29-09-2010

06-10-2010
08-10-2010
Warszawski Uniwersytet Medyczny
Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej

I Wydział Lekarski
II Wydział Lekarski
ĆWICZENIE 2

DIAGNOSTYKA MIKROBIOLOGICZNA – METODY MIKROSKOPOWE

Tematyka:
1. Znaczenie mikroskopii w mikrobiologii.
2. Metody obserwacji mikroskopowej bakterii.
3. Preparaty mikroskopowe. Rola preparatu bezpośredniego.
4. Metody barwienia komórek bakteryjnych.
5. Rodzaje mikroskopów i ich zastosowanie w diagnostyce mikrobiologicznej.

Do wykonania: (rysunki wszystkich mikroskopowanych preparatów)

1. Wykonanie preparatu przyŜyciowego z hodowli grzybów Candida albicans.
2. Wykonanie preparatu barwionego metodą Grama z hodowli bakterii.
3. Obserwacja mikroskopowa bakterii w gotowych preparatach barwionych:

metodą Grama: Gram-ujemne (róŜowe) – pałeczka okręŜnicy Escherichia coli
i Gram-dodatnie (fioletowe) – gronkowce (Staphylococcus aureus),
paciorkowce (Streptococcus pyogenes), laseczki (Clostridium perfringens)

metodą Ziehl-Neelsena – prątki gruźlicy (Mycobacterium spp. – prątki
czerwone na niebieskim tle preparatu

metodą Neissera – maczugowce (Corynebacterium diphteriae – ziarnistości
polifosforanowe fioletowe, komórki Ŝółte)
4. Obserwacja mikroskopowa grzybów w gotowych preparatach barwionych:

metodą Grama – Gram-dodatnie – fioletowe Candida albicans

barwienie w celu obserwacji otoczek – preparat tuszowy Cryptococcus
neoformans – jasne otoczki na ciemnym tle preparatu

mgr S. Jarzynka
Barwienie komórek bakterii metodą Grama:
1. Preparat przyŜyciowy w kropli soli fizjologicznej
2. Wysuszenie i 3-krotne utrwalenie preparatu w płomieniu palnika – zabicie bakterii i
przytwierdzenie do szkiełka.
3. Fiolet krystaliczny – barwnik - 1-2 minuty
4. Spłukać wodą
5. Płyn Lugola – utrwalacz – 1 minuta
6. Spłukać wodą
7. Alkohol etylowy z acetonem – odbarwiacz – 30 sekund – etap róŜnicujący bakterie
Gram dodatnie i Gram ujemne
8. Spłukać wodą
9. Fuksyna wodna/safranina – barwnik – 15-30 sekund
10. Spłukać wodą
11. Obserwacja przy uŜyciu olejku immersyjnego pod obiektywem immersyjnym –
powiększenie x1000.

Barwienie metodą Ziehl-Neelsena:

1. Preparat utrwalony zalać roztworem fuksyny karbolowej
2. Ogrzewanie preparatu w płomieniu palnika do pierwszej pary, przez ok. 2-3 minuty
3. Po ostudzeniu zlać barwnik i spłukać preparat wodą
4. Odbarwić kwaśnym alkoholem
5. Zlać wodą
6. Dobarwić rozcieńczonym błękitem metylenowym przez 1-2 minuty
7. Zlać wodą
8. Wysuszyć i obserwować przy uŜyciu olejku immersyjnego pod obiektywem
immersyjnym – powiększenie x1000

Barwienie metodą Neissera:

1. Utrwalić preparat
2. Zmieszać 2 części błękitu metylenowego z 1 częścią fioletu krystalicznego
3. Barwić mieszaniną barwników przez 5 minut
4. Zlać barwnik
5. Dobarwić chryzoidyną przez 15 sekund
6. Spłukać wodą
7. Wysuszyć i obserwować przy uŜyciu olejku immersyjnego pod obiektywem
immersyjnym – powiększenie x1000
mgr S. Jarzynka
 Rola preparatu bezpośredniego w diagnostyce mikrobiologicznej

Preparat bezpośredni z materiału klinicznego wykonujemy w następujących przypadkach:

Materiały, które powinny być bezwzględnie jałowe u osób zdrowych:
1. Osad płynu mózgowo-rdzeniowego – preparat barwiony metodą Grama lub błękitem
metylenowym – ocena etiologii zakaŜenia ośrodkowego układu nerwowego. Obecność
granulocytów świadczy o etiologii bakteryjnej: ziarenkowce: Gram ujemne –
Neisseria menigitidis, Gram dodatnie – Streptococcus pneumoniae, pałeczki Gram
ujemne – Haemophilus influenzae.
2. Materiał śródoperacyjny, wycinki tkanek, aspirat, płyn z otrzewnej, wymazy z rany
(szczególnie przy podejrzeniu zgorzeli gazowej) – preparat barwiony metodą Grama –
diagnostyka w kierunku zakaŜenia bakteryjnego lub grzybiczego.
3. Krew – preparat barwiony metodą Grama wykonany z podłoŜa płynnego – butelka
BactAlert.
4. Wymaz z worka spojówkowego – preparat barwiony metodą Grama, preparat
barwiony metodą Giemzy – diagnostyka w kierunku chlamydii.
5. Mocz – nie robimy z wyjątkiem – preparat barwiony metodą Grama:
- z osadu - ocena obecności granulocytów
- z pełnego moczu – ocena ilości komórek bakteryjnych, tzn. 1 komórka bakteryjna w
kaŜdym polu widzenia świadczy o obecności >105 jednostek wzrostowych CFU
bakterii w 1 ml.

Materiały, pochodzące z miejsc bytowania fizjologicznej mikroflory:

1. Materiał ze zmian skórnych i tkanki podskórnej – preparat barwiony metodą Grama –
ocena prawidłowości pobrania materiału, o czym świadczy obecność komórek
zapalnych (świadczą o toczącym się zakaŜeniu) i komórek nabłonkowych (materiał
nie został pobrany z miejsca zakaŜenia, a prawdopodobnie ze skóry).
2. Wydzielina ropna - preparat barwiony metodą Grama, preparat barwiony metodą
Giemzy – diagnostyka w kierunku chlamydii.
3. Plwocina – preparat barwiony metodą Grama – ocena prawidłowości pobrania
materiału , o czym świadczy obecność komórek nabłonkowych i granulocytów.
Plwocina: nabłonki <10 w polu widzenia, granulocyty > 25 w polu widzenia.
Ślina: nabłonki >25 w polu widzenia, granulocyty <10 w polu widzenia.
4. Gardło - nie robimy z wyjątkiem - jedynie w przypadkach:
- podejrzenia zakaŜenia błonicą (Corynebacterium diphteriae) - preparat barwiony
metodą Grama (pałeczki Gram dodatnie) lub metodą Neissera (obecność ziarnistości)
- podejrzenia anginy Plauta-Vincenta - preparat barwiony metodą Grama – Gram
ujemne polimorficzne pałeczki Fusobacterium, Gram ujemne krętki i wrzecionowce,
- preparat barwiony metodą Giemzy - krętki
- podejrzenia zakaŜenia grzybiczego (droŜdŜopodobne, pleśniowe) - preparat barwiony
metodą Grama – Gram dodatnie
5. Wydzielina z pochwy, cewki moczowej – preparat barwiony metodą Grama – ocena
stopnia czystości pochwy, diagnostyka w kierunku rzeŜączki.
6. Kał – nie robimy z wyjątkiem – jedynie w przypadkach zakaŜeń u noworodków i
małych dzieci oraz diagnostyki w kierunku zakaŜenia Campylobacter spp. i Vibrio
spp.

Diagnostyka w kierunku gruźlicy:

1. Plwocina, popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL), bronchoaspirat, popłuczyny
Ŝołądkowe, płyn z opłucnej, płyn mózgowo-rdzeniowy – preparat barwiony metodą
Ziehl-Neelsena.
mgr S. Jarzynka