INSTITUTO POLITÉCNICO

NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

INGENIERÍA BIOQUÍMICA

LABORATORIO DE METODOS DE ANALISIS

PRACTICA: DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA EN
REFRESCOS DE COLA POR CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN.

ALUMNO: SALVADOR HERNANDEZ JUAN

GRUPO: 4IM2 SECCION: 3

PROFESOR: FRANCISCO CARMELO

FERNANDEZ LÓPEZ

FUNDAMENTO
La cromatografía líquida de alta resolución se caracteriza por el empleo de una
fase estacionaria constituida por partículas de tamaño muy pequeño, del orden de
los m. Esto hace que la eficacia del sistema sea muy elevada proporcionando
columnas con un número muy grande de platos teóricos.
Para vencer la enorme resistencia que ofrece la fase estacionaria al paso de la
fase móvil es necesario emplear un sistema de bombeo a alta presión.
Otra característica importante de la HPLC es la detección continua de los analitos
conforme son eluidos.
RESULTADOS

Imagen 1. Cromatograma estándar de cafeína.

Imagen 2. Cromatograma estándar de cafeína y muestras utilizadas.

Imagen 3. Cromatograma estándar de cafeína y muestras utilizadas (por separado).

Compuesto TR Tiempo de Área bajo Promedio

(min) elución del la curva
analito (min)
 Estándar 0.833 2.017 562871 x=565393.6667
2.017 566132 %DER = 0.3973%
2.017 567178
Pepsi Kick 0.817 2.000 1016705 x=1017687.5
2.033 1018670 %DER = 0.1365%
Coca-Cola 0.833 2.000 686328 x=682965.5
Light 2.017 679603 %DER = 0.6962%
Coca-Cola 0.850 2.033 516466 x=515562
Original 2.017 514917 %DER = 0.1563%
2.017 515303
TABLA 1: ÁREAS BAJO LA CURVA DE LAS MUESTRAS Y EL ESTANDAR

Concentración cafeína (ESTANDAR): Considerando que la concentración en el

estándar es de 10.3 mg por cada 100 mL=0.103 mg/mL con un área bajo la curva
de 565393.6667; se tomo 1 mL y se diluyo en 10mL por lo que en el promedio del
estándar había 0.0103 mg/mL, nos fue posible calcular la concentración de las
muestras, con una regla de proporcionalidad.
X =565393.6667=0.0103 mg/mL Estandar
Por lo tanto:
Pepsi kick; 1017687.5=0.0185 mg/mL x(10)(100) = 18.5396 mg/100mL
Coca Cola Light; 682965.5=0.0124 mg/mLx(10)(100) = 12.4418 mg/100mL
Coca Cola Original; 515562=0.0093 mg/mL x(10)(100) = 9.3921 mg/100mL
NORMA Oficial Mexicana NOM-218-SSA1-2011, Productos y servicios. Bebidas
saborizadas no alcohólicas, sus congelados, productos concentrados para
prepararlas y bebidas adicionadas con cafeína. Especificaciones y disposiciones
sanitarias. Métodos de prueba.
-3.8 Bebida adicionada con cafeína, a los productos elaborados por la disolución
en agua para uso y consumo humano, de azúcares, ingredientes opcionales,
adicionados o no de aditivos que pueden estar o no carbonatadas y con un
contenido mayor de 20 mg de cafeína por 100 ml de producto. No incluye al café,
sucedáneos del café, té e infusiones de hierbas.
Imagen 5. Tiempo de la cromatografía del estándar de cafeína.

Midiendo de la figura 1 se obtuvo lo siguiente:

WA=0.1615
WB=0.3983
f=0.1894
b=0.2090
∆W=0.2090-0.1894
0.2090+ 0.1894
Asimetria: As= =1.0517 ;menor que 2
0.2090+ 0.189 4−( 0.2090−0.1894 )
Platos teóricos:
2
2 min
N=16 ( ) = 403.2193= 404
0.3984 min
Factor de retención:
2 min−0.833 min
K= = 1.4009 min ; entre 1 y 5
0.833 min
Reproducibilidad:
2246.422564
%DER= ( 100 )=0.3973 ;menor que 1.5%
565393.6667
Resolución:
2 ( 2 min−0.833 min )
R= = 4.1708 ; mayor que 1.5
0.1612min+0.3984 min

PREGUNTAS ADICIONALES
1. ¿Cuál es la importancia de filtrar y desgasificar la fase móvil y la
muestra?
Es necesario filtrar para evitar el paso de cualquier sólido que pudiese desgastar
la columna, así como provocar daños en las tuberías debido al pequeño diámetro
que presentan. También es necesario que las muestras y las fases móviles
carezcan de gases disueltos para evitar la formación de burbujas dentro del
aparato.
 2. Mencionar los métodos de desgasificación más frecuentemente
utilizados en HPLC
Sonificazion
Se usa un baño ultrasonido a los solventes en consecuencia los gases
disueltos se convierten en burbujas diminutas que flotan a la superficie del
solvente y se eliminan.
Helio sparging
En este método se hace burbujear gas de helio de alta pureza en el solvente.
El helio desplaza los gases disueltos hacia la atmósfera.
Desgasificación electrónica en línea del flujo
Es el método más nuevo disponible para desgasificar solventes en HPLC. Se
sitúa la unidad de desgasificación entre el depósito y la entrada a la bomba de
HPLC. Los flujos del solvente entran contacto con una membrana fluoro
polimérica que deja difundir los gases disueltos por la membrana en una
cámara al vacío. Este método es muy conveniente y ofrece una desgasificación
continua del solvente cuando entra a la bomba.
3. ¿En qué difiere la cromatografía en fase normal de la cromatografía de
fase reversa en cuanto a la fase estacionaria, fase móvil y orden de
elución?

Cromatografía Fase Fase móvil Orden de elución

estacionaria
Fase normal Polar No polar Compuestos no
polares.
Fase reversa No polar Polar Compuestos
polares.

4. Si se cambiara la composición de la fase móvil agua-metanol (65:35) a

(75:25) ¿qué sucedería en cuanto al tiempo de retención? y ¿por qué?

Cuanto mayor sea la proporción de agua menor será el poder eluyente de

la fase móvil, y, por tanto, mayores los tiempos de retención.

DISCUSIÓN
Los parámetros básicos que considerar de la cromatografía son la
reproducibilidad, la resolución, el factor de capacidad, el número de platos teóricos
y la asimetría. En la práctica únicamente consideramos el factor de capacidad y la
reproducibilidad.
La reproducibilidad la determinamos calculando el %DER. De forma particular se
denomina reproducibilidad a la capacidad de un instrumento de dar el mismo
resultado en mediciones diferentes realizadas en las mismas condiciones a lo
largo de diferentes periodos de tiempo. De acuerdo con la Tabla 1. Los valores de
%DER para todas las muestras fueron menores a 1.5, esto quiere decir que tanto
el aparato como los analistas llevamos a cabo la práctica de manera correcta.
El factor de capacidad expresa la retención de un compuesto por la fase
estacionaria, independientemente del caudal de la fase móvil. Es recomendable
que su valor esté comprendido entre 1 y 20 para todas las bandas del
cromatograma.
Se calcula con la relación entre el tiempo en el que tarda en salir la muestra
(cafeína) y entre el tiempo en el que sale el compuesto que no presenta
interacción con la fase estacionaria, que de acuerdo con los tres cromatogramas
es la primera banda que se forma. Como las tres muestras presentan esta banda
posiblemente se trate de ácido fosfórico, sin embargo, para poder confirmar lo
anterior sería necesario comparar con un estándar de ácido fosfórico.
De acuerdo con la NOM 218 SSA1 2011 las bebidas adicionadas con cafeína no
deben de contener más de 20 mg/100 mL de producto, así que ninguna de las
muestras supera esta concentración.
CONCLUSIÓN
 Es necesario filtrar y desgasificar las muestras, así como las fases móviles
para evitar daños en el equipo.
 La reproducibilidad que tiene el aparato es el adecuado para seguir
llevando a cabo prácticas.
 El factor de capacidad se encuentras dentro de los valores esperados para
un cromatograma.
 La concentración de cafeína en las tres muestras está dentro de los límites
permitidos de acuerdo con la NOM 218 SSA1 2011.
BIBLIOGRAFÍA
 Cooper, Terrance C. 1984. “Instrumentos y Técnicas de Bioquímica”. Ed.
Reverté, Barcelona, España, pp 141 -143.
 H. Ayres, “Análisis químico cuantitativo”. 1970. Editorial Castillo. 7°
Reimpresión. Madrid, España. pp. 464-468.
 http://www.salud.gob.mx/cdi/nom/compi/NOM-218-SSA1-2011.pdf