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Manual de Bioquímica General

Manual de Bioquímica General Agua La vida en la tierra, desde su origen mismo, se ha

Agua

La vida en la tierra, desde su origen mismo, se ha desarrollado siempre con la ayuda del agua, que ha provisto a los organismos desde los principios de su evolución hasta la actualidad, de un ambiente en el que las moléculas que los constituyen se han multiplicado en número y complejidad. En consecuencia, la fisiología de los seres vivos está íntimamente ligada desde sus mismos niveles moleculares a las propiedades de este solvente vital.

A causa de su ubicuidad es considerada, con frecuencia, un líquido inerte, meramente destinado a llenar espacios en los organismos vivos. Pero en realidad, el agua es una sustancia de gran reaccionabilidad, con propiedades poco frecuentes, que la diferencian mucho, tanto física como químicamente, de la mayoría de los líquidos corrientes. El agua posee, elevados puntos de fusión, la temperatura de ebullición más alta, el calor específico de vaporización más alto, el calor de fusión y tensión superficial elevados. Estas propiedades indican que en el agua las fuerzas de atracción entre las moléculas y, por tanto, su cohesión interna, son relativamente elevadas. Los átomos de hidrógeno y oxígeno del agua se acomodan en una orientación no lineal donde el enlace H-O-H forma un ángulo de 104.5°, figura 1.1.

La naturaleza polar del agua da lugar a la atracción electrostática entre sus moléculas. El hidrógeno de una molécula, en virtud de su carga parcialmente positiva, es atraído hacia el oxígeno de otra molécula que a su vez posee una carga parcialmente negativa. De esta manera, cada hidrógeno de una molécula puede ser compartido con los oxígenos de otras moléculas, del mismo modo en que se comparten los electrones de dos átomos, cuándo estos forman una unión covalente, a este tipo de interacción o atracción entre las moléculas del agua se le llama puente de hidrógeno, figura 1.2.

del agua se le llama puente de hidrógeno, figura 1.2. Figura 1.1 Estructura de la molécula

Figura 1.1 Estructura de la molécula de agua. 3

E El hecho de que los puentes de hidrógeno son en realidad protones que se comparten entre dos átomos de oxígeno, y de que el movimiento de estos es más lento que el de los electrones en una unión covalente, es lo que hace que estas

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Manual de Bioquímica General uniones sean más débiles que las covalentes (4.5 kcal/mol vs. 110 kcal/mol,

uniones sean más débiles que las covalentes (4.5 kcal/mol vs. 110 kcal/mol, respectivamente). Debido a que en la molécula e agua el oxígeno tiene situados sus orbitales electrónicos de modo tetraédrico, cada molécula de agua solo puede formar puentes de hidrógeno estables, con las otras cuatro moléculas vecinas que se encuentran en los vértices del tetraedro que forman los orbitales del oxígeno.

A su vez, esta propiedad explica la extraordinaria capacidad del agua para actuar como solvente de los compuestos polares. Los iones ya sean positivos o negativos de una red cristalina son atraídos por las moléculas dipolares del agua y se solubilizan. Una vez en solución, tanto los iones con carga positiva como los de carga negativa, son rodeados por capas protectoras de moléculas de agua, de modo que disminuye la interacción entre estos iones con cargas opuestas.

la interacción entre estos iones con cargas opuestas. Figura 1.2 Puentes de hidrógeno entre dos moléculas

Figura 1.2 Puentes de hidrógeno entre dos moléculas de agua. 3

Los ejemplos de los compuestos polares que disuelven fácilmente en agua son moléculas orgánicas pequeñas que contienen uno o más átomos electronegativos (tales como oxígeno o nitrógeno), incluyendo los alcoholes, las aminas, y los ácidos carboxílicos.

La atracción entre los dipolos de estas moléculas y del dipolo del agua hace que tiendan a disolver. Las sustancias iónicas y polares son referidas como hidrofílicas debido a esta tendencia. Los hidrocarburos son no polares. Consecuentemente, las moléculas no polares no disuelven en agua y son referidas como hidrofóbicas, los hidrocarburos en particular tienden a secuestrarse desde un ambiente acuoso. Un líquido no polar forma un sistema de dos capas con el agua; un ejemplo es una capa de petróleo. Es posible que una sola molécula tenga porciones polares y no polares. Las sustancias de este tipo se llaman amfipáticas. Un compuesto tal como estos en la presencia del agua tiende a formar las estructuras llamadas las micelas, en las cuales los grupos principales polares están en contacto con el ambiente acuoso y las colas no polares se aíslan del agua.

Otra de las propiedades extraordinarias del agua que la hacen un medio ideal para los organismos vivos es su capacidad calorífica específica, (el número de calorías requeridas para elevar la temperatura de 1 g de agua de 15° a 16° C) que es igual a 1.0 y es notablemente alta entre los varios disolventes con enlaces de hidrógeno. Cuanto mayor sea el calor especifico de una sustancia, menor será el cambio de temperatura que resulte cuando dicha sustancia absorba una cantidad dada de calor. De este modo, las propiedades del agua la hacen apropiada para mantener relativamente

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Manual de Bioquímica General constante la temperatura de un organismo vivo. El calor de vaporización del

constante la temperatura de un organismo vivo.

El calor de vaporización del agua es muy alto. Expresado como el calor específico de vaporización (calorías absorbidas por un gramo de agua vaporizada), el valor para el agua es de 540 en su punto de ebullición e incluso mayor a temperaturas más bajas. Este alto valor resulta de gran utilidad para que los organismos vivos mantengan constante su temperatura ya que es posible disipar una gran cantidad de calor por vaporización del agua.

El alto calor de fusión del agua reviste importancia en la estabilización del medio biológico. Aunque en las formas superiores de vida rara vez se congela el agua, el calor desprendido por ésta al congelarse es un factor importante para disminuir la caída de temperatura de un cuerpo de agua durante el invierno. Así, 1 g de agua al congelarse a 0° C, debe ceder 80 veces tanto calor como el que pierde al disminuir de 1 a 0° C exactamente antes de congelarse.

El agua se expande al solidificarse, y por tanto el hielo es menos denso que el agua. Solo otras pocas sustancias se expanden al congelarse. Si el hielo fuera más pesado que el agua, se hundiría. Esto significa que los océanos, lagos y corrientes de agua se congelarían del fondo hacia la superficie, y una vez congelados, sería extremadamente difícil que se fundieran. Obviamente, una situación así no permitiría que dichos cuerpos

de agua constituyeran el hábitat de muchas formas vivientes, como efectivamente sucede. Lo que sucede en la realidad es que el agua líquida, más caliente, se va al fondo de los lagos y el hielo se mantiene sobre la superficie, donde el calor proviene del medio externo lo alcanza y lo funde. Otras propiedades del agua tales como su alta tensión superficial y su elevada constante dieléctrica son muy importantes desde el punto de vista de la biología.

Ionización del Agua.

Durante la interacción con puentes de hidrógeno entre las moléculas de agua, existe la tendencia a que algunas cedan totalmente sus protones a las moléculas vecinas y que éstas a su vez cedan sus protones a otras. Cuando esto sucede, aparecen cargas reales en las moléculas, una carga neta negativa en aquellas que cedieron sus protones, y una carga neta positiva en las que ganaron los protones. De acuerdo con la teoría de J. N. Brönsted y T. M. Lowry, en la que se conceptúa a un ácido como una molécula que es capaza de donar protones, y una base como una molécula que es capaz de aceptar protones, la ionización del agua, tal como se describe arriba, da lugar a dos especies iónicas de la molécula de agua: el ión hidronio, H 3 O + que funciona como un ácido, pues es capaz de donar un protón y el ión hidroxilo OH - que es una base, pues es capaz de aceptar un protón.

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Manual de Bioquímica General 2H 2 O H 3 O + + OH - Experimentalmente se

2H 2 O

Manual de Bioquímica General 2H 2 O H 3 O + + OH - Experimentalmente se

H 3 O +

+

OH -

Manual de Bioquímica General 2H 2 O H 3 O + + OH - Experimentalmente se

Experimentalmente se ha determinado que en un litro de agua pura a 25° C se mantiene una concentración promedio de 1.0X10 -7 molar de iones hidroxilo. Aunque no existen realmente protones libres (H + ) en el agua, para facilitar la comprensión del proceso de ionización del agua, consideraremos la disociación de ésta en:

H 2 O

agua, consideraremos la disociación de ésta en: H 2 O H + + OH - Al

H +

+

OH -

Al producto de la concentración de los iones hidrógeno por la de los iones OH - se le da

Kw = (1.0X10 -7 ) X (1.0X10 -7 ) = 1.0X10 -4 .

La constante Kw, expresa el producto de las concentraciones de iones H + y OH - que, por definición, no cambia.

El nombre de producto iónico del agua, kw y tiene entonces el siguiente valor.

En consecuencia, cuando una solución es ácida, la concentración de protones es relativamente alta; pero la concentración de hidroxilos disminuye en una cantidad igual, para que el producto de las concentraciones de H + y de OH - se mantenga constante. En el caso de una solución alcalina, la situación se invierte, disminuyendo la concentración de protones y aumentando en forma correlativa la concentración de hidroxilos.

Como las concentraciones que se manejan son tan pequeñas, aun expresadas, matemáticamente como submúltiplos de 10 (potencias negativas de 10), su manejo puede resultar "complicado" por lo que se utiliza el logaritmo negativo de base 10 para expresarlo. Esto es lo que se conoce como "p"

y referido a la concentración de H + se

denomina pH. El pH corresponde al logaritmo negativo de la concentración de hidrogeniones, o sea:

pH = -log [H + ]

o bien,

pH = log 1/ [H + ]

Nótese que la "p" es minúscula, ya que se trata de una sigla que indica potencial.

Si

concentración de protones es de 1x10 -7 , se tiene que:

la

se

considera

que

el

valor

de

pH = log 1/(1X10 -7 ) =log1-Iog 1x10 -7 = 0-(-7) = 7

Es a partir del agua que se define la escala de

pH, por lo cual se habla de soluciones ácidas cuando tiene valores de concentración de hidrogeniones mayores de 1x10 -7 o pH

menores de 7 y de soluciones alcalinas con concentraciones de hidrogeniones menores de 1x10 -7 y pH mayores a 7.

Como la máxima concentración posible de

hidrogeniones en solución acuosa es de 1.0

M, el valor de pH mínimo es 0.0 ya que el log 10

1 es 0. En el otro extremo, cuando la concentración de H + es la mínima (1x10 -14 ) el pH es de 14. El punto de neutralidad es de pH = 7 o en concentración de H + de 1 x 10 -7 . EI rango de pH para indicar la acidez de una

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Manual de Bioquímica General solución va del 0 al 7, mientras que el correspondiente a la

solución va del 0 al 7, mientras que el

correspondiente a la basicidad o alcalinidad de

una solución va del 7 al 14.

Ácidos y bases.

La ecuación para la disociación o ionización

de un ácido (HA) en disolución acuosa diluida

implica la transferencia de un protón desde el

ácido al agua, la cual puede actuar como

aceptor del protón y forma el ácido H 3 O + :

HA + H 2 O

protón y forma el ácido H 3 O + : HA + H 2 O H

H 3 O + + A -

Cada base conjugada posee una afinidad

característica para su protón; los que

muestran una afinidad elevada por el protón

son ácidos débiles y solo se disocian muy

ligeramente, los que muestran una afinidad

pequeña son ácidos fuertes y pierden iones

H + con facilidad.

La tendencia de cualquier ácido a disociarse

viene dada por su constante de disociación:

Ka = [H + ][A ] [HA]

Constituye también una convención, en

bioquímica, emplear las constantes de

disociación basadas en la medida analítica de

las concentraciones de los reactivos y de los

protones, en unas determinadas condiciones

experimentales, es decir, para una

concentración total y fuerza iónica

determinadas y especificando los demás

solutos. Esta constante recibe el nombre de

constante de disociación aparente y se

designa por K' o constante de disociación

termodinámica empleada por los químicos-

físicos, la cual esta corregida por la desviación

del sistema de conducta ideal provocada por

factores tales como la concentración y la

fuerza iónica. Cuanto más sea grande la Ka

mayor es la tendencia del ácido a disociarse;

es decir más fuerte es el ácido. La fuerza de

los ácidos generalmente se expresa en

función del valor de pKa en donde:

pKa = - logKa

Dado que pKa es el logaritmo negativo de Ka

un valor numéricamente pequeño de pKa

corresponde a un ácido fuerte y un valor

numéricamente grande corresponde a un

ácido débil.

Indicadores ácido-básicos.

El pH de una disolución puede determinarse

mediante el empleo de colorantes indicadores,

la mayor parte de las cuales son ácidos

débiles (se designan como HInd). Tales

indicadores se disocian de acuerdo con el

equilibrio:

Hlnd

indicadores se disocian de acuerdo con el equilibrio: Hlnd H + + Ind - Supongamos que

H + + Ind -

Supongamos que la especie Hlnd es incolora y

que la especie Ind - es coloreada. La posición

de equilibrio de esta disociación y por tanto, la

cantidad de luz absorbida por la especie Ind - a

su longitud de onda característica, es

determinada por la concentración de

hidrógeno del medio. En una disolución

fuertemente ácida, el equilibrio se desplaza

hacia la izquierda y se absorberá poca luz a la

longitud de onda del máximo de absorción de

Ind - . En una disolución básica, la especie Ind -

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Manual de Bioquímica General se halla favorecida, ya que el exceso de iones OH - reacciona

se halla favorecida, ya que el exceso de iones OH - reacciona con los iones H + para formar agua, impulsando el equilibrio hacia Ind - . En este caso se absorberá mucha luz.

Tampones.

Los fluidos intracelulares y extracelulares de los organismos vivos contienen pares conjugados ácido-básicos, los cuales actúan como tampones al pH normal de dichos fluido.

El tampón intracelular más importante es el par conjugado ácido-básico H 2 PO 4 - / HPO 4 (pK' = 7,2). Los fosfatos orgánicos, tales como la glucosa-6-fosfato y el ATP, contribuyen también a la capacidad de tamponamiento en la célula.

2-

El principal tampón extracelular en la sangre y en los fluidos intersticiales de los vertebrados es el sistema tampón del bicarbonato.

Puesto que por la ley de Henry la solubilidad de un gas en agua es proporcional a su presión parcial, el pH de su sistema tampón constituido por el bicarbonato es función de la presión parcial del CO 2 en la fase gaseosa situada sobre la disolución tampón

El rasgo distintivo del sistema tampón del bicarbonato lo constituye que el CO 2 sea el producto final de la combustión aerobia de las moléculas combustibles en los vertebrados, que se expulsa en último término por los pulmones.

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Manual de Bioquímica General UNIVERSIDAD VERACRUZANA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GENERAL PRÁCTICA No. 1 PREPARACIÓN DE

UNIVERSIDAD VERACRUZANA LABORATORIO DE BIOQUÍMICA GENERAL

PRÁCTICA No. 1

PREPARACIÓN DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS

Tiempo de práctica: 2 Horas.

Objetivos:

Aprender el uso de la ecuación de Henderson- Hassebalch.

Experimentar y entender cómo se comporta un

sistema amortiguador de pH.

Preguntas prelaboratorio:

1. ¿Qué es el pKa?

2. ¿A partir de que parámetro podemos

calcular el pKa?

3. ¿Qué es una solución buffer?

4. ¿Para qué se utiliza una solución

buffer?

5. ¿En los organismos podemos

encontrar amortiguadores?

Fundamento:

Resulta muy útil poder relacionar el pH de la

solución de un ácido débil con la constante de

disociación de este.

K = [H + ] [A - ]

[HA]

A fin de lograr esta relación se puede

reordenar la ecuación para la constante de

disociación del ácido HA:

[H

+ ]=K a

[HA]

[A]

Si se toman logaritmos negativos de ambos

términos, encontraremos:

- log 10 [H + ] = - log 10 Ka

- log 10 [HA]

[A]

De manera semejante a la forma en que se

define pH (pH = log 10 1 / [H + ] = - log 10 ) por

definición pKa es:

1

pKa = log 10 Ka = −log 10 Ka

sus

equivalentes en la ecuación reordenada de la

disociación del ácido HA, tendremos:

Si

se

sustituyen

pH

y

pKa

por

pH = pKa − log 10

[HA]

[A]

Finalmente, se puede cambiar el signo al

logaritmo en la ecuación invirtiendo la relación

[HA] / [A], porque log 10 [HA] / [A] = + log 10

[A - ] / [HA] y entonces tenemos:

pH = pK + log 10

[A ]

[HA]

Esta es la ecuación de Henderson-

Hasselbach, que establece la relación entre el

pH de la solución acuosa de un ácido débil, su

pK y las cantidades de la forma disociada y no

disociada.

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Manual de Bioquímica General Las soluciones buffer por otra parte contienen un ácido débil y su

Las soluciones buffer por otra parte contienen

un ácido débil y su base conjugada o una base

débil y su ácido conjugado en donde el pH es

igual o cercano a su valor de pKa, la ecuación

de Henderson-Hasselbach puede ser usada

para realizar los cálculos necesarios para su

preparación. 20

Material y procedimiento experimental:

Material de laboratorio:

2

Vasos de precipitados de 100 mL

2

Vasos de precipitados de 150 mL

1

Pipeta graduada de 10 mL

1

Pipeta graduada de 5 mL

1

Pipeta graduada de 1 mL

1

Matraz volumétrico de 100 mL

1

Bureta

1

Agitador magnético

1. Escojer el buffer de tal modo que su pKa

esté muy próximo al pH al cual se va a

trabajar (generalmente, entre 6 y 8). Si se

espera que el pH va a descender durante el

proceso bioquímico, escójase el buffer cuyo

pKa sea algo menor que el pH inicial de

trabajo; si el pH va a aumentar, el pKa debe

ser algo mayor que el pH inicial.

2. Las sustancias que se van a emplear deben

ser hidrosolubles y con un alto grado de

pureza, a fin de evitar efectos o reacciones

espureas.

3. No deben usarse en la elaboración del

buffer, sustancias citotóxicas o que tengan

acción inhibidora de enzimas.

4. Deben ser sustancias química y

enzimáticamente estables.

5. Si las sustancias empleadas interactúan

Piceta

con cationes o aniones o tienen efectos

Reactivos:

salinos, estos efectos deben ser mínimos y

(Para su preparación véase la preparación de soluciones).

Glicina 0.025 M pH 2.0

Lisina 0.025 M pH 2.0

Ácido aspártico 0.025 M pH 2.0

NaOH 1 M

Equipo:

Potenciómetro

a) Preparación de Soluciones Amortiguadoras:

La selección de una solución reguladora

adecuada para un determinado proceso

bioquímico, debe ajustarse a los siguientes

criterios:

bien conocidos. Si forman complejos con

iones, estos deben ser hidrosolubles.

6. No deben absorber luz en las regiones

visibles y ultravioleta.

7. Deben tener adecuada "capacidad buffer"

en el rango de pH requerido. Para cubrir

estos y otros requerimientos especiales,

existe una gran diversidad de reguladores

para uso en bioquímica, algunos no

contienen cationes minerales.

En esta práctica, cada grupo o alumno

recibirá un problema especial consistente en

la preparación de una solución buffer, de pH y

concentración determinados y que llene

ciertos requisitos que se indicaran en cada

Manual de Bioquímica General

Manual de Bioquímica General caso. Deberá: a) efectuar los cálculos correspondientes para saber que sustancias debe

caso. Deberá: a) efectuar los cálculos correspondientes para saber que sustancias debe emplear y que cantidad de cada una de ellas. b) determinar la capacidad buffer de la solución que prepara.

Procedimiento:

Al recibir su problema, estudie las condiciones que se piden y busque un buffer cuyo pKa sea adecuado y aplicando la ecuación de Henderson-Hasselbach, calcule las cantidades que debe pesar de ácido y base conjugada, para preparar 100 ml de disolución.

Pesar las cantidades que calculó o mida los volúmenes adecuados y disuelva. Aforar aproximadamente a 75 mL.

Transfiera esta disolución a un vaso de precipitados de 150 ml y verifique el pH en un potenciómetro previamente calibrado y ajustar a la temperatura a las condiciones de trabajo. Si el pH no es exactamente el pedido, ajústelo agregando el componente (ácido o base), que sea necesario para subir o bajar el pH hasta el valor requerido.

Aforar a 100 mL con agua destilada y verifique nuevamente el pH.

Determinación de la capacidad buffer. La capacidad buffer es la cantidad de base fuerte requerida para alterar el pH de la disolución reguladora, en una unidad de pH:

C.B=

d b

dpH

Siendo dpH el incremento de pH resultante de la adición de un volumen d b de base.

Ponga su disolución en un vaso, introduzca los electrodos del potenciómetro y disponga una bureta con disolución de NaOH 1 N y un agitador magnético, dentro del vaso. Determine el pH inicial.

Ponga el agitador en marcha sin que este golpee los electrodos, y agregue un volumen de NaOH 1 N medido exactamente en la bureta (1 mL. Anote el pH resultante. Repita las adiciones de base, en volúmenes iguales (1 ml) y anote los valores de pH correspondientes, hasta obtener por lo menos cinco lecturas.

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Manual de Bioquímica General Hoja de resultados: Nombre: a) Preparación de soluciones amortiguadoras : 1. Problema

Hoja de resultados:

Nombre:

a) Preparación de soluciones amortiguadoras:

1.

Problema N°

mL.

pH requerido

Grupo:

Fecha:

Concentración molar

2. Cálculos efectuados.

3. Cantidades por pesar o medir de A - y HA.

4. ¿Cuál es el pH de la solución inicial?

5. ¿Cuál es el pH final de la solución?

b) Determinación de pKa:

mL de NaOH agregados

pH

obtenido

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6. ¿Cuál es la capacidad buffer?

Discusión de resultados

Conclusión:

Cuestionario:

Volumen final

Manual de Bioquímica General

Manual de Bioquímica General 1. Indica el pKa de los siguientes ácidos: a) Ácido pirúvico. b)

1. Indica el pKa de los siguientes ácidos:

a) Ácido pirúvico.

b) Ácido láctico.

c) Ácido benzoico.

d) Ácido oxálico.

e) Ácido succínico.

f) Ácido carbónico.

g) Ácido cítrico.

h) Ácido fosfórico.

2. Indique el nombre completo, pKa y peso molecular (o fórmula) de los siguientes

compuestos usados como reguladores de pH en bioquímica: TRIS; CAPS; MES;

TES y Tricina.

3. ¿Para qué valores de concentración de los componente de un buffer, tiene este la

máxima capacidad buffer?

4. ¿Por qué los aminoácidos actúan como reguladores del pH?

5. Define ¿qué es la capacidad buffer?

6. Identifica los ácidos y bases conjugadas de los siguientes pares de sustancias

a) (CH 3 ) 3 NH + / (CH 3 ) 3 N

b) + H 3 N-CH 2 COOH / + H 3 N-CH 2 COO -

c) + H 3 N-CH 2 COO - / H 2 N-CH 2 -COO -

d) - OOC-CH 2 -COOH / - OOC-CH 2 -COO

e) - OOC-CH 2 -COOH / HOOC-CH 2 -COOH

7. ¿Cómo podrías preparar 1 litro de un buffer de fosfato 0.05 M. a pH 7.5 usando

K 2 HPO 4 cristalino y una solución de HCl 1M?

Referencias bibliográficas:

Libro: apellidos autor; Nombre. (Año).Titulo. Editorial.Edición.País.Página consultada.

Página de internet: Autor o responsable.Título. Fecha de última actualización.Liga:

http://www.