PARASITOLOGÍA Práctica Nº 1 : Técnicas de Laboratorio (I).

PREVENCIÓN DEL RIESGO BIOLÓGICO EN EL LABORATORIO: TRABAJO CON

PARÁSITOS.
NTP 545 (ver http://www.mtas.es/insht/ntp-545.htm )
La manipulación de organismos en alguna de sus fases infecciosas pueden comportar riesgo
personal de laboratorio si no se realiza en las condiciones de seguridad biológica adecuada.
El Real Decreto 1995/1978, por el que se aprueba el cuadro de enfermedades profesionales en el
sistema de la S.S. incluye una lista de enfermedades parasitarias
Al trabajar con estos agentes biológicos deben aplicarse también las medidas generales de
seguridad concernientes a las medidas de higiene personal, al trabajo seguro y las buenas
prácticas frente al riesgo biológico (y también, obviamente, frente a otros riesgos característicos
del laboratorio), utilizando protecciones personales como guantes, mascarilla, protector ocular y
facial, y ropa de trabajo adecuados, para prevenir la exposición (véanse las NTP 376 y 432).
Especial mención debe hacerse de las recomendaciones destinadas a evitar heridas y punciones
(las agujas contaminadas no deben reencapsularse nunca y, una vez utilizadas, deben colocarse
en un contenedor de residuos resistente a la perforación) y la formación de bioaerosoles.

El Real Decreto 664/1997, sobre los riesgos relacionados con la exposición agentes biológicos
establece para el trabajo con microorganismos, así como para aquellas actividades que implican la
manipulación de animales vertebrados infectados tanto de forma natural como deliberadamente,
cuatro niveles de contención o de bioseguridad. Estos niveles de seguridad son equivalentes a los
recomendados por organismos como el Center for Disease Control (CDC), Atlanta, USA y la OMS,
y se describen en la NTP 468 (Trabajo con animales de experimentación), por lo que aquí
únicamente se enumera el nivel de contención que corresponde a cada agente parásito (ver tabla
2).
Lista de enfermedades infecciosas y parasitarias contenidas en el R.D.1995/1978

1. Helmintiasis, anquilostomiasis duodenal, anguiIlulosia.

 Trabajos subterráneos, túneles, minas, galerías, cuevas de champiñones, etc.

 Trabajos en zonas pantanosas, arrozales, salinas.

2. Paludismo, amebiasis, tripanosomiasis, dengue, fiebre papataci, fiebre recurrente, fiebre amarilla,
peste, leishmaniosis, pian, tifus exantemático y otras ricketsiosis:

 Trabajos en zonas donde estas afecciones son endémicas.

3. Enfermedades infecciosas o parasitarias transmitidas al hombre por los animales o por sus
productos y cadáveres (para el tétanos se incluirán también los trabajos con excretas humanas o
animales).

 Trabajos susceptibles de poner en contacto directo con animales, vectores o reservorios de la

infección o sus cadáveres.

 Manipulación o empleo de despojos de animales.

 Carga, descarga o transporte de mercancías.

 Personal al servicio de laboratorios de investigación biológica o biología clínica (humana o

veterinaria) y especialmente los que comporten utilización o cría de animales con fines

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 PARASITOLOGÍA Práctica Nº 1 : Técnicas de Laboratorio (I).

científicos.

 Personal sanitario al servicio de hospitales, sanatorios y laboratorios.

4. Enfermedades infecciosas y parasitarias del personal que se ocupa de la prevención, asistencia y

cuidado de enfermos y en la investigación.

 Trabajos de personal sanitario y auxiliar que contacten con estos enfermos tanto en instituciones
cerradas, abiertas y servicios a domicilio.

 Trabajos en laboratorios de investigación y de análisis clínicos.

 Trabajos de toma, manipulación o empleo de sangre humana o sus derivados y aquellos otros
que entrañen contacto directo con estos enfermos (hepatitis vírica).

TABLA 2.
Lista de las diferentes especies de parásitos que se contemplan en el R. D. 664/1997 sobre la protección de los
trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos

AGENTE BIOLÓGICO NOTAS

Acanthamoeba castellani
Ancylostoma duodenale
Angiostrongylus cantonensis
Angiostrongylus costaricensis
Ascaris lumbricoides
Ascaris suum
Babesia divergens
Babesia microti
Balantidium col¡
Brugia malayi
Brugia pahangi
Capillaria philippinensis
Capillaria spp
Clonorchis sinensis
Clonorchis viverrini
Cryptosporidium parvum
Cryptosporidium spp
Echinococcus granulosus
Echinococcus multilocularis
Echinococcus vogeli
Entamoeba histolytica
Fasciola hepática
Fasciolopsis buski
Giardia lamblia
Trypanosoma brucei brucei
(Giardia intestinalis)
Fasciola gigantica Trypanosoma brucei gambiense
Hymenolepis diminuta Trypanosoma brucei rhodesiense
Hymenolepis nana Trypanosoma cruz¡
Leishmania brasilensis Wuchereria bancrofti
Leishmania donovani
Leishmania ethiopica
Leishmania mexicana
Leishnmania peruviana
Leishmania tropica
Leishmania major
Leishmania spp
Schistosoma intercalatum
Schistosoma japonicum
Schistosoma mansoni
Schistosoma mekongi
Strongyloides stercoralis
Strongyloides spp
Taenia saginata
Taenia solium
Toxocara canis

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Direcciones de atlas y fotos de parásitos.

Atlas de Parasitología

ATLAS OF MEDICAL PARASITOLOGY.

Infectious Deseas Unita, Tropical and Parasitology Service, Amadeo di Savoia Hospital.
Editor: Pietro Caramello MD.
Ubicación: Turin.
Valoración: interesante.
Idioma: INGLES
E-mail: caramello@cdfound.to.it
Dirección web: http://www.cdfound.to.it/html/manager.htm

DPDX PARASITE IMAGE LIBRARY.

Identification and diagnosis of parasites of Public Helth Concern.
Atlas de parasitología clasificada: Image Library.
Valoración: muy interesante.
Idioma: INGLES
Dirección web: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/default.htm

PARASITE IMAGE COLLECTION.

Autores: Mr. Banyat Pinta, Miss Rungkarn Methanitikorn y Dr. Nimit Morakote.
Ubicación: Department of Parasitology, Faculty of Medicine, Chiang Mai University, Thailand.
Valoración: muy interesante.
Idioma: INGLES
Dirección web: http://www.med.cmu.ac.th/dept/parasite/default.htm

PARASITES AND PARASITOLOGICAL RESOURCES.

Graphic Images of Parasites. Más de 550 imágenes de 180 especies.
Editor: The Ohio State University. College of Biological Sciences.
Ubicación: Columbus, Ohio.
Valoración: muy interesante.
Idioma: INGLES
Dirección web home: http://www.biosci.ohio-state.edu/~parasite/home.html
Dirección web atlas: http://www.biosci.ohio-state.edu/~parasite/images.html

THE PARASITOLOGY IMAGES LIST.

Colección de imágenes de los más importantes parásitos.
Editor: School of Life Sciences.
Ubicación: Queensland University of Technology.
Valoración: interesante.
Idioma: INGLES

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Dirección web: http://iain.umsmed.edu/~micro/lushb/web/parasite%20web/paramast.htm

VETERINARY PARASITOLOGY IMAGES GALLERY.

Atlas de artrópodos insectos y ácaros.
Autor: Marcelo de Campos Pereira.
Ubicación: Institute of Biomedical Sciencies. Department of Parasitology, University of Sao
Paulo.
Idioma: INGLES
Dirección web: http://icb.usp.br/~marcelcp/
http://www.cdfound.to.it/html/manager.htm
http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/default.htm
http://icb.usp.br/~marcelcp/
http://iain.umsmed.edu/~micro/lushb/web/parasite%20web/paramast.htm
http://www.med.cmu.ac.th/dept/parasite/default.htm
http://www.biosci.ohio-state.edu/~parasite/images.html

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 PARASITOLOGÍA Práctica Nº 1 : Técnicas de Laboratorio (I).

PRACTICA Nº 1: TÉCNICAS DE LABORATORIO (I).

MATERIAL DE LABORATORIO (En el Lab. Parasitología ).
 Centrífuga con su tubos
 Frascos lavadores con Alcohol 70%, formol 4%,
 Embudo de Baerman.
 Vasos de papel
EN LA CAJA GRADE:
 Vasos de papel con rejillas y gasas.
 Kits de flotación.
 Triquineloscopios (2+ 1 roto)
 Tubitos con tapón de goma y tubos Eppendorff
 Portas, con y sin excavación y cubreobjetos.Placas Pettri.( una caja de cada)
 Pipetas desechables, palillos de dientes, espátulas, cucharas y barrita y perlas cristal.
 Tijeras, pinzas aguja enmangada, pincel (1 equipo)
 Cinta adhesiva supertransparente.
PRODUCTOS QUÍMICOS:
Solución de ClNa, Sulfato de Zn al 30% y Sheater´sugar, Glicerina, esmalte uñas.
MATERIAL BIOLÓGICO.
CAJA CON MUESRAS BIOLÓGICAS: Mallofagos, Varroa, Nematodos gallina, de erizo,
Dicrocelium, pulgas, fasciolas, músculo de jabalí con triquina (frasco con fijador etc.
 Tierra de zona de caballos, cabras, ovejas, vacas...
 Heces frescas de animal: perro vaca, conejo, paloma, gallina...
 Animales vivios o recién muertos.
 Ratas blancas y heces de conejo.: Bioterio: (Agustín o Teresa: tlf. 2731).
 Hígado de vaca parasitado con fasciola: (Matadero Mieres Juan Rodrigo Tl.985.450486)
 Matadero Junquera Bobes: Domingo Martinez, Alfredo Turienzo: Tlf.985 741382)
-
CADA EQUIPO TIENE Sobre una lámina de papel de filtro.
 Microscopio , Lupa, con escala micrométrica y micrómeto patrón (LAB. 129).
 1 Dossier en funda de plástico.
 Gradilla con frascos cuentagotas con colorante: Carmín + Alcohol clorhídrico.
 Serie de alcoholes: 70%, 96%, absoluto, xilol y resina. Agua destilada y suero fisiológico.
 Tubos de ensayo y gradilla.
 Portaobjetos excavados (2) y portaobjetos normales y cubre.
 Cristalizador pequeño con barritas de cristal
 Placas Pettri cristal.
 Pincel fino y aguja enmangada.
 Tijeras, bisturí y pinzas finas.
 Guantes de goma y mascarillas.

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 PARASITOLOGÍA Práctica Nº 1 : Técnicas de Laboratorio (I).

GUIÓN PRACTICA 1: ACTIVIDADES A REALIZAR

1- DETECCIÓN Y DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS.
 NECROPSIA.
 ESTUDIOS COPROLÓGICOS.
 TÉCNICAS ESPECIALES DIRIGIDAS.
2- RELAJACIÓN, FIJACIÓN Y CONSERVACIÓN DE PARÁSITOS.

1- DETECCIÓN Y DIAGNÓSTICO DE PARÁSITOS1.

1.1- NECROPSIA .
1.1.a- Exploración externa.
Provistos de guantes y mascarilla y manteniendo gran atención para evitar accidentes, se
procede al examen minucioso del animal en busca de parásitos externos en piel, plumas o pelos.
Para buscar ectoparásitos y realizar un cálculo cuantitativo de la carga parasitaria, se
sacude el plumaje o pelo del animal sobre una hoja blanca durante un tiempo determinado (2
minutos), recogiendo todos los parásitos caídos.
Para la búsqueda directa, se procede al depiojamiento meticuloso y debido al,
generalmente, pequeño tamaño de los ectoparásitos, se debe utilizar la lupa binocular. Con ayuda
de pinzas se recogen los parásitos encontrados indicando la región del cuerpo de su ubicación,
para realizar posteriormente una fijación en el líquido adecuado.
1.1.b- Disección del animal.
La disección de la cavidad abdominal y torácica permitirá la búsqueda de formas
enquistadas o larvarias de helmintos. Se analizarán los peritoneos parietal y visceral, en los
que se pueden encontrar filarias adultas horadando las membranas serosas. Cada órgano
extraído se colocará en un recipiente con suero fisiológico (para evitar que el shock osmótico
reviente los parásitos). Los órganos huecos (intestino, conductos biliares, vesícula biliar, vejiga
urinaria, oviductos…) se abrirán con tijeras y se agitarán en suero fisiológico para desprender
los parásitos que puedan estar adheridos al revestimiento epitelial.
Los órganos macizos (hígado, riñones, pulmones…) se desmenuzarán con pinzas o tijeras.
Todos los recipientes conteniendo las vísceras con las solución salina o fisiológica, se
dejarán sedimentar, eliminando el sobrenadante. (se repite la operación tantas veces sea
necesario hasta que el sedimento aparezca claro). El sedimento final se estudia bajo el

1
NOTA: En el Tema 16 se exponen otras técnicas utilizadas en un Laboratorio de Parasitología
para la detección y diagnóstico de parásitos y sus huevos.

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 PARASITOLOGÍA Práctica Nº 1 : Técnicas de Laboratorio (I).

microscopio. Es más aconsejable la observación en vivo de los helmintos, que posteriormente se

fijarán según las técnicas que a continuación se exponen.
El estudio del contenido duodenal, y fecal, serán objeto de estudios coprológicos que se
detallaran posteriormente.
1.1.b.1 Análisis de contenido duodenal .
Prestaremos especial atención al tubo digestivo, separándolo por regiones (anterior, media
y posterior y a su vez en subregiones si es indicado). Se abre el tubo digestivo y, bajo lupa, se
analiza el contenido del mismo. Es necesario en muchos casos lavar con suero fisiológico el
interior del tubo, colando la papilla obtenida y llevando muestras a la lupa o microscopio para
su estudio.
Es el método más fiable para el estudio de larvas de Strongyloides o Nematodos y
Cestodos adultos, así como de otros parásitos intestinales como Giardia, Isospora y
Criptosporidium.
Muchos nematodos y tenias son blanquecinas y semitransparentes por lo que es
aconsejable realizar un rascado de las paredes internas del tubo digestivo y examinar el frotis
al microscopio. Los parásitos que se encuentren se pueden fijar directamente en el fijador
adecuado o mantener en suero fisiológico mientras dura la necrópsia. (Ver lista de fijadores).

1.2. ESTUDIOS COPROLÓGICOS.

1.2.1 ANÁLISIS MACROSCÓPICO: Observación de las heces,directa y con lupa.
1.2.2 ANÁLISIS MICROSCÓPICO.
1.2.2 a. MÉTODO DIRECTO: FROTIS
Sirve solo para evidenciar la presencia de un
determinado parásito, pero se trata de un método
cualitativo que no permite conocer el nº de formas
larvarias que hay por cada gramo de heces y por tanto
la carga parasitaria.
Frotis fresco. Es un método rápido pero poco seguro.
Posibilidad de falsos negativos, por lo que es necesario
repetir. Permite observar la motilidad de los

microorganismos: amebas y flagelados. Detecta quistes y huevos de helmintos. Precisa una

concentración.
Modo de proceder :
Sobre un porta limpio se coloca una pequeña porción de materia fecal y una gota de
suero fisiológico. Se coloca un cubre y se observa sin teñir. Es importante que el frotis no se a
denso si no transparente. Se repite la observación con diferentes muestras.
Tras la observación de trofozoitos puede utilizarse tinción de Iodo que tiñe quistes y destaca
detalles (los trofozoitos mueren y resultan inidentificables).

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 PARASITOLOGÍA Práctica Nº 1 : Técnicas de Laboratorio (I).

TÉCNICA PARA DETERMINAR PROTOZOOS CILIADOS.

Para hacer que el movimiento de estos seres sea más lento, se hace viscoso el medio
añadiendo al porta una gota de glicerina.

1.2.2 b MÉTODO INDIRECTO.

Para asegurar la perfecta inspección de las heces se deben someter las mismas a un
proceso de “concentración” que permite la separación y detección de huevos larvas de
helmintos y quistes de protozoos del resto de la materia fecal, por medio de su densidad
específica por ASCENSIÓN, FLOTACIÓN y por SEDIMENTACIÓN.
Se basa  diferente densidad de los huevos de parásitos, que flotan o sedimentan y el líquido.
Se utilizan  soluciones acuosas de gran densidad (ClNa y SO 4Zn) o ligeras (eter-alcohol).
Se detectectan huevos de Trematodos y nematodos gastrointestinales y ooquistes de
coccidios (Eimeria spp , Isospora spp, Fasciola sp etc.)

 TÉCNICA DE LA ASCENSIÓN.
Material:
Kit de flotación.
Solución saturada de ClNa, o Sulfato de Zn al 30%
Modo de proceder:
1. Con el propio embudo del kit se toma una porción de heces que se deshacen dentro del
recipiente en donde se vierte una solución de Sulfato de Zinc.
2. Se deshace la muestra revolviendo y se llena totalmente con el Sulfato de Zink para
que forme menisco.
3. Se coloca un cubre de 22 x 22 mm. Se deja reposar durante un os 20 minutos para que
asciendan los huevos existentes. Se observa al microscopio.

 TÉCNICA DE FLOTACIÓN CON CENTRÍFUGA.

Material.
Centrífuga.
Solución concentrada de sacarosa ( Sheather)
Heces frescas: conejo, gallina, perro, cerdo, supuestamente contaminadas)
Modo de proceder:
1. Se toman de 0.5 ó 1 gr. de heces formes, (1 ó 2 ml de líquidas).
2. Se echan en un tubo de centrífuga con 7-8 ml de Sheather’ sugar.
3. Se mezcla bien con varilla de cristal.
4. Se centrifuga a 500 r.p.m. durante 5 min.
5. Se toma un poco de la superficie y se coloca entre portaobjetos y cubreobjetos.
6. Se observa al microscopio.

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 PARASITOLOGÍA Práctica Nº 1 : Técnicas de Laboratorio (I).

 TÉCNICA DE SEDIMENTACIÓN (es preciso preparar con antelación)

Dirigida a huevos de gran densidad (Trematodos y Cestodos).

OBSERVACIÓN DE HUEVOS de Fasciola .

Se machacan fasciolas con agua. Se echa en una copa graduada. Se revuelve y espera
que sedimente. Por su gran densidad, se obtienen un sedimento en el fondo, que se toma con
pipeta y observa al microscopio.
Para conservarlos y estudiarlos al microscopio, se montan con lactofenol en
preparaciones semipermanentes que se sellan con esmalte de uñas.

1.3- TÉCNICAS2 ESPECIALES DIRIGIDAS.

I. Técnica de Grahanm del papel de celofán adhesivo.
II. Diagnóstico de larvas musculares( Trichinela spiralis ): Triquineloscopio y digestión muscular.
III. Aislamiento de Nematodos del suelo o heces: vaso de papel.
IV. Técnica de migración: Baerman-Wetzel)

I. Técnica de Grahanm del papel de celofán adhesivo.

Con cinta adhesiva transparente, se coloca con la cara adhesiva se pega presionando sobre
la mucosa perianal , después se adhiere a un portaobjetos.
Se examina posteriormente con microscopio.
Está indicado para la detección de huevos de Enterobius, Syphacia.

II.Diagnóstico de larvas musculares de Trichinella :

 Trichineloscopio. Se comprimen trozos de 2 mm de músculo (fresco) sospechoso entre
dos cristales. Pueden ser dos portas. Por transparencia se estudia al microscopio y se
observa entre los paquetes de fibras musculares si existen cápsulas con triquina.
 Digestión muscular : Requiere aparato especial para hacer exámenes a numerosas
muestras. En un recipiente se echa 1 gr de músculo por muestra con un poco de CLH y
pepsina. Se calienta a 40ºC y revuelve con agitador durante 30 minutos. La papilla
obtenida se decanta y se estudia al microscopio, observándose las triquinas (en caso
positivo) fuera de las cápsulas.

III. Aislamiento de nematodos del suelo o heces: Técnica del vaso de papel.
(Debe de hacerse con 36 horas de anterioridad a la práctica)
Indicado para separar larvas de Nematodos pulmonares, ancylostómidos y estrongylos
equinos del suelo o heces, o para el aislamiento de fitoparásitos del suelo.

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 PARASITOLOGÍA Práctica Nº 1 : Técnicas de Laboratorio (I).

Quitar el fondo de un vaso desechable y sustituirlo por una triple capa de gasa sujeta
con banda elástica. Añadir tierra o heces e introducirlo en otro con 15-20 ml agua durante 24
a 36 h. Las larvas pasarán al fondo del vaso exterior de donde se recogen y fijan.

IV.Técnica de migración de Baerman-Wetzel. El aparato de Baermann es adecuado,

cuando la muestra a examinar en de cierto tamaño.
Con este método se pueden observar larvas de: Dictyocaulus(l-i), Protostrongylidos (l-i),
etc. Se emplea para la determinación de larvas de nematodos broncopulmonares, sobre
todo en rumiantes.
1. Se pesan 10 g de heces de ovino, o 20 g de heces de bovino.
2. Se hace una torunda con las heces previamente maceradas.
3. Las heces se introducen en un aparato de BAERMAN que consiste en un embudo
soportado en posición vertical al que se le añade en su extremo una goma tubular que se
cierra con una pinza.
4. Se colocan las heces en el embudo y se llena de agua templada.
5. Debe permanecer aproximadamente 12 horas, tras este tiempo las larvas, por
gravedad, se disponen en la parte inferior del tubo de goma.
6. La recogida de los Nematodos se realiza abriendo la pinza de presión y derramando
parte del agua en un vaso de precipitados.-
7. Recoger 5-10 ml en un tubo de ensayo y centrifugar a 1.500-2.000 rpm., 5 min.
8. Se elimina el sobrenadante para observar las larvas en el concentrado.
9. Los 2 ml de centrifugado se pasan a una cámara de FAVATI para su recuento para
ponerlos en relación a la cantidad de heces iniciales.

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