FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES

CARRERA DE INGENIERÍA AMBIENTAL

BIOQUÍMICA AMBIENTAL

ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA
AMILASA SALIVAL
Condori, Medaly; Flores, Claudia; Ormeño, Enzo; Ramírez, Juan

2018
 INTRODUCCIÓN

Los seres vivos pueden considerarse fábricas bioquímicas formadas por

constelaciones integradas de máquinas moleculares que operan con eficiencia,
de todas las clases de máquinas moleculares, las enzimas son sin duda las más
importantes. Sin sus capacidades catalíticas, la mayor parte de las miles de
reacciones bioquímicas que sustentan los procesos vitales ocurrirían a
velocidades muy bajas (Martínez, 2014).
La actividad enzimática es la catálisis de una reacción por parte de una enzima
el sustrato se une al sitio activo de la enzima este proceso es llamado colisión
(Gonzalez, 2013). Algunas enzimas tienen dos sustratos que se unen a
diferentes partes del sitio activo, mientras que los sustratos están unidos al sitio
activo se transforman en sustancias químicas diferentes que son los productos
de la reacción. Los productos se separan del sitio activo dejándolo libre para que
otros sustratos se puedan unir a él (Andrew Allot, 2015)
La actividad enzimática puede ser afectada por muchos factores uno de ellos es
la temperatura que afecta a la tasa de actividad enzimática. La mayoría de las
enzimas tienen una temperatura óptima en la cual se da la mayor rapidez de la
reacción. Ha bajas temperaturas las reacciones enzimáticas suceden muy
lentamente o no ocurren (Lamby, 2013) Al aumentar la temperatura se
incrementa el movimiento molecular resultando más colisiones moleculares. Por
lo tanto la rapidez de las reacciones controladas por enzimas se incrementan al
aumentar la temperatura pero hasta cierta temperatura óptima ya que después
comienza el proceso llamado desnaturalización en el cual se rompen los enlaces
de las estructuras químicas de las enzimas por lo que el sitio activo se modifica
y ya no puede unirse al sustrato lo que provoca la disminución de la actividad
enzimática (Solomon Berg Martin, 2013)
Este trabajo se realizó con la finalidad de cuantificar la actividad enzimática de
la amilasa salival en el sustrato (almidón) y poder hallar sus debidas
concentraciones. Por ello la importancia de este informe es determinar la
actividad de α-amilasa encontrada en la saliva humana. El objetivo del informe
fue reconocer experimentalmente la acción de la amilasa salival y calcular la
actividad enzimática de la amilasa salival a través de un tratamiento
colorimétrico.
MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES:

 Espectrofotómetro VIS, marca Thermo Scientific, modelo Genesys 10S

UV VIS, nro de serie 2D9Q223003
 Beaker 100mL (2)
 Bombillas de succión (3)
 Matraz E. 100mL (2) PYREX
 Pizeta con agua destilada
 Tubos de ensayo (14) PYREX
 Gradillas Almidón 1% (100 mL)
 Cubetas de Esp. (7)
 Parafilm Lugol (gotero)
 Buffer Fosfato pH 7 (100 mL)
 Bagueta Pipetas de 10 mL (2) marca LB-Germany, error ± 0,1 ml
 Pipetas de 20 mL (2) marca LB-Germany, error ± 0,5 ml
 Pipetas de 5 mL (2) marca LB-Germany, error ± 0,1 ml
 Suero Fisiológico (NaCl)

MÉTODOS:
EXPERIENCIA Nº1: PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

Para la preparación de la muestra, se hizo uso de un beaker de 100 mL

al cual se le agrega 60 mL de agua destilada. Se tomó un sorbo de esta,
y se realiza enjuagues dentro de la boca durante cinco segundos,
devolviendo luego al recipiente utilizado para rotular la muestra.
Se tomó dos matraces a los cuales se le vertió los siguientes volúmenes
(Tabla N° 1)
 BLANCO MUESTRA

NaCl 0.025M 10 ml 10 ml

Sustrato de almidón 1% 15 ml 15 ml

Buffer fosfato pH 7 10 ml 10 ml

Agua Destilada 15 ml 13.5 ml

Pre-incubar: 37ºC/5 minutos

Homogeneizar y extraer la muestra correspondiente al tiempo cero

Muestra 1.5 ml

Tabla N° 1: Preparación de la muestra. Elaboración propia

Seguidamente se incubó a 37°C y se extrajo 5ml de cada matraz a los

siguientes tiempos: 1, 2, 4, 6,8, y 10 minutos. A estas muestras extraídas,
incluyendo el tiempo 0, se agregó inmediatamente 7 ml de agua destilada
y tres gotas de solución de Yodo. Se mezcló por inversión y se dejó en
reposo por 10 min y se determinó la absorbancia a una longitud de onda
de 660nm.Posteriormente se realizaron los cálculos; los valores hallados
en el matraz denominado BLANCO no se cambiaron a medida que pasa
el tiempo (no hay enzima), por lo que servirá como control de la cantidad
de almidón inicial en el matraz de MUESTRA. Los cálculos se realizaron
comparando la DO del Blanco, con la DO de la muestra en cada unidad
de tiempo, considerando la concentración del Blanco como la cantidad
inicial de almidón en la muestra. Por último, se graficó la concentración
de almidón versus tiempo. Luego, se restó del Blanco la concentración de
almidón de cada una de las muestras para obtener la cantidad de almidón
 que ha sido digerido. Con estos datos, se graficó la concentración de
almidón digerido versus tiempo. Finalmente, se realizaron restas de la
cantidad de almidón digerido al primer minuto con la de cero minutos, la
de 2 minutos menos la de 1 minuto, la de 4 minutos menos la de 2 minutos
y dividirlo entre dos, la de 6 minutos menos la de 4 minutos y dividirlo entre
dos, y así sucesivamente, para obtener valores de actividad enzimática (o
velocidad enzimática), expresados en cantidad de almidón digerido por
unidad de tiempo. Al final se realizó una tercera gráfica velocidad
enzimática versus tiempo.

RESULTADOS:

Primero agregamos 15 ml de una solución al 1% para luego poder hallar la

concentración del estándar 0.00125 𝑔/𝑚𝑙. Después usando la fórmula de
Lambert-beer: A=a.b.c hallaremos las concentraciones de cada una de las
soluciones preparadas en el experimento (Tabla 2)

Absorbancia Concentración Tiempo

Tubo 1 0.882 0 g/ml 0

Tubo 2 0.742 0.001 g/ml 1

Tubo 3 0.632 0.00089 g/ml 2

Tubo 4 0.632 0.00089 g/ml 4

Tubo 5 0.166 0.00022 g/ml 6

Tubo 6 1.880 0.0026 g/ml 8

Tubo 7 0.130 0.00018 g /ml 10

Tubo 8 -0.056 -0.00007 g/ml 12

Tabla 2: Resultados de las concentraciones del grupo 1

Después de haber hallado la concentración de cada tubo procedemos a hallar

las concentraciones de la enzima dirigida de acuerdo al tiempo transcurrido
(Tabla 3)
 Concentración de enzima dirigida Tiempo

0 g/ml 0

0.00025 g/ml 1

0.00036 g/ml 2

0.00036 g /ml 4

0.00103 g /ml 6

0.00135 g/ml 8

0.00107 g /ml 10

0.00132 g/ml 12

Tabla 3: Concentración de enzima dirigida de acuerdo al tiempo

Finalmente hallamos la velocidad enzimática después de haber transcurrido los

siguientes tiempos (Tabla4). Y por último colocamos la gráfica de absorbancia vs
concentración (Figura 1)

Velocidad de enzima Tiempo

0 0

0.00025 1

0.000305 2

0.00011 4

0.00067 6

0.00004 8

0.000028 10

0.0000208 12
 Tabla 4: Velocidad enzimática de acuerdo al tiempo transcurrido

Figura 1: Grafica de concentración vs absorbancia de los datos del grupo 1 obtenidos

en la tabla1

Para poder comparar nuestros resultados con los del otro grupo 2 tenemos que hallar
sus concentraciones si también presenta un estándar con concentración de 0.00125
g/mL (Tabla 5)

Absorbancia Concentración Tiempo

Tubo 1 0.657 0.00125 g/ml 0

Tubo 2 0.169 0.32 g/ml 1

Tubo 3 0.157 0.29 g/ml 2

Tubo 4 0.110 0.2 g/ml 4

Tubo 5 0.068 0.12 g/ml 6

Tubo 6 0.046 0.087 g/ml 8

Tubo 7 0.029 0.55 g/ml 10

Tabla 5: Resultados de las concentraciones de los tubos del grupo 2

Después de haber hallado las concentraciones de cada tubo del grupo 2,

tenemos que hallar las concentraciones de la actividad dirigida de acuerdo al
tiempo transcurrido (Tabla 6)
 TIEMPO CONCENTRACIÓN DE
ALMIDÓN DIGERIDO

1 0.93

2 0.96

4 1.05

6 1

8 1.16

10 1.19

Tabla 6: Concentración de enzima dirigida del grupo 2 de acuerdo al tiempo

transcurrido.

Finalmente hallamos la
velocidad TIEMPO VELOCIDAD enzimática
después de ENZIMATICA haber
transcurrido los siguientes
tiempos (Tabla 7). Y por último
colocamos la 1 0.93 gráfica de
absorbancia vs concentración
(Figura 2) 2 0.015

4 0.010

6 0.0008

8 0.02

10 0.003
 Tabla 7: Velocidad enzimática del grupo 2 de acuerdo al tiempo transcurrido

Curva de calibración
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Figura 2: Grafica de concentración vs absorbancia de los datos del grupo 2 obtenidos

en la tabla 5

DISCUSIÓN

La saliva es un fluido biológico de gran importancia, ya que, además de mantener

la homeostasis en la cavidad oral, es un medio perfecto para monitorear la salud
en general, debido a que está compuesta de una variedad de proteínas, enzimas,
hormonas, anticuerpos, constituyentes antimicrobianos y citosinas, muchos de
los cuales pasan de la sangre a la saliva, a través de sistemas de transporte intra
y extracelular. Dentro del contenido proteico de la saliva, el componente de
mayor concentración es la α-amilasa, la cual es secretada por el páncreas y por
las glándulas salivales, ambas de carácter enzimático. La variabilidad en la
concentración o actividad de la α-amilasa salival o la pancreática permite
detectar anomalías en los órganos que la producen. La α-amilasa encontrada en
la saliva humana (AASH) es la suma de la secretada por las glándulas salivales
y de la secretada por el páncreas que, por mecanismos de transporte celular,
entra a formar parte de la saliva (Lamby y Gómez ,2013).
Según (Jaramillo, 2013), la mayoría de las proteínas de la saliva, en el medio
oral la AASH posee múltiples funciones, organizadas en tres categorías
biológicas: primero, la función enzimática o la actividad hidrolítica, responsable
de la degradación de los almidones en oligosacáridos, la digestión del glucógeno
y otros polisacáridos (por la hidrólisis de los enlaces glucosúricos α-1,4 de los
oligosacáridos, que liberan glucosa al medio ambiente oral).

Además, las enzimas son biomoléculas de naturaleza proteica que aceleran la

velocidad de reacción hasta alcanzar un equilibrio. Constituyen el tipo de
proteínas más numeroso y especializado y, actúan como catalizadores de
reacciones químicas específicas en los seres vivos o sistemas biológicos.
Muchas de las enzimas no trabajan solas, se organizan en secuencias, también
llamadas rutas metabólicas, y muchas de ellas tienen la capacidad de regular su
actividad enzimática (Lehninger; Nelson y Cox, 2004).

En particular, esta enzima juega un papel importante en niños menores de 6

meses, en los cuales hay retraso (vinculado con el desarrollo) de la producción
de la α-amilasa pancreática. Por otro lado, esta enzima ayuda a digerir los
carbohidratos en pacientes con insuficiencia pancreática. Otra función de la
enzima es que está involucrada en la colonización de bacterias que participan
en la formación de la placa bacteriana (Pérez y Montaño, 2015).
También la presencia de la enzima α-amilasa salival es muy importante en el
proceso de digestión. Pero también es importante saber en qué momento las
glándulas salivales liberan esta enzima a la saliva. La regulación en la liberación
de la α-amilasa salival se lleva a cabo por el sistema nervioso autónomo (que es
el que controla los movimientos involuntarios como la respiración, frecuencia
cardiaca, entre otras), el cual a su vez está dividido en simpático y
parasimpático.

Una manera en que se activa el sistema nervioso autónomo es a través del

estrés, produciendo en los pacientes latidos rápidos del corazón, mareos,
dolores, nerviosismo, agitación, irritabilidad, preocupación, problemas de
concentración y mal humor. Por ello, algunos investigadores proponen que es a
través de una muestra de saliva como se puede detectar cambios en la cantidad
de α-amilasa salival para medir el nivel de estrés. Así como el estrés, la ansiedad
también altera el sistema nervioso autónomo, patologías que pueden ser
detectadas a través de los cambios en la cantidad de α-amilasa salival en los
adolescentes (Pérez y Montaño, 2015).

La actividad de una enzima se mide mediante la determinación de la cantidad de

sustrato formado por unidad de tiempo, en condiciones exactamente definidas
(pH, Tª…) y estrictamente controladas (UJA, Tema5). El aumento de la actividad
enzimática respecto al tiempo estaría influenciado por el punto de vista de la
naturaleza proteica de las enzimas, la velocidad de reacción llega a un máximo
para un pH óptimo. Esto se debe probablemente a cambios de la carga neta
sobre las proteínas, enzimas y quizá el sustrato también, permiten la acción
catalítica más eficaz (Nelson y Cox, 2011) lo cual explicaría los resultados de
concentraciones de la muestra problema en los tubos y la concentración de
almidón digerido respecto al tiempo.
En algunos de los grupos que realizaron el experimento no consiguieron los
resultados esperados, y eso puede ser debido a que, si las enzimas se calientan
existe la posibilidad de que sus enlaces se rompan, es decir ocurre la
desnaturalización. Si una molécula enzimática se desnaturaliza, ya no es capaz
de catalizar reacciones lo que genera una disminución de la actividad enzimática.
Por lo tanto los aumentos de temperatura producen a la vez un incremento y una
disminución de la actividad enzimática (Andrew Allot,2015).Por ello, se niega la
teoría de que, si un líquido se calienta sus partículas reciben energía cinética
esto significa que a temperaturas más altas las moléculas enzimáticas y de
sustrato se mueven rápidamente aumentando las posibilidades de colisiones,
por lo tanto aumenta la actividad enzimática (Andrew Allot, 2015); Por ello, al
haber un exceso de calor las enzimas se desnaturalizan provocando una
disminución de la actividad enzimática.
Los análisis han mostrado que la velocidad de una reacción enzimática es
directamente proporcional a la concentración de la enzima; lo cual es sustentado
por (Toporek ,1984), quien afirma que a mayor concentración de enzimas la
reacción es más rápida. Se sabe desde hace mucho que la velocidad cualquier
reacción química aumenta con la temperatura. Lo mismo ocurre con las
reacciones enzimáticas, pero en vista de la naturaleza proteica de las enzimas,
después de llegar a un máximo, la velocidad vuelve a disminuir por
desnaturalización térmica de la enzima.
Para haber realizado el experimento, fue importante haber conocido la estructura
y propiedad química de los compuestos. De acuerdo a (Toledo; 2014) la
hidrólisis del almidón (desdoblamiento), por acción de la amilasa, se aprovechara
el hecho de que el lugol (específicamente el yodo que contiene el lugol), se
incorpore a la fracción helicoidal del almidón dando un color azul y a medida que
la hidrólisis progresa, el color azul va desapareciendo y cambia a rojizo o café
claro. La baja temperatura inhibe el proceso hasta ser capaz de detenerlo. Un
pH muy ácido o muy alcalino, también puede inhibir el proceso. Por ello es que
se observó que la amilasa que está presente en la saliva, degrada a almidón
existente en la muestra. Sin embargo la actividad enzimática fue lenta debido a
la temperatura a la que se expuso ya que; de acuerdo a (Hernández, Rubén;
2007) Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de
reacción hasta cierta temperatura óptima, ya que después de aproximadamente
45° C se comienza a producir la desnaturalización térmica.

RECOMENDACIONES:

Para este informe de laboratorio reportaron distintos incidentes, entre ellos el

ingreso del reactivo en la propipeta debido a un exceso de presión en ésta,
ocasionando así un pequeño derrame sobre la mesa y contaminando el área de
trabajo.
También presentamos una situación de riesgo al tener un beaker rajado en la
mesa de trabajo ya que se pudo haber roto por completo y haber ocasionado un
accidente.
CUESTIONARIO
1. ¿Cómo se clasifican las enzimas? ¿Por qué?
Ha establecido un sistema por el que todos los enzimas se incluyen en
seis clases principales. Cada clase se divide en varias subclases que, a
su vez, tienen otras subdivisiones. En la actualidad cada enzima se
clasifica y se nombra según la clase de reacción que cataliza. Persisten
muchos nombres comunes, si bien no son demasiado informativos. Así
como también reciben nombres asignados por su descubridor tales como
pepsina, tripsina, etc (IUBMB, 2018)

Clasificacion de la enzimas (EHU, 2013)

a) Oxidorreductasas: Catalizan reacciones redox, cambiando el estado

oxidación de uno de más átomos en una molécula.

b) Transferasas: Transfieren grupos moleculares de una molécula

donadora a una aceptora.

c) Hidrolasas: Catalizan reacciones en las que se producen

rompimientos de enlaces por adición de agua (Hidrólisis).

d) Liasas: Catalizan reacciones en la que se eliminan grupos para formar

un doble enlace.

e) Isomerasas: Catalizan varios tipos de reordenamientos

intramoleculares.

f) Ligasas: Catalizan la formación de enlaces entre dos moléculas de un

sustrato.

2. ¿Por qué el modelo de llave - cerradura entre una enzima y el sustrato se

ha dejado de considerar actualmente?
Como sugirió Emil Fischer (1894) al fundamentar sus resultados dedujo
que la enzima y sustrato, tienen una complementariedad geométrica, es
 decir, sus estructuras encajan exactamente una en la otra, por lo que ha
sido denominado como modelo de la “llave-cerradura”. Sin embargo, en
el sistema no hay espacio para que la enzima transforma al sustrato por
lo tanto es energéticamente desfavorable.

El modelo que ahora es aceptado es el de ajuste inducido, donde ocurren

enlaces débiles y no hay demasiados puntos de conexión, por lo tanto, la
enzima tiene espacio para transformar al sustrato y es energéticamente
favorable.

3. ¿Solo existen enzimas de naturaleza proteica? Explique.

En primer se debe saber que una enzima interviene en todas las

reacciones de la célula, las cuales puede ser de síntesis o degradación.
Estas solo son de naturaleza proteica porque tienen un alto grado de
especificidad, esto se debe a que cada enzima actúa exclusivamente en
una reacción determinada. Además, debemos saber que las proteínas
son materiales que desempeñan la mayoría de funciones que ocurren en
nuestro organismo; por lo tanto, las enzimas realizan una mayoría de
reacciones gracias a su naturaleza proteica (Portón, 2014)

BIBLIOGRAFÍA

- Martinez,Juan ,(2014).Libro electrónico de bioquímica. México:

Universidad Autónoma de Aguascalientes.
- UJA. Universidad de Jaen (2010). Enzimología Clínica: Tema 5
- Andrew Allot (2015).Biologia.Reino Unido:Oxford University Press
- Solomon Berg Martin.(2013).Biologia. Mexico,D.F:Cengage Learning
Editores.
- Lamby Claudia, Gómez Olga,Jaramillo Lorenza,(2014).La a-amilasa
salival: Relación con la caries dental y la salud en general .Colombia:
Universidad Javeriana.
- Toporek, M. (1984) Bioquímica. (3ra. ed.). México Editorial Interamericana
pag. 258,256,257
- Toledo Hector (2014) Hidrolisis del almidón por amilasa salival
- Hernández Ruben,Gil (2007) Fisiología Vegeta .
- Albert Lehninger; David Nelson, Michael Cox (2004) Principios de
Bioquímica .
- Carlos González (2013)Bioquímica: Catalizadores y enzimas
- IUBMB. International Union of Biochemistry and Molecular Biology
(2018) Supplements and Proposed New Enzymes.
- EHU. Universidad del país Vasco (2013) Clasificación de las enzimas
- Emil Fischer (1894) Fundamentos de enzima-sustrato
- Alejandro Porton (2014) Enzimas: catálisis química
- Patricia Lamby (2013) La a-amilasa salival: relación con la caries dental y la
salud en general
-