La cytométrie en flux

La Cytométrie en flux (CMF)

 La Cytométrie en flux (CMF)
FACS : Fluorescence-activated cell sorting

Mesure (-métrie) des propriétés optiques de cellules (cyto-)

transportées par un liquide vecteur (flux) jusqu’à une source
d’excitation lumineuse (laser).

Le cytomètre enregistre le comportement de la cellule

quand celle-ci passe devant un laser en mesurant:

1- La diffusion de la lumière incidente

2- L’émission de la fluorescence
 Principe
Propulsion des cellules une à une à grande vitesse
dans un flux hydrodynamique

Passage devant une source lumineuse (Laser)

Récupération des données optiques

Adaptée aux cellules en suspensions et donc à

L’analyse de liquides biologiques :

-cellules en cultures
- Sang
- Lavage broncho-alvéolaire
- ascite ou épanchement pleural
- Liquide céphalorachidien
- aspiration médullaire
La cytométrie en flux (CMF)
= Cytogramme
 Mesures des phénomènes de
diffusion lumineuse
- Forward Scatter (FSC) : Le signal est relatif à la taille de la cellule.

- Side Scatter (SSC): Le signal est relatif à la granularité de la cellule.

Applications
granularité Dexamethasone

taille

Réduction de la taille et augmentation de la granularité

 Marquage Annexine V-FITC / IP

> L’iodure de propidium (IP) est un intercalant des acides nucléiques bicaténaires.
La quantité d’IP fixée par chaque cellule est proportionnelle au contenu en ADN.

> un double marquage à l'aide d'un second fluorophore : une annexine marquée par un
fluorochrome (FITC ).

> Les annexines ont la capacité de se fixer au phosphatidylsérines.

> Il est possible de distinguer les cellules apoptiques (marquées seulement à l'annexine)
des cellules nécrotiques (marquées avec l'annexine et l'IP).
Marquage Annexine V-FITC / IP
 L’APOPTOSE
Marquage Annexine V-FITC / IP

Intactes
phospatidylsérines

-Annexine V-FITC

Apoptose

rouge
Nécrose

Iodure de
propidium vert
 Activité Caspase
Cells stained with PE-conjugated active caspase-3 AB
 LE CYCLE CELLULAIRE

Le cycle cellulaire est l'ensemble des phases par lesquelles une

cellule passe entre deux divisions successives.
 LE CYCLE CELLULAIRE

La quantité d’ADN par cellule varie au cours du cycle cellulaire.

G0/G1

G2/M

S
 LE CYCLE CELLULAIRE

Marquage à L’iodure de propidium

La majorité des cellules est en G0/G1, car c’est

l’étape la plus longue. Elles forment ainsi un pic
bien distinct (diploïdie).

G0/G1 Les cellules en phase S ont une quantité variable

d’ADN, ce qui explique leur distribution étalée.

En phases G2 et M, les cellules sont tétraploïdes,

ce qui se traduit par une formation d’un second pic
au double de la valeur de G1.
G2/M
Les cellules "en générale" donnent une
S distribution G0-G1/ S / G2-M autour de 60 / 20 /
20 %.
 Apoptose

Pic sub-G1

Iodure de Propidium
 Apoptose
granularité

Pic sub-G1

Iodure de Propidium