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4.

Effet de la concentration d’enzyme

™ Lorsque [enzyme] << [substrat],


la vitesse de la réaction est

Vitesse de réaction
directement proportionnelle à la
concentration de l’enzyme.

™ La vitesse de réaction augmente


lorsque [enzyme] augmente.
Ceci est vraie pour n’importe quel
catalyseur.

[Enzyme]

128

3.6 Cinétique enzymatique

™ Les enzymes détiennent leur


sélectivité et capacité à accélérer
la vitesse d’une réaction de la
formation d’un complexe enzyme-
substrat:
∆G‡=
E+S E·S E+P (sans enzyme)
=∆G‡
où E= enzyme, S= substrat, (avec enzyme)
E·S = complexe enzyme-substrat
et P est le produit de la réaction
∆Gréaction
n’est pas affectée
™ La formation du complexe E·S par l’enzyme
donne lieu à un état de transition
pour la réaction ayant une barrière
énergétique d’activation (∆G‡)
abaissée; la réaction a donc moins
besoin d'un apport externe
d'énergie pour se dérouler.
(D’après Tinoco, Sauer, Wang & Puglisi,
Physical Chemistry: Principles & Applications
In Biological Sciences, 4e éd., 2002) 129
™ La 1ère étape critique dans une réaction avec catalyse enzymatique est la
formation du complexe E·S.

™ Puisque c’est le complexe E·S qui est le réactif dans l’étape de conversion du
substrat en produit, sa concentration détermine la vitesse de réaction.

™ La vitesse de réaction est maximale lorsque toutes les molécules d’enzyme sont
complexées au substrat. Cette situation correspond à des concentrations élevées
de substrat, où l’enzyme est soit disant saturée avec le substrat.

™ Pour une concentration fixe de l’enzyme, un graphique de la vitesse initiale de


réaction (Vo) en fonction de la concentration initial du substrat [S] exhibe une
courbe typique d’une cinétique de saturation, où un plateau est observé à [S]
élevées lorsque V= vitesse maximale (Vmax).

Vo Vitesse de réaction approche Vmax

Vo α [S]

130

3.6.1 Réaction à un substrat:


cinétique de Michaelis-Menten
™ Le modèle cinétique est basé sur la formation du complexe E·S selon les
étapes suivantes: k1 k3
E + S ES E + P (1)
k2
™ On cherche une expression qui relie la vitesse de réaction aux
concentrations du substrat et de l’enzyme et aux vitesses des étapes
individuelles; le point de départ étant que la vitesse de réaction est égale
au produit de [E·S] et la constante de vitesse k3: V=k3[E·S] (2)

™ Les vitesses de formation et de décomposition du complexe E·S sont


données par:
vitesse de formation de E·S = k1[E][S] (3)
vitesse de décomposition de E·S = (k2 + k3)[E·S] (4)

™ Sous conditions d’état stable: k1[E][S] = (k2 + k3)[E·S] (5)

[E][S]
™ Par réarrangement de l’éqn 5, on obtient: [E ⋅ S] = (6) 131
(k 2 + k 3 )/k1
™ L’équation précédente peut être simplifiée en définissant une nouvelle
constante, Km, qui est la constante de Michaelis:
k + k3 (7)
Km = 2
k1

™ En substituant l’expression pour Km dans l’éqn 6, on obtient:


[E][S] (8)
[E ⋅ S] =
Km

™ De plus, [S] ≈ [S]totale, si [E] << [S]


[E] = [E]totale – [E·S] (9)

™ Donc, [E·S]=([E]totale –[E·S])[S]/Km (10)

[S]
™ Par réarrangement de l’éqn 10, on obtient [E ⋅ S] = [E]totale (11)
[S] + K m

132

™ En substituant cette expression pour [E·S] dans l’équation 2, on obtient:


[S]
V = k 3 [E]totale (12)
[S] + K m
™ La vitesse maximale, Vmax, est atteinte lorsque tout les sites enzymatiques
sont saturés de substrat, c’est à dire, lorsque [S] >> Km et donc
[S]/([S] + Km) tend vers 1. Il s’ensuit que Vmax = k3[E]totale (13)

™ La substitution de l’éqn 13 dans l’éqn 12 donne l’équation de Michaelis-


Menten:
[S] (14)
V =V max
[S] + K m

™ L’équation de Michaelis-Menten décrit la courbe cinétique de Vo-[S]:


- Pour des concentrations faibles de substrat, lorsque [S] << Km,
V = [S]Vmax/Km et la vitesse est directement proportionnelle à la
concentration de substrat.
- Pour des concentrations élevées de substrat, lorsque [S] >>Km, V = Vmax
et la vitesse est indépendante de la concentration de substrat.
- La signification de la constante Km est évidente. Lorsque [S] = Km,
V = Vmax/2. Km est la concentration de substrat nécessaire pour que
l'enzyme atteigne (1/2) Vmax. 133
Méthodes graphiques pour la détermination
de Km et Vmax
™ Il y a deux régions d’utilité analytique dans la courbe cinétique de
Vo-[S]: - [S] < 0.1Km (pour la quantification du substrat)
- [S] > 10Km (pour la quantification d’enzyme)

™ Dans le développement d’un essais enzymatique, il est important de


connaître la valeur de Km de l’enzyme et d’ajuster la valeur de Vmax afin que
l’essais est accompli dans le minimum de temps requis pour une précision
donnée.

™ Il y a quatre méthodes graphiques pour établir les valeurs de Km et Vmax


dans des conditions expérimentales données: Lineweaver-Burk, Eadie-
Hofstee, Hanes et Cornish-Bowden-Eisenthal.

™ Les quatre méthodes nécessitent des données expérimentales pour la


vitesse initiale de la réaction en fonction de la concentration initiale du
substrat pour une concentration fixe d’enzyme.

134

Données cinétique

0.6

0.5
Vo (∆A340nm/min)

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0
0 1 2 3 4 5 6 7
[S] mmol/L
135
1. Méthode de Lineweaver-Burk
™ Le réciproque de l’équation de Michaelis-Menten est très utile pour l’analyse
des données de cinétique:
1 K m + [ S]
=
Vo Vmax ⋅ [S]

1 Km [S ]
qu'on peut aussi écrire = +
Vo Vmax ⋅ [S] Vmax ⋅ [S]

1 1 K 1
et qui se simplifie en = + m ⋅
Vo Vmax Vmax [S]

™ L'avantage de cette transformation mathématique est qu'elle permet de


tracer un graphique 1/Vo vs 1/[S] dont la courbe est en fait une droite pour
les enzymes obéissant à la relation Michaélienne entre vitesse de réaction
et concentration du substrat.
136

Y = (1.12551±0.08398) + (3.79517±0.06135) * X

14

12

10
Km/Vmax
8
1/Vo

4 Km = 3.37 mmol/L
Vmax = 0.89 unités d’absorption/min
2
1/Vmax
0
-0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5
-1/Km 1/[S] 137
2. Méthode de Eadie-Hofstee

[S] V [S] + VK m = Vmax [S]


V = Vmax
[S] + K m
Équation de
Michaelis-Menten

V [S] VK m VK m
+ = Vmax V = Vmax −
[S] [S] [S]

™ Un graphique de V en fonction de V/[S] donne une droite.

138

Y = (0.90851±0.03984) + (-3.46041±0.22103)*X
1.1
1.0 Km = 3.46 mmol/L
Vmax Vmax = 0.91 unités d’absorption/min
0.9
0.8
0.7
0.6
Vo

-Km
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30
Vo/[S]

139
3. Méthode de Hanes

[S] V ([S] + K m ) = Vmax [S]


V = Vmax
[S] + K m
Équation de
Michaelis-Menten

K m + [S] [S] [S] K m [ S]


= = +
Vmax V V Vmax Vmax

™ Un graphique de [S]/V en fonction de [S] donne une droite.

140

Y = (3.74211±0.11868) + (1.13445±0.03865)*X

12

11

10

9 1/Vmax
[S]/Vo

7
Km = 3.30 mmol/L
6
Vmax = 0.88 unités d’absorption/min
5

4 Km/Vmax
0 1 2 3 4 5 6 7
[S]

141
4. Méthode de Cornish-Bowden-Eisenthal

[S] Vmax [S] = V [S] + VK m


V = Vmax
[S] + K m
Équation de
Michaelis-Menten
VK m
Vmax = +V
[S]

™ Chaque paire de coordonnées (V, [S])] donne des valeurs uniques


d’ordonné à l’origine (V) et de pente (V/[S]) dans un graphique de Vmax
en fonction de Km. Pour chaque coordonnée (V, [S])], les valeurs
d’ordonnée à l’origine et de pente définissent une droite unique et les
droites se croiseront à un point identique correspondant au Vmax et Km
de l’enzyme.
142

1.6

1.4

1.2

1.0
Faire la moyenne
Vmax

0.8 des différents points


de croisement
0.6

0.4

0.2

0.0

0 1 2 3 4 5 6
Km

143
3.7 Inhibiteurs enzymatiques
™ Des inhibiteurs enzymatiques sont des espèces qui sont capables de
diminuer l'activité enzymatique.

™ Les inhibiteurs enzymatiques interagissent généralement avec l’enzyme


elle-même, formant ainsi un complexe enzyme-inhibiteur (E·I). Dans
certains cas, le mécanisme d’inhibition implique une réaction avec le
substrat.

™ L’inhibition enzymatique peut être:


- réversible (activité spécifique et les paramètres de Michaelis-Menten sont
affectés)
- irréversible (la concentration d’enzyme active est diminuée)

™ L’inhibition de réactions par des produits de la réaction catalysée (ou d’une


réaction subséquente) - mécanisme de régulation/« feedback » pour le
métabolisme cellulaire.

™ Inhibition sélective d’une enzyme par des substances chimiques - à la base


de la pharmacologie et de la chimiothérapie. 144

™ Quantification d’inhibiteurs- à
partir de mesures de l’activité
enzymatique (l’échantillon
d’inhibiteur ne contenant pas
d’enzyme).
V
™ Des standards contenant une
quantité fixe d’enzyme, une
concentration saturée de substrat
et des concentrations variables
d’inhibiteur sont préparés. Des
courbes de l’activité enzymatique
vs. [I] sont réalisées à partir des
standards.
Courbes types pour des inhibiteurs
(a) réversible et (b) irréversible.

(D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

145
3.7.1 Inhibiteur compétitif

™ Il y une compétition entre l’inhibiteur et le substrat pour le site actif de


l’enzyme. L’inhibiteur se lie réversiblement à l’enzyme mais n’est pas converti
en produit.
k1 k2
E + S ES E + P
k-1
k3
E + I EI P
k-3

™ L’inhibiteur bloque le site actif de l’enzyme, empêchant la liaison du substrat.


Son efficacité est décrit par la constante d’inhibition, Ki (constante de
dissociation du complexe E·I) = k-3/k3.

™ Pour une simple réaction à un substrat, l’effet de l’inhibiteur compétitif sur la


vitesse initiale de la réaction est donné par:
Vmax
Vo =
1 + (K m /[S]) × (1 + [I] / K i )
146

™ L’inhibiteur peut être déplacé à des


concentrations élevées du substrat. Graphique Lineweaver-Burk
pour un inhibiteur compétitif
™ Les inhibiteurs compétitifs n’ont pas
d’effet sur le Vmax de l’enzyme, mais
changent le Km. Le Km augmente
par un facteur de (1+[I]Ki).

™ L’inhibition compétitive des


enzymes est une stratégie souvent
adoptée dans le développement de
médicaments et antibiotiques (ex.
les sulfonamides compétition avec
le acide p-aminobenzoïque, un
facteur de croissance essentiel
pour plusieurs types de bactérie).

(D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

147
3.7.2 Inhibiteur non compétitif

™ Ce type d’inhibiteur ne ressemble généralement pas au substrat naturel.

™ L’inhibiteur se lie à l’enzyme à un site autre que le site actif, causant


ainsi un changement réversible dans la structure tertiaire de l’enzyme
qui interfère la vitesse de conversion du substrat en produit.

™ L’inhibiteur peut interagir avec l’enzyme libre ou avec le complexe E·S.

™ Dans ce type d’inhibition, la quantité d’enzyme active semble diminuer


lorsque [I] augmente; Vmax de la réaction diminue:

Vmax
Vo =
(1 + [I] / K i ) × (1 + K m /[S])

où Vmax,app = Vmax/{1+[I]/Ki}

148

Graphique Lineweaver-Burk
pour un inhibiteur non compétitif

(D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

149
3.7.3 Inhibiteur incompétitif

™ Les inhibiteurs incompétitifs se lient au complexe E·S, réduisant


ainsi la vitesse de formation du produit. Il y a une diminution du
Km et du Vmax de la réaction enzymatique.

™ Une approximation de ce comportement est donnée par la relation:


Vmax
Vo =
(K m /[S]) + ([I] / K i ) + 1

™ Le modèle prédit un changement équivalent du Km et du Vmax,


résultant en des droites de pentes identiques dans le graphique
de Lineweaver-Burk.

150

Graphique Lineweaver-Burk
pour un inhibiteur incompétitif

= {1+[I]/Ki}/Vmax

= -{1+[I]/Ki}/Km

(D’après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004)

151
3.8 Activateurs enzymatiques

™ Les activateurs sont des espèces qui augmentent l’activité


enzymatique sans être eux-mêmes impliqués dans la réaction
catalysée par l’enzyme.

™ Ces espèces peuvent être nécessaire à l’activité catalytique de


l’enzyme, tels que des groupements prosthétiques ou cofacteurs,
ou ils peuvent augmenter l’activité spécifique d’une enzyme qui est
déjà active (ex. ions inorganiques).

™ À une concentration saturée et constante du substrat, des


concentrations croissantes de l’activateur augmentent la vitesse
initial de réaction; une vitesse limitante est atteinte à des
concentrations élevées d’activateur.

152

™ Dans certains cas, telle que l’activation par un groupe prosthétique,


la séquence suivante de réactions peut servir comme modèle pour
une description cinétique:
A + Einactive Eactive

S + Eactive SEactive Eactive + P

™ Des séquences parallèles de réactions doivent être considérées si


l’enzyme est catalytiquement active en absence de l’activateur.

™ À l’exception des groupes prosthétiques ou co-facteurs, les


activateurs ne sont pas généralement spécifiques et plusieurs
espèces peuvent avoir le même effet d’activation sur une enzyme
(ex. l’amylase est activé par une variété d’anions, incluant le Cl-).

153