-
corgimemto assicura che sia la sonda che si lega sulla plificazione permette di riconoscere se nel gene del ceppo
zona potenzialmente alterata a generare il segnale fluo- saggiato è presente o meno una mutazione nella regio-
rescente. ne riconosciuta dalle sonde: l’eventuale mismatch provo-
Nel sistema da noi messo a punto per il rilevamento ca un abbassamento della Tm della sonda rispetto alla
della resistenza alla RFM questo schema è stato modifi- sequenza wild type
cato. Entrambe le sonde hanno una Tm all’incirca uguale La diminuzione di Tm dei ceppi mutati rispetto al ceppo
tra di loro e per questo entrambe funzionano da “sen- di controllo H37Rv varia a seconda del codone coinvolto
sor”. In questo modo ciascuna delle due sonde è in e a seconda del tipo del nucleotide sostituito. La muta-
grado di evidenziare la presenza di mutazioni nella re- zione più comune nella posizione 526 (CAC>GAC) determi-
gione da essa riconosciuta. Questa strategia ci permette na una diminuzione di Tm di circa 9,6°C rispetto al con-
di analizzare tutta la regione coperta dal set di sonde, trollo, mentre quella a carico del codone 531 (TCG>TTG)
che ha una elevata frequenza di mutazione, e risulta al- abbassa la Tm di circa 7,5°C (Fig.3). Anche sostituzioni nu-
terata nel 92% dei casi di RFM-resistenza. Le sonde sono cleotidiche diverse da quelle appena descritte o che coin-
in grado di rilevare una sostituzione nucleotidica che volgono altri codoni nella regione a cui si legano le Fig. 3
coinvolga un punto qualunque della regione a cui si le-
gano, tuttavia le mutazioni più frequenti coinvolgono i
codoni 526 e 531 e, con una frequenza molto minore, il
codone 533 del gene rpoB (Fig. 2A).
Per l’analisi della resistenza all’INH invece le sonde im-
piegate sono state progettate secondo il sistema stan-
dard “sensor-anchor”.
In questo caso il codone del gene katG per il quale c’è
una documentata e frequente associazione tra mutazione
e resistenza è uno solo, il codone 315. Non essendoci l’e-
sigenza di riconoscere la presenza di più codoni mutati, il
disegno delle sonde è avvenuto secondo i canoni stan-
dard. La sonda sensor, progettata per riconoscere muta-
zioni nel codone 315, ha una Tm teorica di 66°C, mentre
la anchor, omologa alla regione non soggetta a mutazio-
ni, ha una Tm di circa 3°C più alta (Fig. 2B).
42
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
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nella curva di melting un picco indicante la Tm a una 86(16):6230-4.
temperatura inferiore rispetto alla sequenza wild type. 6. Pozzi G., Meloni M., Iona E., Orru’ G., Thoresen O.F.,
Ricci M.L., Oggioni M.R., Fattorini L., Orefici G. 1999.
Diversamente da quanto accade per la RFM, l’analisi ge- rpoB mutations in multidrug-resistant strains of Mycobacte-
notipica della resistenza all’INH è molto più complessa, rium tuberculosis isolated in Italy. J.Clin.Micro-
biol.37(4):1197-1199.
dato che ad essa sono correlate alterazioni in almeno 4 7. Orrù G., Iona E., Memmi G., Oggioni M.R., Fattorini L.,
regioni geniche: katG, oxyR-ahpC, inhA, kasA (11, 12, 13). Orefici G., Pozzi G.. Mutazioni Associate alla resistenza al-
l’isoniazide in ceppi MDR di Mycobacterium tuberculosis
Tuttavia la maggior parte delle mutazioni che conferisco- isolati in Italia. 28° Congresso Nazionale della Società Italia-
no resistenza all’INH colpisce il gene katG. Il gene katG na di Microbiologia. 19-21/10/2000. Jesi. pg. 93
8. Telenti A., Imboden P., Marchesi F., Lowrie D., Cole S.,
codifica per una catalasi-perossidasi responsabile dell’at- Colston M.J., Matter L., Schopfer K., BodmerT. 1993. De-
tivazione dell’INH da profarmaco a principio attivo (11). tection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium
La più frequente alterazione genica, presente in circa il tuberculosis. Lancet 341:647-650.
9. Hepp M., Brandstatter B., Rieger U., Lehn N., Richter
64% dei casi di resistenza, è una sostituzione nucleotidi- E., Rusch-Gerdes S., Niemann S.J. 2001. Frequency of rpoB
ca nel codone 315, che porta al cambiamento dell’ammi- mutations inside and outside the Cluster I Region in Rifam-
pin-Resistant Clinical Mycobacterium tubercolosis Isolates.
noacido Ser in Thr nella proteina corrispondente (14). Su J.Clin.Microbiol. 39(1):107-110.
questa regione è stata progettata la coppia di sonde 10. Kapur V., Li L.L., Iordanescu S., Hamrick M.R., Wanger
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FRET per la determinazione della resistenza all’INH (Fig. automated DNA sequencing of mutations in the gene (rpoB)
2B). La diminuzione di Tm di 4-6°C, rilevabile nei ceppi encoding the RNApolymerase beta subunit in rifampin-resi-
stant Mycobacterium tuberculosis strains from New York City
mutati nel codone 315 rispetto al wild type, permette di and Texas. J. Clin.Microbiol. 32(4):1095-1098.
riconoscere una larga parte degli isolati micobatterici 11. ZhangY., Heym B., Allen B., Young D., Cole S. 1992. The
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bacterium tuberculosis. Nature 358:591-593.
La real-time PCR risulta un sistema rapido e accurato per 12. Musser J.M., Kapur V., Williams D. L., Kreiswirth
il rilevamento della resistenza negli isolati clinici di M. B.N., van Soolingen D., van Embden J.D.A. 1996. Characte-
rization of the Catalase-Peroxidase Gene (katG) and inhA
tuberculosis. La durata complessiva del saggio, compresa Locus in Isoniazid-Resistant and -Susceptible Strains of My-
l’analisi del risultato, richiede non più di 40 minuti. La cobacterium tuberculosis by Automated DNA sequencing:
Restricted Array of Mutations Associated with Drug Resi-
rapidità dei metodi molecolari rispetto ai colturali diven- stance. J.Infect.Dis. 173:196-202.
ta particolarmente importante quando si ha a che fare 13. Mdluli K., Slayden R.A., Zhu Y., Ramaswamy S., Pan X.,
Mead D., Crane D.D., Musser J.M., Barry III,C.E. 1998.
con microrganismi a crescita lenta, come i micobatteri. Inhibition of a Mycobacterium tuberculosis beta-ketoacyl
Inoltre l’analisi del prodotto di PCR viene effettuata ACP synthase by isoniazid. Science 280:1607-1610.
senza aprire i capillari, minimizzando il rischio di conta- 14. Rouse D.A., DeVito J.A., Zhongming L., Byer H., and
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di real-time PCR è in grado di identificare più del 95% roxidase activities and isoniazid resistance. Mol. Microbiol.
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dei ceppi MDR circolanti.
43
Applicazioni della tecnologia dei DNA
microarray nella ricerca di base
e nella diagnostica clinica
L. Barzon - M. Pacenti - G. Palù
Dipartimento di Istologia,
Microbiologia e
Biotecnologie Mediche
Università degli Studi di Padova
delle interazioni ospite-patogeno (2-7). DNA sono preparati in anticipo e poi impressi sulla su-
Il principio alla base della tecnica dei microarray è il perficie di un vetrino da microscopio;
44
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
● microarray di oligonucleotidi sintetizzati in situ. Questo Oltre ai microarray di acidi nucleici, sono stati sviluppati
metodo consiste nel combinare la tecnologia fotolito- microarray di peptidi o proteine e array di tessuti, di cui
grafica utilizzata nell’industria dei semiconduttori con ricordiamo brevemente le caratteristiche:
la sintesi chimica degli oligonucleotidi.
I principali vantaggi dei primi sono il costo relativamen- ● Array di proteine. Esistono due classi di array per pro-
te basso ed il fatto che non sia necessario conoscere la teomica, distinti a seconda del tipo di molecola immo-
sequenza del DNA da stampare, mentre i vantaggi dei bilizzata nell’array: array di proteine o di molecole le-
microarray di oligonucleotidi sono l’alta densità e il fatto ganti proteine (DNA, RNA, anticorpi, o altri ligandi).
di non dover utilizzare cloni di DNA o prodotti di PCR. Le Gli array costituiti da proteine immobilizzate sul vetri-
innovazioni che hanno reso possibile la tecnologia dei no vengono utilizzati per caratterizzare l’attività biochi-
microarray sono l’uso di supporti solidi non porosi, come mica di una proteina o l’interazione molecolare di pro-
il vetro, molto versatile ai fini della miniaturizzazione e teine, mentre gli array costituiti da ligandi di proteine
dell’individuazione dei marcatori fluorescenti, e la sintesi vengono impiegati per analizzare il profilo di espres-
ad alta densità spaziale di oligonucleotidi su vetrini sot- sione genica cellulare o tissutale. Un esempio di appli-
tilissimi con tecniche che utilizzano maschere fotolitogra- cazione degli array di proteine è l’uso di microarray di
fiche, impiegate nell’industria dei semiconduttori. anticorpi per l’immuno-fenotipizzazione delle leucemie (8).
Tra le numerose applicazioni della tecnologia dei mi-
croarray, le principali sono l’analisi su larga scala dell’e- ● Array di tessuti. Sono costituiti da piccole sezioni cilin-
spressione genica e la ricerca di variazioni della sequenza driche (diametro di 600 µm, spessore di 5 µm) di tes-
del DNA. suti fissati in formalina distribuite su un vetrino. In
genere, un microarray di tessuti contiene da 500 a
● Analisi dell’espressione. L’interesse principale della mag- 1000 sezioni. Vengono impiegati per screening su larga
gior parte degli studi che utilizzano i microarray consi- scala della presenza di molecole di DNA, RNA o protei-
ste nel controllo dei livelli di espressione dell’RNA, che ne in campioni tissutali, mediante ibridazione in situ o
può essere fatto utilizzando o microarray di cloni di immunoistochimica (9).
cDNA o microarray di oligonucleotidi gene-specifici. Nel
caso di alcuni organismi le cui sequenze siano state Applicazioni in oncologia
completamente definite, come quelle del lievito Sac- La tecnologia dei DNA microarrays ha trovato numerose
charomyces cerevisiae, è stato possibile effettuare l’a- applicazioni in ambito oncologico, sia per quanto riguar-
nalisi dell’espressione dell’intero genoma. da lo studio di mutazioni del DNA nelle cellule tumorali,
sia, soprattutto, per lo studio del profilo di espressione
● Analisi della variazione della sequenza del DNA. Il metodo genica che caratterizza la cellula neoplastica nelle varie
di analisi di sequenza basato sui DNA microarray utiliz- fasi del processo tumorigenico.
za microarray di oligonucleotidi (da ottameri a 70-
mers) in grado di appaiarsi con tutte le sequenze wild- a) Analisi di mutazioni. L’analisi di mutazioni in ambito
type e con sequenze dove ci siano sostituzioni di un oncologico riveste un notevole interesse sia per la co-
unico nucleotide. Il DNA da analizzare viene amplifica- noscenza dei meccanismi molecolari alla base della
to, marcato con un colorante fluorescente e ibridato su malattia sia, in ambito clinico, a scopo diagnostico-
uno di questi array. La forza dell’ibridazione è propor- terapeutico. Per la diagnosi di mutazioni si utilizzano
zionale al numero di appaiamenti corretti e massima microarray di oligonucleotidi, sui quali viene ibridato
quando un oligonucleotide è perfettamente comple- il campione di DNA da analizzare e confrontato con la
mentare ad una delle sequenze del DNA da analizzare. sequenza wild-type di riferimento. La maggior parte
Questa metodica è stata applicata con successo per il delle applicazioni di questa metodica riguardano geni
risequenziamento del genoma mitocondriale umano, associati alla suscettibilità al carcinoma della mam-
l’analisi di mutazioni di geni-malattia noti, come il mella, come BRCA1 e BRCA2 (10,11).
gene BRCA1 per la suscettibilità al carcinoma della
mammella, e per lo studio di marcatori per polimorfi- b) Screening di alterazioni genomiche.Oltre alle mutazioni
smi di un solo nucleotide (SNP- single nucleotide poly- puntiformi, nel processo di tumorigenesi si verificano
morphism). frequentemente riarrangiamenti cromosomici con ac-
45
Applicazioni della tecnologia dei DNA microarray
nella ricerca di base e nella diagnostica clinica
quisizione o perdita di materiale genetico, con conse- un diverso profilo molecolare, o valutare la risposta
guente amplificazione di oncogeni e perdita di geni della cellula neoplastica ad una serie di eventi, come
onco-soppressori. L’ibridazione genomica comparativa per esempio, trattamenti farmacologici o radianti
(CGH, comparative genomic hybridization) è una meto- (17). Le numerose applicazioni della tecnologia dei
dica citogenetica sviluppata recentemente che per- microarray in ambito oncologico sono state ampia-
mette di rivelare tutte le regioni cromosomiche di mente trattate in una recente review (18).
amplificazione o delezione in un unico esperimento.
Questo test, che utilizza una miscela di DNA tumorale Applicazioni in microbiologia e virologia
e di DNA di riferimento marcati in modo diverso in Con il sequenziamento del genoma di molti patogeni, la
una FISH competitiva, è stato recentemente affiancato tecnica dei DNA microarray si sta dimostrando un valido
alla tecnica dei DNA microarray per confrontare i dati strumento per l’analisi rapida del genoma dei microrga-
citogenetici con il profilo di espressione genica. La nismi e la loro tipizzazione, per lo studio della fisiologia
tecnologia degli array è stata inoltre adattata al test dei microrganismi, delle interazioni con l’ospite, e dei
CGH, per aumentare il potere di risoluzione del test fattori di virulenza.
citogenetico. In questo sistema, vengono utilizzati Sono stati finora sviluppati microarray per diversi micror-
array composti da cromosomi artificiali batterici (BAC) ganismi, tra cui E. coli, M. tubercolosis, S. aureus, S. pneu-
o di lievito (YAC), oppure da cosmidi (12). Un esempio moniae, H. pylori, P. falciparum, S. mansoni, HIV-1, CMV e
di applicazione di questa metodica è lo studio del HSV-1, alcuni dei quali sono disponibili in commercio. L’u-
locus della neurofibromatosi di tipo 2 (13). tilizzo dei DNA array per l’analisi del profilo globale di
espressione genica può rappresentare un valido strumen-
c) Analisi dei polimorfismi. Gli SNP rappresentano la più to per predire la funzione di geni microbici mediante il
frequente forma di polimorfismo del DNA del genoma confronto con geni ortologhi in altri organismi o sulla
umano, per cui sono dei marcatori genetici estrema- base di un comune pattern di espressione con altri geni
mente utili per mappare geni di suscettibilità a ma- dello stesso microrganismo. Per esempio, nel caso di S. ce-
lattie (14), per studi di perdita di eterozigosità (15), revisiae, l’analisi del profilo di espressione genica ha dimo-
nonché per studi farmacologici e tossicologici (16). La strato che l’espressione di clusters di geni coinvolti nello
tecnica degli SNP microarray si basa sull’amplificazio- stesso processo cellulare era regolata in modo simile (19).
ne del DNA da analizzare in una reazione multipla e Le principali applicazioni dei microarray in ambito micro-
la sua successiva marcatura e ibridazione su array con- biologico pubblicate finora in letteratura riguardano so-
tenenti gli specifici oligonucleotidi. prattutto lo studio della biologia dei microrganismi,
anche se il rapido sviluppo di queste metodiche fa intra-
d) Analisi del profilo di espressione genica. Lo sviluppo di vedere interessanti possibilità di impiego anche nella
metodiche per lo studio su larga scala dei geni diagnostica clinica.
espressi in una cellula o in un tessuto, come l’analisi
seriale dell’espressione genica (SAGE, serial analysis of a) Studio della fisiologia dei microrganismi.
gene expression) o i DNA microarray, ha portato ad Lo studio del profilo di espressione genica dei mi-
una migliore conoscenza delle basi molecolari dello croorganismi in diverse condizioni fisiologiche ha per-
sviluppo di molti tipi di tumore, ad una nuova classi- messo di chiarire la funzione di molti geni. Per esem-
ficazione su base molecolare di alcuni istotipi tumora- pio, sono stati identificati i geni coinvolti nella fase di
li, alla identificazione di nuovi marcatori molecolari crescita esponenziale e nella fase stazionaria di S.
utili per predire la prognosi e la risposta al tratta- pneumoniae (20), i geni espressi nelle diverse fasi del
mento. In questo tipo di studi può essere confrontato ciclo di replicazione di CMV (21), il profilo di espressio-
il profilo di espressione genica nel tessuto tumorale ne genica di mutanti di HSV-1, in cui era stato elimi-
con quello di un tessuto sano dello stesso paziente, nato il dominio di attivazione trascrizionale della protei-
oppure possono essere analizzati tessuti tumorali na virale VP16 (22) o il gene immediate-early α24 (23).
dello stesso paziente ottenuti in diverse fasi della pro- b) Identificazione di fattori di virulenza.
gressione neoplastica. E’ possibile inoltre confrontare Poiché l’espressione di geni implicati nella virulenza
diversi campioni tumorali dello stesso istotipo al fine è regolata in genere in modo molto preciso, questi
di individuare sottogruppi di cancro caratterizzati da possono essere identificati agevolmente confrontan-
46
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
do i geni espressi da un patogeno nel microambiente da diverse località e associati all’insorgenza di febbre
della sede di infezione (o in opportune condizioni reumatica (30). Lo studio genomico mediante mi-
sperimentali) con quelli espressi dal corrispondente croarray di isolati clinici di H. pylori ha dimostrato
microrganismo apatogeno nelle stesse condizioni am- una notevole diversità tra i diversi ceppi (31) e che i ceppi
bientali. Per esempio, l’analisi del profilo di espres- associati a manifestazioni cliniche più lievi presentavano
sione genica di diversi mutanti di S. pneumoniae ha ampie delezioni nell’isola di patogenicità cag (32).
dimostrato che la proteasi ClpP è un importante fat-
tore di virulenza (24). Analogamente, è stato dimo- e) Studio del rapporto microrganismo-ospite.
strato che mutanti di M. tubercolosis privi del fattore Anche se gli studi delle interazioni ospite-patogeno
SigH, determinano una risposta infiammatoria ridot- vengono in genere condotti su modelli murini, inte-
ta e non sono letali dopo iniezione e.v. nell’animale ressanti informazioni possono essere ottenute anche
da esperimento, rispetto ai bacilli wild-type (25). Fa- infettando linee cellulari in vitro. Tra i numerosi studi
cendo crescere lo streptococco di gruppo A in diverse pubblicati in letteratura su questo ambito di ricerca,
condizioni di temperatura, è stata dimostrata una ricordiamo il monitoraggio del profilo di espressione
serie di geni modulati dalla temperatura con un genica in colture primarie di fibroblasti umani infet-
probabile ruolo nella patogenicità del microrganismo (26). tati da CMV, in cui è stata dimostrata induzione di ci-
tochine, proteine inducibili dallo stress, e molti geni
c) Farmacogenomica. inducibili da interferone (33).
Un’altra applicazione dei microarray è lo studio del- L’analisi dell’effetto dell’infezione da HIV-1 in colture
l’effetto dei farmaci sul microrganismo dal punto di di linfociti T CD4 positivi (34-37) ha dimostrato l’ini-
vista dell’espressione genica. bizione dell’espressione di diverse classi di geni, com-
Questo può essere utile per approfondire il meccani- patibile con l’arresto delle cellule nella fase G2 causa-
smo d’azione dei farmaci a livello molecolare, nonché to dalla proteina virale Vpr. Anche l’espressione della
per identificare i meccanismi di sensibilità cellulare e proteina Tat di HIV-1 riduceva l’espressione di molti
di resistenza. Questo approccio è stato impiegato, per geni, soprattutto quelli codificanti per recettori con
esempio, per caratterizzare la risposta di M. tubercolo- attività tirosin chinasica e coattivatori trascrizionali.
sis al trattamento con inibitori della biosintesi di Questa metodica ha permesso di identificare nel mio-
acidi micolici (27), dimostrando come questi farmaci cardio 169 geni, la cui espressione era alterata dopo
inducano l’espressione di geni codificanti per enzimi infezione da coxsackievirus B3 (38). Lo studio di cellu-
coinvolti nella biosintesi di acidi grassi. I microarray le infettate da HSV-1 ha dimostrato l’induzione di
possono inoltre essere utilizzati per lo studio di poli- una serie di geni, indotti anche da interferone ed im-
morfismi del DNA associati alla resistenza ai farmaci, plicati nel controllo della diffusione del virus (39).
come nel caso di microarray di oligonucleotidi utiliz- Il virus della varicella-zoster (VZV) è stato dimostrato
zati per determinare gli alleli mutati del gene rpoB di provocare effetti diversi a seconda del tipo di cellula in-
M. tubercolosis, che conferiscono resistenza alla rifam- fettata, come la selettiva inibizione dell’espressione di
picina (28), o per l’analisi delle variazioni nel genoma caspasi 8 nei linfociti T (40). Analogamente, è stato stu-
di ceppi di S. aureus meticillino-resistenti e non meti- diato l’effetto dell’infezione di cellule epiteliali da parte
cillino-resistenti (29). del virus dell’influenza (41) o di reovirus (42) e l’effetto
dell’infezione di cellule epiteliali (43) o linfociti B (44) da
d) Genotipizzazione. parte del virus di Epstein-Barr. Un simile approccio è
Gli array di oligonucleotidi possono trovare un im- stato applicato anche per lo studio della risposta delle
portante ambito di applicazione nella genotipizzazio- cellule dell’ospite all’infezione da batteri patogeni.
ne dei microrganismi basata sullo studio dei poli- Lo studio dell’interazione di P. aeruginosa con cellule
morfismi. epiteliali polmonari (45) ha dimostrato l’attivazione
Questa metodica è stata impiegata per l’identificazio- del fattore trascrizionale IRF-1 (interferon regulatory
ne delle specie di Mycobacterium sulla base di 82 poli- factor 1), verosimilmente indotto dall’adesione del
morfismi del gene codificante per l’RNA ribosomiale batterio alle cellule.
16S (28) o per analizzare la sequenza di 36 ceppi di Il profilo di espressione genica di macrofagi e cellule
streptococco di gruppo A sierotipo M18, provenienti epiteliali infettate da Salmonella ha dimostrato un
47
Applicazioni della tecnologia dei DNA microarray
nella ricerca di base e nella diagnostica clinica
Applicazioni in cardiologia
Tra le numerose altre applicazioni della tecnologia dei
microarray nella ricerca di base e nella diagnostica clini-
ca, accenniamo brevemente solo alle applicazioni in me-
dicina cardiovascolare (50, 51).
Studi iniziali condotti sia in tessuti umani che in modelli
animali di malattia hanno dimostrato variazioni del pro-
filo di espressione genica nelle diverse condizioni patolo-
giche, quali l’ipertrofia del miocardio (52), l’infarto del dica estremamente utile per lo screening rapido di mutazio-
miocardio (53), l’insufficienza cardiaca (54), e l’iperten- ni o per l’analisi su larga scala di polimorfismi del DNA.
sione polmonare (55). Gli esempi di applicazione clinica dei microarray riguar-
In particolare, lo studio di un modello murino di ipertro- dano soprattutto l’oncologia, dove è stato possibile asso-
fia del miocardio indotta dall’infusione di angiotensina ciare distinti profili di espressione genica con la prognosi
II e isoproterenolo ha permesso di identificare decine di e la risposta al trattamento, come nel caso del carcinoma
geni, precedentemente non associati a questa patologia, della mammella (58, 59), dei linfomi B (60, 61), del carci-
la cui espressione era alterata durante l’induzione o la noma renale (62), del carcinoma della vescica (63) e del
regressione dell’ipertrofia cardiaca (52). melanoma (64).
La metodica dei DNA microarray è stata inoltre applicata Per quanto riguarda le possibili applicazioni in ambito
per il confronto dell’espressione genica in campioni di microbiologico, queste vanno dallo studio dell’espressio-
aneurisma dell’aorta addominale con quello dell’aorta ne di fattori di virulenza di un determinato microrgani-
normale, dimostrando un aumento di espressione nel smo, allo screening rapido di un ampio numero di pato-
tessuto patologica di circa 20 geni diversi, tra cui l’anti- geni alla ricerca di quello responsabile della malattia,
gene nucleare di differenziazione delle cellule mieloidi, alla genotipizzazione, allo studio dell’interazione ospite-
catepsina H, PDGF-A, apoE, gelatinasi B/metalloproteina- microrganismo come indice indiretto di infezione.
si-9 e IL-8, mentre la chinasi della catena leggera della A questo proposito, ciascun patogeno potrebbe indurre
miosina e l’integrina β1 risultavano diminuite (56). una specifica variazione nell’espressione genica nei leuco-
L’analisi dell’espressione genica può essere utile anche citi, patognomonica dell’infezione. La tecnologia dei mi-
per lo studio dell’effetto di alterazioni emodinamiche croarray potrebbe perciò essere utile per identificare in
sulla parete dei vasi sanguigni. modo indiretto l’esposizione a patogeni, anche non colti-
Un esempio di questa applicazione è lo studio dell’effetto del vabili o poco caratterizzati.
flusso su un monostrato di cellule endoteliali in vitro (57). L’analisi del profilo di espressione genica può essere utile
anche in cardiologia. Per esempio, uno studio pubblicato
Prospettive di applicazioni cliniche dei microarray recentemente ha dimostrato che variazioni specifiche del-
I risultati ottenuti dai primi studi clinici dimostrano che l’espressione genica del miocardio in pazienti con cardio-
l’analisi del profilo di trascrizione dei geni può essere un miopatia dilatativa correlavano bene con la risposta al
valido strumento per la classificazione delle malattie in trattamento con β-bloccanti (65). L’analisi del profilo di
diverse categorie di rischio o di risposta al trattamento. Inol- espressione genica potrebbe quindi essere utile sia nel
tre, i microarray di oligonucleotidi rappresentano una meto- formulare la diagnosi, sia nella scelta terapeutica.
48
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
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49
Metodiche estrattive per la
preparazione dei campioni
A. Focà - A. G. Lamberti
Dipartimento Scienze Mediche
Cattedra di Microbiologia
Università degli Studi di
Catanzaro
All’inizio degli anni 70, le tecnologie di ingegneria gene- ● trascrizione “in vitro” di una sequenza di RNA messag-
tica correlate con le conoscenze di biologia molecolare, gero in una sequenza di DNA complementare (o cDNA)
rendendo i geni facilmente accessibili allo studio delle grazie alla scoperta della trascrittasi inversa nel 1970
loro caratteristiche chimico-fisiche e funzionali, hanno da parte di H. Temin- D. Baltimore;
permesso di sviluppare degli strumenti d’investigazione ● “taglio” di piccoli frammenti di DNA dell’ordine di uno
ad alto contenuto tecnologico, in grado di risolvere pro- o qualche migliaio di paia di basi (bp) con l’aiuto delle
blemi sino allora insolubili. endonucleasi di restrizione, enzimi scoperti nel 1970 da
Dal punto di vista strettamente metodologico le tappe H.O. Smith, D. Nathans, W.Arber;
fondamentali del veloce sviluppo della biologia moleco- ● integrazione, grazie alla DNA ligasi, di frammenti di
lare è possibile così riassumerle: DNA all’interno di vettori (plasmidi, fagi, ecc...), per il
50
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
clonaggio dei geni (P.Berg, H.Bayer, S.Cohen, 1972-73); 3. separazione e recupero dell’acido nucleico dai residui
● lettura del messaggio contenuto nelle catene polinu- cellulari
cleotidiche, grazie ai metodi dell’analisi della sequenza 4. precipitazione e successiva valutazione quali-quantita-
del DNA elaborati da F.Sanger e A.Coulson (1975), poi tiva degli acidi nucleici estratti.
da A. Maxam e W. Gilbert (1977); La metodologia utilizzata per la lisi cellulare deve rap-
● amplificazione “in vitro” di un frammento di DNA deli- presentare un felice compromesso: essa deve essere ab-
mitato alle estremità da due primers sequenza-specifici bastanza aggressiva da frammentare il complesso mate-
(K.Mullis 1984). riale di partenza, ma gentile abbastanza da preservare
l’integrità dell’acido nucleico.
L’estrazione degli acidi nucleici è un passaggio delicato e Le tecniche comuni di lisi prevedono:
fondamentale per l’ottenimento di validi risultati e l’ot- ● distruzione meccanica, mediante trattamento con una
vegetali, cellule eucariotiche, cellule procariotiche o Per le cellule ottenute da materiale bioptico oppure da
virus) colture cellulari è prevista una omogeneizzazione in pre-
● dal materiale biologico, contenente la fonte d’acidi nu- senza di SDS nell’apparecchio Potter.
cleici, utilizzato per l’estrazione (organo intero, tessuto, L’inattivazione delle proteine cellulari avviene in maniera
coltura cellulare, sangue, siero, plasma, etc..) diversa a seconda se il materiale genetico da estrarre è
● dall’applicazione prevista post-estrazione (PCR, cloning, rappresentato da DNA o RNA.
marcatura, restrizione enzimatica, Southern blotting, Quando l’acido nucleico è il DNA, si utilizza la proteinasi
RT-PCR, sintesi di oligonucleotidi, etc..). K, una proteinasi molto attiva, che digerisce le proteine
A prescindere dalla tecnica d’estrazione degli acidi nuclei- associate all’acido nucleico e inattiva tutte le nucleasi cel-
ci scelta, essa deve rispondere a due requisiti fondamen- lulari.
tali: la purezza e la resa (quantità). Gli RNA sono più difficili da manipolare poiché sono
La purezza del DNA o del RNA non va intesa come pre- molto sensibili all’azione della ribonucleasi (RNasi A), un
senza in soluzione unicamente dell’acido nucleico in enzima ubiquitario (le dita della mano dell’operatore per
esame, ma come assenza di prodotti contaminanti che, esempio ne sono ricoperte) estremamente attivo e molto
legandosi ai reagenti in soluzione, potrebbero modifi- resistente ai trattamenti aggressivi abitualmente nefasti
carne i risultati quali- quantitativi della sequenza in stu- per tutti gli enzimi, essendo attivo dopo un trattamento
dio. In particolare, i test diagnostici che utilizzano la tec- di un’ora a 90°C. Qualsiasi metodica che implichi l’estra-
nica di PCR, risentono sensibilmente della presenza di so- zione di RNA deve essere eseguita in assoluta sterilità a
stanze che interferiscono con la reazione d’amplificazione; causa delle RNasi microbiche. I materiali ed i reagenti
i componenti porfirinici, ad esempio, derivanti dal grup- utilizzati per l’estrazione, devono essere autoclavati, op-
po eme dei globuli rossi, sono dei potenti inibitori della pure trattati con acido iodoacetico 10 mM e risciacquati
TAQ polimerasi, così come l’urea, il detergente Sodio-do- in acqua distillata autoclavata. I tessuti o le cellule sono
decil-solfato (SDS) e il sodio acetato. omogeneizzate in un tampone contenente un detergente
La quantità di acido nucleico presente in un materiale ad alta concentrazione (SDS o Sarcosyl), un agente disso-
biologico, direttamente correlata con la sensibilità e la ciante (cloruro o isotiocianato di guanidinio), una solu-
specificità dei test diagnostici, deve essere garantita da zione tampone (acetato) ed un agente riducente (2-mer-
tecniche che, evitandone la degradazione meccanica o captoetanolo o DTT). La composizione di questa soluzione
ancora di più quella enzimatica, ne consentano una resa è scelta per inibire le RNasi endogene, denaturare gli
accettabile. acidi nucleici e dissociare le proteine che potrebbero es-
Scelto il campione biologico da utilizzare come fonte di servi fissate.
materiale genetico, l’iter procedurale prevede quattro Il recupero del materiale genetico dalla soluzione conte-
fasi successive: nente il lisato cellulare, con la conseguente separazione
1. lisi delle cellule dell’acido nucleico dai residui cellulari e dalle sostanze in-
2. inattivazione delle nucleasi cellulari terferenti, è attuata secondo tre modalità fondamentali:
51
Metodiche estrattive per la preparazione dei campioni
1. Utilizzo di solventi organici tenzione delle molecole di acido nucleico caricate negati-
E’ sfruttata la solubilità differenziale delle molecole pre- vamente. Variando successivamente la concentrazione sa-
senti in soluzione (Acidi nucleici/contaminanti) fra due lina della soluzione si procederà all’eluizione dell’acido
fasi tra loro non miscibili. La soluzione contenente gli nucleico.
acidi nucleici è vigorosamente mescolata ad una fase Il successivo passaggio è quello della precipitazione che
non miscibile per qualche minuto. La fase acquosa, che ha lo scopo di recuperare gli acidi nucleici in forma soli-
contiene gli acidi nucleici, è recuperata delicatamente da permettendone, dopo averli essiccati, di ridiscioglierli,
con una pipetta, dopo centrifugazione. alla concentrazione desiderata, in una soluzione priva di
Una delle prime sostanze utilizzate allo scopo è il fenolo, sostanze contaminanti e degradanti.
energico deproteinizzante nella quale gli acidi nucleici Una delle sostanze utilizzate per la precipitazione degli
non sono solubili. La qualità del fenolo è una delle ca- acidi nucleici è l’alcool etilico che è utilizzato ad alta con-
ratteristiche principali che garantisce la buona riuscita centrazione (2,5 volumi di etanolo puro per volume di
dell’estrazione: deve essere perfettamente puro e non os- campione) in una soluzione ad alta forza ionica (sodio
sidato (distillato). L’estrazione fenolica è utilizzata ogni acetato 3M pH 5,2).
volta che gli acidi nucleici devono essere liberati dalle In queste condizioni la precipitazione degli acidi nucleici
proteine. avviene quasi totalmente ed è accelerata dal freddo (-
Altre sostanze sono il cloroformio o in sostituzione l’etere 20°C a -70°C). Il precipitato ottenuto è recuperato dopo
che in ogni caso vengono utilizzate sempre dopo un trat- centrifugazione.
tamento con fenolo, in quanto permettono di eliminare Altra sostanza utilizzata è l’isopropanolo che viene di
le tracce di fenolo che sono eventualmente state asporta- norma preferita all’alcool etilico, perché, da un lato per-
te insieme alla fase acquosa. mette la precipitazione degli acidi nucleici senza bisogno
L’isobutanolo, altra sostanza utilizzata, ha il vantaggio di variare la forza ionica della soluzione, e, dall’altro,
oltre che di separare gli acidi nucleici dalle sostanze con- perché non precipitando i frammenti molto piccoli degli
taminanti, anche quella di concentrarli di circa il 10% acidi nucleici, evita che questi, essendo funzionalmente
nella soluzione. inattivi, possano interferire con le successive applicazioni
di microbiologia molecolare.
2. Affinità (glass beads) Qualsiasi sia la sostanza utilizzata per la precipitazione e
Si sfrutta la tendenza di frammenti di DNA plasmidico, prima della risospensione in un tampone TE (tris 10mM,
DNA genomico, RNA totale, ad adsorbirsi sulla superficie EDTA da 0,1 a 1 mM), gli acidi nucleici precipitati devono
di particelle di vetro o gel di silice in presenza di alte essere lavati con etanolo al 70% per essere ripuliti dai
concentrazioni di sali caotropici (in particolare idrocloru- sali,nel caso in cui si sia usato etanolo puro per la preci-
ro (GuHCl) e isotiocianato (GuSCN) di guanidina). La elui- pitazione, o dall’isopropanolo.
zione degli acidi nucleici si ottiene variando la forza ioni- Per il controllo dell’estrazione degli acidi nucleici a que-
ca ed il pH della soluzione, utilizzando acqua distillata o sto punto si esegue una valutazione quali-quantitativa
un tampone a bassa concentrazione salina (TE 10/1mM). per via spettrofotometrica su un’aliquota del campione.
In caso di trattamento di campioni ricchi di cellule e, Per una stima quantitativa si valuta l’assorbanza a 260
contenenti, verosimilmente, elevate quantità di acidi nu- nm di un campione opportunamente diluito, ricordando
cleici (dell’ordine dei µg) le particelle di silice vengono che una unità di densità ottica (D.O.) corrisponde ad una
sostituite con le diatomee (pareti cellulari fossilizzate di concentrazione pari a 50 µg/ml di DNA a doppia elica e
alghe unicellulari). Esse sono costituite quasi interamente a 40 µg/ml di DNA a singola elica o di RNA.
da silice, ma sono di dimensioni più grandi e, quindi, in Per una valutazione qualitativa dell’acido nucleico estrat-
presenza di elevate quantità di DNA, soprattutto geno- to si procede ad una seconda misurazione spettrofotome-
mico, non formano con quest’ultimo complessi agglome- trica contemporaneamente alla prima, ad una lunghezza
rati che non potendosi più risospendere, determinereb- d’onda di 280 nm.
bero una perdita di materiale genetico. Il rapporto fra le due misurazioni, D.O. 260 nm/D.O. 280
nm, garantisce una valutazione qualitativa della solu-
3. Scambio ionico (ionic exchange: Qiagen resin) zione poiché un DNA puro dovrebbe avere un rapporto
In determinate concentrazioni saline, una matrice croma- compreso tra 1,8 e 2,0.
tografica con cariche positive permette il legame e la ri- Una contaminazione della soluzione di estrazione da fenolo
52
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
può essere messa in evidenza misurando la D.O. a 270 nm. Il DNA o l’RNA bersaglio ibrida con una sonda adesa ad
La valutazione delle sostanze contaminanti deve essere una biglia magnetica mentre le sequenze non importan-
presa in considerazione dall’operatore al momento della ti sono rimosse mediante lavaggio.
scelta delle procedure successive a cui sarà sottoposta la Questo sistema si è rivelato molto utile per concentrare
soluzione contenente gli acidi nucleici, infatti, una conta- piccole quantità di molecole bersaglio presenti in un ma-
minazione da proteine o da fenolo produce, da un lato, teriale biologico consentendo un aumento della sensibi-
una sovrastima della concentrazione degli acidi nucleici lità dei test diagnostici e riducendo l’errore di campiona-
e, dall’altro un disturbo nell’attività degli enzimi che sa- mento.
ranno impiegati per i successivi test diagnostici. Uno di questi è il sistema MagNA Pure LC (Roche) che è
Attualmente esistono in commercio numerosi kit che pre- una stazione di lavoro per l’estrazione e l’isolamento au-
vedono l’estrazione di acidi nucleici dai comuni campioni tomatizzato di acidi nucleici, e che permette di ottenere
clinici (siero, plasma, tamponi urogenitali, urine etc..) RNA o DNA, da una varietà di campioni diversi, in un
con metodiche sufficientemente standardizzate e proce- tempo relativamente breve (60-90 min).
dure relativamente rapide e semplici che riducono sensi- Il sistema MagNA Pure LC (Roche) utilizza per l’isolamen-
bilmente i problemi correlati con la manualità. Inoltre, to di DNA o RNA particelle magnetiche di vetro a cui
per un’ulteriore garanzia del processo di estrazione è sono adese sequenze oligonucleotidiche specifiche per gli
prevista anche l’aggiunta di un controllo interno (I.C.) acidi nucleici.
che sottoposto agli stessi trattamenti del campione bio- La fase di lisi delle cellule, di deproteinizzazione, di sepa-
logico, ne dimostra la validità. razione e recupero di materiale genetico avviene nella
Sono stati recentemente introdotti sul mercato e attual- stessa provetta di reazione e nella stessa postazione di
mente sono in corso di valutazione, sistemi che permet- lavoro consentendo di ottenere da un lato, acidi nucleici
tono la completa automatizzazione del processo di estra- che senza alcun altro trattamento possono essere utiliz-
zione degli acidi nucleici e della preparazione dei cam- zati per tutti gli scopi diagnostici, e dall’altro minimiz-
pioni biologici necessari alla successiva applicazione dei zando gli errori dovuti all’operatore.
test diagnostici. La diffusione di questi sistemi automatizzati di prepara-
In questi sistemi, la fase di lisi delle cellule, avviene in zione del campione e la loro associazione all’automazio-
un sistema completamente chiuso e la separazione ne delle altre tecniche utilizzate nella routine diagnosti-
degli acidi nucleici dalle altre sostanze presenti in solu- ca, consentiranno, rendendo i test diagnostici più sensi-
zione è attuata mediante l’uso di una sonda-cattura. bili e specifici, una pronta e corretta diagnosi etiologica.
53
La metodica Taqman (Cobas Taqman)
nella valutazione dinamica
della carica virale
G. Colucci
Scientific Affairs
Roche Molecular Systems,
Rotkreutz, Switzerland
54
Le tecniche molecolari: dalla ricerca alla diagnostica
monografia
55
COBAS AmpliPrep:
l’unico estrattore di acidi nucleici
sviluppato per la Diagnostica
COBAS AmpliPrep è l’unico sistema completamente auto- crementando in tal modo la standardizzazione e la sicu-
matico sviluppato per la preparazione e l’estrazione a rezza dei Test PCR Roche, da sempre sinonimo di qualità
flusso continuo dei campioni destinati ai test PCR. e affidabilità dei risultati.
Gli estratti possono poi essere sottoposti ad amplificazio- Il Sistema COBAS AmpliPrep è composto da:
ne in PCR su Cobas Amplicor oppure, in un futuro molto ● PC gestionale con software dedicato AmpliLink, per
nuali di estrazione degli acidi nucleici, che incidono sul TaqMan collegati al computer di cui al punto preceden-
costo totale delle analisi in PCR almeno per il 70%. te; stampante laser per i referti.
Ad un contenimento così significativo del tempo tecnico
dedicato si associa un elevato aumento della produtti- Principio di estrazione
vità; inoltre tutte le variabili ed i rischi associati alla pre- L’estrazione automatica che avviene all’interno del
parazione manuale dei campioni vengono eliminati, in- COBAS AmpliPrep, coperta da brevetto Roche, è comple-
56
tamente differente dalla tradizionale estrazione alcolica utilizzo;
utilizzata nei test Amplicor e COBAS Amplicor. ● Produttività di 24 campioni all’ora e 144 al giorno per ab-
E’ infatti un’estrazione Target-specifica, basata sull’ibri- breviare i tempi di refertazione e processare senza pro-
dazione di sonde complementari a sequenze presenti sul- blemi anche routine importanti;
l’acido nucleico che deve essere estratto (target). In tal ● Quattro diverse metodiche di estrazione in contemporanea:
modo vengono catturati e sottoposti ad amplificazione ogni metodica ha parametri di estrazione ottimizzati;
solo gli acidi nucleici dell’agente patogeno di interesse, ● Software AmpliLink per la gestione completa del sistema:
incrementando ancora la già ottima specificità della un solo PC e un solo software, con interfaccia grafica
Polymerase Chain Reaction. semplice ed immediata, per governare fino a 3 Cobas
AmpliPrep e 3 Cobas Amplicor o TaqMan collegati in
Descrizione rete;
Dopo una lisi con guanidina isotiocianato, una sonda ● Backup dei dati analitici su CD-R per una assoluta sicu-
biotinilata specifica al target riconosce la sequenza com- rezza dei dati ed economia di spazio e costi di gestio-
plementare e vi si lega; successivamente vengono ag- ne;
giunte in soluzione microparticelle magnetiche rivestite ● Operazioni di manutenzione sullo strumento completamen-
con streptavidina. L’alta affinità tra streptavidina e bioti- te guidate dal software, per rendere l’operatore comple-
na consente la formazione di un complesso formato da tamente autonomo nella gestione dello strumento,
microparticella magnetica-sonda-target. Successivi lavag- senza necessità di consultare guide o manuali durante
gi consentono la perfetta separazione, tramite magneti, il lavoro;
degli estratti. Gli estratti così ottenuti vengono caricati ● Riconoscimento positivo mediante codice a barre di cam-
su COBAS Amplicor o Cobas TaqMan per l’amplificazione pioni, rack e reagenti, per la massima sicurezza e affida-
(PCR) ed eventuale rivelazione con sonde specifiche, co- bilità del processo;
niugato, substrato. ● Principio di estrazione brevettato tramite sonde comple-
L’estrazione che ha luogo all’interno del COBAS Ampli- mentari alle sequenze del target, raggiungendo in tal
Prep è estremamente efficiente e permette di ottenere modo una specificità ineguagliabile (non viene estrat-
acidi nucleici altamente purificati, in quanto le sonde se- to tutto l’acido nucleico del campione, ma solo ciò che
lezionano e trattengono la sequenza bersaglio della suc- sarà amplificato durante la PCR);
cessiva amplificazione, mentre tutto il resto viene elimi- ● Assenza di contaminazioni di qualsiasi tipo: i campioni
zione di acidi nucleici a flusso continuo. Senza inter- le) può essere accesa tra una seduta e l’altra per ga-
rompere il processo, i campioni completati e i reagenti rantire la sterilità delle superfici di lavoro.
esauriti possono essere scambiati con altri nuovi. ● Aghi di dispensazione dei reattivi dedicati: non vengono
● Completa automazione del processo di preparazione dei mai a contatto con i campioni eliminando a priori il
campioni di siero o plasma: in questo modo si elimina problema del carry-over;
completamente la fase di estrazione manuale degli ● Tecnologia walk-away: lo strumento dà avvio all’estra-
acidi nucleici realizzando un cospicuo risparmio in ter- zione solo se è stato caricato a bordo tutto l’occorrente
mini di tempo-operatore. per portare a termine la seduta; mentre lavora la pre-
● Sicurezza per gli Operatori: con il sistema COBAS Ampli- senza dell’operatore non è richiesta;
Prep la manipolazione di campioni potenzialmente in- ● Possibilità di lavoro in over-night con permanenza degli
zie all’automazione, che elimina tutte le variabili asso- parare, nessuna seduta persa per errori nella ricostitu-
ciate alla procedura manuale. zione dei reagenti;
● Fino a 72 campioni a bordo dello strumento; caricamento ● Ridotti tempi di avvio del sistema: l’inizializzazione ter-
in continuo dei campioni per la massima versatilità di mina in pochi minuti, il controllo dei reattivi e dei
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consumabili avviene in tempo reale appena questi
sono caricati a bordo;
● Interfaccia bidirezionale per collegamento con “host-
computer”;
● Gruppo di continuità (U.P.S.) esteso anche al sistema ge-
UI/ml
● HCV monitor: kit da 48 determinazioni, range lineare
Fig. 2
Particolare del
braccio di dispensa-
zione Cobas AmpliPrep
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Cobas TaqMan - la PCR in Real Time:
elevate prestazioni per risultati
qualitativi e quantitativi in Diagnostica
Cobas TaqMan 96
Cobas TaqMan 48
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Cobas TaqMan 48
collegato a Cobas
AmpliPrep
mazione proprie del settore Diagnostico, nasce negli sta- Il Cobas TaqMan 96 è uno strumento da pavimento, pre-
bilimenti di produzione di Rotkreuz, in due configurazio- disposto per il collegamento integrato all’estrattore Am-
ni: da 48 test e da 96 test. pliPrep.
Dopo estrazione manuale o automatica su Cobas Ampli-
COBAS TaqMan 48 Prep i campioni verranno caricati su Cobas TaqMan, e
Il COBAS TaqMan 48 è uno strumento compatto da banco, qui amplificati e rivelati nel medesimo tempo.
per medie routine, caratterizzato da due thermal cycler La PCR Real time consente la produzione in contempora-
completamente autonomi ed indipendenti, ciascuno da nea di dati qualitativi e quantitativi, rendendo inutili i
24 posizioni. E’ dotato di 4 combinazioni di filtri a passaggi della rivelazione colorimetrica con sonde com-
diverse lunghezze d’onda per l’eccitazione e la lettura; plementari, coniugato e substrato.
tale lettura avviene su tutte le posizioni Con questa nuova tecnologia, infatti, non vengono più
contemporaneamente (48 canali). rilevati gli ampliconi prodotti dopo la PCR ma la PCR
E’ possibile quindi analizzare insieme target differenti stessa, con indubbi vantaggi sulla accuratezza e precisio-
(PCR multiplex). ne dei risultati.
Lo strumento è controllato e gestito tramite pc, su cui è La PCR Real Time consente di ottenere elevati livelli di
installato il software dedicato TaqLink. Due lettori di sensibilità e la massima estensione del range dinamico
codice a barre incorporati identificano univocamente i per la titolazione di campioni, anche ad elevatissime cari-
supporti porta campioni. Il Cobas TaqMan è predisposto che virali. La lettura del segnale fluorescente attraverso le
sia per l’uso in STAND-ALONE, con estrazione dei provette di amplificazione e l’assenza di parti in movi-
campioni manuale, sia per l’estrazione automatica se mento permettono all’operatore di raggiungere la massi-
collegato a Cobas AmpliPrep. ma sicurezza evitando ogni possibilità di contaminazione.
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LightCycler: la soluzione di
Roche Applied Science
per la Real Time PCR
Negli ultimi anni la Real Time PCR si è rivelata un me- prendere in considerazione solo i primi cicli di una rea-
todo innovativo ed affidabile per quantificare i prodotti zione di PCR, ovvero la fase lineare, durante la quale la
di PCR (QPCR). I protocolli tradizionali oggi si basano concentrazione del prodotto aumenta in maniera espo-
su una quantificazione cosiddetta “end point”, ovvero nenziale.
sulla quantificazione del prodotto alla fine della reazio- Lo strumento per Real Time PCR di Roche Applied Scien-
ne di amplificazione. I prodotti della PCR però durante ce, LightCycler, consente oggi di eseguire in modo rapi-
la reazione aumentano logaritmicamente solo nei primi do, accurato e riproducibile una QPCR in circa 30 minuti
cicli (tra il 20° e il 25° ciclo) per poi arrivare rapidamen- e di quantificare e monitorare il prodotto di PCR on line,
te a “plateau” intorno al 40° ciclo (vedi Fig. 1). Al fine ovvero di seguire “in diretta” ogni fase della reazione.
di assicurarne un’accurata quantificazione è necessario Lo strumento è un termociclizzatore estremamente rapi-
61
do con un sistema di rivelazione in fluorescenza per l’a- Fig. 1
nalisi e la quantificazione dei prodotti di PCR e RT-PCR. Cinetica di una reazio-
ne di PCR. La curva,
La reazione avviene all’interno di un capillare di vetro. dopo una fase iniziale
Un sistema ad aria consente di raffreddare e riscaldare in durante la quale non
maniera estremamente rapida i campioni con “ramping” si osserva alcun au-
mento del segnale
di circa 20 gradi centigradi al secondo. L’uso di capillari specifico, tra il 20 e il
in borosilicato sia come sede della reazione di PCR, che 25° ciclo cresce in in
come cuvetta per l’analisi fluorimetrica ha permesso in maniera esponenziale
fino a raggiungere un
un certo senso di “miniaturizzare” la reazione e di lavo-
plateau intorno al
rare con microvolumi (10-20 µl) e, allo stesso tempo, di ciclo numero 40-45.
svolgerla in maniera più sicura. L’amplificazione e la rile- Una conferma di que-
vazione fluorescente infatti avvengono all’interno dello sto si ha anche con un
interpretazione dei ri-
stesso capillare eliminando ogni inutile manipolazione sultati ai diversi cicli
del campione e di conseguenza qualsiasi rischio di con- in gel di agarosio con
taminazione (Fig. 2). EtBr.
Il LightCycler e’uno strumento che trova numerose appli-
cazioni sia nella quantificazione Real Time on line di pro- levare due flourofori contemporaneamente è molto im-
dotti di PCR, che nello screening di mutazioni. Per quan- portante quando si vogliono studiare mutazioni com-
to riguarda l’analisi delle mutazioni queste possono es- plesse in una singola reazione, Multiplex PCR, o utilizzare
sere puntiformi o complesse e la loro identificazione av- competitori o standards interni per analisi quantitativa.
viene mediante delle curve di melting generate da speci- Con il LightCycler è possibile effettuare una quantifica-
fiche sonde di ibridazione. La loro analisi permette di zione assoluta, creando una curva standard a concentra-
identificare nel soggetto l’omozigote wildtype, l’omozi- zione nota, o una quantificazione relativa sfruttando un
gote mutante e l’eterozigote (Fig. 3). gene di riferimento.
Grazie ad un unica sorgente di luce (LED) e ad una serie Questo tipo di quantificazione è possibile anche grazie
di tre filtri e specchi che separano la luce in diverse lun- all’utilizzo di un nuovo software che permette di auto-
ghezze d’onda rilevabili in tre canali separati, Il LightCy- matizzare l’intero processo e di normalizzare l’amplifica-
cler è in grado di leggere ed analizzare diversi tipi di zione del campione con un calibratore in modo da otte- Fig. 2
fluorescenza. Con questo strumento è possibile utilizzare nere risultati il più possibile riproducibili. I tempi di Dettaglio della
“camera di reazione”,
fluorofori intercalanti il doppio filamento di DNA (Sybr reazione e di analisi sono in ogni caso estremamente ve- del gruppo ottico e
green), sonde di ibridazione FRET (Fluorescence Resonan- loci e, come abbiamo precedentemente ricordato, la du- del sistema di
ce Energy Transfer), o sonde di idrolisi (sonde TaqMan). rata di un ciclo è di 15-20 secondi e la durata di una PCR rilevamento
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omozigote mutate omozigote mutate
omozigote wildtype omozigote wildtype
eterozigote eterozigote
Fig. 3 di 30-40 cicli si aggira tra i 15 e i 20 minuti.Il LightCycler Il LightCycler è quindi uno strumento molto flessibile in
Analisi di curve di è uno strumento ad elevata produttività e riproducibi- grado di utilizzare diversi fluorofori e tipi di sonde con
melting per la
determazione di lità. Può processare contemporaneamente, secondo i costi di utilizzo e gestione estremamente ridotti.
mutazioni tempi sopra esposti, 32 campioni assicurando la totale Inoltre le sue contenute dimensioni (45 cm x 30 cm x
uniformità delle condizioni per ciascun capillare. 40 cm) consentono di avere un unico strumento da
I capillari, opportunamente chiusi, riducono a zero qual- banco in cui macchina PCR e sistema di rilevamento
siasi rischio di contaminazione. La durata dell’intera ses- sono perfettamente integrati con un’unica gestione
sione di analisi (ad esclusione della preparazione dei computerizzata.
campioni) è di 40 minuti circa. Il LightCycler è correlato da un’ampia gamma di kit speci-
Questo strumento è anche in grado di caratterizzare il fici per numerosi parametri (fattore V,II, ApoE, transloca-
prodotto amplificato attraverso l’analisi della curva di zioni ecc) e da diversi kit generici. I primi trovano appli-
melting. Infatti, poiché ogni amplificato ha la propria cazione in campi come l’oncologia, la coagulazione, la
caratteristica temperatura di melting l’uso del Sybr farmacogenomica, la microbiologia , la virologia e gli
green può caratterizzare e di conseguenza confermare la OGM. I kit generici invece, data la flessibilità del LightCy-
specificità del prodotto di PCR rilevando quindi prodotti cler danno all’utilizzatore la piena libertà di personalizza-
aspecifici (per esempio i primer-dimers). re i propri protocolli nelle più svariate aree di interesse.
Fig. 4
Schema di
funzionamento delle
sonde FRET
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Integra 400 ha battuto i record!
Più di 2000 sistemi
installati nel mondo!!!
Integra 400 nasce nel 1999 e in poco più di 3 anni rag- sistemi Integra di Roche Diagnostics per i loro laboratori.
giunge le 2000 unità analitiche installate in tutto il Per festeggiare l’evento, il 2000° Integra 400 è uscito
mondo! Questo risultato ci riempie di orgoglio perchè è il dalla produzione con il “vestito della festa” e noi siamo
riconoscimento tangibile della qualità del nostro sistema. andati a fotografarlo e festeggiarlo insieme allo staff del
Desideriamo esprimere, soprattutto, la nostra gratitudine Laboratorio Analisi dell’Ospedale Ondoli di Angera
nei riguardi dei Clienti che così numerosi hanno scelto i (Varese), dove è stato recentemente installato.
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