CLASES Y MÉTODOS DE COLORACIÓN

PRACTICA N°2

GRUPO: MAYUJAKE

MARIA CAMILA ASSIA ORTIZ

YUCELYS CONTRERAS SINCELEJO

JAVIER RUIZ CONTRERAS

KEVIN ALMANZA HERNANDEZ

DAVID GUEVARA BENITEZ

CARLOS GARCIA MOGOLLON

INGENIERO DE ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE SUCRE

FACULTAD DE INGENIERIA

PROGRAMA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

SINCELEJO-SUCRE

2015.

Laboratorio de Microbiología Industrial, Universidad de Sucre 1

 RESUMEN

Esta práctica consiste en aplicar las clases y métodos de coloración para la

identificación y caracterización de bacterias en el laboratorio de Microbiología. La
observación puede realizarse por diferentes procedimientos como son la
observación directa de microorganismos “in vivo” o el tratamiento mediante
tinciones. Estos procesos van dirigidos a incrementar el contraste y por
consiguiente a optimizar el resultado. Se realizó tinción Simple para identificar
morfológicamente las bacterias y tinción Diferencial para observar los dos tipos de
división en Gram positivas y Gram negativas y establecer diferencias entre estas;
posteriormente se describieron los pasos a seguir para una correcta tinción de las
muestras y su respectiva observación en el microscopio.

Palabras Claves: Tinción, identificación, Gram positivas, Gram negativas,

Diferencial, Simple.

1. INTRODUCCIÓN

Las bacterias se observan mediante microscopio ya que son microorganismos. Su

observación morfológica sin teñir es confusa debido a que sus células y
estructuras no pueden diferenciarse.

El estudio microscópico de las bacterias se facilitaría notablemente al tratarlas con

colorantes o tintes, haciendo una mejor apreciación de la forma, estructuras
celulares y tamaño relativo de los microorganismos teñidos. Se recomienda antes
de la tinción fijar la muestra para que las células a observar no se pueden mover y
así podemos obsérvalas en un solo lugar de la placa que montamos.

Para teñir los microorganismos se dispone de un gran número de compuestos

orgánicos coloreados (colorantes). En general son un tanto complejos en su
estructura molecular. Una clasificación práctica de estos compuestos es de
acuerdo a su comportamiento químico, es decir, ácida, básica y neutra, de tal
forma que los colorantes ácidos tiñan a los componentes celulares básicos y los
colorantes básicos tiñan los componentes celulares ácidos.

Las coloraciones pueden ser simples y diferenciales, debido a que la morfología

de las bacterias es amplia y dependiendo que queramos reconocer, diferenciar
utilizarnos un tipo de tinción especifica.

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2. OBJETIVO

GENERAL

• Aplicar los métodos de coloración para el reconocimiento de bacterias.

ESPECIFICOS

• Identificar las diferentes morfologías bacterianas mediante la observación

microscópica como primer parámetro de identificación microbiológica

• Realizar coloraciones simples y diferenciales mediante las técnicas

convencionales de tinciones bacterianas para una caracterización celular
adecuada.

• Adquirir destreza en la diferenciación de bacterias Gram positivas y Gram

negativas mediante la tinción de Gram.

3. PROCEDIMIENTO

 Diagrama de flujo.

Se cubrió el frotis con

el colorante ,azul de
metileno, durante 2
minutos.
Se eliminó el exceso
de colorante

coloración simple ( azul

de metileno)

se dejó secar al aire y se

observaron resultados
realizar un frotis
CLASES Y de un cultivo
METODOS DE bacteriano y fijar
COLORACIÓN la muestra a la
llama

se cubrió el frotis con

los colorantes: cristal
violeta (1 min),
coloración diferencal solución de lugol
(tinción de Gram) (1min), alcohol-cetona
(15 s) y safranina
(30s)

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4. RESULTADOS

Tinción simple: se observaron bacterias redondas y ovaladas (fig.1)

Morfología
celular

Figura 1: bacterias observadas con objetivo 40x

TINCION DIFERENCIAL: En esta tinción se observaron Bacterias Gram negativas

y Gram positivas teñidas de rojo y azul respectivamente (fig.2)

Pequeñas coloraciones
azules y rojas.

Figura 2: bacterias enfocadas a resolución 40x

5. ANALISIS DE RESULTADOS

Tinción simple

Este tipo de tinción se basa en la afinidad del colorante por los componentes
celulares. Utiliza un solo colorante (azul de metileno) usado para destacar el
microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras celulares
básicas; preferentemente es de tipo básico y contiene un cromógeno (compuesto
que da color al tinte) con carga positiva, ya que la pared celular de las bacterias
posee componentes con carga negativa que atraen y enlazan el cromógeno. Se
utilizan solamente para incrementar el contraste; todas las células absorberán el
colorante y quedarán teñidas del mismo color. Por tanto, la tinción simple mejora
la observación de la célula completa. [1]

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TINCION DIFERENCIAL

Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen, primero con una
solución de Cristal Violeta (otros colorantes básicos no son tan efectivos) y son
lavadas después para quitar el exceso de colorante. En este estado, todas las
células, tanto las Gram positivas como las Gram negativas, están teñidas de azul.
El portaobjetos se cubre entonces con una solución de Lugol (yodo-yoduro
potásico). El ingrediente activo aquí es el I2; el KI simplemente hace soluble el I2
en agua. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en agua con el
Cristal Violeta. De nuevo tanto las células Gram positivas como las Gram
negativas se encuentran en la misma situación. Se lleva a cabo después la
decoloración, usando una mezcla de Alcohol - Cetona, sustancias en las que es
soluble el complejo I2-cristal violeta. Algunos organismos (Gram positivos) no se
decoloran, mientras que otros (Gram negativos) lo hacen. La diferencia esencial
entre esos dos tipos de células está por tanto en su resistencia a la decoloración;
esta resistencia se debe probablemente al hecho de que en el caso de bacterias
Gram negativas, la mezcla de alcohol/acetona es un solvente lipídico y disuelve la
membrana exterior de la pared de la célula (y también puede dañar la membrana
citoplasmática a la que se une peptidoglicano). La delgada capa de peptidoglicano
es incapaz de retener el de complejo cristal violeta-yodo y la célula se decolora.
Las células Gram positivas, a causa de sus paredes celulares más espesas
(tienen más peptidoglicano y menos lípido), no son permeables al disolvente,
provocando que el de complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la
pared celular. Después de la decoloración las células Gram positivas son todavía
azules, pero las Gram negativas son incoloras. Para poner de manifiesto las
células Gramnegativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un
colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina básica. Después de la
coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las
Gram positivas permanecen azules. [2]

6. CONCLUSIÓNES

 Se identificó mediante coloración simple la forma de las bacterias presentes en

la muestra.
 Se realizaron coloraciones simples y diferenciales mediante las técnicas
convencionales de tinciones bacterianas y se logró observar una
caracterización celular adecuada.

 Se determinó si las bacterias de la muestra eran Gram positivas o Gram

negativas.

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7. CUESTIONARIO

a. Describa el fundamento de la tinción de Gram, describiendo (grafica) la

morfología de las estructuras bacterianas.

La tinción de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en
dos grandes grupos: bacterias con pared de tipo Gram positiva y bacterias
con pared de tipo Gram negativa. [3]

Comparación de las envolturas

celulares bacterianas.

Arriba: Bacteria Gram-positiva. 1-

membrana citoplasmática, 2-
peptidoglicano, 3-fosfolípidos, 4-
proteínas, 5-ácido lipoteicoico.

Abajo: Bacteria Gram-negativa. 1-

membrana citoplasmática (membrana
interna), 2-espacio periplasmático, 3-
membrana externa, 4-fosfolípidos, 5-
peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-
proteínas, 8-lipopolisacáridos, 9-
porinas.

b. Describa una técnica de tinción para observar endosporas bacterianas.

Tinción de esporas. Esta tinción permite poner de manifiesto la endospora

bacteriana, una forma de resistencia producida por algunos géneros de
bacterias Gram positivas. Las endosporas aseguran la supervivencia de
estas bacterias en condiciones desfavorables (altas temperaturas,
desecación, radiaciones ultravioletas, gamma y agentes químicos), durante
largos periodos de tiempo. Se conocen como endosporas bacterianas
porque se originan en el interior de los microorganismos.

c. Describa una técnica para observar cápsulas bacterianas.

La mejor técnica para visualizar cápsulas se basa en realizar una tinción

negativa utilizando tinta china o nigrosina, colorantes que no penetran en la
célula sino que ennegrecen el medio. Las células se observan brillantes, sin
teñir y se aprecia una zona clara alrededor de las mismas. En ocasiones se
utiliza un colorante posterior para resaltar las células.

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 d. Describa una técnica para observar flagelos bacterianos.

La tinción de flagelos de Leifson es una tinción simple que usa un colorante,

la rosanilina y ácido tánico que engrosa los flagelos para que puedan verse.
Es imprescindible fijar las células con formol y realizar la tinción muy
cuidadosamente para poder observar los flagelos.

e. Describa una técnica para observar mohos y levaduras.

Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor

aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras
muestras. Según fue descrito por Hageage y Harrington, este colorante se
emplea en lugar de KOH al 10% para el examen inicial de los materiales
clínicos. También se emplea para aumentar la visualización de los
elementos morfológicos de los cultivos puros de los hongos. En algunos
laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas aplicaciones.
Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde manzana, según
la fuente luminosa que se utilice.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

LUNA, Gilma Janeth. Manual operativo de Análisis Microbiológicos para

alimentos. Fondo Editorial Fundación Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano.
Bogotá-Colombia. 1994.

Microbiología. Prescott Harley Klein. Quinta edición. McGraw-Hill

Biología de los microorganismos. Brock. 10a edición. Pearson Prentice Hall.

[1] Zynnon. Scribd [blog]. Copyright:Attribution Non-commercial. Feb 09, 2012

[Consulta 7 septiembre 2015]. Disponible en
http://es.scribd.com/doc/80998594/Tincion-Simple#scribd

[2] E. Santambrosio. Tinción y observación de microorganismos. Universidad

Tecnológica Nacional. 2009. [Consulta 7 septiembre 2015]. Disponible en
http://www.frro.utn.edu.ar/repositorio/catedras/quimica/5_anio/biotecnologia/practic
o4.pdf
[3] Wikipedia: the free encyclopedia [Wiki en Internet]. St. Petersburg (FL):
Wikimedia Foundation, Inc. 29 jul 2015. [Consulta 7 septiembre 2015]. Disponible
en: https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteria_Gram_positiva

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1. METODOLOGIA Inicialmente se elaboró el frotis del cultivo suministrado por el
laboratorio, siguiendo los pasos: 1. Se calentó el asa de inoculación hasta que estaba
al rojo. 2. Se Tomó la porción de la muestra (o una colonia del cultivo ( ) que
posteriormente se va a examinar por medio de una asa o escobillón 3. Se colocó la
muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa, debidamente marcado 4. Debido a
que la muestra no es líquida, se colocó una pequeña gota de solución salina sobre el
portaobjetos antes de realizar el frotis; se trazó con la muestra un espiral desde el
centro hasta la periferia. 5. Nuevamente se calentó el asa para desinfectarla. 6. Dejar
secar el frotis al medio ambiente. 7. Para la fijación se pasó tres veces a través de la
llama con la muestra hacia arriba. Fig 3. Procedimiento del paso 1 al 6, para la
elaboración del frotis. Posteriormente se realizó el procedimiento para la coloración
que se muestra a continuación: Fig 4. Esquema del Procedimiento de coloración de
Gram. Imagen en: https://compendiomicrobiologia.wordpres
s.com/2014/03/09/staphylococcus-spp/ 1. Se agregó el cristal violeta sobre el
portaobjetos y dejar actuar por 1 minuto.
2. 4. Fig 5. Aplicación de Cristal Violeta 2. Enjuagar con agua corriente y dejar escurrir 3.
Después se agregó la solución de lugol y dejar actuar por 1 minuto Fig 6. Adición de
lugol al portaobjetos 4. Escurrir la solución y enjuagar el portaobjetos con agua
corriente 5. Se agregó el alcohol-acetona, hasta que se decolorara completamente. Fig
7. Decoloración con alcohol – cetona. 6. Por último, se agregó la solución de Safranina
y dejar actuar por 5 segundos, enjuagar, escurrir y dejar secar. Fig 8. Laminas
después de realizar la tinción de Gram. 7. Se llevaron las láminas al microscopio y se
observó. RESULTADOS Y ANALISIS DE RESULTADOS La coloración de Gram está
constituida por:  Cristal Violeta: colorante primario o básico, que se une a la pared
celular bacteriana. En este punto tanto bacterias Gram + y Gram – estarán de color
violeta.  Lugol: solución de yodo, utilizado como mordiente, el cual facilita la adhesión
del cristal violeta a la pared celular.  Alcohol – Cetona: empleado para aclarar,
deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos, tratados con mordiente,
y forma una barrera que la laca no puede atravesar, porque loa poros de la pared se
cierran. En las células gramnegativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en
las células grampositivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape
del complejo de cristal violeta.
3. 5. En este punto las Gram + permanecen de color violeta, y las Gram – se decoloran. 
Safranina: Es un colorante secundario, que imparte una coloración de contraste o
contracolor (color rosado). Finalmente las Gram – se encontraran teñidas de rosado y
las Gram + violetas. (4) Luego de hacer la tinción fueron observados los
microorganismos en el microscopio óptico para ver sus características morfológicas,
con aceite de inmersión fue posible verlos en aumento de 100x. Fig 9. Aumento de
100x de reacción + al Gram, lo que indica la presencia de una bacteria Gram + Se
observan bacterias en forma de cocos, agrupadas a modo de racimos de uva,
fuertemente teñidas de violeta, lo que es indicativo de bacterias Gram +, es decir; su
pared celular está formada por una gruesa capa de peptidoglucano. Es realmente
difícil identificar el género y especie de unos microorganismos con solo su morfología,
ya que existen muchas otras características distintivas entre ellos. En el caso de las
Bacterias Gram + comparten la características de constar con de una pared gruesa
que establece la forma de la célula y una membrana citoplásmica. Además estas
pueden ser encapsuladas o no, en cuanto a morfología; son esféricas, bacilares o
filamentosas; los bastones y filamentos son ramificados o no ramificados; y quizá
muestren una ramificación verdadera. Incluso algunas bacterias de esta categoría
producen esporas, por ejemplo (1) El resultado obtenido se corrobora gracias a que el
cultivo de donde se extrajo la muestra para la coloración corresponde a Puede
producir una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones cutáneas y de
las mucosas relativamente benignas, tales como foliculitis, forunculosis o conjuntivitis,

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 hasta enfermedades de riesgo vital, como celulitis, abscesos profundos, osteomielitis,
meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía. Además, también puede afectar al
aparato gastrointestinal, ya sea por presencia física de o por la ingesta de la
enterotoxina estafilocócica secretada por la bacteria. (5) Las cepas habituales de son
resistentes a la penicilina, dejando como los antibióticos más eficaces para combatirlos
a los aminoglucósidos, las cefalosporinas, la oxacilina o la nafcilina. (6)
Morfológicamente es un coco inmóvil, de 0.8 a 1 micrómetro de diámetro, que se
divide en tres planos para formar racimos de uvas, responde positivamente a la tinción
de Gram, es aerobio y anaerobio facultativo por lo que puede crecer tanto en
4. 6. una atmósfera con o sin oxígeno, no presenta movilidad ni forma cápsula. Posee un
endopigmento color amarillo - naranja a blanco porcelana color dorado al cual se le
conoce como” ”. Fermenta glucosa, lactosa y maltosa. El crecimiento ocurre en un
amplio rango de temperatura 6,5 a 50º C, siendo óptimo 30-40º C. (7) Sus colonias
lisas, brillantes y convexas. Fig 10. Aumento de 100x de reacción - al Gram, lo que
indica la presencia de una bacteria Gram – Se observan bacterias en forma de
cocobacilos de color rosa, por lo que se identifica que esta muestra fue obtenida de
una colonia de bacterias Gram -, con una delgada capa de peptidoglucano en su pared
celular. Del mismo como que se comentó anteriormente sobre las bacterias Gram +,
sucede con las Gram -, presentan amplios aspectos tanto morfológicos como
funcionales que hacen difícil identificarlas tan solo con este método. El cultivo de esta
muestra es de es decir; bacterias Gram -. es la bacteria anaerobia facultativa
comensal más abundante de la microbiota; asimismo, es uno de los organismos
patógenos más relevantes en el hombre, tanto en la producción de infecciones
gastrointestinales como de otros sistemas (urinario, sanguíneo, nervioso). (8) La es un
Bacilo Gram negativo que no forma esporas, miden 0.5 µ de ancho por 3 µ de largo y
se encarga de producir vitamina B y K. Las colonias de en agar E.M.B. tienen 2 a 4
mm de diámetro, un centro grande de color oscuro e incluso negro, y tienen brillo
verde metálico cuando se observan con luz refleja. En agar MacConkey las colonias
son rojas con halo turbio. (9) Por último, es importante resaltar la relevancia que tiene
la coloración de Gram en la práctica de microbiología, ya que permite identificar el tipo
de microorganismo (en este caso fueron; cocos y cocobacilos), Reacción al Gram
(Bacterias Gram + y Gram -) y respuesta leucocitaria. CAUSAS DE ERROR Una
reacción Gram positiva falsa  Frotis fijado antes de estar seco o demasiado grueso 
Colorante Cristal-Violeta con sedimento (filtrarlo).  El Lugol no se escurrió
completamente.  No se decoloró suficientemente.  La solución de Safranina se dejó
por demasiado tiempo. Una reacción Gram negativa falsa
5. 7.  No se dejó actuar suficiente la solución de yodo.  La preparación se sobre-
decoloró. CONSULTA 1. Investigar causas que alteran la coloración de Gram I: Edad
de la bacteria. II: Errores del operador. III: Uso de antibióticos A pesar de la gran
utilidad de la tinción de Gram, este método debe ser valorado con precaución, ya que
la reacción puede variar según la edad de las células (cultivos viejos de bacterias
Gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teñirse como Gram
negativos) y la técnica empleada (al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede
correr el riesgo que bacterias Gram positivas se tiñan como Gram negativas). Por esta
situación, junto a la muestra deben teñirse controles con bacterias Gram positivas (por
ejemplo Staphylococcus aureus) y Gram negativas (por ejemplo, Escherichia coli). 2.
Cuáles son las bacterias resistentes a la coloración de Gram? Las siguientes bacterias
de naturaleza Gram positiva se tiñen como Gram negativas:  Mycobacterias porque
están encapsuladas.  Mycoplasmas, debido a que no tienen pared.  Formas L, ya
que sufren pérdida ocasional de la pared.  Protoplastos y esferoplastos se da la
eliminación total y parcial de la pared, respectivamente. (10) 3. ¿Qué fin tiene la
fijación de las muestras al realizar un frotis bacteriano? El Fijado al vidrio del
portaobjetos se da para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten

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 la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los
sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias
queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y
bacteriana y las posibles agrupaciones de células que pudiera haber. 4. Mencione 4
géneros de bacterias Gram + y Gram -. Bacterias Gram + • Responsable de abscesos,
dermatitis, infecciones localizadas y posibles gastroenteritis. • Causante de infecciones
supurativas en el trayecto respiratorio, así como de fiebre reumática. • Bacterias
responsables de los tétanos, entran al cuerpo desde el suelo por traumatismos en las
extremidades. • Se trata de la conocida bacteria del ántrax, tanto en su versión
cutánea como en la pulmonar. (11)
6. 8. Bacterias Gram – • Habitante usual del colon humano, está involucrada en las
llamadas “diarreas del viajero”, así como en meningitis neonatal, sepsis e infecciones
urinarias. • Bacteria responsable de la enfermedad conocida como fiebre tifoidea,
suele transmitirse por vía fecal-oral: contaminación de aguas, mala disposición de
excretas o higiene defectuosa. • Bacilo usualmente aerobio, es responsable de
numerosas meningitis, otitis, sinusitis, bronconeumonías, celulitis y artritis séptica. • .
Causante de la enfermedad conocida como Tos ferina, de alta mortalidad infantil. (11)
CONCLUSIONES  Es importante realizar minuciosamente el procedimiento para la
coloración de Gram, para evitar resultados erróneos  La muestra en fresco nos
permite ver el movimiento de los microorganismos  Gracias a la coloración de Gram
podemos distinguir entre baterías Gram + y Gram -, también la morfología de las
mismas.

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